PT87560B

PT87560B - Processo de preparacao de analagos lineares e ciclicos de fragmentos alfa-msh com potencia extraordinaria

Info

Publication number: PT87560B
Application number: PT87560A
Authority: PT
Inventors: Victor J Hruby; Fahad A Al-Obeidi; Mac E Hadley
Original assignee: University Patents Inc
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1988-05-23
Publication date: 1992-09-30
Also published as: DK277788A; DE3851002D1; IE881537L; EP0292291A3; CN1032795A; AU1650688A; EP0292291B1; EP0292291A2; DK277788D0; PH25819A; FI882380A; FI882380A0; AU618733B2; PT87560A; JPH0826077B2; JPS6470499A; CA1340107C; CN1031242C; DK172760B1; ATE109793T1

Description

Em virtude do apoio parcial proporcionado por concessões do United States Public Health Service (Serviço de Saúde Público dos Estados Unidos) e da National Science Foundation (Fundação de Ciência Nacional) para realizar a presente invenção, o Governo dos Estados Unidos tem determinados direitos em relação a esta tecnologia sob a norma 35 USC 202.

A presente invenção refere-se a uma nova classe de análogos de fragmento linear e cíclico, não descritos anteriormente, de alfa-MSH, ao processo de estimulação de me 1anocitos .em vertebrados pela aplicação transdérmica deste análogos, e a composições úteis no processo.

Nos vertebrados, a cor da sua pele, pêlo e plumagem são determinadas pelo número e distribuição de certas células que detêm a cor, por exemplo melanocitos, cujo número e distribuição está sob controlo genético. Os melanocitos em mamíferos estão localizados na camada de base da epiderme, na junção derme-epiderme, e dentro de folículos dos cabelos. A síntese de pigmento (meianina) dentro destes melanocitos é controlada pela actividade de um enzima, a tirosinase, que está localizada num organelle (pequeno orgao) intracelular, a preme 1 anos soma. Por activação da tirosinase, quer o pi gme n t o e ume lanina (castanho-

-preto) quer o pigmento feomelanina (amarelo-vermelho) é depositado dentro do pequeno orgão; depois de completada a melanização, a preme 1 anos soma é conhecida como uma melanossoma, mais especificamente, quer uma eume 1 anos soma quer uma feome 1 anos soma, dependendo da cor Qver Fitzpatrick, T.B., Y.Hori, K.Toda, M.Seiji, Jap.J.Derm. 79:278

Os· melanossomas são proporcionados aos queratinocitos circundantes da pele ou às células dentro do veio do cabelo em crescimento peio processo conhecido como secreção citocrina.

Embora a síntese de melanina e os padrões de pelagem sejam expressos geneticamente, a mudança da melanogénese folicular e da cor da pelagem em alguns mamíferos pode ser controlada hormonalmente pela a 1fa-me 1 anotropína (também conhecida como hormona de estimulação alfa-melanocito, isto é, alfa-MSH), un tridecapéptido linear da fórmula:

Ac-Ser-Ty r-Ser-Me t-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NF^

Esta hormona é derivada de ura proteína de elevado peso mo lecular, percursora, a proopicmelanocortina, segregada pelos níveis intermédios da glândula pituitária, e estimula a actividade de adenilato ciclase, a actividade da tirosinase, e a subsequente produção de melanina [ver Hadley, M.E., C.B. Heward, V.3. Hruby, T.K.Sawyer, e Y.C.S.Young, Pigment Cel 1 6:323 (1980 )] .

Nos seres humanos, a alfa-MSH é aparentemente encontrada apenas na glândula pituitária do feto e não no adulto. Em seres humanos adultos, um certo nível de produção de me 1anina égeneticamente determinado e está essencialmente presente. A síntese de melanina variável acima e para além deste nível de linha de base está directamente 'Ν dependente da estimulação UV, por exemplo a luz do sol; a exposição aos raios de sol a níveis elevados aumentou a produção de melanina, com o consequente escurecimento da pele. Esta resposta pode ser uma adaptação evolucionária para proteger a pessoa contra o envelhecimento e propriedades mutagénicas de UV. A exposição a baixos níveis de UV resulta em níveis inferiores de síntese de melanina integumenta 1, desvanecimento da cor da pele, e um efeito de bloqueio diminuído que permite à pele absorver maiores quantidades de radiação. Embora os adultos não sintetizem alfa-MSH na glândula pituitária, os melanocitos humanos responderão a esta hormona (e uma preparação racemizada da me sma).

A hipopigmentação da pele em seres humanos resulta dos defeitos’ locais na produção de melanina dentro dos melanocitos; todavia, a etiologia para muitos destes distúrbios h i ρ o p i gme ntários é ainda desconhecida.

Calcula-se que aproximadamente 1% da população do mundo está alectada ccm alguma forma de disfunções de hipopigmentação. Embora se saiba que a alfa-MSH e certos análogos de alfa-MSH podem provocar o escurecimento em anfíbios quando administrados subcutaneamente, e que a alla-MSH esta associada com o escurecimento da pele dos seres humanos adrenaleciomizados quando administrada i n t r arnu s cu 1 a rme n t e ÇLernei, A.B., e 3.S. McGuire, N.E. J.Med. 2 7 0 : 5 3 9 - 5 4 6 (l 9 6 h) J , estas vias de administração não são adequadas para aplicação repetida necessária para conseguir e manter o efeito desejado. Antes do presente invento não eram conhecidos quaisquer meios adequados para o tratamento destas doenças de h i pop i gmen tação.

Descobriu-se agora que alguns análogos de alfa-MSH podem efectivamente ser administrados transcutaneamente, e estes compostos atingirão os melanocitos na forma activa para estimular a produção de melanina. Assim, de acordo com a presente invenção, é agora possível e conveniente aplicar composições tópicas que compreendem análogos alfa-MSH para conseguir a normalização de disfunções de hipopigmentação, tal como hipopigmentação pós-inflamatória, incluindo pitiríase, alba, traça multicolor, vitiligo, hipomelanose mosqueada idiopática, e nevus depigmentosos. Além disso, é agora possível conseguir o escurecimento do cabelo grisalho devido ao envelhecimento por aplicação tópica de análogos alfa-MSH. É também possível aumentar o valor comercial das peles de animais por escurecimento através da aplicação tópica destes análogos. Além disso, é agora possível conseguir o escurecimento da pele na ausência total do sol ou irradiação de luz UV (ultravioleta).

Todos os estudos anteriores dos pêptidos relacionados com a alfa-MSH isolados a partir da glândula pituitária mostraram a conservação da sequência Met^- Glu⁵- His⁶- Phe?, Arg8- Trp^- Gly^ (que é Met i on i na-áci do Glutâmico -Histidina -Feni1 a 1anina-Arginina-Triptofano-Glicina) como o núcleo activo comum. Esta sequência de heptapéptido foi sugerida para ser o local activo das hormonas que resultaram da proopiome 1anocortina.

Com base na relação estrutural de alfa-MSH (e seus análogos e fragmentos) para a sua potência biológica, utilizando i n vitro um sistema de bioensaio com pele de rã, o local activo da alfa-MSH aparece para ser a sequência de núcleo activo ccmuri de Ac-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Giy-hH^ convenientanentemodificada. Este fragmento (Alfa-MJ-^ ^θ) foi sintetizado e testado para a sua actividade de estimulação de melanocito na pele da rã e mostrou ser um agonístico fraco quando comparado com a hormona nativa. A permutação do aminoácido na posição 5 (Glu) e 10 (Gly) não tinha, antes da realização do presente invento, sido investigada. A partir da inves-

tigação anterior (ver as Patentes Norte-Americanas N2s. 4.457.864 e 4.485.039 e o Pedido de Patente Norte-Americana NS. de Série 825.262), na qual a presente invenção encontra as suas bases, verificou-se que a substituição de metioniha por norleucina no heptapéptido de núcleo linear activo deu um potente análogo de alfa-MSH. Além disso, a substituição de fenilanina na posição 7 pelo seu enantiómero D-feni1 a 1anina, resultou num análogo biologicamente mais potente possuindo actividade prolongada em ambos os bioensaios reconhecidos (pele de rã e de lagarto). A tabela seguinte resume alguns destes estudos.

