CZ284972B6

CZ284972B6 - Peptidy s organoprotektivním účinkem a farmaceutické prostředky s jejich obsahem

Info

Publication number: CZ284972B6
Application number: CZ94205A
Authority: CZ
Inventors: Branko Turkovic; Stiepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic; Predrag Sc. Dr. Sikiric; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak
Original assignee: Predrag Sc. Dr. Sikiric; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stiepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic
Priority date: 1992-05-30
Filing date: 1993-05-28
Publication date: 1999-04-14
Also published as: GR3024905T3; BG61477B1; DE69219590T2; CZ20594A3; WO1993024521A1; US6211151B1; FI940375A0; DE69312232T2; BG98426A; EP0572688B1; NO940299D0; DE69312232D1; JPH06509588A; HU224073B1; HUT66309A; NO310027B1; ATE155485T1; EP0601154B1; US6268346B1; CA2114313C

Abstract

Peptidy, které mají organoprotektivní účinnost téhož typu jako známá sloučenina BPC, avšak mají kratší řetězec aminokyselin než uvedená známá látka, takže vyvolávají menší množství vedlejších účinků. Peptidy jsou vhodné pro výrobu farmaceutických prostředků pro použití u chorob, vyvolaných stresem, úrazů, zánětů, šoku, při mozkových poruchách, vředové chorobě a podobných stavech. ŕ

Description

Peptidy s organoprotektivním účinkem a farmaceutické prostředky s jejich obsahem

Oblast techniky

Vynález se týká nových peptidů s vysokou biologickou účinností téhož typu jako v případě známé sloučeniny BPC, avšak s kratším řetězcem aminokyselin a farmaceutických prostředků s obsahem těchto látek.

Dosavadní stav techniky

Biologicky účinná bílkovina s organoprotektivním účinkem, izolovaná z lidského nebo živočišného organismu a označená BPC (Body Protecting Compound) byla popsána v EP č. 432 400 a také v P. Sikiric a další, Exp. Clin. Gastroenterol., 1, 15-26, 1991. Tato sloučenina má velmi široké spektrum biologické účinnosti, chrání například proti vředové chorobě, má hepatoprotektivní, protivirový, antiedematosní účinek, sloučenina je obecně protizánětlivá, chrání proti vzniku zhoubných nádorů apod. Její molekulová hmotnost je vysoká, 40 000 ± 5 000, struktura je jen částečně stanovena. Bílkovinu je možno použít k léčení svrchu uvedených onemocnění, dále u poruch nervového systému, poruch dopaminergní etiologie, při chirurgických a stomatologických zákrocích, u poruch fertility a ve veterinárním lékařství. Toto široké spektrum účinnosti však může být důsledkem nedostatečně stanovené chemické struktury této látky nebo dokonce důsledkem nedostatečné čistoty nebo nedostatečné homogenity sloučeniny BPC po její izolaci.

Nyní bylo zjištěno, že některé syntetické peptidy, obsahující pouze 5 až 15 zbytků aminokyselin, s molekulovou hmotností 900 až 1600 mají biologickou účinnost BPC, avšak při zvýšené selektivitě.

Uvedené nové peptidy je možno získat daleko hospodárnějším způsobem. Tyto látky také vyvolávají daleko menší počet vedlejších reakcí vzhledem ktomu, že obsahují menší počet zbytků aminokyselin než BPC.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří nová skupina syntetických peptidů s překvapivě vysokou biologickou účinností, zvláště ve smyslu protektivního účinku na organismus. Tyto syntetické látky s velmi dobře definovanou strukturou jsou velmi výhodné ve srovnání sjen částečně definovanou vysokomolekulámí bílkovinou BPC, kterou je možno získat jen velmi obtížným postupem z pochybných přírodních zdrojů.

Podstatu vynálezu tedy tvoří peptidy s organoprotektivním účinkem, obsahující 8 až 15 zbytků aminokyselin s následujícím strukturním vzorcem

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa

10 15 kde

Xaa znamená zbytek neutrální alifatické aminokyseliny jako Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva,

Yaa znamená zbytek bazické aminokyseliny, jako Lys, Arg, Orn, His,

-1 CZ 284972 B6

Zaa znamená zbytek kyselé aminokyseliny, jako Glu, Asp, Aad nebo Apm, přičemž alespoň jeden ze zbytků Xaa nebo Zaa může být vynechán a současně mohou být vynechány zbytky v polohách 10 až 15, molekula peptidu je popřípadě cyklizována amidovou vazbou mezi prvním a posledním zbytkem aminokyseliny.

