DK172760B1

DK172760B1 - Lineære og cycliske analoge til alfa-MSH-fragmenter med ekstraordinær styrke, lægemiddel eller kosmetisk præparat indeholde

Info

Publication number: DK172760B1
Application number: DK198802777A
Authority: DK
Inventors: Victor J Hruby; Fahad A Ol-Obeidi; Mac E Hadley
Original assignee: University Patents Inc
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1988-05-20
Publication date: 1999-06-28
Also published as: AU1650688A; PH25819A; EP0292291B1; CN1031242C; DK277788D0; DE3851002T2; IE64903B1; FI882380A; JPH0826077B2; EP0292291A3; EP0292291A2; IE881537L; DE3851002D1; PT87560A; JPS6470499A; DK277788A; ATE109793T1; FI882380A0; AU618733B2; PT87560B

Description

i DK 172760 B1

Den foreligggende opfindelse angår hidtil ukendte lineære og cycliske analoge af o-MSH, et lægemiddel indeholdende en sådan analog, et kosmetisk præparat indeholdende en sådan analog samt anvendelsen af disse analoge til frem-5 stilling af et medikament med melanotropisk vikning, til fremstilling af et medikamentudleveringssystem og til fremstilling af et diagnostisk middel.

Hos hvirveldyr er farven af deres hud, pels og fjer bestemt af antallet og fordelingen af visse farvebærende 10 celler, f.eks. melanocytter, hvis antal og fordeling er under genetisk kontrol. Melanocytter hos pattedyr er lokaliseret ved basislaget i epidermis, ved den dermal-epidermale overgang og i hårfollikler. Syntesen af pigment (melanin) i disse melanocytter er kontrolleret af aktiviteten af et 15 enzym, tyrosinase, som er lokaliseret i en intracellulær organel, præmelanosomet. Efter aktivering af tyrosinase afsættes der enten eumelaninpigment (brun-sort) eller phaeo-melaninpigment (gul-rødt) i organellen, og efter fuldstændig melanisering er præmelanosomet kendt som et melanosom, nær-20 mere betegnet som enten et eumelanosom eller et phaeomelano-som afhængigt af farve [se T.B. Fitzpatrick, Y. Hor i, K.

Toda, M. Seiji, Jap. J. Derm. 79, 278 (1969)]. Melanosomer afleveres til omgivende keranocytter i huden eller til celler i skaftet af voksende hår ved den proces, som er kendt som 25 cytocrinsekretion.

Selv om melaninsyntese og hårlagsmonstre eksprimeres genetisk, kan follikulær melanogenese og ændringer i hårlagsfarve hos visse pattedyr kontrolleres hormonalt ved hjælp af ot-melanotropin (også kendt som det a-melanocytsti-30 mulerende hormon, dvs. α-MSH), et lineært tridecapeptid med formlen

Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2· 35 Dette hormon stammer fra et forstadieprotein, proopio melanocortin, med høj molekylvægt og udskilles af pars inter- 2 DK 172760 B1 media i hypofysen, og det stimulerer adenylatcyclaseaktivi-tet, tyrosinaseaktivitet og derefter melaninproduktion i melanocytter [se M.E. Hadley, C.B. Heward, V.J. Hruby, T.K.

Sawyer og Y.C.S. Young, Pigment Cell 6, 323 (1980)).

5 Hos mennesker findes α-MSH tilsyneladende kun i hypo fysen hos fosteret og ikke hos den voksne person. Hos voksne mennesker er et vist niveau af melaninproduktion genetisk bestemt og grundlæggende til stede. Variabel melaninsyntese ud over dette basislinieniveau er direkte afhængig af UV-10 stimulering, f.eks. sollys. Udsættelse for høje niveauer af sol udløser forøget produktion af melanin med ledsagende formørkelse af huden. Denne reaktion kan være en udviklingsmæssig tilpasning til beskyttelse af personen imod de ældende og mutagene egenskaber hos UV (ultraviolet lys). Udsættelse 15 for lave niveauer af UV resulterer i lavere niveauer af syntese af dækkende melanin, afblegning af hudfarven og en formindsket blokeringsvirkning, hvilket tillader huden at absorbere større mængder stråling. Selv om voksne personer ikke syntetiserer q-MSH i hypofysen, vil humane melanocytter 20 reagere på dette hormon (og et racemiseret præparat deraf).

Hypopigmentering af huden hos mennesker er et resultat af lokale mangler i melaninproduktion i melanocytterne, men etiologien for mange spådanne hypopigmentære forstyrrelser er imidlertid endnu ukendt.

25 Det anslås, at ca. 1% af verdens befolkning lider af en eller anden form for hypopigmenteringsdysfunktioner.

Selv om det er kendt, at α-MSH og visse analoge af a-MSH kan bevirke mørkfarvning hos amphibier, når de indgives subcutant, og af α-MSH er forbundet med mørkfarvning af huden 30 hos adrenalektomiserede mennesker, når det indgives intramu-skulært [A.B. Lerner og J.S. McGuire, N.E.J. Med. 270. 539--546 (1964)], er disse indgiftveje ikke egnede til gentagen indgift, som er nødvendig for at opnå og opretholde den ønskede virkning. Forud for den foreliggende opfindelse har 35 der ikke været kendt hensigtsmæssige måder til behandling af disse hypopigmenteringsforstyrrelser.

3 DK 172760 B1

Det har nu vist sig, at visse analoge af α-MSH effektivt kan indgives transcutant, og disse forbindelser vil nå melanocytterne i aktiv form til stimulering af produktionen af melanin. Ifølge den foreliggende opfindelse kan det derfor 5 nu være muligt og bekvemt at indgive topiske præparater omfattende α-MSH-analoge til opnåelse af normalisering af hypopigmenteringsdysfunktioner, såsom postinflammatorisk hypopigmentering, herunder pityriasis, alba, tinea versio-color, vitiligo, idiopatisk guttate hypomelanosis og nevus 10 depigmentosus. Desuden kan det nu være muligt at opnå mørkfarvning af gråt hår på grund af ældning ved topisk indgivelse af α-MSH-analoge. Det er også muligt at forøge værdien af kommercielle dyreskind ved mørkfarvning via topisk indgivelse af disse analoge. Desuden er det nu muligt at opnå 15 mørkfarvning af huden i total fraværelse af sollys eller bestråling med UV-lys.

I overensstemmelse hermed er de a-MSH-analoge ifølge opfindelsen ejendommelige ved, at de har de i krav 1, 2 og 3 anførte formler.

20 Alle tidligere studier af de peptider, som har rela tion til β-MSH isoleret fra hypofysen, har vist bevarelsen af sekvensen Met4-Glu^-His®-Phe7-Arg8-Trp9-Gly10, dvs. me-thionin-glutaminsyre-histidin-phenylalanin-arginin-trypto-phan-glycin, som den fælles aktive kerne. Denne heptapeptid-25 sekvens er blevet foreslået som værende det aktive sted i hormoner stammende fra proopiomelanocortin.

Baseret på den strukturelle relation mellem a-MSH (og dets analoge og fragmenter) og dets biologiske styrke, ved anvendelse af bioafprøvningen med frøhud in vitro, ser 30 det aktive stede i α-MSH ud til at være den fælles, aktive kernesekvens i hensigtmæssigt modificeret Ac-Met-Glu-His--Phe-Arg-Trp-Gly-NH2. Dette fragment (a-MSH-4_10) er blevet syntetiseret og afprøvet for dets melanocytstimulerende aktivitet i frøhud, og det har vist sig at være en svag ago-35 nist, når det sammenlignes med det native hormon. Aminosyre-ombytning i stilling 5(Glu) og 10(Gly) er ikke blevet under- DK 172760 B1 4 søgt forud for den foreliggende opfindelse. Ud fra tidligere forskning (US-patentskrifter nr. 4.457.864, 4.485.039, 4.866.038, 4.918.055 og 5.049.547), hvorpå den foreliggende opfindelse er baseret, har det vist sig, at ombytningen af 5 methionin med norleucin i det aktive, lineære kerneheptapep-tid har givet en kraftig analog til α-MSH. Desuden har ombytning af phenylalanin i stilling 7 med dets enantiomer D--phenylalanin resulteret i en biologisk kraftigere analog med langvarig aktivitet i begge anerkendte bioafprøvninger 10 (frø- og firbenhud). Den efterfølgende tabel opsummerer nogle af disse studier.

Selektive fragmenter af α-MSH og deres biologiske aktiviteter på hud af frøer (Rana pipiens) og firben (Anolis caroli- 15 nensis).