Fragmentos Selectivos de Alfa-MSH e Suas Actividades Biológicas na Pele da Rã (Rana p i ριe n s) e do Lagarto (Ano 1i s caro 1i nens i s)

Péptido Potênçia relativa

Rã Lagarto

alfa-MSH	1,0	1,0
Ac-[Nle^{4 * *},D-Phe⁷]-al fa-MSH_1>il3NH₂	60,0	5,0
Ac-alfa-MSH_Zf_₁₀NH₂	0,0003	0,004
Ac- [Nle*J-alfa-M5H₄_₁₀NH₂	0,002	0,06
Ac-(Nle*] -alfa-MSH₄__HNH₂	0,002	1,0
Ac-[Nle*,D-Phe⁷] -aifa-M5H₄__1θΝΗ₂	0,02	10,0
Ac-[Nle⁴,D-Phe⁷]-alf a-MSH₄__HNH₂	0, 16	8,0

A investigação destas relações estrutura-actividade mostrou <dois factores importantes: (1) a substituição do amino,ácido Met com a sua cadeia lateral oxidável por aminoácido Nle oxidativamente estável, que é também um fci4 isostere para Met, resultou em cerca de 10 vezes de aumen to da actividade biológica do fragmento péptido; e (2) a substituição de L-Phe na posição 7 por D-Phe e mantendo

Lys na posição 11 aumenta aind;a mais a actividade biológica da alfa-MSH.

Além disso, os estudos conduzidos sobre análogos alfa-MSH lineares , um número de compostos alfa-MSH constrangidos em conformidade foi sintetizado e testado quanto à POtência biológica. O primeiro análogo estudado foi Ac Ccf S*, Cy s ¹ θ]-a J f a-MSH^ _ | ° qual tinha cerca de 10 vezes a actividade da hormona alfa-MSH nativa no bioensaio da pele da rã e cerca de duas vezes a potência da alfa-MSH no bioensaio da peie do lagarto. O desenho e síntese destes análogos alfa-MSH cíclicos anteriores foram baseados na consideração da estrutura Beta-Turn no centro do núcleo activo (His -Phe -Arg -Trp ) da alfa-MSH, e na importância deste padrão de conformação para a actividade biológica.

A partir dos estudos da actividade da estrutura clássica desta ciasse cíclica de análogos aifa-MSH, foram tiradas várias conclusões: 1) a ciclização entre as posições 4 (Met) e 10 (Gly) por substituição isostérica com aminoácido cisteína aumentou a actividade de dispersão do melanocito em não menos que 10 vezes no bioensaio da pele da rã e duas vezes na pele do lagarto; 2) a substituição de Phe* por D-Phe nestes análogos cíclicos provoca uma dupla actividade na peie da rã e quatro vezes superior no bioensaio na pele do lagarto; 3) a presença de Lys na posição 11 deu sempre análogos mais activos que aqueles que a não continham; e M a redução ou expansão do tamanho do anel da ponte de dissulfureto a partir de um anel com 23 membros provoca severa redução na potência biológica do análogo resultante.

Os resultados destes estudos com análogos alfa-MSH cíclicos são indicados na tabela seguinte:

Potências Relativas in Vitro de Análogos Alfa-MSH Cíclicos nos Bioensaíos na Pele da RS e do Lagarto , Potência *

Analogo Pêptido _Ra Lagarto

Efeito de Substituição de Aminoácidos

a 1 f a-MSH	1,0	1,0
Ac[Cys⁴, Cys¹⁰}-alfa -MSH₁_₁₃NH₂	10,0	2,0
Ac-[Cys⁴, Cys¹⁰]-alfa -MSH₄_₁₃NH₂	30,0	0,6
Ac-[Cys⁴, D-Phe⁷, Cys¹⁰]-alfa -
MSH. _n,NH_o 4-13 2	6,0	6,0
Π 1 Λ Ac-[Cys , Cys ] - alfa -MSH₄^₁₂NH₂	10,0	1,5
1 4 7^10 Ac-[Cys , D-Phe , Cys J-alfa-
MSH. , ₀NH. 4-12 2	20,0	6,0
1 4 ’ iQ Ac-[Cys , Cys ]- alfa -MSH^^NI^	0,16	0,07
/ a *7 1 Λ Ac-[Cys , D-Phe _r Cys ^υ]-alfa-
^MSH4-11^NH2	2,5	3,0
l 4 1 io Ac-[Cys , Cys ]-alfa-MSH_4w10NH₂	0,06	0,003
l 4 7 · 10 Ac-[Cys , D-Phe , Cys ^ul- alfa-
msh₄_₁₀nh₂	0,75	0,5

Ί

Efeitos de Tamanho do Anel **

Ac-[Cys, Cys ]- al fa-MSH₄^₁₃NH₂	30,0	0,60
Γ 4 f ₁₀ [Mpa , Cys ]- alfa MSH₄_₁₃NH₂	30,0
1.0
Γ 4 l i o [Maa , Cys^x]- aifa-MSH₄_₁₃NH₂	0,06	0,06
^4 ' 4 Ac-[Hcy , Cys]- alfa-MSH₄ ₁₃NH₂	0,06	0,70

I *As potências biológicas são medidas em relação à alía-MSH sobre a porção linear da curva dose-resposta.

** Tamanho do Anel = NÚmero de ligações que formam o anel do péptido.

Maa = ácido 2-Mercaptoacético

Mpa = ácido 3-Mercaptopropión1co

Hc y = Homo cisteína

Para maior investigação sobre a relação estrutura-potência dos fragmentos alía-MSH^ jg’^{a re}A^uerente investigou sistematicamente a exigência estrutural para a actividade me 1anotrópica de um certo número de análogos de alfa-MSH^ lineares não descritos anteriormente com ênfase sobre o efeito de substituição nas posições 5 e 10.

Com base nos resultados obtidos para os análogos alfa-MSH lineares, a requerente investigou ainda .una espécie diferente de análogo alfa-MSH limitado em conformidade. Abreviadamente, fabricaram-se e concentraram-se fragmentos 4-10 e (4-13) de alfa-MSH com a estrutura geral:

Ac-[N1e^-Xxx⁵, D-Phe⁷,Yyy¹⁰] -a 1fa-MSH^_j_θΝΗ_? em que o aminoácido Xxx é quer ácido glutâmico (Glu) quer ácido aspártico (Asp) (que é um dos ácidos mono amino

dicarboxί1icos), e em que o aminoácido Yyy é um aminoácido básico, lisina, ornitina, ácido 2,4 - diami nobutírιco (Dab) ou ácido 2,3 - diaminopropiónico (Dpr). Os análogos Ac-alfa-MSH^ jθ lineares indicados nas tabelas seguintes foram sintetizados pelos métodos sintéticos de péptido de fase sólida utilizando resina p-meti1benzidrilamina, como um suporte sólido, e purificada por métodos relacionados com os anteriormente utilizados para a alfa-me 1 anotropina e análogos.

Estrutura dos Análogos Al fa-Melanotropina

N9.

Sequência Primária

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1. Ac-Ser-Try-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val~NH₂

2. Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH₂

3. Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-Ní^

6.

7.

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NU^

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH₂

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg~Trp-Gly-NH₂

Ac-Nle-Glu-Hís-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH.9.

10.

11.

12.

Ac-Nle-Asp-His~D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH2

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH₂

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH₂

Ac~Nle-Asp-íiis-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH₉

13.

14.

15.

