DE4431121A1 - Herstellung von konformationsstabilisierten Calcitonin-Analoga mit erhöhter hypocalcämischer Wirkung in vivo - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Calcitonin-Analoga, welche im Vergleich mit den natürlich vorkommenden und therapeutisch angewandten Calcitoninen in ihrer Konformation stabilisiert sind, eine erhöhte Bioaktivität in üblicherweise verwendeten in vitro-Testsystemen aufweisen und eine erhöhte hypocalcämische Wirkung in vivo (Patentanspruch 1) zeigen.

Calcitonin ist ein aus 32 Aminosäureresten bestehendes Peptidhormon mit großer pharmakologischer Bedeutung. Diese geht insbesondere auf seinen starken hypocalcämischen Effekt und die durch humanes Calcitonin (hCt) ver­ ursachte Inhibition des Knochenabbaus zurück (Azria, M. "The Calcitonins: Physiology and Pharmacology; Karger: Basel, 1989). Humanes Calcitonin sowie die Calcitonine vom Lachs (sCt), Schwein (pCt) und Aal (eCt) werden medizi­ nisch unter anderem bei der Behandlung der Osteoporose, der Paget′schen- Krankheit und bei der Hypercalciämie eingesetzt (Azria, M. in "The Calcitonins: Physiology and Pharmacology; Karger: Basel, 1989). Da die Calcitonine aus ultimobranchialen Spezies (wie z. B. das sCt) eine 20- bis 50-fach höhere biologische Wirkung als die homologen Moleküle aus Mammaliern aufweisen, finden sie derzeit große medizinische Anwendung (Guttmann, S. in "Calcitonin 1980 Chemistry Physiology Pharmacology and Clinical Aspects; Pecile A. Ed.; Excerpta Medica: Amsterdam-Oxford-Princeton, 1981; Seiten 11-24). Die relativ geringe Homologie zwischen den Primärsequenzen von Lachs- und huma­ nem Calcitonin (16 von 32 Aminosäureresten) führt jedoch zu einer hohen Antigenizität von sCt (Azria, M. in "The Calcitonins: Physiology and Pharmaco­ logy; Karger: Basel, 1989; Seiten 133-143). Mit sCt behandelte Personen entwickeln daher oft eine "sekundäre Resistenz" oder "Desensitisierung" gegen das verabreichte Hormon. Eine Antikörperbildung gegen die verabreichten Calcitonine wurde innerhalb von 6 Monaten in einem Großteil der mit sCt oder pCt behandelten Patienten beobachtet (Azria, M. in "The Calcitonins: Physiolo­ gy and Pharmacology; Karger: Basel, 1989; Seiten 133-143). Deswegen ist die Entwicklung von biologisch aktiveren Analoga von hCt, welche sich durch eine möglichst hohe strukturelle Ähnlichkeit zum nativen Hormon auszeichnen sollten, von größtem medizinischen Interesse. Ein guter und häufig angewand­ ter Test zur Bewertung der biologischen Wirksamkeit von Calcitoninen und ihren Analoga ist der hypocalcämische Test in Mäusen und Ratten in vivo (Kumar, M.A. et al.; J. Endocrin. 33 (1965) Seiten 469-475 und Yates, A.J. et al.; Endocrinology 126 (1990) Seiten 2845-2849). In diesem System wird der reduzierende Effekt der verabreichten Calcitonine auf den Calcium-Gehalt des Serums bestimmt. Andere üblicherweise verwendete Testsysteme zur Bewer­ tung der biologischen Wirksamkeit der Calcitonine und ihrer Analoga beinhalten Rezeptorbindungstests, wie die Untersuchung der Calcitoninbindung an Ratten­ hirnrezeptoren (Nakamuta, H.; Japan. J. Pharmacol. 31 (1981) Seiten 53-60), und die Adenylat-Cyclase-Aktivierung in Nierenmembranfraktionen (Marx. et al.; Science 178 (1972) Seiten 999-1000 und Goltzman, D.; Endocrinology 106 (1980) Seiten 510-518). Vorhersagen zur Sekundärstruktur der Calcitonine sowie Struktur-Aktivitäts-Beziehungsanalysen von sCt (Merle, M.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 87 (1979) Seiten 455-460 und Epand, R.M.; Int. J. Pept. Protein Res. 25 (1985) Seiten 105-111) wiesen auf eine enge Beziehung zwischen einer potentiellen, amphiphilen α-helikalen Region zwischen den Aminosäureresten 8 und 22 und der biologischen Wirkung des Moleküls hin. Andererseits führten andere Arbeiten die biologische Aktivität der Calcitonine hauptsächlich auf die Konformationsflexibilität und "durch-den-Raum"-Wechsel­ wirkungen verschiedener Molekülregionen zurück (Epand, R.M. et al.; Biochemi­ stry 25 (1986) Seiten 1964-1968). Durch einen systematischen, sequentiellen Aminosäureaustausch in der potentiellen, amphiphilen, α-helikalen Region (8-22) von hCt durch Leucin, welches in sCt an diesen Positionen lokalisiert ist, konnten Maier et al. (Maier, R. et al.; Clin. Endocrinology 5s (1976) 327s-332s) hCt-Analoga erhöhter biologischer Aktivität synthetisieren. Von Basava et al. (Basava, C. and Hostetler, K.Y. in "Peptides: Chemistry and Biology 1991" Smith, J.A., Rivier, J.E., Eds.; Escom Science Publishers B.V.: Leiden, 1992; Seiten 20-22) wurden hCt-Analoga vorgestellt, wobei dem Design-Konzept dieser Analoga ein Austausch von 3-5 Aminosäureresten auf der hydrophoben Seite der potentiellen, α-helikalen Region (8-22) von hCt durch Leucine zugrun­ de lag. Nach unserem Kenntnisstand hat jedoch keine dieser hCt-Analoga klinische Anwendung zur Behandlung der oben erwähnten Krankheiten gefun­ den, so daß nach wie vor nur Calcitonine (sCt und α-Aminosuberinsäure-1,7- eCt) mit hoher Antigenizität zur therapeutischen Anwendung zur Verfügung stehen. Da aufgrund der hohen proteolytischen Abbaurate (in vivo Halbwerts­ zeit) der zur Zeit therapeutisch eingesetzten Calcitonine verhältnismäßig hohe Mengen verabreicht werden müssen, wobei dies wiederum zu einer schnellen Antikörperbildung (sekundäre Resistenz) und eventuellen Nebeneffekten (Ge­ genanzeigen) führt, wird der Erhöhung der Proteolyseresistenz große Bedeutung beigemessen. Konformationsstabilisierte Analoga, wie z. B. Moleküle mit einem höheren Grad an Sekundärstruktur, sind natürlicherweise oft resistenter gegen­ über einem proteolytischen Abbau, da potentielle, proteolytische Schnittstellen in diesen Molekülen nicht zugänglich sind (Fauchere, J.-L. and Thurieau C.; Advances in Drug Research, 23 (1992) Seiten 128-159 und Fry D.C. et al.; Biopolymers 32 (1992) 649-666).