Peptid Relativ styrke

Frø Firben 20 a-MSH 1,0 1,0

Ac-[Nle4,D-Phe7]-a-MSH1_13NH2 60,0 5,0

Ac-a-MSH4.10NH2 0,0003 0,004 25

Ac-(Nle4)-a-MSH4_10NH2 0,002 0,06

Ac-[Nle4]-ar-MSH411NH2 0,002 1,0 30 Ac-(Nle4,D-Phe7)-a-MSH4_10NH2 0,02 10,0

Ac-[Nle4,D-Phe7]-a-MSH4_11NH2 0,16 8,0 35

Undersøgelsen af disse relationer mellem struktur og aktivitet har vist to vigtige faktorer: (1) ombytningen af

Met-aminosyren med dens oxiderbare sidekæde med den oxidativt 40 stabile aminosyre Nle, som også er en isoster for Met, har resulteret i en ca. 10 ganges forøgelse af peptidfragmentets biologiske aktivitet, og (2) ombytning af L-Phe i stilling 7 med D-Phe og bibeholdelse af Lys i stilling li forøger yderligere den biologiske aktivitet af a-MSH.

5 DK 172760 B1

Ud over de studier, som er udført på lineære a-MSH-analoge, er en række konformationelt ufrie g-MSH-forbindelser blevet syntetiseret og afprøvet for biologisk styrke. Den 5 først studerede analoge har været Ac-[Cys4,Cys10]-a-MSH1_ 13NH2, som har haft fra ca. 10 til ca. 20 gange aktiviteten af det native α-MSH-hormon ved frøhudbioafprøvningen og ca. det dobbelte af styrken af α-MSH ved firbenhudbioafprøvningen. Design og syntese af disse, cycliske α-MSH-analoge har 10 været baseret på en betragtning af /?-drejestrukturen ved centrum i den aktive kerne (His6-Phe7-Arg8-Trp9) i a-MSH og vigtigheden af dette konformationsmønster for den biologiske aktivitet.

Ud fra strukturaktivitetsstudier af denne cycliske 15 klasse af α-MSH-analoge er der blevet draget flere konklusioner: 1) ringslutning mellem stillingerne 4 (Met) og 10 (Gly) ved isosterisk ombytning med aminosyren cystein forøger melanocytdispersionaktiviteten med ikke mipdre end 10 gange ved frøhudbioafprøvningen og 2 gange ved firbenhudbioafprøv-20 ningen, 2) ombytning af Phe7 med D-Phe7 i disse cycliske analoge bevirker den dobbelte aktivitet i frøhudbioafprøvningen og 4 ganges aktivitet i firbenhudbioafprøvningen, 3) tilstedeværelsen af Lys i stilling 11 giver altid mere aktive analoge, end når den mangler, og 4) reduktion eller ekspan-25 sion af ringstørrelsen af disulfidbroen fra 23-leddet ring bevirker kraftig nedgang i den biologiske styrke af den resulterende analoge.

Resultaterne af disse undersøgelser med cycliske a-MSH-analoge er vist i nedenstående tabel.

30 6 DK 172760 B1

Relativ styrke in vitro af cyclisk a-MSH-analoge ved bioafprøvning med frø- og firbenhud.

— ' styrke* _Peptidanaloge_Frø_Firben

Virkning af aminosyresubstitution a-MSH 1,0 1,0 I I I ιοί

Ac[Cys\ CysAVJJ-alpha-MSH1_13NH2 10,0 2,0 I--7

Ac-[Cys4, Cys10J-alpha-MSH4_13NH2 30,0 0,6 Γ λ 7 I in

Ac-[Cys , D-Phe , Cys ]-alpha- MSH4_13NH2 6,0 6,0

Ac-[CysS~Cys10]-alpha-MSH4_12NH2 10,0 1,5 " ' I 4 7 * 1 n

Ac-[Cys , D-Phe , Cys ]-alpha- MSH4-12NH2 20,0 6,0

Ac-[Cys4, Cys10J-alpha-MSH4_3^NH2 0,16 0,07 i 47 l 10

Ac-[Cys , D-Phe , Cys ]-alpha- MSH4-UNH2 2'5 2'° 1 i I jo

Ac-[Cys , Cyslu]-alpha-MSH4_10NH2 0,06 0,003 i 4 7 I 107

Ac-[Cys , D-Phe , Cys _j-alpha- MSH4_10NH2 0,75 0,5

Ac-[Cys4, Cys1^-alpha-MSH4_13NH2 30,0 0,60 [Mpa\ Cys10]-alpha MSH4_13NH2 30,0 1.0 y j [Maa4, Cys10]-alpha-MSH4_13NH2 0,06 0,06 V T 1 4

Ac-[Hcy , Cys ]-alpha-MSH4_13NH2 0,06 0,70 7 DK 172760 B1 ♦ Biologiske styrker er målt i forhold til α-MSH over den linære del af dosis-reaktion-kurven.

Maa = 2-Mercaptoeddikesyre.

5 Mpa = 3-Mercaptopropionsyre.

Hcy = homocystein.

Til yderligere undersøgelse af relationen mellem struktur og styrke af a-MSH-4_10-fragmenter er strukturkravet 10 for melanotrop aktivitet af en række ikke tidligere beskrevne, lineære a-MSH4_^o_ °9 3-analoge blevet systema tisk undersøgt med vægten lagt på virkningen af ombytning i stillingerne 5 og 10.

Baseret på de resultater, som er opnået for lineære 15 α-MSH-analoge, er en afvigende slags konformationelt ufrie α-MSH-analoge dernæst blevet undersøgt. Kort fortalt har man fremstillet og koncentreret sig om 4-10-fragmenter af q-MSH med den almene struktur 20 Ac-[Nle4-Xxx5, D-Phe7, Yyy10]-a-MSH4_10NH2, hvor Xxx er enten glutaminsyre (Glu) eller asparaginsyre (Asp), dvs. én af monoamino-dicarboxyl-syrerne, og hvor aminosyren Yyy er lysin, ornithin, 2,4-diaminosmørsyre (Dab) 25 eller 2,3-diaminopropionsyre (Dpr), dvs. en dibasisk aminosyre. De i nedenstående tabeller angivne, lineære Ac-a-MSH--analoge er blevet syntetiseret ved fastfasepeptidsynteseme-toder ved anvendelse af p-methylbenzhydrylaminharpiks som det faste underlag og renset ved metoder, som er beslægtede med 30 dem, som tidligere er blevet anvendt for a-melanotropin og analoge. Til sammenligning er strukturen af a-MSH gengivet først.

8 DK 172760 B1

IN (Μ (N <N

k a se a: CN 2 z 2 2

S I I I I

2 rH <H ι-l F-t I lU fl flj lfl ro <~I > > > >

<-H « I I I I

> o o o o ι μ μ μ μ (Μ O A A CU O, rH μ i i i i A >i >i >i >, <Ν<Ν<Ν(νΙΝ<Ν{Ν<Ν i r-irHiHiHtcit;a:®ac®xw rH MUOUOZZZZZZZZ in cm •-I >illllllllllllS® Ή rH|l||||||||||>,>,

jii O

η, i μμμμμμμμμμμμι i 0 Pift .η σ> μιιιιιιιιιιιιμμ

Λ rn EHtT>&i&itTitT>tPO'tr>Cr'(3'tT'b,EHEH

C C i μμμμμμμμμμμμι i £ Q) &>«<1<<<(<<(β;(<ίΐ<|<|<<&ΐ0ΐ c > co Μιιιιιιιιιιιιμμ .η ί <α>α>β>β)α>α>α>α>Φα>β>α>«:<

nj I »Cj ,C »C «£ «C »C ® *£· iC Λ »fi I I

o V) ΟΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΦβ) u r- JZIIIIIIII II IIJZÆ