Ac-Nle~Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂

Ac-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂

Ac-Nle~Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂

ANÁLOGO

1.	alia -MSH
2.	Ac-[Nle⁴, D-Phe⁷, Lys¹⁰, Gly¹¹]-alfa -MSH₁_₁₃NH₂
3.	Ac-[Nle⁴, Asp⁵, D-Phe⁷, Lys¹⁰, Gly^1:L]-alfa -MSH₁_₁₃NH₂
4.	Ac-[Nle⁴, D-Phe⁷, Lys¹⁰, Gly^1:L]-alfa -MSH₄_₁₃NH₂
5.	4 5 7 1 f) 11 Ac-[Nle\ Asp , D-Phe', Lys , Gly ^Α] - a 1fa -MSH₄_₁₃NH₂
6.	Ac-[Nle⁴, Asp⁵, D-Phe⁷]-alfa -MSH₄__1QNH₂
7.	Ac-[Nle⁴, D-Phe⁷, Lys¹⁰,] -.al ia -MSH₄__1QNH₂
8.	Ac-[Nle⁴, Asp⁵, D-Phe⁷, Lys¹⁰]-a 1 fa -MSH₄__1QNH₂
9.	Ac-[Nle⁴, D-Phe⁷, Orn¹⁰] -.a 1 f a -MSH₄_₁₀NH₂
10.	Ac-[Nle⁴, Asp⁵, D-Phe⁷, Orn¹⁰]-alfa -MSH₄_₁₀NH₂
11.	Ac-[Nle⁴, D-Phe⁷, Dab¹⁰]-alfa -MSH_4-1QNH₂
12.	Ac-[Nle⁴, Asp⁵, D-Phe⁷, Dab¹⁰]-alfa -MSH₄__1QNH₂
13.	a 5 7 in Ac-[Nle , Asp , D-Phe , Dpr ]-alía -MSH_4>_₁qNH₂
14.	Ac- [Nle⁴, Lys¹⁰] -alfa -MSH₄_₁₍₎NH₂
15.	Ac-[Nle⁴, Asp⁵, Lys¹⁰]-alfa -MSH₄_₁₍₎NH₂

Os análogos lineares de fragmentos alfa-MSH foram manufacturados de acordo com o exemplo seguinte:

EXEMPLO I

Ac-[Nle%D-Phe⁷, Lys¹⁰, Gl y ¹ *]-a 1 f a-MSHj _ _{} 3}ΝΗ_?

Este composto foi preparado ligando N*-Boc-Val (o termo Boc significa t-butil oxicarboni1 o) à resina de p-met i lbenzidr i lamina (2,0 g de resina pMBHA, 0,7 rrmo 1 c de NH₂/g de resina) utilizando um excesso triplo de amínoá10

S'‘

eido e utilizando métodos de fase sólida da síntese do pêptido. Passados 90 minutos a resina foi lavada com diclorometano, neutralizada e o grupo amino acetilado com uma mistura de anidrido acético-piridina. Nao foram detectados quaisquer grupos amino reactivos na resina pelo teste da ninidrina passados 30 minutos. Um ciclo de ligação de cada resíduo de aminoácido à cadeia de pêptido em crescimento consistiu no seguinte: 1) Lavagem com 4 porções de 30-ml de CH₂C1_2> 2 mi n./1avagem; 2) Clivagem do grupo Boc por 30 ml de ácido trifluoroacético a 48% em diclorometano contendo 2% de anisole, um tratamento durante 5 min., um segundo tratamento por 20 min.;

3) Lavagem com 4 porções de-30 mi de dic1 orometano,2 min./ /lavagem; 4) Neutralização por adição de duas porções de 30-ml de diisopropi1 eti1ami na a 10% em diclorometano, e agitando cada uma durante 2 min.; 5) Lavagem com 4 porções de 30-ml de diclorometano, 2 mi n./1avagem;

6) Adição de 3 equivalentes de derivado Boc amino (neste caso 2,1 rnrole) em 5 ml de diclorcmetano, 2,4 equivalentes de N-hidroxibenzotr iazole de 1 nmole/ml de solução de HOBt em DMF (d imet i 1 f orrfiami da ) (excepto no caso de N-Boc-N^imTos His), (o termo N^imTos significa N-imidazol tosil), seguida por 2,4 equivalentes de D02 de ima solução de 1 nmole/ml de EXE em DMF. A mistura foi então agitada durante 2-3 horas (no caso de Trp, Arg e His, foi utilizada DMF como um dissolvente de ligação); 7) Depois de completada a ligação (ninidrina negativa) efectuou-se a lavagem com três porções de 30-ml de diclorometano , 2 mi n ./1 avagem; 8) Lavagem com uma porção de 3 ml de etanol a 100%, 2min./1avagem;

9) Lavagem com quatro porções de 30 ml de diclorometano, min./1avagem. A resina de pêptido protegida que corresponde ao composto do título foi obtida depois da ligação por fases dos seguintes aminoácidos N^-Boc (ou derivados) e foi realizada (na ordem da adição): N^-Boc-Pr og; N^Boc-Gly, N°^Boc-Ly s - (N^ C1Z) 5 N^Boc-N*-For-Trp ,

N^-Boc-N^-Tos-Arg, N* Boc-D-Phe, N°^Boc-N^im-Tos-Hi s (o g i termo N^& significa N-guanidino; N significa N-indolil,

1 e 2C1Z significa 2-c 1 or obenz i 1 ox i car b i-no 1). A resina Boc-His (N^^m-Tos) - D - Phe - Arg (N^-Tos)-Trp (N*-For)-Lys (N^€-2C1Z) - Gly - Pro - Vai - p -MBHA resultante foi dividida em quatro porções. Um quarto (1 ,0g~0,5 nrmole) da resina de pêptido protegida foi transformado na resina de pêptido protegida do título depois de se ligar N^-Boc-Gl u-Jf-Bz 1 , N^Boc-Nle, N^Boc-Ser (O-Bzl), N^-Boc-Tyr (0-2 BrZ); N°^Boc-Ser (0-Bzl) (o termo 2BrZ significa 2-bromo-benziloxicarboni1). Depois da ligação do ultimo aminoácido, o grupo protector N -Boc foi removido, o grupo amino neutralizado, e o pêptido protegido foi

I N°^acetilado com um excesso de 10 vezes de N-aceti1 -imi dazol em 20 ml de diclorometano e a resina de pêptido protegida resultante, a resina Ac-Ser-(0-Bz1)-Tyr (0-2-BrZ)-Ser ( 0-Bz 1 )-NI e-Gl u-(íf-Bz 1 )-Hi s (N^im-Tos)-D-Phe-Arg (N^g-Tos)Trp (N‘-For)-Lys (N^Ê-2-C1 Z) -G1y-Pro-Va1 -p-MBHA, foi seca i n vacuo. A resina de pêptido protegida (1,0 g) foi clivada a partir da resina por meio de HF líquido. Depois da evaporação de materiais voláteis i n vacuo a 0°C, o produto que foi seco foi lavado com éter etílico (3 x 30ml ) , extraído com HOAc aquoso a 30% (3 x 30 ml), e liofilizado. O pó de pêptido (530 mg) foi dividido em duas porções (260 mg cada), e uma porção foi dissolvida em 1,5 ml de tampão de acetato de amónio (pH Q,5), filtrada através de um filtro em forma de cartucho, no topo de uma coluna CMC (2,0 x 30,0 cm), e eluida utilizando cada uma 250 ml de 0,01 M (pH 4,5), 0,1 M (pH 6,8), e 0,2 M (pH 6,8) de NH^CAc . O pico maior detectado a 280 nm foi eluido entre o fim de 0,1 e a primeira metade da fracção 0,2 M NH^OAc, e foi liofilizado para dar 142,3 mg de pó branco. Foram purificados 80,0 mg do pó de pêptido sobre HPLC preparativo, e o pico maior reunido e liofilizado para dar 63 mg do pêptido do título.

EXEMPLO II

Ac-[Nle\ Asp⁵, D-Phe⁷,Lys¹⁰, G1 y ¹¹]-a 1 f a-MSH₁ _ _{} 3}NH₂

Este composto foi preparado a partir de 1,Og ( 0,5 rrmole). de resina N^Boc-His(N^im-Tos)-D-Phe-Arg-(N^g-Tos)-Trp-N¹-For)-Lys-(N^'-2-ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA por ligação por fases de N^Boc-Asp ( 0-Bz 1 ) , N°í-Boc-Nle, N -Boc-Ser(0- BZ1 ), N^-Boc-Tyr (0-2-BrZ), hftoc -Ser(O-Bzl). Cada ligação foi conseguida pelo mesmo caminho anteriormente mencionado. A acetilação da resina de tridecapapéptido protegida foi realizada mediante um excesso de dez vezes de N-acetί1imi dazo 1 e em diclorometa no (5h) , depois de desprotecção e neutralização do grupo Boc de N-terminal. A resina Ac-Ser(O-Bzl)-Tyr(0 - 2-BrZ)-Ser(0-Bzl)-Nle-Asp(O-Bzl)~His(N'-Tos)-D-Phe-Arg-(N&-Tos) -Trp(N¹-For)-Lys(N^2-C1Z)-Gly-Pro-Va1-p-MBHA foi seca in vacuo para dar 1,Sg de resina de péptido protegida. 1,Og da resina de péptido protegida foi clivado por HF líquido e depois da evaporação dos materiais voláteis, lavado com dietiléter (3x30ml), o péptido extraído com HOAc aquoso a 30% (3x30ml), e liofilizado. Uma porção do tridecapéptido bruto (20 Omg) foi dissolvida em l,5ml de t amp ã o NH^OAc (pH 4,5), filtrada através de um filtro em forma de cartucho dentro do topo da coluna CMC(2,0x30,0 cm), e eluida com a mesma sequência do gradiente descontínuo de NH^OAc, como mencionado no Exemplo I. O péptido separado depois da liofilização tinha 152mg. Uma quantidade de 10Omg deste péptido bruto foi ainda purificada medían te HPLC, para dar 67mg do péptido do título.