Der Erfindung (siehe Abbildung) und der von ihr abgeleiteten Verbindungen liegt das Problem zugrunde, daß die zur Zeit therapeutisch angewandten Calcitonine eine relativ geringe Homologie zu humanem Calcitonin aufweisen, und daher eine schnelle Antikörperbildung im Patienten hervorrufen, welche unter anderem zur sogenannten sekundären Resistenz führen kann. Potente und klinisch anwendbare humane Calcitonine (und hCt-Analoga) stehen zur Zeit nicht zur Verfügung. Auch die zur Zeit therapeutisch angewandten Calcitonine der ultimobranchialen Spezies weisen keine hohe therapeutische Wirksamkeit auf, und müssen daher langfristig und in relativ hohen Mengen verabreicht werden. Die von uns beschriebene Erfindung bietet die Möglichkeit neue, konformations­ stabilisierte Calcitonin-Analoga herzustellen, welche eine höhere hypocalcämi­ sche Wirkung in vivo aufweisen als die natürlich vorkommenden Calcitonine und ihre bisher entwickelten Analoga, und gleichzeitig eine verminderte in vivo- Abbaurate aufweisen sollten, was zu einer Verminderung der therapeutisch anzuwendenden Mengen, zu einer Erhöhung der therapeutischen Wirksamkeit und zu einer Verzögerung oder Verhinderung der Antikörperbildung im Patienten führen sollte. Die in der Erfindung beschriebenen humanen Calcitonin-Analoga sollten zudem durch ihre hohe Homologie zum natürlich vorkommenden, huma­ nen Calcitonin eine Antikörperbildung im Patienten weitgehend verhindern.

Die im Patentanspruch 1 beschriebene Verbindung, Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt, bietet eine Lösung zu den oben beschriebenen Problemen. Das humane Calcito­ nin- Analog Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt weist eine 80-fach erhöhte Rezeptorbin­ dungsaffinität im Vergleich zum natürlichen hCt in einem Rezeptorbindungstest an Membranen aus dem Rattengehirn auf (Nakamuta, H. et al. Endocrinology 127 (1990) Seiten 163-169). Dieses Analog stimuliert zudem in einem Test zur Bestimmung der Adenylat-Cyclase-Aktivität in Nierenmembranen (Salomon, Y. et al.; Anal. Biochem. 58 (1974) Seiten 541-548) die Adenylat-Cyclase etwa 5- fach stärker als das natürliche hCt und erweist sich in diesem Testsystem als voller Agonist von hCt. Darüberhinaus weist dieses Analog in einem in vivo- Test in Mäusen (Yates, A.J. et al.; Endocrinology 126 (1990) Seiten 2845-2849) eine 10- bis 20-fach erhöhte hypocalcämische Wirkung im Vergleich zum natürlichen hCt auf. Circulardichroismus-Studien zur Aufklärung der Raum­ struktur dieses Analogs weisen darauf hin, daß in wäßriger Lösung eine geord­ nete, wenn auch noch nicht identifizierte Konformation des Moleküls stabilisiert wird, welche sich von der des natürlichen humanen Calcitonins unterscheidet, und welche sich durch die zur Verfügung stehenden, bekannten Sekundärstruk­ tur-Basisspektra zur Zeit nur unzureichend beschreiben läßt. Die hohe in vivo- und in vitro-Aktivität von Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt läßt sich auf eine Stabili­ sierung der rezeptorgebundenen, und somit der eigentlich aktiven, Konformation von hCt zurückzuführen (Hruby, V.J. Life Sci. 31 (1982) Seiten 189-199). Dabei ist es wichtig hervorzuheben, daß kleinere Peptidhormone in der wäß­ rigen Umgebung des Organismus oft in ungeordneter Raumstruktur vorliegen, und ihre biologisch aktive Konformation erst durch die Wechselwirkung mit dem zellmembrangebundenen Rezeptor annehmen (Taylor, J.W. and Ösapay, G.