Γ1 u AQQQQQCIQQQQQOAA

0 S I I I I I I I I I I I I I I I

c 3 winwwwwwwwwwwwwto S .5 lO -ri -Η ·μ ·Η ·Η ·μ ·Η ·Η ·Η ·Η -Η ·Η -ri ·Η ·μ

™ C KKKcnK«w®KffiKtoK»K

ω £ I I I I I I I I I I I I I I I

s w DDaaaoiDaoaacuaaa 1 LD rHrHWrHWWfHWiHWr-HtnWi-lUl i ϋο<:ο<<ϋ<θι<ΰ)<ι<ο»<

° I I I I I I I I I I I I I I I

<i_, 4->a)a>a)a)a)iD<DiD<Da><t)<yiD<D

(rt IT QJrHr—liHfHiHrH»—ti—If—IrHrHrHrH»—I

U I I I I I I I I I I I I I I I

3 μμμυυυυυυυυουυυ r; ro ο)<υα>ίΐ;<<:<ιβ;<ι<Λ:<<:<< v in in in

•3 III

£ μ μ μ

_p N >1 S

U) Eh Eh Eh

” III

μ μ μ -π a> o ο in in in

1 f I

u u υ < < < x in

S

1! I ο ή in ro Hi·

c SrHfNrO^’iniOr'OOUlr-lrHrHrHrH

9 DK 172760 B1

CM IN

X s 2 2 ro ro

rH i—I

I I

CM ι-H CM »T

X X a X CN CM JM CM

2 X 2 X X X XX

ro S co £ 2 2 22

r-t I ι-H I O O O O

I KJ In) rH rH rH rH

rH .C «f 43 CM I I II

K χ « χ X ** cm ** cm »r

WrHWiH CM2XXXXXX 2 id £ id X OW2W2WW cm

IlTlX^SoSoSS X

<0 fd — Oli »Hl Η I I 2

X rH X rH H 4 « I ft) Iltild O

X rH α Η I X X X X X *H

rH>irH>i<i>t/)XXXXXOi I

Id r-l Itii-CXSrHIOrHM.HrHCN'd·

I U I O W I <ti£itiSitiitiXX

Λ Λ · a i i T iii i2w rH »i-l »IX — Itii—iltii-ir- OJ5

rH O rH O Λ CL, O X O X O O rH I

>ιι-Ι >ιι-Ι X r-l iH (li Η X rH ·—I *3

rH (0 rH IQ X Id W rH C ι-Η Λ )H -d1 .C O >1 O >i rH I >,<d)HldldXXX

X ^id — ^ioiQOWi-J

» » i » — — £ <ti

o »O »—O »O »O »»I I

Λ Η>ΗΙ»>ΗΓ'ΗΙ'Η>Ι' Id I— S' wo)Wd)4)tod)c:a)xa)4)Xo O >i X >« X X >ι X Ih X iti X X Οι η

'l OPiOXPiOXOXQXPi'jW

2 I || 1 I I I Id >1

5 »O »o o »O - Q »QQIiJ

*» t— Γ» C—* Γ— Γ— —i qj * ¢) ·. k (l) »Q> » 0) » »O »

X m x in in X in X in xminrHin p< O X XXX Οι X Οι X X X w X

i w I in tn I w i tn i in w >1 in Q<Orf;i<0<Oi<Q-<<Xi< 0)0)0)0)0)001010) 0)0)0)0)0) „i-trHrHrHi-HrHrHrHrH rHrHrHi-Hi—1 χ£££££££'£££££££ * Ϊ T Ϊ ϊ T T . i i i i i i i Ιυυυυυυουυου. υυυ O dH OJ ro ^

^HfNfO^}*ir>VOr**00 G\ r—I »—4 r-H rH iH

10 DK 172760 B1

De lineære analoge α-MSH-fragmenter fremstilles ifølge nedenstående eksempler:

Eksempel 1 5

Ac-[Nle4, D-Phe7, Lys10, Gly11]-a-MSH1_13NH2

Denne forbindelse fremstilles ved kobling af Na-Boc--Val (udtrykket "Boc" betyder t-butyloxycarbonyl) til p-10 -methylbenzhydrylaminharpiks (2,0 g pMBHA-harpiks, 0,7 mmol NH2/g harpiks) ved anvendelse af tredobbelt overskud af aminosyre og ved anvendelse af fastfasemetoder til peptidsyntese. Efter 90 minutters forløb vaskes harpiksen med dichlor-methan, neutraliseres, og aminogruppen acetyleres med en 15 blanding af eddikesyreanhydrid og pyridin. Ingen reaktive aminogrupper på harpiksen påvises ved ninhydrinprøven efter 30 minutters forløb. En cyklus til kobling af hver enkelt aminosyrerest ind i den voksende peptidkæde består af følgende: 1) vask med fire portioner på 30 ml CH2C12, 2 minut-20 ter/vask; 2) fraspaltning af Boc-gruppen ved hjælp af 30 ml 48%'s trichloreddikesyre i dichlormethan indeholdende 2% anisol, en behandling i 5 minutter, en anden 20 minutter; 3) vask med fire portioner på 30 ml dichlormethan, 2 minut-ter/vask; 4) neutralisation ved tilsætning af to portioner 25 på 30 ml 10%'s diisopropylethylamin i dichlormethan og omrystning i 2 minutter hver gang; 5) vask med fire portioner på 30 ml dichlormethan, 2 minutter/vask; 6) tilsætning af 3 ækvivalenter af Boc-aminoderivatet (i dette tilfælde 2,1 mmol) i 5 ml dichlormethan, 2,4 ml N-hydroxybenzotriazol 30 som 1 mmol/ml-opløsning af HOBt i DMF (bortset fra hvor der er tale om N-Boc-NlinTos-His) (udtrykket "N^Tos” betyder N-imidazoltosyl) efterfulgt af 2,4 ml DCC som 1 mmol/ml opløsning af DCC i DMF. Derefter omrystes blandingen i 2-3 timer (hvor der er tale om Trp, Arg og His, anvendes DMF som kob-35 lingsopløsningsmiddel); 7) efter afslutning af koblingen (negativ på ninhydrin) vask med 3 portioner og 3 ml dichlor- 11 DK 172760 B1 methan, 2 minutter/vask; 8) vask med en portion på 3 ml 100%'s ethanol, 2 minutter/vask; 9) vask med fire portioner på 30 ml dichlormethan, 1 minut/vask. Den beskyttede peptidharpiks svarende til titelforbindelsen fås, efter at trinvis 5 kobling af følgende Na-Boc-aminosyrer (eller derivater) er gennemført (i tilsætningsrækkefølge): Na-Boc-Pro, Na-Boc-

Gly, N“-Boc-Lys-(N€-2-ClZ); Na-Boc-Ni-For-Trp, Na-Boc-N9-Tos-Arg, Na-Boc-D-Phe, Na-Boc-N^m-Tos-His (udtrykket "Ν'?" betyder N-guanidino, "N1" betyder N-indolyl, og "2C1Z" be-10 tyder 2-chlorbenzyloxycarbonyl). Den resulterende Boc-His-(Nim_ToS) -D-Phe-Arg (N^-tos) -TrpiNi-For) -Lys (Ne-2C1Z) -Gly-Pro-Val-p-MBHa-harpiks deles i fire portioner. En fjerdedel (1,0 g, 0,5 mmol) af den beskyttede peptidharpiks omdannes til den beskyttede titelpeptidharpiks efter kobling af Na-15 Boc—r-Bzl-Glu, Na-Boc-Nle, Na-Boc-Ser(0-Bzl) , Na-Boc-Tyr (0-2-BrZ) , Na-Boc-Ser(0-Bzl) (udtrykket "2BrZ" betyder 2-brom-benzyloxycarbony1). Efter kobling af sidste aminosyre fjernes NQ-Boc-beskyttelsesgruppen, aminogruppen neutraliseres, og det beskyttede peptid Na-acetyleres med et tidobbelt overskud 20 af N-acetylimidazol i 20 ml dichlormethan, og den resulterende, beskyttede peptidharpiks, Ac-Ser(0-Bzl)-Tyr(0-2-BrZ)-Ser (0-Bzl) -Nle-Glu(-r-Bzl)-His(Niin-Tos) -D-Phe-Arg(N^-Tos) -Trp(N^-For)-Lys(Nc-2-ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA-harpiks, tørres i vakuum. Den beskyttede peptidharpiks (1,0 g) spaltes fra 25 harpiksen ved hjælp af flydende HF. Efter afdampning af de flygtige materialer i vakuum ved 0°C vaskes det tørrede produkt med 3 x 30 ml ethylether, ekstraheres med 3 x 30 ml 30%'s vandig HOAc og lyofiliseres. Peptidpulveret (530 mg) deles i to portioner på hver 260 mg, og den ene portion 30 opløses i 1,5 ml ammoniumacetatpuffer (pH 4,5), filtreres gennem et patronfilter i toppen af en CMC-kolonne (2,0 x 30,0 cm) og elueres ved anvendelse af 0,01 M (pH 4,5), 0,1 M (pH 6,8) og 0,2 M (pH 6,8) NH4OAc, 250 ml af hver. Den hovedspids, som påvises ved 280 nm, elueres mellem afslutnin-35 gen af NH4OAc-fraktionen på 0,1 M og første halvdel af fraktionen på 0,2 M og lyofiliseres til opnåelse af 142,3 mg 12 DK 172760 B1 hvidt pulver. 80,0 mg af peptidpulveret renses ved præparativ HPLC, og hovedspidsen samles og lyofiliseres til opnåelse af 63 mg af titelpeptidet.

