HU224073B1

HU224073B1 - Biológiai aktivitással rendelkező peptidek, ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények és eljárás ezek előállítására

Info

Publication number: HU224073B1
Application number: HU9400252A
Authority: HU
Inventors: Marko Duvnjak; Zeljko Grabarevic; Boris Mildner; Stjepan Mise; Marijan Petek; Ivo Rotkvic; Sven Seiwerth; Predrag Sikiric; Ernest Suchanek; Branko Turkovic; Ivan Udovicic
Original assignee: Marko Duvnjak; Zeljko Grabarevic; Boris Mildner; Stjepan Mise; Marijan Petek; Ivo Rotkvic; Sven Seiwerth; Predrag Sikiric; Ernest Suchanek; Branko Turkovic; Ivan Udovicic
Priority date: 1992-05-30
Filing date: 1993-05-28
Publication date: 2005-05-30
Also published as: NO940299L; GR3024379T3; DK0572688T3; FI120454B; CA2114313A1; CZ284972B6; AU4319693A; EP0572688A1; DE69312232T2; GR3024905T3; ES2103854T3; ES2107033T3; RU2111214C1; PL302304A1; HU9400252D0; RO112506B1; CA2114313C; UA32523C2; CZ20594A3; NO940299D0

Abstract

A találmány tárgyát új (I) általános képletű peptidek, H-Xaa Zaa ProPro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa-OH (I) 1 5 1015 képezik, amely képletben Xaa neutrális alifás aminosavmaradékotjelent, amilyen az Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle vagy Nva, aholegy vagy több Xaa csoport hiányozhat; Yaa bázikus aminosavmaradékotjelent, amilyen a Lys, Arg, Orn vagy His, és Zaa savasaminosavmaradékot jelent, amilyen a Glu, Asp, Aad vagy Apm, ahol egyvagy mindkét Zaa csoport hiányozhat, és ahol a 12-helyzetű Ala és/vagya 10–15., illetve 11–15. aminosavszekvenciák hiányozhatnak, és/vagy az(I) általános képletnek megfelelő mindenkori N- és C-terminálisaminosavak amidkötéssel kapcsolódhatnak egymással, vagy a C-terminálisaminosav amid formában is állhat. Ugyancsak a találmány tárgyátképezik a fenti peptideket tartalmazó gyógyászati készítmények,valamint a fenti peptidek és gyógyászati készítmények előállítása is.

Description

A találmány új, (I) általános képletű szekvenciát tartalmazó peptidekre, ezeket tartalmazó gyógyszerkészítményekre és előállításukra vonatkozik, mely peptidek ugyanolyan típusú, nagyfokú biológiai aktivitással rendelkeznek, mint az ismert természetes eredetű BPC 5 vegyület, azzal a különbséggel, hogy az új peptidek aminosavlánca rövidebb.

Biológiailag aktív, szervvédő aktivitással rendelkező proteint - melyet emberből vagy állatból izoláltak és BPC-nek (Body Protecting Compound) neveztek el - 10 írtak le az EP 0 432 400 számú európai szabadalmi leírásban. Ezt publikálták még: P. Sikiric és munkatársai,

Exp. Clin. Gastroenterol., 1, 15-26, 1991. Ennek a proteinnek a molekulatömege 40 000±5000 Dalton, szerkezete csak részlegesen meghatározott. A vegyület 15 nagyon széles spektrumú biológiai aktivitással rendelkezik, úgymint: fekélyprotektív, hepatoprotektív, vírusellenes, ödémacsökkentő, általános gyulladásgátló, rosszindulatú daganat elleni aktivitással stb. A vegyület felhasználható az említett betegségek kezelésében, to- 20 vábbá az idegrendszer betegségeinek és rendellenességeinek kezelésében, a dopaminerg kóroktani rendellenességek kezelésében, a sebészetben, a sztomatológiában, a fertilitás kezelésében és az állatgyógyászatban. Az aktivitás ezen széles spektruma valószínű- 25 lég a meghatározatlan szerkezet, vagy még inkább, az izolált BPC vegyület elégtelen tisztaságának, illetve homogenitásának a következménye.

900-1600 Dalton molekulatömegű, 8-15 aminosavból álló szintetikus peptidekről állapítottuk meg, hogy ezek a természetes eredetű „testvédő” BPC vegyületnek megfelelő biológiai aktivitással, de nagyobb szelektivitással rendelkeznek. Új peptidjeink gazdaságosabban állíthatók elő, és kevésbé vannak kitéve mellékreakciók hatásainak, mivel a BPC vegyületnél kevesebb aminosavgyököt tartalmaznak.

A találmány egyik vonatkozásának megfelelően tehát szintetikus peptidek csoportját bocsátjuk közre, mely peptidek meglepően nagyfokú biológiai aktivitással rendelkeznek, különösen a „testvédelmet” illetően. Ezen pontosan meghatározott szerkezettel rendelkező szintetikus vegyületek mindenképpen nagy előnnyel rendelkeznek a csak részlegesen meghatározott, nagy molekulatömegű BPC proteinnel szemben, amely bonyolult eljárással nyerhető bizonytalan természetes forrásból.

Részletesebben, a találmány nagyfokú biológiai aktivitással rendelkező, 8-15 aminosavgyökből álló peptidek egy új csoportjára vonatkozik. Ezen szekvenciák az (I) általános képletnek felelnek meg, melyben a hárombetűs aminosavkódokat használtuk, s az aminosavgyökök alatti számok a gyöknek a peptidláncon belüli elhelyezkedésére utalnak.

H-Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Alá Asp Zaa Alá Xaa Xaa Xaa 15 10 15 (I)

Az Xaa, Yaa és Zaa szubsztituenseket az I. táblázatban mutatjuk be.

I. táblázat

Gyök	Szubsztituens
Xaa	neutrális alifás aminosav: Alá, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva
Yaa	bázikus aminosav: Lys, Arg, Orn, His
Zaa	savas aminosav: Glu, Asp, Aad, Apm

Az előnyben részesített peptidek a következők:

1. szekvencia:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Asp Alá Leu Gly Val 15 10 15

2. szekvencia:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Asp Alá Gly Leu Val 15 10 15

3. szekvencia:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp Asp Alá Leu Gly Val 15 10 15

HU 224 073 Β1

A fenti szekvenciában egy vagy mindkét Zaa csoport hiányozhat, és ahol a 12-helyzetű Ala és/vagy a 10-15., illetve 11-15. aminosavszekvenciák hiányozhatnak, és/vagy az (I) általános képletnek megfelelő mindenkori N- és C-terminális aminosavak amidkötéssel kapcsolódhatnak egymással, vagy a C-terminális aminosav amid formában is állhat.

A találmány egy másik vonatkozásának megfelelően a C-terminálison amid- vagy karboxiterminált ana4. szekvencia

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala 1 5

5. szekvencia

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala 1 5

6. szekvencia

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala 1 5 8

7. szekvencia

Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Ala Asp 15 9

8. szekvencia

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp 15 9 lóg peptidszekvenciákat bocsátunk közre, melyek a fentebb megadott szerkezeti képletekkel rendelkeznek, s melyekben az 1-15-ig terjedő régióban minimum egy, maximum hét aminosavgyök hiányzik, és a megmaradó aminosavgyökök közül legalább egy az I. táblázatban leírtaknak megfelelően szubsztituált.