Acc. Chem. Res. 23 (1990) Seiten 338-344). Darüber hinaus sollte die durch die Lactam-Verbrückung eingeführte Konformationsrestriktion in Cyclo^17,21- [Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt zu einer erhöhten Proteolyseresistenz führen, was außerdem ein möglicher Grund für die beobachtete, hohe biologische Aktivität von Cy­ clo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt ist (Fauchere, J.-L. and Thurieau C.; Advances in Drug Research, 23 (1992) Seiten 128-159 und Fry D.C. et al.; Biopolymers 32 (1992) 649-666).

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist im Patentanspruch 2 beschrie­ ben. Die Anwendung der Erfindung aus Patentanspruch 1 auf die Herstellung der Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-Analoga von natürlichem humanem Calcitonin, Lachs-Calcitonin und Aal-Calcitonin, ihren jeweiligen α-Aminosuberinsäure-1,7- Derivaten, ihren jeweiligen N^α-Acetyl-Derivaten, ihren jeweiligen N^a-Desamino- Derivaten, und von anderen Calcitonin-Derivaten, bei denen bei Erhaltung der Primärsequenz funktionelle Gruppen der Aminosäuren chemisch kovalent modifiziert sind, und von Calcitonin-Derivaten, welche durch zwei oder mehrere der oben aufgelisteten Modifikationen entstanden sind, sollte Verbindungen liefern, durch welche die mit Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt erzielten vorteilhaften Wirkungen (siehe oben und Patentanspruch 1) weiter verstärkt werden sollten. So ist es bekannt, daß die α-Aminosuberinsäure-1,7-Derivate der Calcitonine eine erhöhte Hydrolyse- und Proteolyseresistenz gegenüber den natürlichen Verbindungen aufweisen (Azria, M. in "The Calcitonins: Physiology and Phar­ macology; Karger: Basel, 1989; Seiten 133-143). Gleichermaßen ist es be­ kannt, daß sich Peptidhormone, welche am aminoterminalen Ende entweder kovalent geschützt sind (also z. B. acetyliert oder formyliert sind) oder desami­ niert sind, durch eine erhöhte Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau auszeichnen (Fauchere, J.-L. and Thurieau C.; Advances in Drug Research, 23 (1992) Seiten 128-159).

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist auch im Patentanspruch 3 be­ schrieben. Die Anwendung der Erfindung aus Patentanspruch 1 auf die Her­ stellung der Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-Analoga von humanem Calcitonin, [Leu­ ^12.16,19,Tyr²²]-hCt, [Leu^0,8,12]-hCt, und [Leu^0,8,12,16]-hCt, und auf diese und andere humane, Lachs-, und Aal-Calcitonin-Derivate, in welchen jeweils 1-12 Amino­ säurereste der jeweiligen Primärsequenz durch andere, natürliche oder unnatürli­ che (z. B. Ornithin, N-Methylaminosäuren etc.) Aminosäuren ersetzt sind, oder in welchen 1-12 Aminosäurereste der jeweiligen Primärsequenz deletiert sind, oder in welchen 1-12 Aminosäurereste der jeweiligen Primärsequenz durch eine beliebige Kombination aus Substitutionen und Deletionen verändert sind, und/oder in welchen 1 oder mehrere Amidbindungen (CONH) des Peptidrückgrats durch CH₂NH, CSNH, CH₂S, CH₂CH₂, CH : CH, COCH, CH(OH)CH₂, CH₂SO, er­ setzt sind, sollte ebenso Verbindungen liefern, durch welche die mit Cyclo^17,21- [Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt erzielten vorteilhaften Wirkungen (siehe oben und Patent­ anspruch 1) weiter verstärkt werden sollten. So weisen bereits die "unverbrück­ ten" hCt-Analoga, [Leu^12,16,19, Tyr²²]-hCt, [Leu^0,8,12]-hCt, und [Leu^0,8,12,16]-hCt, eine gegenüber dem natürlichen hCt erhöhte hypocalcämische Wirkung auf (Basava, C. und Hostetler, K.Y.; in "Peptides Chemistry and Biology 1991; Smith J.A. und Rivier, J.E., Eds.; Escom: Leiden, 1992; Seiten 20-22). Die zusätzliche Einführung einer Konformationsrestriktion nach Patentanspruch 1 sollte daher zu einer weiteren Erhöhung der hypocalcämischen Wirkung führen. Außerdem konnte gezeigt werden, daß der Austausch oder die Deletion einer oder mehrerer Aminosäurereste aus der Primärsequenz der natürlichen Calci­ tonine oft mit dem Erhalt der biologischen Aktivität vereinbar ist (z. B. Moe, G.R. und Kaiser E.T.; Biochemistry 24 (1985) Seiten 1971-1976 und Schwartz, K.E. et al.; Endocrinology 108 (1981) Seiten 831-835). So sollte es also möglich und hilfreich sein, bestimmte Aminosäuren der Primärsequenz, welche bevor­ zugte Angriffsstellen für Proteasen darstellen, wie z. B. Phenylalanin, Tyrosin oder Lysin, durch "proteolyseresistente" Aminosäuren zu ersetzen, oder diese Aminosäuren zu deletieren. Dementsprechend sollten also die Cyclo^17,21- [Asp¹⁷,Lys²¹]-Derivate der so modifizierten Calcitonine eine nicht nur erhöhte, sondern auch länger andauernde Wirkung aufweisen. In ähnlicher Weise sollten auch die Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-Derivate von Calcitoninen, in welchen eine oder mehrere Amidbindungen des Peptidrückgrats, wie in Patentanspruch 3 be­ schrieben, ersetzt sind, eine erhöhte und länger andauernde Wirkung aufwei­ sen, da die proteolytische Anfälligkeit der natürlichen Amidbindungsstruktur höher ist, als die der in Patentanspruch 3 beschriebenen Peptidrückgratmodifi­ zierungen (Fauchere, J.-L. and Thurieau C.; Advances in Drug Research, 23 (1992) Seiten 128-159).