5 Eksempel 2

Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Lys10, Gly11]-a-MSH1_13NH2

Denne forbindelse fremstilles ud fra 1,0 g (0,5 mmol) 10 NQ-Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(N^-Tos)-TrpfNi-For)-Lys(N€--2C1Z)-Gly-Pro-Va1-p-MBHA-harpiks ved trinvis kobling af Na-Boc-Asp(OBzl), Na-Boc-Nle, N-Boc-Ser(0-Bzl) , Na-Boc-Tyr(0--2-BrZ), Na-Boc-Ser(0-Bzl). Hver enkelt kobling gennemfores ved den ovenfor omtalte metode. Acetylering af den beskyttede 15 tridecapeptidharpiks gennemføres ved hjælp af et 10 ganges overskud af N-acetylimidazol i dichlormethan (5 timer) efter afbeskyttelse og neutralisation af den N-terminale Boc-grup-pe. Ac-S er(0-Bzl)-Tyr(0-2-BrZ)-Ser(0-Bzl)-Nle-Asp(O-Bzl)-His (Niim-Tos) -D-Phe-Arg(N9-Tos) -Trp(Ni-For) -Lys(Nc-2-ClZ)-20 Gly-Pro-Val-p-MBHA-harpiksen tørres i vakuum til opnåelse af 1,8 g beskyttet peptidharpiks. 1,0 g af den beskyttede peptidharpiks spaltes ved hjælp af flydende HF, og efter afdampning af de flygtige materialer vaskes med 3 x 3 0 ml diethylether, peptidet ekstraheres med 3 x 30 ml 30%'s vandig 25 HOAc og lyofiliseres. En portion på 200 mg af det rå trideca-peptid opløses i 1,5 ml NH4OAc-puffer (pH 4,5), filtreres gennem et patronfilter i toppen af en CMC-kolonne (2,0 x 30,0 cm) og elueres med samme sekvens af den diskontinuerlige gradient af NH4OAc, som er omtalt i eksempel 1. Det fraskilte 30 peptid er efter lyofilisering 152 mg. 100 mg af dette råpeptid renses yderligere ved hjælp af HPLC til opnåelse af 67 mg af titelpeptidet.

13 DK 172760 B1

Eksempel 3

Ac-[Nle4, D-Phe7, Lys10, Gly11]-a-MSH4_13NH2 5 Ud fra 1,0 g (0,05 mmol) Boc-His(Nlm-Tos)-D-Phe-Arg- (N^-tos) -Trp(Ni-For) -Lys (Ne-2C1Z) -Gly-Pro-Val-p-MBHa-harpiks syntetiseres titelpeptidet ved fastfaseteknik efter trinvis kobling af NQ-Boc-Glu(t-Bzl) og Na-Boc-Nle. Hver enkelt koblingsreaktion gennemføres som i ovenstående eksempler, 10 bortset fra at acetyleringen af N-terminalen gennemføres med et 2 gange overskud af 1:1 eddikesyreanhydrid:pyridin i dichlormethan i 1 time. Peptidet 4 fås i renset form som beskrevet i eksempel 2 til opnåelse af et hvidt pulver i et udbytte på 22%.

15

Eksempel 4

Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Lys10, Gly11]-o-MSH4_13NH2 20 Ud fra 1,0 g (0,5 mmol) Boc-His (Nim-Tos) -D-Phe-Arg(N^-

Tos) -Trp (N^-For) -Lys (N€-2C1Z) -Gly-Pro-Val-p-MBHa-harpiks, fremstillet som beskrevet i eksempel 1, fremstilles titelpeptidet ved trinvis kobling af Na-Boc-Asp(Ø-Bzl) og Na-Boc-Nle.

Der anvendes samme teknik som beskrevet i eksempel 1 ved 25 behandling af den resulterende, beskyttede peptidharpiks.

Det ønskede peptid fås i et udbytte på 53 mg af HPLC-rent peptid, idet der gås ud fra 130 mg råpeptid renset i forvejen med CMC-chromatografi som beskrevet i eksempel 1.

30 Eksempel 5

Ac[Nle4, D-Phe7, Lys10]-a-MSH4_10NH2 2,7 g harpiks af p-methylbenzhydrylamin (0,7 mmol 35 NH2/g harpiks) suspenderes i dichlormethan og vaskes 3 gange med portioner på 30 ml dichlormethan. Den vaskede harpiks DK 172760 B1 14 omrystes derefter i 2 timer i dichlormethan, før opløsningsmidlet frafiltreres. Den opkvældede MHBA-harpiks neutraliseres og kobles med aminosyrerne som beskrevet i eksempel l.

Følgende aminosyrederivater kobles ind i harpiksen (i række-5 følgen for deres kobling): Na-Boc-D-Lys(N€-2-ClZ), Na-Boc--TrpiNi-For), NQ-Boc-Arg(N9-Tos), NQ-Boc-D-Phe, Na-Boc-His-_(fjim_Tos). Den resulterende Boc-His (N^-Tos)-D-Phe-Arg (N^-Tos)-Trp(N^-For)-Lys(Na-2-ClZ)-p-MBHA-harpiks deles i to portioner. I den ene del af harpiksen indkobles trinvis 10 Na-Boc-Glu(-r-Bzl) og Na-Boc-Nle. Den færdige peptidharpiks decarboxyleres, og N-terminalen acetyleres med 2 ganges overskud af en l:l-blanding af eddikesyreanhyrid:pyridin i dichlormethan i 1 time. Den faerdigbehandlede, beskyttede peptidharpiks vaskes med dichlormethan og tørres i vakuum 15 til opnåelse af 2,1 g. 1,7 g af den beskyttede peptidharpiks spaltes ved hjælp af vandfri flydende HF-anisol-dithioethan (17 ml HF, 2 ml anisol, 1 ml dithioethan). Efter afdampning af de flygtige materialer vaskes det tørrede, spaltede peptid med 3 x 30 ml vandfri diethylether og ekstraheres med 3 x 20 30 ml 30%'s vandig HOAc. Den vandige ekstrakt af peptidet lyofiliseres til opnåelse af 700 mg råpeptid. En prøve på 300 mg af råpeptidet opløses i 2 ml NH4OAc-puffer (pH 4,5) og filtreres gennem et patronfilter på toppen af en CMC-kolonne. Hovedspidsen samles og lyofiliseres til opnåelse 25 af 172 mg hvidt pulverpeptid. 110 mg af råpeptidet renses på HPLC til opnåelse af 50 mg rent titelpeptid.

Eksempel 6 30 Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe, Lys10]-a-MSH4_10NH2

Den beskyttede peptidharpiks til titelforbindelsen fremstilles ud fra 1,8 g Boc-His(N^m-Tos)-D-Phe-Arg(N^-Tos)--Trp(NFor)-Lys(Ne-2-ClZ)-p-MBHA-harpiks ved trinvis kobling 35 af Na-Boc-Asp(/3-Bzl) og NQ-Boc-Nle. Hver enkelt koblingsreaktion gennemføres med et 3 gange overskud af Na-Boc-aminosyre 15 DK 172760 B1 (eller derivat), et 2,4 gange overskud af DCC og et 2,4 gange overskud af HOBt ved samme metode, som er beskrevet i det foregående. Efter kobling af sidste aminosyre fjernes Na-Boc-beskyttelsesgruppen, aminogruppen neutraliseres og 5 acetyleres med et 2 gange overskud af en l:l-blanding af eddikesyreanhydrid:pyridin i dichlormethan i l time. Ac-Nle-Asp(0-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(N^-Tos)-Trp(N^-For)--Lys(Ne-2-clZ)-p-MBHA-harpiks vaskes med dichlormethan og tørres i vakuum til opnåelse af 2,1 g. En prøve på 1,5 g af 10 den beskyttede peptidharpiks spaltes ved hjælp af flydende HF og behandles som i eksempel 5 beskrevet til opnåelse af 64 mg af titelpeptidet efter HPLC-rensning af 112 mg af det CMC-chromatografisk rene peptid.

15 Eksempel 7

Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Dab10]-a-MSH4_10NH2

Den beskyttede peptidharpiks til titelforbindelsen 20 syntetiseres som i eksempel 5 beskrevet, bortset fra, at der anvendes NQ-Boc-Dab(N',-Z) og Na-Boc-Asp(Ø-Bzl) i stedet for hhv. Na-Boc-Lys(Ne-2ClZ) og Na-Boc-Glu(-r-Bzl) i koblingsskemaet til opnåelse af Ac-Nle-Asp(/?-Bzl)-His(Nim-tos)-D--Phe-Arg(N^-Tos)-Trp(N^-For)-DabfN^-Z)-p-MBHA-harpiks. Efter 25 spaltning og behandling af peptidharpiksen som beskrevet i eksempel 5 fås peptidet 12 som et hvidt pulver i et udbytte på 36%.