EXEMPLO II1

Ac-[Nle\ D-Phe⁷, Lys¹⁰, Gly¹¹]-aJfa-MSH^_₁₃NH₂

A partir de 1, Og (0,5 rrmole) de resina Boc-His (N^im-Tos )-D-Phe-Arg-(N^g-Tos )-Trp(N‘-For )-Lys (N^L-2-ClZ)-Giy-Pro-Va1-p-MBHA, o péptido do título foi sintetizado pela técnica de fase sólida depois da ligação por fases de N°^Boc-Glu(|f-Bzl ) , e N°^Boc-Nle. Cada reacção de ligação foi realizada como nos exemplos anteriores, excepto i 3 no facto da acetilação do N-final ter sido realizada por um excesso duplo de anidrido acético-piridina 1:1, em di clorometano durante 1 hora. O péptido 4 foi obtido na forma purificada, como indicado no Exemplo II, para dar um pó branco com um rendimento de 22%.

EXEMPLO IV

Ac-^Nle^, Asp^, D-Phe⁷, Lys^, G1 y ]-a 1 f a-MSH^

A partir de 1 ,0g ( 0,5 rrmole) da resina Boc-His (N^im-Tos )-D-Phe-Arg (N^-Tos )-Tr p (N¹-For)-Lys (N^L-2-CJZ)-Gly-Pro-Va 1 -p-MBHA, preparada como no Exemplo I, foi pre parado 0 péptido do título, mediante ligação por fases de N°^Boc-Asp (jô-Bz 1 ), e N°^Boc-Nle. Foi utilizada a mesma técnica descrita no Exemplo I, no processamento da resina de péptido protectora resultante. O péptido desejado rendeu 53 mg de péptido HPLC puro, partindo de 130 mg de péptido bruto previamente purificado com cromatografia CMC, como indicado no Exemplo I.

EXEMPLO V

Ac [Nle⁴, D-Phe⁷, Ly s ^{1 0} ]-a 1 f a-MSH^ _ j _QNH₂

2,7g de resina de p-meti1benzidri1ami na (0,7 rrmole de NH₂/g de resina) foram suspensos em diclorometano e lavados três vezes com porções de 30ml de diclorometano. A resina lavada foi então agitada durante duas horas em diclorometano, antes de se separar 0 disso^ vente por filtração. A resina MBHA intumescida foi neutralizada e ligada com aminoácidos, como indicado no Exem pio I. Os derivados de aminoácido seguintes foram ligados na resina (pela sua ordem de ligação): N -Boc-D-Lys (Ν^-2-ClZ), N^-Boc-Trp-(N¹-For ) , N^-Boc - Ar g (N^g - To s ) ,

N *Boc-D-Phe, N^-Boc-Hi s - (N^im-Tos ). A resina Boc-His(N^irn-Tos) -D-Phe-ArgíN^-TosJ-TrpíN^For )-Lys(N -2-ClZ)-p-IVBm resultante foi

dividida em duas porções. Una parte da resina foi ligada por fases: N ^Boc-Gl u (jjf-Bz 1 ) e N^Boc-Nle. A resina de péptido acabada foi deboxilada, e o N-terminal acetilado com um excesso duplo da mistura 1:1 de anidrido acético-piridina em diclorometano, durante 1 hora. A resina de péptido protegida acabada foi lavada com diclo rometano e seca i n vacuo para dar 2,lg. Uma porção de 1 ,7g da resina de péptido protegida foi clivada por HF-anisole-ditioetano líquido anidro (17ml de HF, 2ml de anisole, 1 ml de ditioetano). Depois de evaporação dos materiais voláteis o péptido seco e clivado foi lavado ccm 3x3Qnl de éter dietíllco anidro e extraído com 3x30ml de HOAc aquoso a 30%. O extracto aquoso do péptido foi lio filizado para dar 700 mg de péptido bruto. Uma amostra de 300 mg do péptido bruto foi dissolvida em 2ml de tampão NH^OAc (pH ¢,5), e filtrada através de um filtro de cartucho sobre o topo da coluna CMC. O pico maior foi reunido e liofilizado para dar 172 mg de péptido na forma de pó branco. 110 mg do péptido bruto foram purifica dos sobre HPLC para dar 50 mg do péptido do título, puro.

EXEMPLO VI

Ac-jcNle^ Asp⁵, D-Phe, Lys ^{1 0}]-a 1 fa-MSH^_ _QNH₂

A resina de péptido protegida para o composto do título foi preparada a partir de 1,8g de Boc-His(N^im-Tos)-D-Phe-Arg-(N^g-Tos)-TrpíN¹-For)-Lys(N^L-2-ClZ)-p-MBHA mediante ligação por fases de N^-Boc-Asp (/3-Bz 1), e N*-Boc-Nle. Cada reacção de ligação foi realizada com um excesso de 3 vezes de aminoácido (ou derivado) N-Boc, um excesso de 2,4 vezes de DCC, e um excesso de 2,4 vezes de HOBt, seguindo a mesma estratégia anteriormente indicada. Depois da ligação do último aminoácido, o grupo de protecção N^-Boc foi removido, o grupo amino neutraH zado e acetilado com um excesso de 2 vezes da mistura 1:1 de anidrido acético-piridina em diclorometano, durante

hora. A resina Ac-Nle-Asp(^-Bzl)-His(N^^m-Tos)-D-Phe-Arg(N^-Tos )-Trp-(N¹-For )-Lys (Ν^-2-Cl Z)-p-MBHA foi lavada com diclorometano e seca in vacuo para dar 2,lg. Uma amostra de 1,5g da resina de péptido protegida foi cliva da por meio de HF líquido e processada como no Exemplo V, para dar 64 mg do péptido do título, depois da purificação com HPLC de 112 mg de péptido CMC cromatograficamente puro.

EXEMPLO VII

Ac-[Nle\ Asp⁵, D-Phe⁷, Dab^{1 0}J-a 1 fa-MSH^ _1QNH₂

I

A resina de péptido protegida para o composto do título foi sintetizada como no Exemplo V, excepto pelo facto de terem sido utilizados N*-Boc-Dab(N#-Z), e N-Boc-Asp(β-Βζ1), em vez de N^-Boc-Lys(N -2C1Z ) e N^-Boc-Gl u (2f-Bz 1), respect i vamente , no esquema de ligação para dar a resina Ac-Nle-Asp(^-Bzl)-His(N^im-Tos)-DPhe-Arg(N-Tos )-Trp (N¹-For )-Dab (Njf-Z)-p-MBHA. Depois de clivagem e processamento da resina de péptido, como indj_ cado para o Exemplo V, foi obtido o péptido 12 como um pó branco com 36% de rendimento.

| EXEMPLO VIII

Ac-[Nle⁴, Asp⁵, D-Phe⁷, Dpr ¹ ° ] -al fa-MSH^_ _{1 Q}NH₂

A resina do péptido protegida para o composto do título foi sintetizada como no exemplo V, com a excepção de que foi utilizado N^-Boc-Dap (Ν,,β-Ζ) em vez de N^-Boc-Lys (N^v-2-ClZ) e N*-Boc-Asp (0-Bzl) em vez de N°*-Boc-Glu (Jf-Bzl) no esquema de ligação para dar a resina Ac-Nle-Asp (j8-BzI )-Hi s-(N^im-Tos )-D-Phe-Arg (N^S-Tos)-Trp (N^For)-Dap (Νβ-Ζ)-p-MBHA. O péptido foi clivado a partir da resina, e processado como no exemplo V para dar o desejado péptido como um pó branco: rendimento 36%.