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist auch im Patentan­ spruch 4 beschrieben. In diesem Patentanspruch wird das in Patentanspruch 1 beschriebene Prinzip der Einführung von Konformationsrestriktionen weiter ausgestaltet, indem sowohl die chemische Struktur als auch die Position der in hCt eingeführten Lactam-Verbrückung verändert ist. Dabei werden die einge­ führten Lactam-Verbrückungen nun anstatt in der Position i, i+4, wie in Cy­ clo¹⁷²¹-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt, in den Positionen i, i+3, oder i, i+5, oder i, i+6, oder i, i+7 eingeführt, wobei i für die Position 15, oder 16, oder 17 der Aminosäure­ sequenz stehen kann. So konnte gezeigt werden, daß die biologisch aktive Raumstruktur von Peptidhormonen durch die Einführung von Lactam-Verbrückun­ gen zwischen Aminosäureresten in den Positionen i, i+3, oder i, i+4, oder i, i+5, oder i, i+6, oder i, i+7 der Primärstruktur stabilisiert werden kann (Hruby, V.J.; Life Sci. 31 (1982) Seiten 189-199, Kirby, D.A. et al.; J. Med. Chem. 36 (1993) 385-393). Darüber hinaus kann die chemische Struktur der verbrückten Aminosäurereste einen variierenden Effekt auf die Konformations­ stabilisierung und biologische Aktivität haben. Z. B. kann die einfache Inversion der die Lactam-Verbrückung bildenden Aminosäurereste einen starken Einfluß auf Konformation und Aktivität haben. Da das Erreichen der maximalen Kon­ formationsstabilisierung und biologischen Aktivität von mehreren Faktoren, wie der Primärsequenz, "durch den Raumwechselwirkungen" zwischen Amino­ säureresten, bzw. bestimmten Molekülregionen und somit der chemischen Struktur und Position der Lactam-verbrückten Aminosäurereste, abhängig ist, werden unter Patentanspruch 4 konformationsstabilisierte hCt-Analoga herge­ stellt, in denen sowohl die chemische Struktur der Lactam-verbrückten Reste als auch ihre Position in der Primärsequenz variiert sind. Zusätzlich ist der in Patentanspruch 4 beschriebene Einbau des Lactam-verbrückten Aminosäure­ paars Glutaminsäure und Ornithin vorteilhaft, da, bei Erhalt der prinzipiellen Cyclusgröße bei i, i+4 Verbrückungen (das in Patentanspruch 1 beschriebene Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt enthält eine 20-gliedrige Ringstruktur), eine erhöhte Proteolyseresistenz erreicht wird. So verleiht der Einbau von nicht-proteinoge­ nen Aminosäuren (wie Ornithin) in Peptide, diesen natürlicherweise eine erhöhte Proteolyseresistenz.

Eine zu der in Patentanspruch 4 ähnliche Ausgestaltung der Erfindung ist auch im Patentanspruch 5 beschrieben. Die in Patentanspruch 4 beschriebene Her­ stellung von hCt-Analoga mit Lactam-Verbrückungen unterschiedlicher chemi­ scher Struktur und unterschiedlicher Stellung in der Primärsequenz, wird in Patentanspruch 5 auf die in Patentanspruch 2 und 3 beschriebenen, anderen natürlichen Ausgangs-Calcitonine und Ausgangs-Calcitonin-Derivate angewen­ det. Dabei sollten, wie in Patentanspruch 4 ausgeführt, konformationsstabili­ sierte Calcitonin-Analoga der anderen Ausgangs-Calcitonine und Ausgangs- Calcitonin-Derivate mit erhöhter biologischer Aktivität und Proteolyseresistenz hergestellt werden können. Ein Hauptvorteil dieser Erfindung liegt darin, daß die bereits erhöhte biologische Aktivität der Calcitonine der ultimobranchialen Spezies und der anderen in Anspruch 5 beschriebenen Ausgangs-Calcitonin- Derivate zur Herstellung noch aktiverer Lactam-verbrückter Derivate genutzt werden kann. Die hohe beobachtete Antigenizität der ultimobranchialen Calcito­ nine sollte dabei durch die Einführung der konformationsstabilisierenden Lac­ tam-Verbrückung reduziert werden, da einerseits antigene Regionen durch die eingeführte Konformationsrestriktion dem Immunsystem weniger zugänglich sein sollten, und andererseits durch die erzielte höhere biologische Aktivität geringere Mengen des Analogs für therapeutische Zwecke verabreicht werden müßten.