Eksempel 8 30

Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Dpr10]-a-MSH4_10NH2

Den beskyttede peptidharpiks til titelforbindelsen syntetiseres som i eksempel 5 beskrevet med den undtagelse, 35 at Na-Boc-Dpr(N^-Z) anvendes i stedet for Na-Boc-Lys(Ne-2--C1Z) og Na-Boc-Asp(0-Bzl) i stedet for N°-Boc-Glu(Tr-Bzl) i 16 DK 172760 B1 koblingsskemaet til opnåelse af Ac-Nle-Asp(Ø-Bzl)-His(Nim-Tos) -D-Phe-Arg(N^f-Tos) -TrpiNi-For) -Dab(NØ-Z) -p-MBHA--harpiks. Peptidet afspaltes fra harpiksen og behandles som i eksempel 5 beskrevet til opnåelse af det ønskede peptid 5 som et hvidt pulver, udbytte 36%.

Eksempel 9

Ac-[Nle4, Lys10]-a-MSH-4_10NH2 10

Den beskyttede peptidharpiks til titelforbindelsen syntetiseres som beskrevet i eksempel 5 med den undtagelse, at N“-Boc-Phe anvendes i stedet for Na-Boc-D-Phe i koblingsskemaet til opnåelse af Ac-Nle-Glu (*r-Bzl) -His (N*m-Tos) -Phe-15 -Arg(N^-Tos)-Trp(N^-For)-Lys(Ne-2-ClZ)-p-MBHA-harpiks. Peptidet spaltes og behandles til opnåelse af titelforbindelsen i et udbytte på 40%.

Eksempel 10 20

Ac-[Nle4, Asp5, Lys10]-a-MSH4_10NH2

Den beskyttede peptidharpiks til titelforbindelsen syntetiseres som beskrevet i eksempel 5 med den undtagelse, 25 at NQ-Boc-Phe anvendes i stedet for NQ-Boc-D-Phe, og at Na--Boc-Asp (/3-Bzl) erstatter Na-Boc-Glu(τ-Bz1) i koblingsske-maet, til opnåelse af Ac-Nle-AspC/S-BzlJ-Phe-ArgiN^-Tos)--Trp(N^-For)-Lys(Ne-2-ClZ)-p-MBHA-harpiks. Peptidet spaltes fra harpiksen, beskyttelsesgrupperne fjernes, og titelforbin-30 delsen renses som ovenfor beskrevet til opnåelse af produktet som et hvidt pulver i et udbytte på 37%.

De biologiske styrker for de lineære analoge fremstillet ifølge ovenstående eksempler er vist i nedenstående 35 tabel, hvor "P" betyder langvarig virkning ("+" = ja, = nej), og "ND" angiver, at prøven ikke er blevet anvendt til 17 DK 172760 B1 det specielle forsøg.

Biologisk styrke Restaktivitet Analog Frø Firben Frø Firben 5---- a-MSH 1,0 1,0 P(-) P(-) I 6,0 8,0 P(+) P(-) 10 2 9,0 8,0 P(+) P(-) 3 0,8 8,0 P(+) P(+) 4 1,0 10,0 P(+) P(+) 15 5 0,1 8,0 P(-) P(-) 6 0,2 8,0 P(-) P(-) 20 7 0,7 8,0 P(-) P(-) 8 0,6 8,0 P(-) P(-) 9 0,9 10,0 ND P(-) 25 10 0,9 10,0 P(±) P(±) II 0,9 50,0 P(-) P(-) 30 12 0,2 8,0 P(-) P(-) 13 0,001 0,08 P(+) P(-) 14 0,004 0,08 P(+) P(-) 35

De resultater, som er opnået med de lineære, konfor-mationelt ufrie ct-MSH-analoge, har ført til undersøgelser 40 ved anvendelse af en forskellig type ufri analog, konforma-tionelt ufrie, cycliske a-MSH-analoge.

Fastfasepeptidsyntesen af cycliske melanotropinpep-tidanaloge er blevet gennemført ved konventionel fastfasesyn-teseteknik. Kort fortalt kobles Na-tert.butyloxycarbonylbe-45 skyttede aminosyrer (Boc-aminosyrer) og deres derivater til en p-methylbenzhydrylaminharpiks med et 3 gange overskud af det Boc-beskyttede aminosyrederivat, et 2,4 gange overskud af N-hydroxybenzotriazol (HOBt) som 1 mmol/ml-opløsning i 18 DK 172760 B1 DMF (bortset fra hvor der er tale om His) og 2,4 gange overskud af 1 mmol/ml-opløsning af dicyclohexylcarbodiimid (DCC) i DMF. Koblingsreaktionen gennemføres i dichlormethan i et tidsrum på 1-3 timer, hvilken kobling overvåges ved hjælp 5 af ninhydrin- og/eller chloranilprøver og gentages efter behov. Reaktive sidekæder på aminosyrer beskyttes som følger:

Lys med 2,4-dichlorbenzyloxycarbonyl; Orn, Dab og Dpr med benzyloxycarbonyl; Trp med formyl; Arg med tosyl; His med tosyl; Glu og Asp som benzylester. Spaltning af N^-Boc-be-10 skyttelsesgruppen gennemføres ved behandling med 48%'s tri-fluoreddikesyre indeholdende 2% anisol i dichlormethan i hver gang 5 og 20 minutter.

En cyklus til inkorporeringen af hver enkelt aminosy-rerest i den voksende peptidkæde består af følgende: 1) 15 vask med CH2Cl2 (4 x 30 ml, 1 minut/vask) ; 2) Boc-beskyttelse fjernes på hver enkelt trin ved to behandlinger med 48% TFA i 0Η2012 indeholdende 2% anisol i hver gang 25 minutter; 3) vask med CH2C12 (2 x 30 ml) ; 4) neutralisation med 10% diiso-propylethylamin i CH2Cl2 (2 x 30 ml, 3 minutter/vask); 5) 20 vask med CH2C12 (3 x 30 ml, 2 minut/vask); 6) tilsætning af det Boc-beskyttede aminosyrederivat i 20 ml CH2Cl2 (undtagen hvor der er tale om Trp, Arg og His, hvor DMF erstatter CH2C12 på grund af opløselighedsproblemet), efterfulgt af HOBt, efterfulgt af DCC og omrystning i 1-3 timer; 7) vask 25 med CH2C12 (3 x 30 ml, 2 minutter/vask) ; 8) vask med 100% ethanol (3 x 30 ml, 2 minutter/vask) . Afslutning af koblingen overvåges, og efter kobling af sidste aminosyre fjernes Na--Boc-beskyttelsesgruppen, aminogruppen neutraliseres og acetyleres med et 10 gange overskud af N-acetylimidazol i 30 CH2C12 eller ved anvendelse af en l:l-blanding af eddikesyre-anhydrid:pyridin i CH2C12 (2 x overskud i 1 time).

Peptiderne afbeskyttes og fjernes fra harpiksen med vandfri, flydende HF (10 ml/1 g harpiks) indeholdende 10% anisol og 8% 1,2-dithioethan ved 0eC i 45 minutter. Efter 35 afdampning af de flygtige materialer i vakuum vaskes de frie peptider med diethylether eller ethylacetat (3 x 30 19 DK 172760 B1 ml) og ekstraheres derefter med en 30%’s vandig opløsning af eddikesyre (3 x 30 ml) og 3 x 30 ml destilleret vand.

Den forenede vandige ekstrakt lyofiliseres til opnåelse af et hvidt pulver af råpeptidet. Hvert peptid renses ved kolon-5 nechromatografi på kationbyttercarboxymethylcelluloseharpiks (CMC) ved anvendelse af en diskontinuerlig gradient af am-moniumacetatpuf fer som følger: 250 ml 0,01 M NH4OAc (pH

4,5), 250 ml 0,01 M NH40Ac (pH 6,8), 250 ml 0,1 M NH4OAc (pH 6,8) og 250 ml 0,2 M NH40Ac (pH 6,8). Hovedspidsen (påvisning 10 ved 280 nm) elueret under sidste del af 0,01 M NH40Ac-puf-feren (pH 6,8) og første halvdel af 0,1 M NH4OAc-pufferen (pH 6,8) lyofiliseres til opnåelse af et renset peptid som et hvidt pulver.

Strukturen af de cycliske a-melanotropinanaloge, som 15 er en del af den foreliggende opfindelse, er vist i nedenstående tabel.