EXEMPLO IX

Ac-^Nle⁴, Lys¹⁰]-alfa-MSH_ZA_₁₀NH₂

A resina de péptido protegida para o composto do título foi sintetizada como indicado no Exemplo V, com a excepção de que foi utilizado N^-Boc-Phe em vez de N**-Boc-D-Phe no esquema de ligação para dar a resina Ac-Nle-G1 u (if-Bz 1 )-Hi s (N^im-Tos )-Phe-Ar g(N^-Tos )-Tr p (N* -For)-Lys-(N^-2-ClZ)-p-MBHA. O péptido foi clivado e processado, 7, para dar o composto do título com 40% de rendimento.

) EXEMPLO X

Ac-[Nle\ Asp⁵, Ly s ^{1 0} ]-a 1 f a-MSH^_ j _QNH₂

A resina de pépt.ido protegida para o composto do título foi sintetizada como referido no Exemplo V, com a excepção de que N^-Boc-Phe foi utilizado em vez de N*-Boc-D-Phe e N^-Boc-Asp (/?-Bz 1 ) foi substituído por N^,o<-Boc-Glu(áf-Bz 1 ) no esquema de ligação para dar a resina Ac-Nl e-Asp (P-Bzl) - Phe-Ar g (N-Tos J-TrpíN^-Forl-LysCN^-Z-ClZ)-p-MBHA. O péptido foi clivado a partir da resina, os grupos protectores r emo v i d o s, e o c omp osto do título purificado como anteriormente referido para dar o produto como um pó branco com 37% de rendimento.

As potências biológicas para os análogos lineares fabricados de acordo com os exemplos anteriores são indicadas na tabela seguinte, na qual P indica acção prolongada (+=sim, -=Não) e ND indica que a amostra não influiu no teste específico.

(tabela na Pag. seguinte)

Análogo	Potênc i a	Biológica	Act i vidade	Res i dua1
- Rã	Lagarto	Rã	Lagar to
1	1,0	1,0	P(-)	P (-)
2	6,0	8,0	P( + )	P(-)
3	9,0	8,0	p( + )	P(-)
4	0,8	8,0	P( + )	P ( + )
5	1,0	10,0	P ( + )	p (+)
6	0,1	8,0	P(-)	P(-)
7	0,2	8,0	P(-)	P(-)
8	0,7	8,0	P(-)	P(~)
9	0,6	8,0	P (-)	P(-)
10	0,9	10,0	ND	P(-)
11	• 0,9	10,0	P(±)	p (±)
12	0,9	50,0	P (-)	P(-)
13	0,2	8,0	P (-)	P <-)
14	0,001	0.08 1	P(+)	P(-)
¹⁵	0^004	0_?08	P(+)	P (-)

Os resultados obtidos com os análogos alfa-MSH lineares conformacionalmente constrangidos conduziram a investigações que utilizam um tipo diferente de análogo restricto, análogos alfa-MSH cíclicos conformacionalmente constrangidos.

A síntese de péptido de fase sólida dos análogos de péptido de me 1anotropina cíclicos foi conduzida por meio de técnicas sintéticas de fase sólida convencionais. Em resumo, os aminoácidos N-terc-butiloxicarbonilo (Boc) protegidos e os seus derivados foram ligados a uma resina de p-me ti1benzidri1amina com um excesso triplo do deriva do de aminoácido Boc-protegido, um excesso de 2,4 vezes de N-hidroxibenzotriazoi (HOBt) de uma solução de 1 mmole/ ml em DMF (excepto no caso de His), e um excesso de

2,4 vezes de solução de 1 rrmole/ml de dicic1ohexi1carbo diimida (DCC) em DMF. A reacção de ligação foi realiza da em diclorometano durante um período de 1 a 3 horas, a qual foi controlada por meio de testes de ninidrína e/ou cloraníl, e repetida quando necessário. As cadeias laterais reactivas de aminoácidos foram protegidas como se segue: Lys 2,4-dic1orobenzi1oxicarboni1 o ; Orn, Dab, e Dpr benzi1oxicarboni 1 o; Trp, formilo; Arg, tosilo; His tosilo; Glu e Asp, éster benzilico. A clivagem do grupo protector N*-Boc foi realizada por tratamento com ácido trif1uoroacético a 4&% contendo 2% de anisole em diclorometano , durante 5 a 20 min. cada.

O ciclo para a incorporação de cada resíduo de aminoácido na cadeia de péptido em crescimento consiste no seguinte: 1) lavagem com CHgClg (4x30ml, 1 min./lava gem), 2) a protecção Boc foi removida em cada fase mediante dois tratamentos com TFA a 4%% em CHgClg contendo 2% de anisole, durante 5 a 20 min. cada; 3) lavagem com CHgClg (2x30ml); 4) neutralização com 10% de diisopropiletilamina em (2x30ml, 3 mi n./1avagem) ; 5) lavagem com CH₂C1₂ (3x30ml, 2 min./1avagem) ; 6) adição do derivado de aminoácido Boc-proteg i do em 20ml de CHgC^ (excepto nos casos de Trp, Arg e His em que a DMF foi substituída por CHgClg devido ao problema de solubilidade), seguida por HOBt, seguida por DCC, e agitando durante 1-3 horas; 7) lavagem com CH₂C1₂ (3x30ml, 2 mi n./ 1 avagem); e 8) lavagem com EtOH a 100% (3x30ml, 2 mi n./1avagem) .

A conclusão da ligação foi controlada e, depois da liga ção do último aminoácido, o grupo protector N^-Boc foi removido, o grupo amino neutralizado, e acetilado com um excesso de 10 vezes de N-aceti1imidazoie em CH₂Ci_2>ou utilizando uma mistura 1:1 de anidrido acético : piridina em CH₂C1₂ (excesso de 2 vezes durante 1 hora).

Os pêptidos foram desprotegidos e removidos da resina com HF líquido anidro (lOml/lg de resina), con19 tendo 10% de anisole e 8% de 1 , 2-d i t i oetano a 0°C durante 45 min. Depois da evaporação dos materiais voláteis i n vacuo, os péptidos livres foram lavados com dietiléter ou acetato de etilo (3x30ml), e depois extraídos com irra solução aquosa a 30% de ácido acético (3x30 mi), e água destilada (3x30 ml). O extracto aquoso combinado foi liofilizado para dar un pó branco do pêptido bruto. Cada pêptido foi purificado por cromatografia em coluna sobre resina de carboximet i 1 ce 1 u 1 ose, permutador a de catioes CMM, utilizando gradiente descontínuo de tampão de acetato de amónio como se segue: 250ml de 0,01M NH^OAc(pH 4,5), 250 ml de 0,01 M NH^OAc (pH 6,8), 250ml de 0,1 M NH^OAc (pH 6,8), e 250ml | de 0,2 M NH^OAc (pH 6,8). O pico maior (detecção 280 nm) eluiu durante a última parte de 0,01 M NH^OAc (pH 6,8), e a primeira metade do tampão 0,1 M NH^OAc (pH 6,8) foi liofilizada para dar um pêptido purificado como um pó branco.

A estrutura dos análogos cíclicos de alfa-melanotropina que compreendem uma parte da p-resente invenção é indicada na tabela seguinte:

Estrutura dos Análogos Cíclicos de Alfa-Me1anotropina

N2 _Sequência Primária___

2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13

Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH^ '

Ac-Nle-GÍu--His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH₂

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH„ r——-—, 2 ι θ Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH_ ι- 2

Ac-Nle-Asp-His~D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH„

Ί ........—i 2

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂

NS.

Aná1ogo alfa-MSH

Gly¹¹]- alfa_MSH4_13NH Gly¹¹] alfa -MSH4_₁₃NH₂alfa-MSH₄~₁₍₎NH₂ ^alfa-^MSH4-10^NH2 alía-_MSH₄__loNH₂alfa-MSH₄__1QNH₂ alfa-MSH. - _nNH_o4-10 2 | Os análogos de péptido, de acordo com a presente invenção são preparados de acordo com os seguintes exemplos;

EXEMPLO XI

Ac-[Nle\ Glu⁵, D-Phe⁷, Lys¹⁰, Gly¹¹] -Al fa-MSH^_ ₁₃NH_?