Az előnyben részesített peptidszekvenciák a követ-

	kezők:
10
Asp	Ala Leu	Gly	Val
10			14
Asp	Ala Gly	Leu	Val
10			14

11. szekvencia

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asn 15 9

A találmány egy további vonatkozásának megfelelően a fentebb megadott szerkezeti képletekkel leírható peptideket - melyekben legalább egy aminosavgyök hiányzik, és a megmaradó aminosavgyökök közül legalább egy az I. táblázatnak megfelelően szubsztituált ciklikussá alakítjuk, mégpedig úgy, hogy a molekula első és utolsó aminosavgyöke között új =CO-NH- kötést hozunk létre.

Az előnyben részesített peptidszekvenciák a követ40 kezők:

9. szekvencia

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val 25 10 13

10. szekvencia

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp 2 5 9

Azt találtuk, hogy a fentiekben leírt peptidek alkal- 55 mazásukkor hasonló vagy nagyobb biológiai aktivitást mutattak, mint az eredeti BPC protein.

A leírt peptidek farmakológiai vizsgálatát különböző, általános mintákon in vitro és in vivő végeztük, és a következő farmakológiai tulajdonságokat találtuk. 60

Fogságstressz által indukált gyomorfekély Albínó Wistar-patkányokat (hímek, 180-200 g) használtunk a kísérletekhez. Az állatokat szobahőmérsékleten 48 órára hanyatt fekvő helyzetben rögzítettük. A 48 óra letelte után azonnal leöltük őket, és mértük a károsodást. A 4., 6. és 2. számú szekvenciával leírt

HU 224 073 Β1 peptideket a károsító eljárás előtt egy órával, intraparenterálisan vagy intragasztrikusan, 10 pg vagy 10 ng/testtömegkilogramm dózisban alkalmaztuk. Mind az intragasztrikus, mind az intraparenterális alkalmazás esetében a mégoly alacsony 10 ng/testtömegkilogramm dózis is erős védőhatást nyújtott.

Fekélyciszteamin modellje

A kísérletekhez albínó Wistar-patkányokat (nőstények, 180-200 g) használtunk. Desztillált vízben oldott ciszteamin-hidrokloridot 400 mg/testtömegkilogramm dózisban, szubkután alkalmaztunk. 24 órával később az állatokat leöltük. A 4. számú szekvenciával leírt peptidet 1,0 pg, 100 ng és 50 ng/testtömegkilogramm dózisban, intraparenterálisan és intragasztrikusan alkalmaztuk. Erős és dózisfüggő védőhatást tapasztaltunk. Mind az intraparenterális, mind az intragasztrikus alkalmazást illetően hasonló aktivitás mutatkozott.

Terpentin indukálta szájödéma

Wistar hím patkányokat (180-240 g testtömeg) használtunk, csoportonként 10 darabot. Patkányonként 0,02 ml terpentint alkalmaztunk intramukózásan. Kontrollként két patkányt 0,9%-os sóoldattal kezeltünk (0,02 ml/patkány). A 2. és 4. számú szekvenciával leírt peptideket a terpentin hozzáadása előtt egy órával 10 pg és 10 ng/kg dózisban, intraparenterálisan és intragasztrikusan alkalmaztuk. A szájödémát az ödémaindukció után egy órával mértük fel. A statisztikai analízist Mann-Whitney-teszttel végeztük. A vizsgált peptidek 10 pg/testtömegkilogramm dózisban voltak hatásosak.

Sebészet: a peptidek bőrsebekre gyakorolt hatása

A kísérletekhez hím albínó patkányokat (200-250 g testtömeg) használtunk, minden kísérlethez 10 darabot. A bőrsebzett patkányokat egymástól elkülönítve, ketrecekben tartottuk. Valamennyi állaton - éteres altatás közben - a háti bőrön, a középvonaltól 1,5 cm-re mindkét oldalon párhuzamos vágást ejtettünk a bőr teljes vastagságában. Az egyik sebet ezután két sebészeti kapoccsal összeillesztettük, míg a másikat érintetlenül hagytuk. A sebzést követően a sóoldatban feloldott, 4. számú szekvenciával leírt peptidet 1,0 pg és 1,0 ng/testtömegkilogramm dózisban, illetve a sóoldatot (kontrollként) 0,5 ml/testtömegkilogramm arányban intradermálisan a sebek vonala közé juttattuk.

A vizsgált peptidnek mind a sebészeti kapcsokkal kezelt, mind a kezeletlen sebek esetében nyilvánvaló volt a gyógyító hatása. Öt nap elteltével a kontrolihoz képest a kezelt állatok esetében kevesebb gyulladt sejt és a retikulinszálak nagyobb mérvű kialakulása volt tapasztalható.

A peptidek kísérleti égésekre gyakorolt hatása

Hím albínó Wistar-patkányokat (200-250 g testtömeg) használtunk, kísérletenként 10 darabot. Éteres altatás közben a nazális mukózát izzó égővel öt másodperces égetésnek vetettük alá. A 4. számú szekvenciával leírt peptidet a sebzés előtt egy órával 10 pg/testtömegkilogramm dózisban, intraparenterálisan alkalmaztuk. Kontrollként intraparenterálisan 5,0 ml/testtömegkilogramm arányban sóoldatot használtunk. Ezen kísérlet rendszerint jelentős orrduzzadást okozott, mely a kontrollállatok számára általában végzetes volt (a kezelt állatok számára azonban nem!) a sebzést követő kilenc napon belül. A kontrollállatokkal ellentétben, a kezelt állatok esetében csak nagyon mérsékelt orrduzzadást tapasztaltunk. A normális orron át légzés kevéssé károsult, és a túlélés zavartalan volt.

A peptidek törésgyógyulásra gyakorolt hatása

A kísérletekhez hím albínó Wistar-patkányokat (270-300 g testtömeg) használtunk. Éteres altatás közben a bal oldali tibiákat a csont középső részén kézzel eltörtük. Rögzítést nem alkalmaztunk, és az állatokat hagytuk szabadon mozogni a ketrecükben. Az állatokat a beavatkozást követő 5., 8., 12. és 30. napon öltük le.

A 4. szekvenciával leírt peptidet 10,0 pg/testtömegkilogramm dózisban, a törés előtt egy órával, illetve ezt követően naponta egyszer (utoljára a leölés előtt 24 órával) intraparenterálisan alkalmaztuk. A tesztcsoport egyidejűleg azonos mennyiségű sóoldatot kapott (0,9%, 5,0 ml/testtömegkilogramm) intraparenterálisan. Valamennyi peptiddel kezelt állat esetében, minden egyes vizsgálati intervallumot illetően jelentős gyógyulás mutatkozott. Figyelemre méltó, hogy valamennyi kezelt állat egyöntetűen mérsékeltebb helyi poszttraumatikus haematomát mutatott, mint a kontroll, és a sérülésük egészen hamar rendbe jött.

Vírusellenes aktivitás

A vírusellenes aktivitást BALB-C törzsből származó, 24 órás újszülött egereken (mindkét nem) vizsgáltuk.