20 DK 172760 B1

(N

X

<n z a i (n z -i as i <o z n r-i > n

Ή (O I <H

> O I

I tt

O (¾ a <N <N IN (N

r-ινιΐ cn a « £ as κ

.. CU >, N N N N N S Z Z q Z Z

«> i .h a a a a a i o o 2 o o

^ *-i w o z z z z z a H H i H H

0 <“· >illllll i ιιΛιι Ω w in in c Λ (-i ^ _ ν· -τ·

2 I f>ir>i->i rU rH rCU r-l Z Z £ Μ K

S O >1 ι-ΐ i-3 i-3 O Ω Ω r-l W CO a V) Cfl

2 Ή rH I I | | | | >, S S f S S

5 e> α o. o. o. o. o. .-η ιιΐιι o a a ° a a

g* , „ a^HHHE-iEH I I I I I

P 2 O' Wllllll * r- r·^ r-, H c η C O' tr O' O' o> o o o o o o

•g ® I Vi Μ Μ M V4 (4 r-t rH rH rH t-H rH

2 > O' i< < < < < < W (Π M C Æ _U

S m 00 Ijllllll ^ _>t r>, >,rn n) tt Π3 ω < <u o> <1) 0) 0) 0) g1 Ω ΩΩΟΩΩ >H w ΙΛΧΙΛΧΙΛΛ ° 2 0)0(0.(1.¾¾¾ 'j » C g a i i i i i I 2 t" c-~ r~ i- r- - > I a Ω Q Q Q Q Ω 5 0) 0)0)0)0)0)

8 C I I I I I I I "· JZ JZ X Λ JZ JC

ή tn in tn tn in in <n ¾ ¾¾¾¾¾

2 jp VO ·Η ·Η -H -rt -Η -Η -Η I I I I I I

* Λ Z B B Z X a B Ω ΩΡΩΩΩ

w I I I I I I I

•h aaLao.ao.0. * - - - - - ^ m ri uh *-tn Lin >-t/i *-to in m in n in in p u u c? «< << < < a a o. & ola >ι i i i i i i i .-i h1-wu w *-w in U 410)0)0)0)0)0) c? o < < < <

Tj· Q) rH Η H rH Η H ^ *2 s z z z z z z *---·>--«· Ό I I t I I I I S ·*Τ Ν,Ν·Ν,Ν·Ν· h v o o υ o v ύ v ο)θ)θ)β>β)

2 m 0) O X>! ^ O l< L rH i—IrHrHrHrH

g W 8 Z Z Z Z Z Z

41 I i—i 1—ri—, >—. , i .

-¾ *4 I I I I I I

3 in >» υουουυ £ E-· <<<«:<< W i *H ' 0) w o <

K

CO

s μ i m ^ r- co o> o m r- oo σ> o

C ζ$ t-H r—i r—♦ i—< t-H <N rH rH r-H rH rH CVJ

21 DK 172760 B1

De peptidanaloge ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles ifølge nedenstående eksempler.

Eksempel 11 5 ,-:-,

Ac-[Nle4, Glu5, D-Phe7, Lys10, Gly11]-a-MSH4_13NH2

Idet der gås ud fra 1,0 g Na-Boc-Val-p-MBHA-harpiks (0,7 mmol Na-Boc-Val) fremstilles den beskyttede peptidhar-10 piks for titelforbindelsen efter trinvis kobling af følgende NQ-Boc-beskyttede aminosyrer (i tilsætningsrækkefølge): Na--Boc-Pro; Na-Boc-Gly; Na-Boc-Lys(Ne-2,4-C1Z); Na-Boc-Trp(N1--For); Na-Boc-Arg(N^-Tos); Na-Boc-D-Phe; Na-Boc-His(Nim--Tos) ; Na-Boc-Glu(-r-Bzl) ; NQ-Boc-Nle. Efter kobling af sidste 15 aminosyre fjernes Na-Boc-beskyttelsesgruppen, aminogruppen neutraliseres og acetyleres med enten 10 gange overskud af N-acetylimidazol i dichlormethan (6-8 timer) eller med 2 gange overskud af en l:l-blanding af eddikesyreanhydrid:pyri-din i dichlormethan (1-2 timer), og den resulterende, beskyt-20 tede peptidharpiks er Ac-Nle-Glu(-r-Bzl)-His(Nlin-Tos)-D-Phe--Arg(N9-Tos)-TrpiN^-For)-Lys(Ne-2,4,C12Z)-p-MBHA. En portion på 1,0 g (0,6 mmol) af den beskyttede peptidharpiks behandles med 10 ml vandfri HF i nærværelse af en .1 ml anisol og 0,8 ml 1,2-dithioethan i 45 minutter ved 0°C. Efter at HF, anisol 25 og 1,2-dithioethan er afdampet i vakuum, vaskes den tørrede produktblanding med tre portioner på 30 ml diethylether, og peptidet ekstraheres med tre portioner på 30 ml 30%'s eddikesyre. Efter lyofilisering af den vandige ekstrakt af peptidet fås dernæst efter lyofilisering 325 mg råt Ac-Nle-30 Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2-peptid som et hvidt pulver. 150 mg råt Ac-[Nle4, D-Phe7, Lys10, Gly11)-a-MSH4_13NH2 underkastes et rensningsskema, som indbefatter opløsning af råpeptidet i 2-4 ml 0,01 M NH4OAc, pH 4,5, og chromatografi på en carboxymethylcellulosekolonne (2,0 x 35 25,0 cm) med en diskontinuerlig gradient (250 ml af hver) 0,01 M (pH 4,5), 0,01 M og 0,2 M NH4OAc (pH 6,8). Den ved 280 nm påviste hovedspids elueres under første halvdel af 22 DK 172760 B1 0,1 M NH4OAc-pufferen (pH 6,8) og lyofiliseres til opnåelse af 104 mg af et hvidt pulver. Det CMC-rene Ac-[Nle4, D-Phe7,

Lys*0, Gly11]-Qt-MSH4_^3NH2 renses yderligere ved HPLC ved anvendelse af 0,1%’s trifluoreddikesyrepuffer og acetonitril 5 som organisk modifikationsmiddel på en semipræparativ "Vydac 218TP15-16 C18RP,,-kolonne (25 cm x 25 mm) . 100 mg af peptidet HPLC-renses til opnåelse af 74 mg rent peptid Ac-[Nle4, D-Phe7, Lys10, Gly11]-a-MSH4_13NH2. En prøve på 40 mg rent Ac-[Nle4, D-Phe7, Lys10, Gly11]-a-MSH4_13NH2 opløses i 1 10 ml 5%'s vandig HCl-opløsning og chromatograferes på en di-ethylaminoethylcellulosekolonne (på saltsyreform) (1,0 x 15,0 cm) med 100 ml 5%'s vandig HCl-opløsning, og den elu-erede spids overvåges ved 280 nm. Lyofilisering af den opsam-lede peptidspids giver 35 mg Ac-[Nle4, D-Phe7, Lys10, Gly11]-15 q-MSH4_13NH2 x HCl-salt. Peptidsaltet opløses i 3 ml tørt DMF og DMF frit for sekundær amin (destilleret fra ninhydrin ved formindsket tryk). Til peptidopløsningen i DMF sættes vandfrit K2HP04, reaktionsblandingen afkøles i et is-salt-bad til 0°C, og 17 μΐ diphenylphosphorylazid tilsættes, og 20 reaktionsblandingen omrøres ved 0°C, hvorefter hele reaktionskolben overføres til et kølerum ved 12°c. Reaktionsblandingen omrøres natten over ved 12eC, og reaktionens afslutning overvåges ved HPLC ("Vydac"-kolonne, 25,0 cm x 4,6 mm) med 0,1% trifluoreddikesyre/CH3CN. Ligeledes anvendes 25 ninhydrinprøven til påvisning af ringslutningens afslutning.

Ac-[Nle4, Glu5, D-Phe7, Lys10, Gly11]-a-MSH4_13NH2 renses, efter at omsætningen er kvalt med 10%'s vandig HOAc-opløs-ning, ved afsaltning på "P4"-polyacrylamidkolonne (80,0 cm 30 x 1,0 cm) ved anvendelse af 30%'s HOAc og renses ved semipræparativ HPLC af 16 mg cyclisk peptid Ac-[Nle4, Glu^, D--Phe7, Lys10, Gly11]-q-MSH4_13NH2.

23 DK 172760 B1

Eksempel 12

Ac-[Nle4, Glu5,D-Phe7, Lys10]-a-MSH4_10NH2 5 Titelforbindelsen fremstilles ved at gå ud fra 2,0 g

Na-Boc-Lys(Ne-2,4-Cl2Z)-p-MBHA-harpiks (1,0 mmol Na-Boc--Lys(Ne-2,4,C12Z)), og den beskyttede peptidharpiks for titelforbindelsen fremstilles efter trinvis kobling af følgende Na-Boc-beskyttede aminosyrer (i tilsætningsrækkefølge) : 10 Na-Boc-Trp(Ni-For); N°-Boc-Arg(N^-Tos); Na-Boc-D-Phe; Na-Boc-His(Nlm-Tos). Den resulterende, beskyttede peptidharpiks, Na-Boc-H is (Nlm-Tos) -D-Phe-Arg (N^-Tos) -Trp (N-^-For) -Lys-(Ne-2,4-Cl2Z)-p-MBHA-harpiks, opdeles i to halvdele. En portion på 1,4 g (0,5 mmol) af den beskyttede pentapeptidhar-15 piks omdannes til den beskyttede titelpeptidharpiks efter kobling af Na-Boc-Glu(·»-Bzl) og NQ-Boc-Nle. Efter kobling af sidste aminosyre fjernes NQ-Boc-beskyttelsesgruppen, aminogruppen neutraliseres og acetyleres som beskrevet i eksempel 11 til opnåelse af den beskyttede peptidharpiks 2 0 Ac-Nle-Glu (t-BzI) -His (Nim-Tos)-D-Phe-Arg(N9-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Ne-2,4,C12Z)-p-MBHA-harpiks. 1,0 g af den beskyt tede peptidharpiks underkastes spaltning med flydende HF, og peptidet behandles som i eksempel 11 til opnåelse af 356 mg af det rå peptid Ac-[Nle4, D-Phe7, Lys10]-a-MSH4_10NH2 25 som et hvidt pulver. 100,0 mg af råpeptidet underkastes det i eksempel 11 beskrevne rensningsskema til opnåelse af 65 mg HPLC-rent peptid Ac-[Nle4, D-Phe7, Lys10]-a-MSH4_10NH2.