Partindo com 1,0 g de resina N^-Boc-Vai-p-MBHA (0,7 rrmoíe de N^-Boc-Va 1 ), a resina de péptido protegida para o composto do título foi preparada depois da ligação por fases dos seguintes aminoácidos N^-Boc-pr oteg ι dos (por ordem de adição); N^-Boc-Pro; N^-Boc-Gly; N^-Boc-Ly s (N^-2,4-ClZ); N*-Boc-Trp(N^l-For); N^-Boc-Arg-(N^g-Tos) ; N* ) -Boc-D-Phe; N*-Boc-Hi s (N^im-Tos ) ; N^-Boc-Gl u (ί'-Βζ 1 ) ; N⁴*-Boc-Nle. Depois da ligação do último aminoácido,o grupo protector Ν'*-Boc foi removido, o grupo amino neutralizado, e acetilado quer com um excesso de 10 vezes de N-acetiH midazol em diclorometano (6-8 horas), quer com um excesso de 2 vezes de uma mistura 1:1 de anidrido-acético : pi r idj_ na, em diclorometano (1-2 horas), e a resina de péptido protegida resultante foi Ac-Nle-Glu(^-Bz1)-His(N^lm-Tos)D-Phe-Arg(N^g-Tos)-Trp-(N¹-For>Lys(N^-2,4-C1Z)-G1y-Pro-Valp-MBHA. Uma porção de 1,0 g (0,6 nrmo 1 e) da resina de pé ptido protegida foi tratada com lOml de HF anidro, na pre sença de 1 ml de anisole e 0,8ml de 1,2-ditioetano, duran te 45 min., a 0°C. Depois do HF, o anisole e o 1,2-ditio etano foram evaporados i n vacuo, a mistura seca do produ to foi lavada com três porções de 30ml de éter dietflico, e o péptido foi extraído com três porções de 30ml de ácU do acético a 30%. Depois, por liofilização do extracto aquoso do péptido, uma porção de 325 mg do péptido Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH₂ bruto foi obtida como um pó branco. Uma porção de 150 mg de Ac(jMle*, D-Phe⁷, Lys^°, G1 y-a 1fa-MSH^ 13^2 bruto foi submetida ao esquema de purificação que incluía a dissolução do péptido bruto em 2-4ml de 0,01 Μ ΝΗ,ΟΑ , pH 4,5, τ C e cromatografado sobre coluna de carboximetilcelulose (2,0x25,0 cm) com um gradiente descontínuo (250ml cada) de 0,01 (pH 4,5), 0,01, e 0,2 M NH^OAc (pH 6,8) . O pico maior detectado a 280 nm foi eluido durante a primeira metade do tampão 0,1 M NH^OAc (pH 6,8), e foi liofilizado para dar 104 mg de um pó branco. O CMC de Ac-[Nle*,D-Phe⁷, Lys^°, G1 y -al f a-MSH^ 13^2 P^uro ainda purificado por HPLC, utilizando 0,1% de tampão de ácido trifluoroacético e acetonitrilo como modificador orgânico sobre coluna semi-preparadora Vydac 218TP15-16 CjgRP (25 cm x 25mm). Uma porção de 100 mg do péptido foi purífica, r 4 7 da com HPLC para dar 74 mg do péptido Ac-|_Nle , D-Phe , Lys¹⁰, G1 y¹-a 1 fa-MSH^ , ^NH₂ puro. Uma amostra de 40 mg de Ac-JVlle*, D-Phe⁷, Lys m-Gl.y - a 1 f a-MSH^ puro foi dissolvida em 1 ml de solução aquosa de HC1 a 5%, e croma tografada sobre coluna de dieti1aminoeti1ce1u1ose (na forma de ácido clorídrico) ( 1 ,Όχ 1 5 , Ocm), com 100 ml de solução aquosa, de HC1 a 5%, e 0 pico eluido controlado a 280 nm. A liofilização do pico do péptido reunido deu 35 mg de Ac-jNle, D-Phe⁷, Lys*⁰, G1 v * -al f a~MSH^_ j ₃NH₂ x sal de HC1. O sal de péptido foi dissolvido em 3 ml de □VF seca, e EMF livre de amina secundária (distilada a partir de ninidrina sob pressão reduzida), λ solução de péptido em DMF foi adicionado K₂HPO^ anidro, a mistura de reacção foi arrefecida num banho de gelo-sal a 0°C, e 17^,1 1 t r 0 s de difeni1fosforilazida adicionados, e a mistura de reacção agitada a 0°C, e depois o frasco da reacção total transferido para uma câmara arrefecida a 12°C. A mistura da reacção foi agitada durante a noite a 12°C, e o comple mentar da reacção foi controlado por HPLC (coluna Vydac, 25,0cm x 4,6mm com ácido trif1uoroacético/CN^CN, a 0,1%. Também foi utilizado o teste de ninidrina para detectar quando a ciclização estava completa. O Ac-JjMle*, d u , D-Phe⁷ , Lys¹⁰, Gly¹-alfa-MSH^ j 3^2 foi purificado depois de extinguir a reacção com 10% de solução aquosa de HOAc , dessa1inizando sobre coluna de poliacrilamida P^ (80,0cm x l,0cm), utilizando 30% de HOAc, e purificada mediante HPLC semi-preparativo para dar 16 mg de péptido cíclico Ac-[Nle*, Glu^, D Phe⁷, Lys¹⁰, Gly^j-alfa,msh₄_₁₃nh₂.

EXEMPLO XII

Ac- .[Nle*, Glu⁵, D-Phe⁷, Lys¹°]-a1fa-MSH^__ÃQNH₂

O composto do título foi preparado começando com 2,0g de resina N^-Boc-Lys (N^-2,4-C1 ₂Z)-p-MBHA (1,0 mmole de N^-Boc-Lys(N^&-2,4-C1₂Z), a resina de péptido protegida para o composto do titulo foi preparada depois da ligação por fases dos seguintes aminoácidos N^-Boc-protegidos

I (por ordem de adição): N-Boc-Trp (N¹ -For ) ; N*-Boc-Arg(N^g-Tos); N^ Boc-D-Phe; N^,a<-Boc-His(N^lrn-Tos). A resina de péptido protegida resultante, que é a resina N^-Boc-HisíN^-Tos)D-Phe-Arg(N^g-Tos)-Trp-(N¹-For)-Lys(N^-2,4-C1₂Z)-p-MBHA foi separada em duas metades. Uma porção de 1,4g (0,5 mmole) da resina de pentapéptido protegida foi trans formada na resina de péptido protegida do título, depois da ligação de N^-Boc-Gl u ( V-Bz 1 ) e N^-Boc-Nle. Depois da ligação do último aminoácido, 0 grupo protector N*-Boc foi removido, 0 grupo amino neutralizado e acetilado, como indicado no Exemplo XI, para dar a resina de péptido pro tegida, que é a resina Ac-Nle-Glu(y-Bzl)-His(N^lm-Tos)-D-Phe-Arg(N^g-Tosl-TrpfN^For)-Lys(N^-2,4-CIZ)-p-MBHA.

Uma porção de 1,0 g da resina de pêptido protegida foi submetida a clivagem por meio de HF líquido, e o pêptido processado como no Exemplo XI para dar 356 mg do pêptido Ac-[Nle\ D-Phe^, Lys θ ]-a 1 f a-MSH^ jθΝΗ₂ bruto, como um pó branco. Uma porção de 100,0 mg do pêptido bruto foi submetida ao esquema de purificação como delineado no Exemplo XI para dar 65 mg de pêptido HPLC puro Ac-[Nle\ D-Phe'⁷, Ly s θ ]-a 1 f a-MSH^ jqNH2· 40 mg deste pêptido puro foram ciclizados pela mesma via que no Exemplo XI para dar 13 mg de HPLC puro Ac-[Nle\ Glu^, D-Phe'⁷, Lys^j-alfa-MSH4__1QNH₂

EXEMPLO XIII

Ac-^Nle^, Asp⁵, D-Phe , Lys ^j-ai f a-MSH^_ j qNH^

A partir de 1 , 4g (0,5 nrmole) de resina Boc-His (N^im-Tos)-D-Phe-Arg(N^g-Tos)-Trp(N¹-For)-Lys(N^c-2,4-Cl₂Z)-p-MBHA, a resina de pêptido protegida do composto do t£ tulo foi preparada por ligação por fases de Ν’*-Boc-Asp (β-Bzl ), e N**-Boc-Nle. Cada reacção de ligação foi realizada seguindo o mesmo esquema de ligação referido sob a metodologia geral do pêptido de fase sólida. Depois da ligação do último aminoácido, o grupo protector N^-Boc | foi removido, o grupo amino neutralizado, e acetilado co mo referido no Exemplo XI, para dar a resina de pêptido protegida, que é a resina Ac-Nle-Asp(/?-Bzl)-His(N^im-Tos)-D-Phe-Arg(N^g-Tos)-Trp(N¹-For)-Lys(N^è-2,4-CI₂Z)-p-MBHA.