Az alkalmazott vírusok: ARBO-vírusok közül: TBE (Tick Born Encephalitis=kullancsencephalitis), Bhania, Dengue 1,2, 3, 4, Sinbis, West-Nile, Calovo, Hepatitis A, LCM (limfatikus choriomeningitis); illetve Herpes I vírusok. A vírusokat százszoros hígításban, általánosan elfogadott módon készített szuszpenzióként alkalmaztuk (0,02 ml/egér dózisban, intrakután vagy perorálisan [Hepatitis A] adagolva). Mivel a vírusok virulenciája különböző, a dózisokat úgy állítottuk be, hogy az LD₁₀₀-ra (100%-os letális dózis) vonatkozóan összehasonlíthatók legyenek a 0,02 ml-nyi, százszoros hígítású intrakután (vagy perorális, Hepatitis A) oltóanyagban. Ilyenformán össze tudtuk hasonlítani a különböző vírusinfekciók lefolyását, függetlenül attól, hogy különböző víruskoncentrációjú oltóanyagokat használtunk.

A 4. számú szekvenciával leírt peptidet 0,9%-os sóoldatban 20 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk, és csak egy alkalommal, 2,0 pg/testtömegkilogramm dózisban, intrakután vagy intraparenterálisan adagoltuk:

a) a vírusinfekciót megelőzően két órával (—2h)

b) az infekcióval egy időben (0)

Kontrollként azonos mennyiségű sóoldatot adagoltunk intrakután vagy intraparenterálisan. Az eredményeket a II. táblázatban foglaltuk össze. A táblázatban szereplő számok azt az időt jelentik (napokban), amely alatt a peptiddel vagy sóoldattal (kontroll) kezelt csoportba tartozó, vírusfertőzött egerek mindegyike elpusztult.

HU 224 073 Β1 //. táblázat

Kezelés
Vírusinfekció	Sóoldat	4. szintetikus peptid
-2h^x	o*	-2h^x	Ο*
ip·	ic.	iP·	ic.	ip·	ic.	iP·	ic.
TBE	a	5	5	5	5	n. m.	n. m.	20	20
Bhania	a	5	5	5	5	n. m.	n. m.	20	20
Dengue 1	a	5	5	5	5	n. m.	n. m.	20	20
Dengue 2	a	5	5	5	5	n. m.	n. m.	20	20
Dengue 3	a	5	5	5	5	n. m.	n. m.	20	20
Dengue 4	a	5	5	5	5	n. m.	n. m.	20	20
Sinbis	a	5	5	5	5	n. m.	n. m.	20	20
West-Nile	a	5	5	5	5	n. m.	n. m.	20	20
Calovo	a	5	5	5	5	n. m.	n. m.	15	15
Hepatitis A⁺		5	5	5	5	n. m.	n. m.	20	20
LCM		5	5	5	5	n. m.	n. m.	20	20
Herpes I		5	5	5	5	n. m.	n. m.	20	20
Kontroll		n. m.	n. m.	n. m.	n. m.	n. m.	n. m.	n. m.	n. m.

n. m. - nem meghatározott: az állatokat a vírusinfekció után 40 napig tartottuk megfigyelés alatt. Ezen az időn belül nem pusztultak el a - ARBO-vírusok + - a vírusokat perorálisan juttattuk az állatokba x - az állatokat két órával a vírusinfekció előtt (2h), illetve az infekcióval egy időben (0) kezeltük ip. - intraparenterális ic. - intrakután °vs. sóoldat P<0,001; minden csoportban 8 db egér.

Antidepressziós aktivitás

Az antidepressziós aktivitás vizsgálatát az „erőltetett úszásteszttel” végeztük (Porsolt és munkatársai,

Eur. J. Pharmacol., 47, 379-391, 1978, szerint).

A kísérlethez hím Wistar-patkányokat (180-240 g 40 testtömeg) használtunk. A 4. szekvenciával leírt peptidet a kísérlet előtt egy nappal, illetve másnap, a kísérlet előtt egy órával, intraparenterálisan adagoltuk. A kontrollcsoportot intraparenterálisan sóoldattai kezeltük.

Az állatokat öt percen át vizsgáltuk, s mértük az ér- 45 zéketlenség időtartamát (T,). A T, a kontrollcsoportban 150 másodperc volt, míg a peptiddel kezelt csoportban csak 60-70 másodperc. Ez a hatás hosszú időtartamú:

nap múltán még tapasztalható volt.

Dózishatás: 10 pg-10 ng/kg: teljes hatás 50 pg/kg: a hatás még tapasztalható pg/kg: a hatás megszűnik

A Parkinson-kór modelljére gyakorolt hatás

A vizsgálathoz a Parkinson-kór jól ismert modelljeit használtuk (Karakola, S. és munkatársai, Pharmacol. 55 Toxicol., 67, 95-100, 1990): a rezerpin és az MPTP modellt.

Az MPTP modellhez NMRI-Hannover hím patkányokat, míg a rezerpin modellhez mindkét nembéli patkányokat használtunk. 60

Az MPTP-t hat egymást követő napon naponta egyszer, mg/testtömegkilogramm dózisban, intraparenterálisan alkalmaztuk, majd további négy napon keresztül 50 mg/testtömegkiiogramm dózisban. A vizsgált peptidet (4. számú szekvencia) 1,5 pg és 15,0 pg/testtömegkilogramm dózisban, intraparenterálisan, minden egyes MPTP-adagolást követően vagy megelőzően 15 perccel alkalmaztuk.

A rezerpint intraparenterálisan 5 mg/testtömegkilogramm dózisban alkalmaztuk. A vizsgált peptidet intraparenterálisan 10 pg vagy 10 ng/testtömegkilogramm dózisban, 15 perccel a rezerpines kezelés előtt (vagy azt követően 24 órával, ugyanolyan dózisban) alkalmaztuk.

Kontrollként azonos mennyiségű sóoldatot használtunk 5 ml/testtömegkilogramm dózisban, intraparenterálisan.

A peptiddel történt előzetes kezelés után a hípokinéziát, a merevséget (katalepszia) és a remegést (tremor) illetően jelentős csökkenést tapasztaltunk.

Az MPTP modell esetében a peptiddel történt előkezelés megszüntette a katalepszia kialakulását, és csökkentette az akinézia és a tremor megjelenését.

A 15 perc elteltével végzett utókezelés erősen gátolta az MPTP katalepszia további kifejlődését, és határozottan csökkentette az akinéziát és a tremort. Az egy5

HU 224 073 Β1 szeri MPTP-kezelés után feljegyzett magas (50%-os) mortalitás mind a peptiddel előkezelt, mind a peptiddel utókezelt állatok esetében csökkent.

A peptidkezelés hatása vérzéses sokk esetén

Valamennyi kísérlethez felnőtt, nőstény albínó Wistar-patkányokat használtunk (150-180 g testtömeg). A vérzéses sokkra gyakorolt hatást két kísérleti sorozatban vizsgáltuk.

a) Az állatoktól vért vettünk -1 ml-t 3 percen keresztül, majd a fennmaradó mennyiséget két perc alatt, egészen a halál beálltáig. A 4. számú szekvenciával leírt peptiddel (10,0 pg v. 10 ng/testtömegkilogramm dózisban, intraparenterálisan), illetve sóoldattal (5,0 ml/testtömegkilogramm dózisban, intraparenterálisan) a vérvétel előtt 15 perccel kezelt állatok esetében meghatároztuk a halálos kimenetelű vérveszteséget. A peptiddel nagyobb dózisban kezelt állatok esetében ez az érték a kontrolihoz képest jelentősen magasabb volt.

b) A vérnyomást kontrollált vérvétellel csökkentettük, s ilyenformán 5 percen át 30-35 Hgmm értéken tartottuk. Ezután intravénásán alkalmaztuk a 4. szekvenciával leírt peptidet (10,0 pg v. 10,0 ng/testtömegkilogramm) vagy sóoldatot (kontroll, 3,0 ml/testtömegkilogramm). A kontrollal ellentétben, a peptiddel kezelt állatok esetében emelkedő vagy szinten maradó vérnyomást és az elhullás teljes megszűnését tapasztaltuk.