Aminokyseliny jsou označeny běžnými třípísmenovými kódy, pod zbytkem je vyznačena jeho poloha v řetězci peptidu. Pokud jde o možnou substituci zbytků ve významu Xaa, Yaa a Zaa, je možno použít některé méně obvyklé zbytky, z tohoto důvodu uvádíme zkratky těchto zbytků:

bAla kyselina beta-aminopropionová

Nva nor-valin

Apm kyselina 2-aminopimelová

Aad kyseliny 2-aminoadipová.

Výhodné jsou zejména následující peptidy.

Peptid s řetězcem č. 1:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015

Peptid s řetězcem č. 2:

Gly Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val

1015

Peptid s řetězcem č. 3:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val

1015

Podle dalšího provedení se vynález týká také analogických peptidů, zakončených na C-zakončení amidovou nebo karboxylovou skupinou, svrchu uvedeného obecného vzorce, v němž alespoň jedna a nejvýš 7 zbytků aminokyselin v oblasti 1 až 15 je vynecháno a alespoň jeden ze zbývajících zbytků aminokyselin je substituován zbytky z následující tabulky I:

Tabulka I

Zbytek	Substituce
Xaa	neutrální alifatická aminokyselina: Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva
Yaa	basická aminokyselina: Lys, Arg, Om, His
Zaa	kyselá aminokyselina: Glu, Asp, Asd, Apm

Dále budou uvedeny některé výhodné peptidy z této skupiny:

Peptid s řetězcem č. 4:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val 15 10 14

-2CZ 284972 B6

Peptid s řetězcem č. 5:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ale Gly Leu Val

5 1014

Peptid s řetězcem č. 6:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala

58

Peptid s řetězcem č. 7:

Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Ala Asp

59

Peptid s řetězcem č. 8:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp

59

Podle dalšího provedení vynálezu je možno peptidy se svrchu uvedeným strukturním vzorcem, v nichž alespoň jeden zbytek aminokyseliny je vynechán a zbývající zbytky aminokyselin mohou být nahrazeny podle tabulky I převést na cyklickou formu tvorbou nové skupiny CO-NH mezi prvním a posledním zbytkem aminokyseliny v molekule. Z těchto peptidů jsou výhodné následující sloučeniny:

Peptid s řetězcem č. 9:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val | 2_____________5___________ 10______________13 |

Peptid s řetězcem č. 10:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

I 2 5 9 I

Bylo prokázáno, že svrchu popsané peptidy mají biologickou účinnost, která je srovnatelná nebo vyšší než biologická účinnost bílkoviny BPC.

Byly také provedeny farmaceutické zkoušky při použití uvedených peptidů na běžných modelech in vitro a in vivo a byly zjištěny následující farmakologické vlastnosti:

1. Žaludeční vřed, vyvolaný stresem z imobilizace

V pokuse byli použiti krysí samci kmene Wistar s hmotností 180 až 200 g. Všechna zvířata byla imobilizována břichem vzhůru na 48 hodin při teplotě místnosti. Bezprostředně poté byla zvířata usmrcena a poškození bylo změřeno. Byly použity peptidy s řetězci č. 4, 6 a 2 v dávce 10 pg nebo 10 ng/kg b.w., i.p. nebo i.g. jednu hodinu před začátkem pokusu.

Všechna podání i.g. i i.p. měla ochranný účinek, i tak nízké dávky jako 10 ng/kg b.w. poskytovaly dobrou ochranu proti poškození.

-3 CL 284972 B6

2. Cystaminový model vředu

Pro pokus byly užity bílé krysí samice kmene Wistar s hmotností 180 až 200 g. Zvířatům byl 5 podán podkožně nebo b.w. v dávce 400 mg/kg cystaminhydrochlorid, rozpuštěný v destilované vodě. Po 24 hodinách byla zvířata usmrcena. Peptid s řetězcem č. 4 byl podán v dávkách 1,0 pg, 100 ng a 50 ng/kg b.w., i.p. a i.g. Bylo možno pozorovat významný ochranný účinek, závislý na velikosti dávky. Bylo možno pozorovat stejnou účinnost pro intraperitoneální a intragastrické podání účinné látky.