Uma amostra de 1,0 g da resina de pêptido seca no vácuo foi clivada e processada como no Exemplo XI para dar •ivn u λ Γμι λ 5 7, 101-al f a-MSH., _inNH_o.

370 mg do Ac-[Nle , Asp , D-Phe , Lys J 4-10 2

Una porção do heptapéptido bruto (110 mg) foi purificada pelo mesmo processo utilizado no Exemplo XI para dar 82 mg do pó branco do pêpt i do 1i near. Uma porção de 40,0 mg do Ac-^Nle^, Asp , D-Phe , Ly s -a 1 f a-MSH^ _ ₍ θΝΗ₂puro foi submetida a cíc1ização. para dar, depois de se pro cessar a purificação do HPLC, uma produção de 12 mg do

- 24 (

Ac-JjSIl·

D-Phe', Lys

MSH, io^nh2 puro

EXEMPLO XIV

Ac-[Nle\ aIp⁵, D-Phe⁷, Orn¹⁰] -a 1fa-MSH^_jθΝΗ₂

Urna porção de 1,0 g de resina p-MBHA (0,7 mmole/ /g) foi carregada com N^-Boc-Orn(N -Z) utilizando o esque ma de ligação referido nç processo geral de fase sólida. Depois de 1 hora de ligação a reacção foi parada, a resj_ na lavada, neutralizada, e o grupo amino livre sobre resina acetiíado com 2 vezes um excesso de uma mistura 1:1 de anidrido acét1co:piridina em diclorometano durante 1 hora. Depois os seguintes aminoácidos foram ligados com êxito à resina, ligando por fases: N^-Boc-TrpiN*-For); N^-Boc-Arg (N^g-Tos); N°^-Boc-D-Phe; N®⁴ Boc-Hi s (N^im-Tos ) ; N*^-Boc-Asp (J^-Bzi); N -Boc-Nie. Cada reacção de ligação foi realizada seguindo o esquema de ligação indicado na metodologia gerai do pêptido de fase sólida. Depois áá ligação do último aminoácido, o grupo protector N -Boc foi removido, o grupo amino N-terminal neutralizado e acetiíado para dar a resina de pêptido protegida Ac-Nle-Asp(j5-Bzl)-Hi s-(N^im-Tos)-D-Phe-Arg(N^g-Tos-Trp( N¹ -For)-Orn(N -Z)-p-MBHA. Uma porção de 1,0 g de resina de pêptido seca no vácuo foi clivada e processada como indicado no Exemplo XI para dar 332 mg do Ac-[Nle , Asp , D-Phe , Orn J-alfa -MSH^ |qNH₂ bruto. Uma porção de 105 mg do hepapépu do bruto foi purificada pelo processo utilizado no Exemplo XI para dar 78 mg de pó branco do pêptido linea.r.

Uma amostra de 40,0 mg do Ac-[Nle\ Asp⁵, D-Phe⁷, Orn¹⁰]-alfa-MSH^ P^uro exposta ^ao processo de ciclização utilizado para o Exemplo XI, para dar, depois do tra tamento a d eq u a d o. uma produção do produto de 15 mg de Ac(n 1 e \ Asp⁵, D-Phe⁷, Orn¹°J-a 1f a-MSH^_ j qNH₂.

EXEMPLO XV

Ac-jNle\ Asp\ D-Phe⁷, Dab¹°J-a1fa-MSH^_j_QNH₂

Foi ligado 1,0 g de resina p-MBHA (0,7 mmole/g) com N**-Boc-Dab (Nj^-Z), utilizando o esquema de ligação referido no processo geral de fase sólida. Depois de 1 hora de ligação a reacção foi parada, a resina lavada, neutralizada e o grupo amino, que não reagiu sobre a resina, acetilado com um excesso simples de uma mistura 1:1 de anidrido acético: piridina em diclorometano durante 1 hora. Depois, os aminoácidos seguintes foram sucessivamente ligados à resina por meio de ligação por fases: N*-Boc-Trp (Ν'-For); N^-Boc-ArglN^-Tos); N⁰*Boc-D-Phe; N^-Boc-HisíN -Tos); N^-Boc-Aspl^-Bzl); e N*-Boc-Nle.

Depois da ligação do último aminoácido, o grupo protector N -Boc foi removido, o grupo amino N-terminal neutralizado e acetilado como referido no Exemplo XI, para dar a resina de péptido protegida Ac-Nle-Asp(#-Bzl)-His(N^im-Tos)-D-Phe-Arg(N^g-Tos)-Trp(N¹-For)-Dab(N -Z)-p-MBHA. Uma porção de 1,0 g da resina de péptido seca no vácuo jo i c1i v a da e processada para dar 318,2 mg do Ac-[Nle\

AÍp⁵, D-Phe ⁷, Dab¹ °J - a 1 f a-MSH^_ _θΝΗ₂ bruto. Uma porção de 100,0 mg do heptapéptido bruto foi purificada para dar 78,2 mg de pó branco do péptido linear. Uma porção de 45,0 mg do Ac-[Nle\ Asp^, D-Phe⁷, Dab ¹ θ]-a 1 fa-MSH^_jθ

NH~ puro foi ciclizada e purificada como se d i seu t i u an^z Γ 4 [ 5 7 teriormente para dar 13,2 mg de Ac-[Nle , Asp , D-Phe , Dab¹⁰]-alfa-MSH₄_₁₀NH₂ puro.

EXEMPLO XVI

Ac > [n 1 e *, A sp⁵, D-Phe⁷, d!> r¹⁰]-alfa-MSH₄_₁₍₎NH2

Uma porção de 1,0 g de resina p-MBHA (0,7 mmoie/g) foi ligada com N^-Boc-Dap(N -Z) utilizando o esquema de ligação indicado no processo geral de fase sólida.

Depois de 1 hora de ligação a reacção foi parada, a resina lavada, neutralizada e.o grupo amino, que não reagiu sobre a resina, foi lavado, neutralizado e o grupo amino, que não reagiu sobre a resina, foi acetilado com um excesso de 2 vezes de uma mistura 1:1 de anidrido acético: piridina em diclorometano durante 1 hora. Depois os seguintes aminoácidos foram sucessivamente ligados à resina por meio de ligação por fases: N**“Boc- Trp(N*-For); N*- Boc - Arg( NS- Tos);

N*-Boc-D-Phe; N*-Boc-Hi s (N^im-Tos); N^-Boc-Asp (β-Bz 1 ) ; N^-Boc-Nle. Depois da ligação do último aminoácido, o grupo protector N^-Boc foi removido, o grupo amino N-terminal neutralizado e acet.ilado como no Exemplo XI para dar a resina de péptido protegida Ac-Nle-Asp (β-ΒζΙ) -Hi S(N^-Tos)-D-Phe-Arg(N®-Tos)-Trp(N^-For)-DpKP-Z)-pMBHA. Uma porção de 1,Og de resina de péptido seca no vácuo foi clivada e processada como indicado em 1 para dar 310,8 mg de Ac-[Nle/Asp⁵, D-Phe⁷, Dpr ¹ °]-aIfa-MSH^_jθ NH^· Uma porção de 115,0 mg do heptapéptido bruto foi purificada de acordo com o processo de Exemplo XI para dar 82,5 mg de pó branco do péptido linear. Una porção de 38,3 mg do Ac-^Nie^, Asp\ D-Phe⁷, Dp r a i f a-MSH^ _ _} θ NH₇ foi ciclizada e purificada como se discutiu ante^z I _ _ riormente para dar 11,3 mg de Ac- Nle , Asp , D-Phe , Dk¹⁰J-alfa-MSH^_₁₀NH₂ puro.

As potências biológicas de alfa-MSH, os análogos lineares e cíclicos foram determinados pela sua capacidade para estimular a dispersão do melanossoma i n v i t r o nos bioensaios da rã e do lagarto. Este ensaio in vitro proporciona curvas nítidas de resposta de dose cortada (entre 2,5 x 10^ e A x 10 ^θΜ) e pode detectar a concentração mínima de alfa-MSH de cerca de 10 ^1}M.