Eine weiterführende vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist auch im Patentanspruch 6 angegeben. Dieser Patentanspruch zeichnet sich durch die Einführung von zusätzlichen Konformationsrestriktionen in die in Patentan­ spruch 5 hergestellten Calcitonin-Analoga aus. Dazu werden Aminosäurereste in der Region 17 bis 21 der Primärsequenz dieser Calcitonin-Analoga durch sol­ che ausgetauscht, welche in p-Haarnadelschleifenstrukturen häufig vorkommen, oder durch andere Aminosäuren, welche letztere Struktur bekanntermaßen stabilisieren können (siehe Patentanspruch 6). Die beschriebene Einführung β- Haarnadelschleifen-stabilisierender Aminosäuren geht auf Erkenntnisse zurück, gemäß welchen sich die in Patentanspruch 1 beschriebene, erhöhte biologische Aktivität von Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt unter anderem auf die Stabilisierung einer β-Haarnadelschleifenstruktur in der Region 16-21 der Primärsequenz zurückführen läßt. So weisen Ergebnisse der ¹H-NMR-Untersuchungen von hCt (Motta, A. et al.; Biochemistry 30 (1991) Seiten 2364-2371) auf eine p-Haarna­ delschleifenstruktur in der Region 16-21 von hCt (wobei Lys¹⁸ und Phe¹⁹ die Reste i+1 und i+2 [i = erste Position] in dieser Struktur sein sollen) hin. Ver­ gleicht man die hohe biologische Aktivität des Analogs Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]­ hCt (sowohl in vivo als auch im Rezeptorbindungstest in vitro) mit der wesent­ lich geringeren biologischen Aktivität des von uns ebenfalls hergestellten hCt- Analogs Cyclo^17,21-[Lys¹⁷,Asp²¹]-hCt, welches eine gleich positionierte, aber inverse Verbrückung enthält, so weist dies auf die potentielle Bedeutung der oben erwähnten β-Haarnadelschleifenstruktur hin. Dieser Vergleich, in Ver­ bindung mit den Ergebnissen aus den ¹H-NMR-Studien von hCt und der Tatsa­ che, daß sowohl in hCt als auch in allen anderen natürlich vorkommenden Calcitoninen ein Asparagin- bzw. ein Histidinrest in Position 17 der Aminosäure­ sequenz vorkommt (Reste, welche sich sehr häufig in der Position i einer β- Haarnadelschleifenstruktur befinden), spricht für eine mögliche Stabilisierung derβ-Haarnadelschleifenstruktur in Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt. Die eingeführte Lactam-Verbrückung in Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt oder in den anderen in Patentanspruch 5 beschriebenen Lactam-verbrückten Calcitonin-Analoga sollte somit die Carbonylfunktion von Asp¹⁷ in einer festen Position fixiert haben, was für die Stabilisierung der β-Haarnadelschleifenstruktur durch eine Wasserstoff­ brücke zwischen dem Carbonylrest der Seitenkette von Asp¹⁷ und dem Proton der Amidbindung zwischen Lys¹⁸ und Phe¹⁹ von großer Bedeutung sein sollte (Brigs et al.; Science 233(1986) Seiten 206-208). Daraus läßt sich schließen, daß die Einführung von β-Haarnadelschleifen-stabilisierenden, bzw. von häufig in β-Haarnadelschleifen vorkommenden Aminosäureresten in die in Patent­ anspruch 5 beschriebenen Calcitonin-Analoga diese in ihrer biologisch aktiven Konformation weiter stabilisieren sollte.

Patentanspruch 7 stellt eine Vereinfachung der in Patentanspruch 6 beschriebe­ nen Erfindung dar. In diesem Patentanspruch soll die Einführung von β-Haarna­ delschleifen-stabilisierenden, bzw. von häufig in β-Haarnadelschleifen vorkom­ menden Aminosäuren zur Konformationsstabilisierung und Erhöhung der biologi­ schen Aktivität von den in Patentanspruch 2 und 3 beschriebenen Ausgangs- Calcitoninen und Ausgangs-Calcitonin-Derivaten genutzt werden. Dabei wird hier auf die vorherige Herstellung der entsprechenden Lactam-verbrückten Analoga verzichtet. Dies hat den Vorteil, daß so Calcitonin-Analoga mit erhöh­ ter biologischer Aktivität gegenüber den natürlich vorkommenden Calcitoninen und den in Patentanspruch 2 und 3 beschriebenen Ausgangs-Calcitonin-Deriva­ ten (also ohne die zuvor beschriebenen Lactam-Verbrückungen) durch gängige Methoden der Peptidchemie einfach hergestellt werden können.