Fentiek értelmében, a vizsgált peptid igen hatásosnak bizonyult a vérveszteség következményeinek elhárításában.

A letális sugárzás hatásának befolyásolása

18-22 grammos, 5-6 hetes, hím és nőstény NMRI-Hannover egereket használtunk a kísérletekhez. A 4. számú szekvenciával leírt szintetikus peptidet a besugárzás előtt vagy után egy órával 20 pg/testtömegkilogramm dózisban, intraparenterálisan alkalmaztuk. A kontrollállatokat ezzel egy időben azonos mennyiségű, 0,9%-os sóoldattal (5,0 ml/kg) kezeltük. Általános körülmények között tartott egészséges állatok - melyeket nem sugároztunk be, és nem kezeltünk gyógyszerekkel - szolgáltak egészséges kontrollként.

Besugárzás: Teatron 80 (Co 60, 2200 Ci). Az elaltatlan egereket ketrecekben, 16-os csoportokban, teljes testfelületen sugároztuk be, 9 Gy supraletális dózissal. A besugárzott terület 20*20 cm, a besugárzási távolság 80 cm volt.

Az elhullást 30 napon keresztül naponta kétszer regisztráltuk. Valamennyi kontrollállat 7-12 napon belül elpusztult (LD_100/12). Az egészséges, besugárzás nélküli kontrollállatok esetében elhullást nem tapasztaltunk.

A peptiddel a besugárzást követően egy óra elteltével kezelt állatok esetében a kontrolladatokhoz viszonyítva nem mutatkozott különbség, míg a besugárzás előtt egy órával kezelt állatok esetében jelentős túlélést tapasztaltunk. Az LD₁₀₀ értékében - a kontrolihoz képest - 70%-os növekedést jegyezhettünk fel.

Az indukált testi hiba befolyásolása

A kísérletekhez két hónapos, 25 grammos NMRIHannover nőstény egereket használtunk, melyek korábban még nem párosodtak. A nőstény egereket a párzási időszakukban kipróbált, egészséges hím egerekkel egy éjszakán keresztül pároztattuk. A vemhesség 20. napján az egereket leöltük.

A vemhesség 10. napján intramuszkulárisan 15 700 U/testtömegkilogramm A-vitamint adagoltunk (0,05 ml/testtömegkilogramm). Ezzel egy időben intraparenterálisan adagoltuk a 4. számú szekvenciával leírt peptid 10 pg v. 10 ng/testtömeg-kilogrammos dózisát. Kontrollként intraparenterálisan sóoldatot alkalmaztunk (5,0 ml/testtömegkilogramm).

Az A-vitaminnal nem kezelt állatok - melyek a fentiekkel azonos időben és dózisban kapták a sóoldatot vagy a 4. számú peptidet - képezték az egészséges kontrollcsoportot. Ezek esetében testi fogyatékosságot nem tapasztaltunk.

Az eredményeket a III. táblázatban összegeztük. Látható a vizsgált peptid meglepően jelentős és dózisfüggő, az A-vitamin indukálta testi hiba elleni védőhatása.

III. táblázat

Makroszkopikus vizsgálat

Kezelés	A magzatok teljes száma	Testi hibás magzatok száma
Kontrollcsoport (sóoldat)	55	0
A-vitamin	54	36
A-vitamin+4. peptid 10 ng/kg	36	13
A-vitamin+4. peptid 10 gg/kg	18	1

Akut mérgezés

A szintetikus peptidek akut mérgező hatását nőstény egereken határoztuk meg (kb. 20 g testtömeg). Valamennyi kísérlethez és kontrollként hat állatból álló csoportokat használtunk.

A 2., 3., 4. és 6. szekvenciákkal leírt peptideket intravénásán, 8, 25 és 50 mg/kg dózisban alkalmaztuk. A kontrollcsoportot sóoldattal (0,9%, 5,0 ml/testtömegkilogramm) kezeltük. A következő 15 nap során a mérgezés tüneteinek megjelenését figyeltük az állatokon.

Az alkalmazott dózisok esetében sem mérgezési tüneteket, sem elhullást nem tapasztaltunk. Érdekes jelenségként az találtuk, hogy a peptides kezelést követő kétórás időtartamban az állatok mozgékonyabbak és elevenebbek lettek.

A gyógyszertani vizsgálatok alapján megállapíthatjuk, hogy ezen peptidek stressz és betegségek ellen védik a szervezetet, és általánosan normalizálják a szervek működését.

Felhasználásuk hasznos lehet jó néhány emberi vagy állati betegség és rendellenesség kezelésében. Részletesebben, ezen vegyületek a következő rendellenességek kezelésére használhatók:

- stressz indukálta rendellenességek vagy betegségek

- különböző kóroktani gyomorfekélyek

- különböző kóroktani gyulladások és ödémák

- traumák, égések, törések (a sebészet általában)

- vírusfertőzések

HU 224 073 Β1

- sokk

- Parkinson-kór

- sugárzás hatásának kivédése

- testi fogyatékosságok elkerülése

Általánosságban elmondható, hogy a leírt peptidek nemtoxikus gyógyszerhordozókkal, töltőanyagokkal, pufferekkel vagy fiziológiás sóoldattal kombinálva sokféle gyógyszerkészítményben alkalmazhatók. Az ilyen gyógyszerkészímények alkalmazhatóak alkalomszerűen vagy rendszeresen, s készülhetnek bármilyen alkalmas formában, úgymint folyadék, szilárd, félszilárd, injektálható oldat, tabletta, kenőcs, borogatóvíz, kapszula vagy hasonlók.

Rendszeres alkalmazás esetén ezeket a peptideket általában 10^_5-10^-2 mg/testtömegkilogramm dózisban kell adagolni, míg alkalomszerű használat esetén magasabb, például 0,1-0,5%-os koncentrációban.

mg/testtömegkilogramm dózisig a mérgezési tünetek teljes hiánya biztosított, és a vegyületek perorális (intragasztrikus) alkalmazás esetén is kedvező aktivitást mutatnak.

A találmányban leírt peptidek szintetizálhatok a védőcsoporttal ellátott aminosavak homogén folyadék rendszerű „step by step” kondenzációjával, vagy előnyösebben szilárd fázisú eljárással. A ciklikus peptidek előállításához megfelelő hosszúságú, részleges védett - például alkil-észter-csoporttal a C-terminálison - lineáris peptideket használunk, melyeket aziddá alakítunk, majd párosítunk, s végül eltávolítjuk a védőcsoportokat. Más módon részlegesen védett, szabad terminális csoportokkal rendelkező lineáris peptideket is ciklikussá tehetünk, mégpedig difenil-foszforil-aziddal, nagyon híg oldatban.