O ensaio é baseado na dipersão centrífuga de melanossomas (grânulos de melanina) dentro dos processos dendríticos de melanoforos dérmicos integumentares que conduzem ao escurecimento da peie. Todas as soluções do texto foram preparadas através de diluições em série a

~4 partir de uma solução de reserva (10 M). As rãs (Rans pipiens) utilizadas nestas avaliações foram obtidas na Kons Scientific, Germantown , WI, e os lagartos (Ano 1i s carolinens i s) foram obtidos na Snake Farm, La Place,

LA. As actividades biológicas dos análogos cíclicos de alfa-mel anotropina estão mencionados na tabela seguinte:

Análogo	Potênc i a Rã	Biológica Lagarto	Actividade Residual
Rã	Lagar to
16		1,0	P(-)	P(-)
17	1,0	6,0	p(+)	p( + )
18	0,5	9,0	P ( + )	p (+)
19	0,5	90_?0	p (+)	p( + )
20	1,0	20,0	p(-)	pH
21	b⁰	⁵,0	p(-)	p(-)
22	0,01	5,0	P(-)	p(-)

As patentes anteriores da requerente (4.457.Z64 e ¢.485.039), cujas descrições são aqui incorporadas na totalidade como referência, i.ndicaram a importância da restrição limitada do local activo de alfa-MSH ou ACTH.

A restrição da ciclização de alfa-MSH nas posições 4 e 10 utilizando substituição pseudoisostérica de Met-4 e Gly-IQ com aminoácidos Cys resultou em múltiplos aumentos na actividade de dispersões do melanocito do análogo sintetizado. O aumento da potência dos análogos cíclicos comparada com a do seu antecessor linear está claramente dependente do sistema de bioensaio utilizado. O interesse maior da requerente foi conseguir análogos com elevada potência sobre a pele do lagarto, visto que a actividade do último bioensaio está linearmente correla28

cionada com a actividade nos sistemas dos mamíferos. As caracterí^st icas mais importantes dos análogos cíclicos traram baixa actividade no bioensaio na pele do lagarto e elevada potência na pele da rã; também com uma redução de 500 vezes na actividade depois da redução do'tamanho do anel (anel com 22 elementos) ou aumento (anel com 24 elementos) em comparação com o tamanho optimizado de anel (anel com 23 elementos). A restrição limitada de alfarMSH por ligação com amida entre ami noácidos nas posições 5 e 20 resultou num grupo de compostos c-íclicos que compreendem uma parte da presente invenção. Com o tamanho do anel centrado num anel de 23 elementos, o composto 19 deu a mais elevada potência biológica na pele do lagarto sem grande alteração em potência no ensaio com a pele de rã. O aumento em potência entre o cíclico e o seu antecessor linear está na ordem de dez vezes de grandeza. A potência do análogo cíclico 18 não é apenas bastante afectada em comparação ao linear , mas apresenta também uma importante alteração com a aparência de actividade prolongada no análogo cíclico. O tripéptido C-terminal, Gly-Pro-Val não tem efeito sobre a potência destes análogos como se revela no composto 17. Existe um factor importante nestes péptidos de lactama cíclicos, que é o prolongamento em actividade do cíclico em comparação com o verificado no linear. Os compostos da presente invenção são superiores aos alfa-MSH em uma ou mais das seguintes características; potência, como medida peio ensaio i η viyp e in vitro da rã e/ou do lagarto; duração do efeito iη νivo em tais ensaios, e/ou resistência à degradação pelos enzimas do soro do sangue.

Os compostos úteis na presente invenção podem ser administrados transdermicamente, e são formulados em composições adequadas determinadas pelos meios desejados de administração, de acordo com os métodos e pro29

,cessos bem conhecidos dos técnicos nesta matéria. Como , é utilizado ao longo desta Memória Descritiva, o termo transdermi co deve ser considerado no seu sentido mais lato, isto é, como administração através duma camada epitelial de células. Como tal, o termo é apropriadamente utilizado para designar a administração tópica, oral, per nasal, e outros métodos de administração. Por exemplo, os compostos adequados para utilização nesta invenção po dem ser formulados ou compostos com várias bases convencionais, em preparações tais como crerres, unguentos, geis, loções, comprimidos, ou sprays, conforme o modo desejado de administração no indivíduo. Quando se fabricam estas preparações, a composição pode também ser misturada com agentes convencionais de espessamento, emolientes, agentes tensioactivos, pigmentos, perfumes, preservantes, cargas e emulsionantes, os quais são todos bem conhecidos e convenci ona imente utilizados na formulação de preparações transdermi cas. Tipicamente, estes ingredientes não activos constituirão a maior parte da preparação final. De preferência, as composições são fabricadas de modo a permitirem a libertação lenta ou a libertação temporizada.

A's propriedades notáveis dos compostos da invenção tornam também os mesmos úteis como substitutos de alfa-MSH e [Nle J-alfa-M5H nos esquemas de diagnostico

terapêutico e de pesquisa básica existentes. Na área dos processos de diagnóstico, é evidente que os compostos da invenção, especialmente aqueles que têm sido radioiodinizados ou ligados com emissores de radiação gama, são excepcionaImente bem adequados para uso em células de melanoma local izadoras e/ou diferencialmente caracterizadoras, sobre a base de associação com receptores de melanotropina em tais células. A estabilidade do soro dos compostos da invenção torna os mesmos candidatos primários nos sis temas de libertação de drogas selectivos propostos, em que os tecidos atingidos são conhecidos como tendo elevadas concentrações de receptores de me 1 ano t r op i na. A po-.

. tência re1 ativamente elevada e a actividade prolongada · dos codhpostos da invenção nos fenómenos de mudança de cor associados é esperado que sejam duplicadas no contexto de outros efeιtos biológicos anteriormente notados para a hormona de estimulação de melanocito que ocorre naturalmente é os seus análogos sintéticos.

Assim, enquanto se ilustrou e descreveu as for mas de realização preferidas da presente invenção, deve compreender - se que esta invenção é susceptível de variação e rtjod i i i cação, e portanto não se deseja que a mesma seja limitada aos termos precisos indicados, mas deseja-se beneficiar de tais alterações e modificações que possam ser feitas para adaptar esta invenção a vários usos e condições. De acordo com isto, tais mudanças e alterações sâo apropriadamente consideradas como estando dentro da gama completa de equivalentes, e portanto dentro do previsto nas reivindicações seguintes.

Tendo, assim, descrito a presente invenção e a maneira e processo de a realizar e utilizar, nos termos tais qtiíè sejam completos, claros, concisos e exactos, de modo a permitir a qualquer pessoa entendida nesta técnica, à qual a invenção diz respeito, ou com a qual está mais directamente relacionada, e para realizar e utilizar a mesma.

Claims

1- Processo para a preparação de um análogo a 1fa-melanotropina linear, escolhido do grupo que consiste em:

Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH,,

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH₂

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg~Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH₂

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg~Trp-Lys-NH₂Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-0rn-NH2 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH₂

I Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH»

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab~NH~ Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂Ac-Nle-Glu-Hís-Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂Ac-Nle-Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ caracterizado pelo facto de se ligar o aminoácido bloqueado por N*-t-butiI oxicarbonilo à resina p-meti1-benzildri1amina, acetilarem-se os grupos amino, ligando por fases o aminoácido apropriado protegido pelos grupos N-terc-butiloxicarbonilo, e remo ₍ verem-se tais grupos protectores depois de completada cada fase de ligação, neutralizar-se o grupo amino, acetilar-se e clivar-se o análogo resultante da resina.

2- Processo para a preparação de um análogo alfa-melanotropina cíclico, escolhido do grupo que consiste em:

an-Ser-Tyr-Ser-Met-G]u-His-Phe~Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH₂Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys - N H ₂

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orη-NH₂Ac-Nle-A sp-His-P-Phe-Arg-Trp-Dab - N H ₂Ac-Nle-A sp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂ caracterizado pelo facto de se ligar o aminoácido bloqueado por N^-t-butil oxicarbonilo à resina p-meti1-benzildri1amina, aceti larem-se os grupos amino, ligando por fases o aminoácido apropriado protegido pelos grupos N-terc-butiloxicarbonilo, e removerem-se tais grupos protectores depois de completada cada fase de ligação, neutralizar-se o grupo amino, acetilar-se e clivar-se o análogo resultante da resina.