40 mg af dette rene peptid ringsluttes ved samme metode som i eksempel 11 til opnåelse af 13 mg HPLC-rent 30 ,-,

Ac-[Nle4, Glu5,D-Phe7, Lys10]-a-MSH4_10NH2·

Eksempel 13 35 Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe, Lys10]-q-MSH4_1QNH4

Ud fra 1,4 g (0,5 mmol) Boc-His (Nim-Tos)-D-Phe-Arg (N*?--Tos) -Trp (N1-For) -Lys(N€-2,4-Cl2Z) -p-MBHa-harpiks fremstilles 24 DK 172760 B1 den beskyttede peptidharpiks af titelforbindelsen ved trinvis kobling af Na-Bos-Asp (/J-Bzl) og NQ-Boc-Nle. Hver enkelt koblingsreaktion gennemfares ved at følge det samme koblingsskema, som er beskrevet under den almene fastfastpeptid-5 metodologi. Efter kobling af sidste aminosyre fjernes Na--Boc-beskyttelsesgruppen, aminogruppen neutraliseres og acetyleres som beskrevet i eksempel 11 til opnåelse af den beskyttede peptidharpiks Ac-Nle-Asp(/3-Bzl)-His(N^m-Tos)-D--Phe-Arg (N^-Tos) -Trp (N*-For) -Lys (Ne-2,4 , C12Z) -p-MBHA. En 10 prove på 1,0 g af den vakuumtorrede peptidharpiks spaltes og behandles som i eksempel 11 til opnåelse af 370 mg råt Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Lys10]-a-MSH4_10NH2. En portion af det rå heptapeptid (110 mg) renses ved den i eksempel li anvendte metode til opnåelse af 82 mg hvidt pulver af det 15 lineære forstadium til titelpeptidet. 40,0 mg rent Ac-[Nle4,

Asp5, D-Phe7, Lys10]-a-MSH4_i0NH2 underkastes ringslutning, således at der efter gennemforelse af HPLC-rensning fås 12 mg rent 20 Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe, Lys10]-a-MSH4_10NH4 .

Eksempel 14 25 Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Orn10]-a-MSH4_10NH2 1,0 g p-MBHA-harpiks (0,7 mmol/g) belastes med Na--Boc-Orn(N-Z) ved anvendelse af det koblingsskema, som er beskrevet ved den almene fastfasemetode. Efter 1 times kob-30 ling standses reaktionen, harpiksen vaskes, neutraliseres, og den frie aminogruppe på harpiksen acetyleres med to gange overskud af l:l-blanding af eddikesyreanhydrid:pyridin i dichlormethan i 1 time. Derefter kobles følgende aminosyrer med godt resultat til harpiksen ved trinvis kobling: 35 Not-Boc-Trp(Ni-For) ; Na-Boc-Arg (N^-Tos) ; Na-Boc-D-Phe;

Na-Boc-His (N-^-Tos) ; Na-Boc-Asp(/3-Bzl) ; Na-Boc-Nle. Hver enkelt koblingsreaktion gennemføres ved at følge samme koblingsskema, som er skitseret under den almene fastfasepeptid- 25 DK 172760 B1 metodologi. Efter kobling af sidste aminosyre fjernes Na--Boc-beskyttelsesgruppen, den N-terminale aminogruppe neutraliseres og acetyleres til opnåelse af den beskyttede peptidharpiks Ac-Nle-Asp (Æ-Bz 1) -His (Nlm-Tos) -D-Phe-Arg (N*?-5 -Tos)-Trp(N^-For)-Orn(N-Z)-p-MBHA-harpiks. 1,0 g af den vakuumtørrede peptidharpiks spaltes og behandles som beskrevet i eksempel 11 til opnåelse af 332 mg råt Ac-[Nle4,

Asp5, D-Phe7, Orn10]-<*-MSH4_10NH2. 105 mg af det rå hepta-peptid renses ved den i eksempel 11 anvendte metode til 10 opnåelse af 78 mg hvidt pulver af det lineære peptid. En prøve på 40,0 mg rent Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Orn10)-or--MSH4_10NH2 underkastes den i eksempel 11 anvendte ringslutningsmetode til opnåelse af, efter passende oparbejdning, 15 mg rent 15 ,-,

Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Orn10]-a-MSH4_1oNH2.

Eksempel 15 20 Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Dab10]-a-MSH4_10NH2 1,0 g p-MBHA-harpiks (0,7 mmol/g) kobles med Na-Boc--DabiN^-Z) ved anvendelse af det koblingsskema, som er beskrevet ved den almene fastfasemetode. Efter 1 times kobling 25 standses reaktionen, harpiksen vaskes, neutraliseres, og de uomsatte aminogrupper på harpiksen acetyleres med et l gange overskud af en l:l-blanding af eddikesyreanhydrid:pyridin i dichlormethan i 1 time. Derefter kobles følgende aminosyrer successivt til harpiksen ved trinvis kobling: Na-Boc-Trp(N*--30 For); N“-Boc-Arg (N^-Tos) ; Na-Boc-D-Phe; Na-Boc-His (Nlrn-Tos); NQ-Boc-Asp(/3-Bzl) ; Ntt-Boc-Nle. Efter kobling af sidste aminosyre fjernes N°-Boc-beskyttelsesgruppen, den N-terminale aminogruppe neutraliseres og acetyleres som beskrevet i eksempel 11 til opnåelse af den beskyttede peptidharpiks 3 5 Ac-Nle-Asp (/?-Bzl) -His (N^-Tos) -D-Phe-Arg (N^-Tos) -Trp (N1- -For) -Dab (Ν'*-Z) -p-MBHA. 1,0 g af den vakuumtørrede peptidharpiks spaltes og behandles til opnåelse af 318,2 mg råt Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Dab10]-a-MSH4_10NH2. 100,0 mg af 26 DK 172760 B1 det rå heptapeptid renses til opnåelse af 78,2 mg hvidt pulver af det lineære peptid. 45,0 mg rent Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Dab10]-a-MSH4_10NH2 ringsluttes og renses som ovenfor beskrevet til opnåelse af 13,2 mg rent 5 i-1

Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Dab10]-a-MSH4_10NH2.

Eksempel 16 10 Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Dpr10]-a-MSH4_10NH2 1,0 g p-MBHA-harpiks (0,7 mmol/g) kobles med NQ-Boc--Dap(NØ-Z) ved anvendelse af det koblingsskema, som er beskrevet ved den almene fastfasemetode. Efter 1 times kobling 15 standses reaktionen, harpiksen vaskes, neutraliseres, og den uomsatte aminogruppe på harpiksen acetyleres med to gange overskud af en l:l-blanding af eddikesyreanhydridtpyri-din i dichlormethan i 1 time. Derefter kobles følgende aminosyrer successivt til harpiksen ved trinvis kobling: NQ-Boc-20 Trp(N^-For); Na-Boc-Arg(N^-Tos); NQ-Boc-D-Phe; Na-Boc-His-(Nim-Tos) ; Na-Boc-Asp(/3-Bzl) ; NQ-Boc-Nle. Efter kobling af sidste aminosyre fjernes Na-Boc-beskyttelsesgruppen, den N-terminale aminogruppe neutraliseres og acetyleres som i eksempel li til opnåelse af den beskyttede peptidharpiks 25 Ac-Nle-Asp (/J—Bzl)-His(Nim-Tos) -D-Phe-Arg (N^-Tos) -TrpfN1-For)-Dpr(0-Z)-p-MBHA. 1,0 g af den vakuumtørrede peptidharpiks spaltes og behandles som skitseret under 1 til opnåelse af 310,8 mg råt Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Dpr10]-a-MSH4_10NH2.