Das in Patentanspruch 1 beschriebene Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt, sowie die in den Ausgestaltungen dieser Erfindung beschriebenen konformationsstabilisier­ ten, potenten Calcitonin-Analoga sollten als wirkungsvolle Medikamente bei der Behandlung von Osteoporose, Paget′scher Krankheit, Hypercalciämie und anderen Krankheiten, bei denen Calcitonine therapeutisch eingesetzt werden, anwendbar sein. Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt und die von ihm abgeleiteten konformationsstabilisierten Calcitonin-Analoga bieten sich zur gewerblichen Anwendung an. Sie eignen sich als potentielle Kandidaten zur therapeutischen Verwendung bei den oben genannten Krankheiten und können unter Verwen­ dung der beschriebenen peptidsynthetischen Methoden (für genaue Beschrei­ bung siehe unten) in Produktionsstätten von pharmazeutischen Betrieben herge­ stellt werden. Der beschriebene Herstellungsweg zur Synthese der Erfindung und der von ihr abgeleiteten Analoga kann problemlos auf die zur Arzneimittel­ produktion notwendigen Großmaßstäbe angewendet werden.

Für die Synthesen aller hier beschriebenen konformationsstabilisierten Calcito­ nin-Analoga wird die Festphasenmethode der Peptidsynthese in Verbindung mit einer Methode zur Herstellung von cyclischen, durch die Seitenketten Lactam­ verbrückten Peptiden, direkt auf dem polymeren Träger (Harz) nach Felix et. al (Felix, A.M. et al.; Int. J. Pept. Prot. Res. 32 (1988) Seiten 441-445) einge­ setzt. Die Synthese von hCt-Analog Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt (Patentanspruch 1) wird im folgenden detailliert beschrieben:

Zunächst wurde N^α-Boc-(hCt(22-32))-MBHA (1) nach gängigen Methoden der Festphasenpeptidsynthese (siehe z. B. Stewart, J.M. and Young, I.D.; in "Solid- Phase Peptide Synthesis" Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) wie folgt hergestellt: 4 g eines p-Methylbenzhydrylamin Harzes (welches in der Form seines HCl-Salzes vorliegt) mit einer Beladung von 0.65 mmol/g wurden in einer Schüttelente zunächst wie üblich neutralisiert (mit Triethylamin in DMF) und gewaschen (mit DMF und DCM). Es folgte Zugabe von Boc-Pro-OH und DCC in 3-fachem Überschuß (7.2 mmol) in Dichloromethan (DCM) (30 ml) und die Reaktionssuspension wurde 18 h geschüttelt. Danach wurde das Polymer wie üblich mit DCM, iProOH, DCM, DMF gewaschen und die Beladung des Harzes nach der Pikrinsäure-Methode bestimmt (0.62 mmol/g). Die restlichen freien Aminogruppen wurden mittels Essigsäureanhydrid (26 mmol) und Pyridin (26 mmol) in DCM (30 ml) (1 h) acetyliert und wie üblich gewaschen. Für die anschließende Verlängerung der Peptidkette wurde die DCC/HOBt-Methode (dreifacher Überschuß an geschützter Aminosäure) in DMF oder Mischungen aus DMF/DCM (4/1) verwendet. Die Vollständigkeit der Kupplungen wurde mittels des Kaiser-Tests überprüft. Für Ile²⁷ und Phe²² wurden doppelte Kupp­ lungen durchgeführt. Die Aminosäurederivate waren N^α-Boc-geschützt und Thr wurde als Boc-Thr(Bz) eingesetzt. Für die Abspaltung der Boc-Gruppe wurde 50% TFA (Trifluoressigsäure) in DCM verwendet (30 min). Das wie oben beschrieben erhaltene Peptidharz (1) hatte eine Substitution von 0.57 mmol/g und wurde durch Aminosäureanalyse und FAB-MS nach Abspaltung des Peptids aus einem kleinen Teil des Peptidharzes charakterisiert. Ein Teil des wie oben beschrieben erhaltenen Peptidharzes 1 (500 mg; 0.17 mmol) wurde mit Boc- Lys(Fmoc) gekuppelt (1 mmol) und anschließend mit Essigsäureanhydrid (1 mmol) in Gegenwart von Pyridin (1 mmol) acetyliert. Das erhaltene "verdünnte" (Beladung 0.21 mmol/g Harz) Peptidharz wurde dann bis zum Aminosäurerest Asp¹⁷ verlängert (Kupplungsmethode wie beschrieben für 1). Dabei wurden N°- Boc-geschützte Aminosäurederivate verwendet und His²⁰ und Lys¹⁸ wurden als Boc-Lys(2ClZ) und Boc-His(Bom) eingesetzt. Die N^Ω-Fmoc-Gruppe von Lys²¹und der Fluorenylmethylester(OFm)-Schutz des β-Carboxyls von Asp¹⁷ wurden durch Behandlung mit einer 20%igen Piperidinlösung in DMF (1 × 1 min; 1 × 28 min) nach einer Methode von Felix et al. (Felix, A.M. et al.; Int. J. Pept. Protein Res. 32 (1988) Seiten 441-454) abgespalten. Die Lactam-Verbrückung zwischen den von Schutzgruppen befreiten Seitenketten von Asp¹⁷ und Lys²¹ erfolgte dann durch die Zugabe von HBTU (HBTU, O-Benzotriazol-N,N,N′,N′-Tetrame­ thyl-Uronium Hexafluorophosphat) (0.3 mmol) und DIEA (0.34 mmol) in DMF (50 ml) zum Peptidharz und anschließendes Schütteln (für 4 h). Die Cyclisierung wurde durch den Kaiser-Test verfolgt. Nach dem Entfernen der Kupplungs­ reagenzien wurde die Cyclisierungsprozedur noch einmal wiederholt (2 h) und das Peptidharz anschließend acetyliert (wie oben beschrieben). Die weitere Verlängerung des so erhaltenen Peptidharzes (mit N^α-Boc-geschützten Amino­ säuren) erfolgte nach der Kupplungsmethode der "symmetrischen Anhydride" (5-fache Überschuß) mit der Ausnahme von Boc-Gln und Boc-Asn, welche nach der DCC/HOBt-Methode gekuppelt wurden. Die Kupplungen der Aminosäu­ rereste Leu⁴ und Asn³ wurden einmal wiederholt. Die Seitenketten von trifunk­ tionellen Aminosäuren wurden wie folgt geschützt: Asp(β-OcHx), Cys(S-p-Mb), Glu(γ-OBzl), Thr(Bzl) und Tyr(2BrZ). 100 mg des so erhaltenen NH₂-Cyclo^17,21- [Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt-MBHA wurden mit einer Mischung aus HF/Anisol/Dimethylsul­ fid/p-Thiokresol in Verhältnis 10/1/1/0.2 (v/v/v/w), welche auch Cystein in einer Endkonzentration von 0.27 M enthielt, behandelt (30 min auf -20°C und 1 h auf 0°C). Das von Schutzgruppen befreite und vom Harz abgespaltene Rohprodukt wurde durch Zugabe von Ether ausgefällt, mit Ether (3x) gewaschen und in 10% Essigsäure extrahiert (4 × 20 ml) und lyophilisiert. Es folgte Luftoxidation des wie oben beschrieben erhaltenen Rohproduktes zur Schließung der Dis­ ulfidbrücke in einer 0.1 M NH₄HCO₃ Lösung bei hoher Verdünnung (10^-4 M) im Dunkeln (24 h). Danach wurde die Lösung angesäuert (pH 4-5; 1 M HCl) und lyophilisiert. Das so erhaltene Rohprodukt wurde durch präparative Umkehr­ phasen-HPLC auf einer C¹⁸-Säule (Dynamax 300 A; 10 mm × 250 cm; 5 µm Partikelgröße; Porengröße 300 Å) gereinigt. Es wurde ein Gradient von 10-90% B über 30 min verwendet, wobei A aus 0.058% TFA in Wasser und B aus 0.05% TFA in 90% Acetonitril bestand. Die Detektion der Peptide erfolgte bei 220 nm. Die Reinheit des so erhaltenen Cyclo^17,21-[Asp¹⁷,Lys²¹]-hCt wurde durch Aminosäureanalyse, Ionen-Spray-MS und analytische HPLC verifiziert.