Az (I) általános képletű peptidek előállítására irányuló eljárás általános jellemzői a következők.

Az (I) általános képletű peptidek kémiailag nagyon hasonlók, és ugyanazzal a kémiai eljárással előállíthatok, azzal a különbséggel, hogy az egyedi szekvenciának megfelelő aminosavmaradék-sorrendet alkalmazzuk. Az alábbiakban a következő rövidítéseket használjuk:

bAla = béta-alanin

Aad = 2-amino-adipinsav

Apm = 2-amino-pimelinsav

PAM = amino-acil-4-(oxi-metil)-fenil-ecetsav amino-polisztirol-hordozón

DMF = dimetil-formamid

1. példa

Peptidszintézis BOC módszerrel

PROTOKOLL szilárd fázisú szintézishez, a Merrifield módszert és BOC stratégiát követve:

Kiindulási anyagként 0,1 g 0,56 mekv./g BOC-Val-t tartalmazó BOC-Val-PAM-ot alkalmazunk (a BOC-Val mennyisége tehát 0,056 mekv).

A BOC védőcsoportok eltávolítására 12 ml 1:1 trifluor-ecetsav/diklór-metán eleggyel történő kezelést végzünk.

Mosás: 6*12 ml diklór-metán 4*12 ml DMF.

Protonmentesítés: in situ, 0,25 mekv. diizopropiletil-amin 12 ml DMF-fel elkészített oldata hozzáadásával.

Kapcsolás: 0,224 mekv. BOC-aminosavat 1H-hidroxi-benzotriazol 0,5 mól/liter töménységű, DMF-fel készített oldatából 8 ml-ben oldunk, amely oldatot 0,224 mekv. diizopropil-karbodiimiddel 20 percen át előaktiváltunk.

A kapcsolás időtartama 1 óra, 20 °C-on.

Mosás: 4*12 ml DMF.

Kapcsolás: 10 ml 10%-os ecetsavanhidrid diklór-metánban 20 percen át.

Mosás: 4*12 ml diklór-metán (1-1 percen át).

Ezt a ciklust követően ugyanezeket a műveleteket ismételjük meg a következő aminosavval (I. az 1. ábrát).

A konverzió az egyes lépésekben 99,5%-nál magasabb.

A szintézis befejezése után a hasítást a HF-es eljárással végezzük (folyékony HF 0 °C-on 2 órán át, gyökfogóként 10% anizol hozzáadása). A HF-et nitrogénáramban távolítjuk el. A kapott olajos maradékot éterbe öntjük; így a nyers peptidet kapjuk, amelyet a jelen példában később leírt HPLC eljárással tisztítunk.

Ezzel a módszerrel állítottuk elő az 1. és a 11. szekvenciájú peptidet is, amelyeket UV- és IR-spektrumot bemutató ábrákkal jellemzünk.

A ciklikus peptidszintézis részletes leírása

A peptideket, részlegesen védett alakban, az

1. vagy 2. példa szerint állítjuk elő. Ezeknek a peptideknek DMF-fel elkészített 0,0005 M oldatát 1/1 mólarányban difenil-foszforil-aziddal és trietil-aminnai elegyítjük 20 °C-on, és 12 órán át keverjük. Az oldószer desztillálása után a nyers maradékot trifluor-ecetsavban oldjuk, és az oldatot éterbe öntjük; így a nyers ciklikus peptidet kapjuk.

Ezt a peptidet azután a leírt módszer szerint (1. példa) HPLC kromatográfiával tisztítjuk.

Vizsgálataink szerint az egyező aminosavszekvenciával rendelkező aciklusos és a ciklikus vegyületek biológiai aktivitása gyakorlatilag azonos, de a gyűrűs vegyületek oldatban sokkal kedvezőbb stabilitást mutatnak.

Az (I) általános képletű vegyületek biológiai aktivitásának hasonlósága az Xaa (semleges aminosavmaradék), Yaa és Zaa helyettesítők minőségével függ össze. Ezeket ugyanis úgy választjuk meg, hogy ne változtassák meg a vegyület pKa-értékét. A vegyületek hidrofobicitásának kismértékű változtatása nem befolyásolja jelentősen az aktivitás szintjét.

A teljes szintézis után a hasítást alacsony koncentrációjú HF-es módszerrel végeztük (0 °C, 2 óra). Karbóniumion-mentesítő anyagként anizolt használtunk. A HF-et nitrogénáram alatt elpárologtattuk. Az olajszerű maradékot vízmentes éterbe öntve nyers peptidet kaptunk. A nyers peptidet reverz fázisú HPLC-vel, RP-18 szilikagéllel töltött 5*150 mm-es oszlopon oldószeres gradienselúcióval (víz/acetonitril elegyben 0,1 %-os TFA) tisztítottuk. A detektálást 225 nm-en ultraibolya-abszorpcióval végeztük.

A 4. számú szekvenciával leírt peptid szintézisét az

1. ábrán mutatjuk be.

HU 224 073 Β1

2. példa

Peptidszintézis Fmoc módszerrel

A szintézishez standard Fmoc-csoporttal védett aminosavakat használtunk (Fmoc=9-fluorenil-metiloxi-karbonil). Az oldalláncokat O-terc-butil-észterekként 5 (Asp, Apm, Glu, Aad) és Boc-származékokként (Lys) védtük. Az első aminosavat (Val) polimer hordozó BHA-gyantához (BHA=benzo-hidril-amino-gyanta) kapcsoltuk, kapcsolóreagensként diizopropil-karbodiimiddel. Minden lépésben az Fmoc-védőcsoportot piperi- 10 dinnel eltávolítottuk. A második és valamennyi következő aminosavat hasonló módon kötöttük meg. A szintézis befejezése után a hasítást TFA/TFMSA/anizol 2:17:52 térfogatarányú elegyével végeztük.

A peptidet ezután az 1. példában leírt HPLC mód- 15 szerrel tisztítottuk.

A 2. számú szekvenciával leírt peptid szintézisét a

2. ábrán mutatjuk be.

3. példa 20

Peptidszintézis Ddz módszerrel

Az aminosavakat az α-amino funkciós csoportjukon Ddz-csoporttal (a,a-dimetil-3,5-dimetoxi-benzil-oxikarbonil) védtük. Az oldallánci funkciós csoportokat a lizin esetében Z-csoporttal (benzil-oxi-karbonil), míg az 25 aszparaginsav és a glutaminsav esetében O-terc-butil-csoporttal védtük.

1,4 mmol/g kapacitású Merrifield-féle hordozót (keresztkötéses, klórmetilezett polísztiréngél) használtunk az első Ddz-aminosav céziumsóként történő megkötéséhez. A diciklohexil-karbodiimiddel (DCC) végzett kondenzációt követően a Ddz-csoportot minden egyes lépésben eltávolítottuk (TFA 5%-os diklór-metános oldatával), miután mosást és deprotonálást végeztünk (trietil-amin 10%-os diklór-metános oldatával). A deprotonálás után hasonló módon következett az újabb kapcsolási lépés. Ezeket a lépéseket addig ismételtük, míg a peptid szekvenciája teljessé nem vált.