115,0 mg af det rå heptapeptid renses ved fremgangsmåden 30 ifølge eksempel 11 til opnåelse af 82,5 mg hvidt pulver af det lineære peptid. 38,3 mg rent Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7,

Dpr10]-q-MSH4_10nh2 ringsluttes og renses som ovenfor beskrevet til opnåelse af 11,3 mg rent 35 Ac-[Nle4, Asp5, D-Phe7, Dpr10]-a-MSH4_10NH2.

De biologiske styrker af α-MSH, de lineære og de cycliske analoge er blevet bestemt ved deres evne til stimulering af melanosomdispersion in vitro ved frø- og firben- 27 DK 172760 B1 bioafprøvninger. Disse afprøvninger in vitro tilvejebringer skarpe dosis-reaktion-kurver (mellem 2,5 x lo-11 og 4 x 10-10 Qg jcan påvise en minimal koncentration af α-MSH på ca. 10-11 M. Afprøvningen er baseret på den centrifugale 5 dispersion af melanosomer (melaningranuler) under de dendri-tiske processer af dækhudsmelanophorer, som fører til mørkfarvning af huden. Alle forsøgsopløsningerne er blevet fremstillet via seriefortyndinger ud fra en stamopløsning (10-4 M) . De ved disse bedømmelser anvendte frøer (Rans pipiens) 10 er opnået fra Kons Scientific, Germantown, WI, og firbenene (Anolis carolinensis) er fra Snake Farm, La Place, LA. Biologiske aktiviteter af de cycliske a-melanotropinanaloge er angivet i nedenstående tabel.

15 -

Biologisk stvrke Restaktivitet

Analog Frø Firben Frø Firben 20 a-MSH 1,0 1,0 p(—) p(—) 15 1,0 6,0 p(+) p(+) 16 0,5 9,0 p(+) p(+) 25 17 0,5 90,0 p(+) p(+) 18 1,0 20,0 p(—) p(-) 30 19 1,0 5,0 p(—) p(~) 20 0,01 5,0 p(-) p(-) 35 I US-patentskrifterne nr. 4.457.864 og 4.485.039, hvortil der her skal henvises, er angivet vigtigheden af konformationel ufrihed af det aktive sted i a-MSH. Ring-slutningsufrihed for α-MSH i stillingerne 4 og 10 ved anvendelse af pseudoisosterisk ombytning af Met-4 og Gly-10 med 40 Cys-aminosyrer har resulteret i mange gange forøgelse i melanocytdispergeringsaktivitet for den syntetiserede analoge. Denne styrkeforøgelse for de cycliske analoge sammenlignet med den hos deres lineære forgængere er tydeligvis af- 28 DK 172760 B1 hængig af det anvendte bioafprøvningssystem. Hovedinteressen har været at opnå analoge med hej styrke på firbenhud, da aktiviteten ved sidstnævnte bioafprøvning er lineært kor-releret til aktiviteten i pattedyrsystemer. Hovedegenskaberne 5 hos I—7-1 1n [Cys*, Cys-LU]-a-MSH-cycliske analoge har været, at de har udvist lav aktivitet ved firbenhudbioafprøvning og høj styrke i frøhud, tillige med 500 gange nedsættelse i aktivitet ved 10 ringstørrelsesformindskelse (22-leddet ring) eller -forøgelse (24-leddet ring) i sammenligning med den optimerede ringstørrelse (23-leddet ring). Den konformationelle ufrihed hos a--MSH ved lactambinding mellem aminosyrer i stillingerne 5 og 10 har resulteret i en gruppe cycliske forbindelser, som 15 udgør en del af den foreliggende opfindelse. Med ringstørrelsen centreret ved en 23-leddet ring har forbindelsen 17 givet den højeste biologiske styrke i firbenhud uden stor ændring i styrken ved frøhudafprøvningen. Forøgelsen i styrke mellem den cycliske forbindelse og dens lineære forgænger 20 er af størrelsesordenen 10 gange. Styrken af den cycliske analoge 16 er ikke påvirket meget sammenlignet med den lineære, men med én vigtig ændring, nemlig fremkomsten af langvarig aktivitet i den cycliske analoge. Det C-terminale tripeptid, Gly-Pro-Val, har ingen virkning på styrken af 25 disse analoge, således som forbindelse 15 afslører. Der er en vigtig faktor i disse cycliske lactampeptider, nemlig den mere langvarige aktivitet hos de cycliske forbindelser sammenlignet med den, som findes i de lineære. Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse er α-MSH overlegne i en 30 eller flere af følgende egenskaber: styrke som målt ved frø- og/eller firbenafprøvning in vivo og in vitro, varigheden af virkningen in vivo ved sådanne afprøvninger og/eller modstandsevnen mod nedbrydning af blodserumenzymer.

De forbindelser, som kan anvendes ifølge opfindelsen, 3 5 kan indgives transdermalt og formuleres til egnede præparater bestemt af den tilsigtede indgiftsmåde efter metoder og processer, som er velkendt for fagfolk på området. Som an- 29 DK 172760 B1 vendt i nærværende beskrivelse skal udtrykket "transdermal" forstås i sin bredeste forstand, dvs. indgivelse tværs igennem et epithellag i celler. På denne måde anvendes udtrykket hensigtsmæssigt som betegnelse for topiske, orale, pernasale 5 og andre indgiftsmetoder. F.eks. kan de forbindelser, som er egnede til anvendelse ifølge opfindelsen, formuleres eller blandes med forskellige konventionelle grundmasser til sådanne præparater som cremer, salver, geler, lotioner, tabletter eller sprays afhængigt af den ønskede indgiftsmåde 10 til et individs hud. Ved fremstillingen af disse præparater kan midlet også blandes med konventionelle fortykkelsesmidler, blødgøringsmidler, overfladeaktive midler, pigmenter, parfumer, konserveringsmidler, fyldstoffer og emulgeringsmidler, som alle er velkendte og konventionelt anvendt ved 15 formuleringen af transdermale præparater. Typisk vil disse ikke-aktive ingredienser udgøre hovedparten af det færdige præparat. Fortrinsvis fremstilles præparaterne således, at de tillader langsom frigivelse eller tidsbestemt frigivelse.

De bemærkelsesværdige egenskaber hos forbindelserne 20 ifølge opfindelsen gør dem også værdifulde som erstatninger for ct-MSH og [Nle4]-a-MSH i eksisterende diagnostiske, terapeutisk og grundlæggende research-skemaer. På området diagnostiske metoder er det indlysende, at forbindelser ifølge opfindelsen, især dem, som er blevet radioaktivt ioderet 25 eller koblet med gammastråleudsendende stoffer, er ekscep-tionelt velegnede til anvendelse ved lokalisering og/eller differenskarakterisering af melanomaceller på basis af associering med melanotropinreceptorer i sådanne celler. Serumstabiliteten af forbindelser ifølge opfindelsen gør dem til 30 hovedkandidater i foreslåede, selektive medikamentfrigi-velsessystemer, ved hvilke målvævene vides at have høje koncentrationer af melanotropinreceptorer. Den relativt høje styrke og langvarige aktivitet af forbindelser ifølge opfindelsen i farveændringsforbundne fænomener forventes at 35 blive fordoblet i sammenhæng med andre biologiske virkninger, som tidligere er iagttaget for naturligt forekommende melano-cytstimulerende hormon og dets syntetiske analoge.

Claims

1. Lineær α-MSH-analog, som er en Ac-a-MSH4 analog med den almene formel

2. Lineær α-MSH-analog, kendetegnet ved, 10 at den er valgt blandt: Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2 Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2 Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2 15 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH2 Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2 Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH2 Ac-Nle-Asp-His~D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH2 20 Ac-Nle-Glu-His~D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH2 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH2 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dpr-NH2 Ac-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2 Ac-Nle-Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2. 25

3. Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH2 i f Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH2 j--—-, Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dpr-NH-, 40 ^ DK 172760 B1

3. Cyclisk α-MSH-analog, kendetegnet ved, at den er valgt blandt: Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2 3. i--- , Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2 I-;--- Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2 I 1

4. Lægemiddel, kendetegnet ved, at det indeholder en forbindelse ifølge ethvert foregående krav og et farmaceutisk acceptabelt bærestof eller fortyndingsmiddel.

5. Kosmetisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1-3 sammen med et kosmetisk acceptabelt bærestof eller fortyndingsmiddel .

5 Ae[Nle4, Xxx5, D-Phe7, Yyy10]-a-MSH4_10NH2, hvori Xxx er Glu eller Asp, og Yyy er Lys, Orn, Dab eller Dpr.

6. Anvendelse af en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1-3 til fremstilling af et medikament med melanotro-pisk virkning.

7. Anvendelse af en forbindelse ifølge ethvert af 15 kravene 1-3 til fremstilling af et medikamentudleveringssystem.

8. Anvendelse af en forbindelse ifølge ethvert af kravene 1-3 til fremstilling af et diagnostisk middel. 20