Bezugszeichenliste

hCt humanes Calcitonin
sCt Lachs-Calcitonin
pCt Schweine-Calcitonin
eCt Aal-Calcitonin
Aminosäuren wurden unter Verwendung des 1-, bzw. 3-Buchstaben-Codes nach IUPAC abgekürzt;
Chemikalien wurden unter den verkehrsüblichen Bezeichnungen der Peptidsyn­ these abgekürzt.

Claims (7)

1. Herstellung von konformationsstabilisierten Calcitonin-Analoga mit erhöhter hypocalcämischer Wirkung in vivo als wirkungsvolle Medikamente bei der Be­ handlung von Osteoporose, Paget′scher Krankheit, Hypercalcämie und anderen Krankheiten, bei denen Calcitonine therapeutisch eingesetzt werden, dadurch gekennzeichnet, daß durch Festphasensynthese auf p-Methylbenzhydrylamin-Harz in Verbindung mit einer Methode zur "Seitenketten-an-Seitenketten"-Cyclisierung ein humanes Calcitonin (hCt)-Analog hergestellt wird, in welchem Aminosäurerest 17 des natürlichen hCt durch Asparaginsäure und Aminosäurerest 21 des natürlichen hCt durch Lysin ersetzt sind, und die Seitenkettenreste dieser eingeführten Aminosäuren in Form einer Lactam-Verbrückung kovalent miteinander verknüpft sind, und die hergestellte Verbindung, Cyclo^17,21-[Asp¹⁷, Lys²¹]-hCt, eine 10-20- fach erhöhte hypocalcämische Aktivität in Mäusen in vivo im Vergleich zu natürlich vorkommendem hCt aufweist.

2. Herstellung von konformationsstabilisierten Calcitonin-Analoga mit erhöhter hypocalcämischer Wirkung in vivo nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Calcitonin-Analoga von natürlichem humanem Calcitonin, Lachs-Calcitonin und Aal-Calcitonin, ihren jeweiligen α-Aminosuberinsäure-1,7-Derivaten, ihren jeweiligen N^α-Acetyl-Derivaten, ihren jeweiligen N^α-Desamino-Derivaten, und von anderen Calcitonin-Derivaten, bei denen bei Erhaltung der Primärsequenz funktionelle Gruppen der Aminosäuren chemisch kovalent modifiziert sind, und von Calcitonin-Derivaten, welche durch zwei oder mehrere der oben aufgeliste­ ten Modifikationen entstanden sind, hergestellt werden, in welchen Aminosäu­ rerest 17 des jeweiligen Calcitonins oder Calcitonin-Derivats durch Asparagin­ säure und Aminosäurerest 21 des jeweiligen Calcitonins oder Calcitonin-Deri­ vats durch Lysin ersetzt sind, und die Seitenkettenreste dieser eingeführten Aminosäuren in Form einer Lactam-Verbrückung kovalent miteinander verknüpft sind.