Végül a peptidet HBr/TFA/anizol eleggyel lehasítottuk a polimer hordozóról. Az illékony részek eltávolítása után a frissen hasított peptidet vízmentes éterrel kicsaptuk és megszárítottuk. A nyers peptidet ezután az

1. példában leírt HPLC módszerrel tisztítottuk. A 6. számú szekvenciával leírt peptid szintézisét a 3. ábrán mutatjuk be.

4. példa

Ciklikus peptid szintézise

Az 1. és 2. példában leírt módon előzetesen elkészítettük a peptid részlegesen védett formáját:

OBzl NO₂ OBzl

I I I

Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Arg-Pro-Ala-Asp-OH

Ezen peptid 0,0005 mólos dimetil-formamidos oldatát difenil-foszforil-azid és trietil-amin hozzáadása után 20 °C-on 12 órán keresztül ciklizáltuk.

Ezt követően az elegyet hidrogén/palládium aktív 35 szenes katalizátorral 25 °C-on 8 órán keresztül hidrogéneztük. Az oldószert óvatosan elpárologtattuk, majd a nyersterméket az 1. példában leírt HPLC módszerrel tisztítottuk.

A 10. szekvenciával leírt ciklikus peptidet 10%-os kitermeléssel nyertük:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Alá Asp 15 10

5. példa

Lineáris és ciklikus peptidek szintézise Ddz módszerrel 45

A lineáris és ciklikus peptideket Ddz-védőcsoportok felhasználásával állítottuk elő. Az oldallánci funkciós csoportokat a lizin esetében Z-csoporttal, a glutaminsav és az aszparaginsav esetében O-benzil-észter(OBzI) csoportokkal védtük. 50

Polimer hordozóként HYCRAM^R (az ORPEGEN, Heidelberg, Németország védjegye) gyantát használtunk, mely 4-(bróm-krotonil)-p-alanil-amido-metil-polisztirén. Az első aminosavat (Ddz-valin) céziumsóként kapcsoltuk a polimer hordozóhoz. 55

Ezután a Ddz-csoportot trifluor-ecetsav 5%-os diklór-metános oldatával eltávolítottuk, az aminocsoportokat pedig diizopropil-etil-aminnal deprotonáltuk.

A következő lépésben a polimeres közegben, diizopropil-karbodiimid (DIPC) felhasználásával, 1-hid- 60 roxi-benzotriazol jelenlétében Ddz-glicint kapcsoltunk a valingyökre.

A fenti lépéseket addig ismételtük, míg a teljes peptidlánc el nem készült. A szintetizált peptidet védett formájában vízmentes tetrahidrofuránban oldott tetrakisz(trifenil-foszfin)-palládiummal (O), oxigén kizárásával óvatosan lehasítottuk a HYCRAM^R hordozóról. Az allilcsoportok akceptoraként adalékot, például morfolint használtunk.

Ezt követően a polimer hordozót leszűrtük, és tetrahidrofuránnal mostuk, majd a peptides oldatot rövid szilikagél oszlopon átengedve eltávolítottuk a palládiumkatalizátort.

A 4a. számú részlegesen védett peptidet tartalmazó eluátumot az oldószer vákuumban történő elpárologtatása után beszárítottuk.

A 4. számú szekvenciával leírt lineáris peptid szintézise

HU 224 073 Β1

A 4a. számú részlegesen védett pepiidet 2,2,2trifluor-etanolban feloldottuk, és aktív szenes palládiumkatalizátor (10%) jelenlétében hidrogéngázzal 30 °C-on hidrogéneztük. A katalizátort később leszűrtük, és az oldószert vákuumban elpárologtattuk. A nyers maradékot az 1. példában leírt HPLC módszerrel tisztítottuk. A tisztítás után a 4. számú peptidet nyertük. Ezen termék azonos az 1. példában előállított vegyülettel.

A 9. számú szekvenciával leírt ciklikus peptid szintézise

A 4a. számú részlegesen védett peptidet 0,001 mólos koncentrációban dimetil-formamid/diklór-metán 1:1 arányú elegyében oldottuk fel. A ciklizálás érdekében DIPC és HOBt hozzáadása után a reakcióelegyet 20 °C-on 10 óra hosszat állni hagytuk. Ezután az oldatot kis térfogatra koncentráltuk, 2,2,2-trifluor-etanollal hígítottuk, majd Sephadex LH-20 gyantával töltött oszlopon átengedve tisztítottuk. A részlegesen védett 9a. számú ciklikus peptidet tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és aktív szenes palládiumkatalizátor (10%) jelenlétében, hidrogén átbuborékoltatásával, inbAla Apm Pro Pro Pro Nle

A 3. példában leírt eljárást követjük a peptid előállítására. A nyers peptidet a polimer hordozóról való lehasítás után HPLC módszerrel tisztítjuk; ennek során (szilanizált) RP-18 szilikagéllel töltött HPLC oszlopot használunk és gradienselúciót végzünk (0,1% vizes trifluor-ecetsav-oldat - 0,1%-os 35:65 acetonitriLvíz eleggyel készített trifluor-ecetsav-oldat eluálószerrel). A futtatás időtartama 25 perc. Kimutatás 214 nm-en a tenzív rázás közben 30 °C-on 8 órán keresztül hidrogéneztük.

Ez követően a katalizátort szűréssel eltávolítottuk, és az oldószer vákuumban történő elpárologtatósával az oldatot beszárítottuk. A nyers peptidet az 1. példában leírt HPLC módszerrel tisztítottuk. A kapott tiszta peptidet a 9. számú szekvenciával leírt pepiiddel azonosítottuk.

A HYCRAM® polimeren Ddz módszerrel végzett szintézist és ciklizálást a 4. és 5. ábrán mutatjuk be. Valamennyi szintetizált peptid tisztaságát ellenőriztük. Ezt HPLC módszerrel, oktadecilszilanizált RP-18 szilikagéllel töltött oszlopon végeztük, víz/acetonitril/trifluor-ecetsav elegyével megvalósított gradienselúcióval. A tisztaság minden esetben magasabb volt 95%-nál.

A peptideket aminosavanalízissel (az eredmények az elméleti értékek 10%-án belül voltak) és szekvenciaanalízissel jellemeztük, a molekulatömeget FAB-tömegspektrometriával, ultraibolya- és infravörös-spektrofotometriával határoztuk meg (6. és 7. ábra).

A 12. szekvenciájú peptid szintézise

A peptid szerkezete:

Pro Alá Asp Asp Ile Nva minták UV-abszorpciójával. Az oldat tisztítása után a peptidet liofilizáljuk.

A szintetizált peptidet aminosav-összetétellel, szekvenciaelemzéssel, molekulatömeggel és a 8. ábra szerinti IR- és UV-spektrummal jellemezzük.

6. példa

A 13. szekvenciájú peptid szintézise

A peptid szerkezete:

Aad Pro Pro Pro Nle His Pro Alá Asp Nva Ile

A peptidet az előző példa szerint állítjuk elő és tisztítjuk. A szintetizált peptidet aminosav-összetétellel, szekvenciaelemzéssel, molekulatömeggel és a 9. ábra 40 szerinti IR- és UV-spektrummal jellemezzük.