3. Bukální edém, vyvolaný terpentinem

K pokusu byly užity krysy kmene Wistar s hmotnostní 180 až 240 g, vždy 10 krys ve skupině. Terpentin byl podán do sliznice v dávce 0,02 ml/krysa. Kontrola: 0,02 ml 0,9% roztoku chloridu 15 sodného ve vodě do sliznice, 2krát. Peptidy s řetězci 2 a 4 byly podány v dávkách 10 pg a ng/kg i.p. a i.g. jednu hodinu před podáním terpentinu. Bukální edém byl měřen 24 hodin po podání dráždicí látky. Statistická analýza byla provedena Mann-Whitneyovým testem. Sledované peptidy byly účinné v dávkách 10 pg/kg b.w.

4. Chirurgický zákrok: účinek na kožní řezy

K pokusu byli použiti samci bílých krys kmene Wistar, 10 krys s hmotností 200 až 250 g pro každý pokus. Krysy s kožními ranami byly chovány jednotlivě v oddělených klecích. Zvířata byla uvedena do lehké éterové narkózy a pak byly na kůži zad provedeny dva řezy o délce 3 cm 25 vždy 1,5 cm od střední čáry. Jedna z nich byla uzavřena dvěma chirurgickými svorkami a druhá ponechána bez ošetření. Bezprostředně po provedení obou řezů byl intradermálně mezi oba řezy aplikován peptid s řetězcem č. 4 ve fyziologickém roztoku chloridu sodného v dávce 1,0 pg a 1,0 ng/kg b.w. nebo v případě kontrol 0,5 ml/kg fyziologického roztoku/kg.

V případě obou ran, jak po uzavření svorkami, tak bez ošetření, bylo možno pozorovat velmi dobrý hojivý účinek. Po 5 dnech bylo možno pozorovat u ošetřené skupiny menší množství zánětlivých buněk a podstatně lépe vyvinutá retikulinová vlákna než u kontrol.

5. Účinek na pokusné spáleniny

Pro tento pokus byli použiti bílí samci kmene Wistar, v každé skupině bylo užito 10 krysích samců s hmotností 200 až 250 g. V lehké éterové narkóze byla nosní sliznice uvedena do styku na 5 sekund s kauterem. Peptid s řetězcem č. 4 byl podán v dávce 10 pg/kg i.p. jednu hodinu před vyvoláním poškození. Kontrolám bylo podáno 5,0 ml/kg fyziologického roztoku i.p. Zákrok 40 obvykle vyvolal velký otok nozder a byl obvykle smrtelný u kontrolních (avšak nikoliv u ošetřených) zvířat do devátého dne po provedení zákroku. Na rozdíl od kontrol bylo možno u ošetřených zvířat pozorovat jen velmi mírný posttraumatický otok nozder. V důsledku toho bylo normální nosní dýchání jen málo ovlivněno a krysy proto zákrok přežily.

6. Vliv na hojení zlomenin

K pokusu byli užiti bílí krysí samci kmene Wistar s hmotností 270 až 300 g. V éterové narkóze byla rukou zlomena ve střední části levá holenní kost. Nebylo použito žádné znehybnění a zvířata se mohla volně pohybovat po kleci. Zvířata byla usmrcena 5., 8., 12. nebo 30. dne po 50 zlomení holenní kosti.

Peptid s řetězcem č. 4 byl podán v dávce 10 pg/kg i.p. 1 hodinu před zlomeninou a pak jednou denně (poslední podání 24 hodin před usmrcením). Kontrolní skupině bylo podáno současně

-4CZ 284972 B6 stejné objemové množství 0,9% vodného roztoku chloridu sodného, 5,0 ml/kg i.p.). V každém ze zkoumaných časových intervalů bylo možno pozorovat u všech zvířat, jimž byl podán peptid prokazatelně rychlejší hojení. U všech těchto zvířat se také vyvinul podstatně menší posttraumatický hematom než u kontrolních zvířat a také funkce se navrátila rychleji.

7. Protivirový účinek

Protivirový účinek byl sledován na novorozených myších kmene Balb-C ve stáří 24 hodin, obojího pohlaví.

Byly připraveny suspenze virů, a to: ARBO-viry TBE (Tick Bome Encephalitis), Bhania, Dengue 1, 2, 3, 4, Sinbis, West-Nile, Calovo, Hepatitis A, LCM (Lymphatic choriomeningitis) a Herpes Typ I v ředění 10'² a v množství 0,02 ml/myš byly podány i.c. nebo p.o. (Hepatitis A). Vzhledem k rozdílům ve virulenci byly dávky upraveny tak, že byly srovnatelné vzhledem k LDjoo v 0,02 ml i.c. (nebo p.o. v případě Hepatitis A) v ředění 10’². Tímto způsobem bylo možno srovnávat průběh různých virových infekcí bez ohledu na možné naočkování různých koncentrací virů.