3. Herstellung von konformationsstabilisierten Calcitonin-Analoga mit erhöhter hypocalcämischer Wirkung in vivo nach Patentanspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in Patentanspruch 1 und 2 beschriebene Erfindung auf die humanen Calcitonin (hCt)-Analoga, [Leu^12,16,19, Tyr²²]-hCt, [Leu^0,8,12]-hCt und [Leu^0,8,12,16]­ hCt, und auf diese und andere humane, Lachs-, und Aal-Calcitonin-Derivate angewendet wird, in welchen 1-12 Aminosäurereste der jeweiligen Primärse­ quenz durch andere, natürliche oder unnatürliche (z. B. Ornithin, N-Methylamino­ säuren etc.) Aminosäuren ersetzt sind, oder in welchen 1-12 Aminosäurereste der jeweiligen Primärsequenz deletiert sind, oder in welchen 1-12 Aminosäu­ rereste der jeweiligen Primärsequenz durch eine beliebige Kombination aus Sub­ stitutionen und Deletionen verändert sind, und/oder in welchen 1 oder mehrere Amidbindungen (CONH) des Peptidrückgrats durch CH₂NH, CSNH, CH₂S, CH₂CH₂, CH : CH, COCH, CH(OH)CH₂, CH₂SO, ersetzt sind.

4. Herstellung von konformationsstabilisierten Calcitonin-Derivaten mit erhöhter hypocalcämischer Wirkung in vivo nach Patentanspruch 1 durch Einführung alternativer Lactam-Verbrückungen, dadurch gekennzeichnet, daß ausgewählte Aminosäurenpaare, die sich in den Positionen 17 und 20, oder 17 und 21, oder 16 und 20, oder 16 und 21, oder 16 und 22, oder 15 und 21, oder 15 und 22 der primären Aminosäuresequenz von natürlichem humanem Calcitonin befinden, durch Lysin und Asparaginsäure, oder Asparaginsäure und Lysin, oder Ornithin und Glutaminsäure, oder Glutaminsäure und Ornithin, oder Glutaminsäure und Lysin, oder Lysin und Glutaminsäure, oder andere, auch unnatürliche, Diaminoaminosäuren und Dicarboxylaminosäuren, oder Dicarbox­ ylaminosäuren und Diaminoaminosäuren, oder Cystein und Cystein, oder Penicillamin und Penicillamin ersetzt werden, und kovalente Lactam-Verbrückung­ gen zwischen den Seitenkettenresten dieser Aminosäurenpaare hergestellt werden.

5. Herstellung von konformationsstabilisierten Calcitonin-Analoga mit erhöhter hypocalcämischer Wirkung in vivo nach Patentanspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die in Patentanspruch 2 und 3 beschriebenen Ausgangs-Calcitonine und Ausgangs-Calcitonin-Derivate anstatt durch die in Patentanspruch 2 und 3 beschriebene (Asp¹⁷, Lys²¹]-Verbrückung durch die in Patentanspruch 4 be­ schriebenen Verbrückungen modifiziert sind.

6. Herstellung von konformationsstabilisierten Calcitonin-Analoga mit erhöhter hypocalcämischer Wirkung in vivo nach Patentanspruch 5 unter zusätzlicher Einführung β-Haarnadelschleifen-stabilisierender Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß in den nach Patentanspruch 5 hergestellten Calcitoninen zusätzlich die Ami­ nosäure in der Position 18 der Primärsequenz durch die β-Haarnadelschleifen­ stabilisierenden Aminosäuren Prolin, oder D-Prolin, oder Serin, oder D-Serin, oder Threonin, oder D-Threonin, oder Alanin, oder D-Alanin, oder den N-Methyl­ derivaten von Serin, Threonin und Alanin ersetzt ist, und/oder die Aminosäure in der Position 19 der Primärsequenz durch die β-Haarnadelschleifen-stabili­ sierenden Aminosäuren Glycin, oder Prolin, oder D-Prolin, oder Serin, oder D- Serin, oder Asparagin, oder D-Asparagin, oder Asparaginsäure, oder D-Aspara­ ginsäure, oder D-Phenylalanin, oder D-Lysin, oder eine C_α-C_βDehydroaminosäu­ re (z. B. Z-Dehydrophenylalanin), oder den N-Methylderivaten dieser Aminosäu­ ren (außer von Prolin) ersetzt ist.

7. Herstellung von konformationsstabilisierten Calcitonin-Analoga mit erhöhter hypocalcämischer Wirkung in vivo nach Patentanspruch 6 unter Weglassung der jeweiligen Lactam-Verbrückung, dadurch gekennzeichnet, daß in die in Patentanspruch 2 und 3 beschriebenen Ausgangs-Calcitonine die in Patentanspruch 6 beschriebenen β-Haarnadelschleifen-stabilisierenden Amino­ säuren eingeführt werden, wobei auf die in Patentanspruch 2 und 3 beschriebe­ ne Einführung der jeweiligen Lactam-Verbrückung, sowie auf die zur Herstellung der Lactam-Verbrückungen ausgewählten Aminosäuresubstitutionen verzichtet wird.