7. példa

Az 1., 3. és 5. szekvenciájú peptid szerkezete nagyon hasonló. Ezeket részletesen a 2. példában leírt 45 eljárással állítjuk elő, védett aminosavak hozzáadásával, a leírt aminosavszekvenciának megfelelő sorrendben. A nyers peptideket az 1. példában is leírt HPLC eljárással tisztítjuk. A peptidek UV- és IR-spektrumát a 8-10. ábrán mutatjuk be. 50

8. példa

A rövidebb és hasonló peptidláncot tartalmazó 7.,

8. és 11. szekvenciájú peptidet az 1. példában leírt eljárással állítjuk elő, BOC-védett aminosavaknak a 55 megfelelő aminosavszekvencia szerinti hozzáadásával. A nyers peptideket az 1. példában is leírt HPLC eljárással tisztítjuk.

A peptidek UV- és IR-spektrumát a 11-13. ábrán mutatjuk be. 60

9. példa

Kapszulák előállítása

A találmány szerinti szekvenciával rendelkező szintetikus peptideket tartalmazó kapszulákat a gyógyszeriparban ismert eljárással állítjuk elő, megjegyezve, hogy ezzel a módszerrel bármelyik, találmány szerinti peptid kikészíthető kapszula alakban.

A kapszulák összetételét a következőkben példaként a 2. szekvenciájú peptidre vonatkozóan adjuk meg, de helyette az 1-11. szekvenciájú peptidek közül bármelyik alkalmazható.

2. szekvenciájú peptid laktóz magnézium-sztearát	0,5 mg 99,0 mg 0,5 mg
	100,0 mg
Egy másik összetétel:
2. szekvenciájú peptid	0,3 mg
9. szekvenciájú peptid	0,3 mg
laktóz	99,0 mg
magnézium-sztearát	0,4 mg
100,0 mg

HU 224 073 Β1 mannit 10,0 mg

10. példa

Tabletták előállítása

A találmány szerinti szekvenciával rendelkező 1-11. szintetikus peptidet tartalmazó talettákat a gyógyszeriparban ismert szokásos eljárással állítjuk elő.

A tabletták összetétele: a találmány szerinti peptid	0,5 mg
laktóz	37,5 mg
keményítő	6,0 mg
talkum	3,0 mg
tragakanta	2,5 mg
magnézium-sztearát	0,5 mg
	50,0 mg
11. példa Krém előállítása
A találmány szerinti szekvenciával rendelkező 1-11. szintetikus peptidből gyógyászatilag hatékony mennyiséget tartalmazó krémet a gyógyszeriparban szokásos
eljárással állítjuk elő.
A krém összetétele: a találmány szerinti peptid	2,5 g
emulgeálószer	25,0 g
hidrogénezett arachisolaj	60,57 g
Tween 80	131,6 g
propilénglikol	30,0 g
metil-hidroxi-benzoát	0,16 g
propil-hidroxi-benzoát	0,17 g

250,0 g

12. példa

Injekciós oldat előállítása

A találmány szerinti szekvenciával rendelkező 1-11. szintetikus peptidből gyógyászatilag hatékony mennyiséget tartalmazó injekciós oldatot a gyógyszeriparban szokásos ismert eljárással állítjuk elő.

Az oldat összetétele:
a találmány szerinti peptid	0,3 mg
nátrium-karboxi-metil-cellulóz	1,5 mg
poli(vinil-pirrolidon)	5,8 mg
lecitin	2,7 mg
benzil-alkohol	0,1 mg
puffer	q. s.
kétszer desztillált víz	1,0 ml térfogatra

Az oldatot szűrjük, sterilezzük és ampullákba töltjük.

13. példa

Száraz injekciók előállítása A száraz injekciók összetétele:

2. szekvenciájú peptid 0,3 mg

9. szekvenciájú peptid 0,3 mg

10,6 mg

A vegyületeket 1 ml kétszer desztillált vízben oldjuk, sterilre szűrve az oldatot ampullákba töltjük és vákuumban liofilizáljuk.

Az egynél több peptidet tartalmazó gyógyszerkészítményekkel kapcsolatban megjegyezzük, hogy adott esetben előnyös lehet hasonló aktivitású, de különböző időtartamon keresztül ható peptidek összekeverése, mivel így egy adott hatású és hosszabb időn át aktív gyógyszerformát kapunk.

Az előállított peptidek biológiai aktivitásának meghatározása

A találmány szerinti peptideket különböző farmakológiai modellekben tanulmányoztuk, ip., iv., perorális vagy helyi beviteli módokat alkalmazva. A kiindulási vizsgálatokhoz rendszerint a sterilre szűrt oldatot vagy krémet alkalmazzuk.

Ciszteamin duodenum modellben vizsgáljuk az 5. és 6. példa szerinti 12., illetve 13. szekvenciájú peptid gyógyhatását. összehasonlítás céljából ugyanolyan dózisban a 2. szekvenciájú peptidet alkalmazzuk.

200 g tömegű nőnemű Wistar-patkányokon végezzük valamennyi vizsgálatot. A ciszteamint 400 mg/kg dózisban se. és a 12., illetve 13. szekvenciájú peptidet 10 ng/kg dózisban ip., 1 órával a ciszteamin bevitele előtt alkalmazzuk. A kontrollállatok egyidejűleg azonos térfogatú sóoldatot (5 ml/kg ip.) kapnak. A ciszteaminadagolást követően 24 óra múlva valamennyi állatot megöljük, és meghatározzuk a károsodott szakaszok számát és hosszúságát. Valamennyi kontrollállatban jelentős károsodást észlelünk. A kezelt állatokban ezzel szemben ismételten azt figyelhetjük meg, hogy a károsodott helyek száma jelentősen csökkent (12. és 13. peptid), vagy károsodás gyakorlatilag nem lép fel (2. peptid). Az eredményeket a 10. ábrán mutatjuk be.

A következőkben az előállított peptidek további kvantitatív adatait mutatjuk be.

A szekvenciaelemzést Edman peptidbontási módszerével végeztük Applied System 475A Protein Sequencerrel. Az 1-8. és a 11-13. szekvenciájú peptid aminosavszekvenciája a vártnak megfelel, míg a ciklikus 9. és 10. peptid N-terminális része nem volt ezzel a módszerrel jellemezhető.

Az aminosavelemzést az Applied Biosystem 421 aminosavelemző alkalmazásával (PTC 222-018 oszlop, 5 μ, 220*2,1 mm) végeztük.

A peptidek aminosav-összetétele a vártnak megfelel. A 11. pepiidben az Asn-t Asp-ként mutattuk ki annak következtében, hogy a minta előkészítése során az Asn hidrolízise ment végbe.

A tömegspektrumokat Auto-Spec E-FAB tömegspektrométer alkalmazásával vettük fel.

HU 224 073 Β1

Szekvencia- szám	Tapasztalati képlet	Aminosav-összetétel	Mól. tömeg	MH⁺/FAB (talált)
1.	θ6βΗΐ06Νΐ6θ22	2Leu, Glu, 4Pro, Lys, 2Gly, 2Ala, 2Asp, Val	1475,6	1475
2.	^62^98^16022	3Gly, Glu, 4Pro, Lys, 2Ala, 2Asp, Leu, Val	1419,5	1419
3.	114^16^22	3Leu, Glu, 4Pro, Lys, 2Ala, 2Asp, Gly, Val	1531,7	1531
4.	C66H109N15O12	3Leu, Glu, 4Pro, Lys, 2Ala, Asp, Gly, Val	1416,6	1416
5.		3Gly, Glu, 4Pro, Lys, 2Ala, Asp, Leu, Val	1304,4	1304
6.	O40H65N9O11	Glu, 4Pro, Leu, Lys, Alá	817,9	818
7.	043^68^12014	2Asp, 4Pro, Ile, Arg, Alá	977,0	977,5
8.	θ44Η7θΝ₁₀0₁₄	Glu, 4Pro, Leu, Lys, Alá, Asp	963,1	963,5
9.	Ο65Η109Ν15Ο19	3Leu, Glu, 4Pro, Lys, 2Ala, Asp, Gly, Val	1398,6	1398
10.	042Η63Ν13Ο14	2Gly, Glu, 4Pro, Arg, Alá, Asp	974,0	974
11.	c₄₄h₇₁n₁₁o₁₃	Glu, 4Pro, Leu, Lys, Alá, Asn	962,1	962
12.	O63H102N14O20	bAla, Apm, 4Pro, Nle, Orn, Alá, 2Asp, Ile, Nva	1375,5	1375
13.	056^87^130-16	Aad, Nle, His, 4Pro, Alá, Asp, Nva, Ile	1198,3	1198

A metodika részletes ismertetését a következő irodalmi helyek tartalmazzák:

1. G. Rucker, Spectroskopische Methoden in dér Pharmazie, Bánd I., Wissensch. Verlag Stuttgart 25 1976, S.: 15-39,43-60

2. M. Bodanszky, Peptide Chemistry, Springer Verlag Berlin, 1988, S.: 13-38

3. G. A. Grant, Synthetic Peptides, W. H. Freeman &

Co. Verlag, 1992, New York, S.: 227-247

4. P. D. Bailey, An Introduction to Peptide Chemistry,

Wiley Verlag, New York, 1992, S.: 66-74.

Bár a találmánynak csak néhány megvalósítási módját jellemeztük részletesen, a szerkesztő számára nyilvánvaló, hogy a találmány keretein belül sok más megvalósítási mód, illetve változtatás lehetséges.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 35

1. (I) általános képletű peptidek,

H-Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Alá Asp Zaa Alá Xaa Xaa Xaa-OH (I)

15 10 15 amely képletben

Xaa neutrális alifás aminosavmaradékot jelent, amilyen az Alá, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle vagy Nva, ahol egy vagy több Xaa csoport hiányozhat;

Yaa bázikus aminosavmaradékot jelent, amilyen a Lys, Arg, Orn vagy His, és

Zaa savas aminosavmaradékot jelent, amilyen a Glu, Asp, Aad vagy Apm, ahol egy vagy mindkét Zaa csoport hiányozhat, és ahol a 12-helyzetű Alá és/vagy a 10-15., illetve 11-15. aminosavszekvenciák hiányozhatnak, és/vagy az (I) általános képletnek megfelelő mindenkori N- és C-terminális aminosavak amidkötéssel kapcsolódhatnak egymással, vagy a C-terminális aminosav amid

45 formában is állhat.
2. Az 1. igénypont szerinti peptidek, ahol az (I) általános képletű szekvencia első és utolsó aminosavgyöke között amidkötéssel ciklizált.
3. Az 1. igénypont szerinti peptid, melynek (I) általá50 nos képletű szekvenciájából legalább 1, de legfeljebb

7 aminosavmaradék hiányzik.
4. A Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Asp Alá Leu Gly Val

15 10 15 képletű, 1. igénypont szerinti peptid.

5. A Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Asp Alá Gly Leu Val

15 10 15 képletű, 1. igénypont szerinti peptid.

HU 224 073 Β1

6. A Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys 1 5 képletű, 1. igénypont szerinti peptid. Pro Alá Asp Asp Alá Leu Gly Val 10 15 7. A Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp Alá Leu Gly Val 1 5 10 14 képletű, 1. igénypont szerinti peptid. 8. A Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Alá Gly Leu Val 1 5 10 14 képletű, 1. igénypont szerinti peptid. 9. A Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá 1 5 8 képletű, 1. igénypont szerinti peptid. 10. Az Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Alá Asp 1 5 9 képletű, 1. igénypont szerinti peptid. 11. A Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp 1 5 9 képletű, 1. igénypont szerinti peptid. 12. A Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp Alá Leu Gly Val 2 ⁵ 10 képletű, 1. igénypont szerinti peptid. 13. A Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Alá Asp I ^{2 5} _L\

képletű, 1. igénypont szerinti peptid.

14. A Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asn 15 9 képletű, 1. igénypont szerinti peptid.

15. Gyógyászati készítmény, mely hatóanyagként 40 az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti peptidek közül egyet vagy többet tartalmaz gyógyszerészeti szempontból alkalmas, szilárd vagy folyékony halmazállapotú hordozóval együtt.

16. A 15. igénypont szerinti, stressz indukálta be- 45 tegségek és rendellenességek, gyulladások, ödémák, traumák, égések, vírusfertőzések, immunrendszeri megbetegedések, CND rendellenességek, különböző kóroktani gyomorfekélyek, csonttörések, sokk, általános sebészeti rendellenességek, agykárosodások, depresszió, Parkinson-kór kezeléséhez, illetve sugárzás elleni védelemre, kémiai szerek által indukált testi fogyatékosság kivédésére és általános hatású „testvédő” vegyületekként alkalmazható gyógyászati készítmények.

17. Eljárás (I) általános képletű peptidek,

Η-Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Alá Asp Zaa Alá Xaa Xaa Xaa-OH (I)

15 10 15 amely képletben

Xaa neutrális alifás aminosavmaradékot jelent, amilyen az Alá, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle vagy Nva, ahol egy vagy több Xaa csoport hiányozhat;

Yaa bázikus aminosavmaradékot jelent, amilyen a Lys, Arg, Orn vagy His, és

55 Zaa savas aminosavmaradékot jelent, amilyen a Glu, Asp, Aad vagy Apm, ahol egy vagy mindkét Zaa csoport hiányozhat, és ahol a 12-helyzetű Alá és/vagy a 10-15., illetve 11-15. aminosavszekvenciák hiányozhatnak, és/vagy

60 az (I) általános képletnek megfelelő mindenkori N- és

HU 224 073 Β1

C-terminális aminosavak amidkötéssel kapcsolódhatnak egymással, vagy a C-terminális aminosav amid formában is állhat, előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti pepiidnek megfelelő, legalább egy, peptidkémiában ismert védőcsoportot tartalmazó és/vagy adott 5 esetben szilárd gyantahordozóhoz kapcsolt pepiidről lehasítjuk a védőcsoportot és a gyantahordozót.

18. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 17. igénypont szerint előállított peptidet legalább egy, gyógyszerészeti szem- 10 pontból alkalmas, szilárd vagy folyékony halmazállapotú hordozóval keverve szokásos dózisformává alakítunk.

19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stressz indukálta betegségek és rendellenességek, gyulladások, ödémák, traumák, égések, vírusfertőzések, immunrendszeri megbetegedések, CND rendellenességek, különböző kóroktani gyomorfekélyek, csonttörések, sokk, általános sebészeti rendellenességek, agykárosodások, depresszió, Parkinson-kór kezeléséhez, illetve sugárzás elleni védelemre, kémiai szerek által indukált testi fogyatékosság kivédésére és általános hatású „testvédő” vegyületekként alkalmazható gyógyászati készítményeket állítunk elő.