Peptid s řetězcem č. 4 byl užit v koncentraci 20,0 pg v 1 ml v 0,9% vodném roztoku chloridu sodného a byl podán pouze jednou v dávce 2,0 pg/kg i.c. nebo i.p.:

a) 2 hodiny před podáním viru (-2^h),

b) současně s infekcí (0).

Kontroly: tentýž objem fyziologického roztoku chloridu sodného i.c. nebo i.p.. Výsledky jsou shrnuty v tabulce II. Čísla udávají počet dnů, po nichž infikované myši uhynuly.

Tabulka II

Virus

Způsob ošetření zvířat

Fyziologický roztok :

Syntetický fragment 4

-2h

X

- -k -

0^x

k -

-2h’

í

- h -

0^x

i.p.

1

i.c.

i.p.

i.c.

i.p.

: i.c.

i.p.

i.c.

TBE

a

5

1

5

;

n.d.

: n.d.

20

Bhania

a

5

• “ * k *

5

” k ” • ~ k “

5

b -

n.d.

: n.d.

20

Dengue 1

a

5

L .

5

• - k -

5

. _ I___

5

k -

n.d.

_ L -

20

k -

20

Dengue 2

a

5

. L _

5

• .

5

_ _ L _

5

n.d.

• n.d.

20

Dengue 3

a

5

Γ

5

• “ k “

5

n.d.

: n.d.

20

Dengue 4

a

5

E “ .μ -

5

- - k ~

5

- - k -

5

. - μ _

n.d.

: n.d.

20

_ _ μ _ «

20

Sinbis

a

5

,_p _

5

. . μ .

5

- - k -

5

• · b -

n.d.

! n.d.

• k -

20

_ - k - -

20

WestNile

a

5

.L _

5

_ L, _

n.d.

20

L - .

20

Calovo

a

5

Γ

5

r · - _ L -

5

” ” Γ

5

Γ “ k ·

n.d.

: n.d.

15

_ - μ _ .

15

Hepatitis

A⁺

5

r - -k -

5

_ _ U -

5

· k _

n.d.

: n.d.

- k -

20

• . μ . .

20

LCM

5

- k -

5

- - k -

5

• - k -

5

• - k -

n.d.

• n.d.

- k -

20

- . μ ..

20

Herpes typ

1

5

L

5

_ _ L

n.d.

• n.d.

_ L _

20

_____

20

žádný

- - - r--- r r i---- r r r ___L ____1______ L. ________L ______1___________L______ - - - _ L_ ______- - - -

(zdravá zvířata)

n.d.

•

n.d.

: n.d.

-

n.d.

•

n.d.

n.d. = nebylo stanoveno: zvířata byla pozorována po dobu 40 dnů po aplikaci viru, nedošlo k žádnému uhynutí.

a = ARBO-viry + = perorální aplikace viru x = zvířata byla ošetřena 2 hodiny před aplikací viru (-2h) nebo současně s aplikací viru (0)

P < 0,01, užito bylo 8 myší na jednu skupinu.

8. Antidepresivní účinnost

Aby bylo možno stanovit antidepresivní účinnost, byl použit test s nuceným plaváním podle publikace Porsolt a dalšé, Eur. J. Pharmacol., 47, 379-391, 1978.

K pokusu byli užiti krysí samci kmene Wistar s hmotností 180-240 g. Sledovaný peptid s řetězcem č. 4 byl podán první den po předběžné zkoušce a druhý den jednu hodinu před pokusem i.p.

Kontrolní skupina: fyziologický roztok chloridu sodného i.p.

Zvířata byla pozorována 5 minut. Pak byla měřena doba nehybnosti (Ti).

Tj pro kontrolní skupinu byla přibližně 150 sekund, u skupiny, jíž byl podáván peptid byla pouze 60-70 sekund. Tento účinek trval velmi dlouho, po 16 dnech jej ještě bylo možno prokázat.

Závislost účinku na dávce:

pg až 10 ng/kg: plný účinek pg/kg: stále ještě prokazatelný účinek pg/kg: účinek mizí.

9. Účinek na modelu Parkinsonovy choroby

K tomuto sledování byly užity známé modely Parkinsonovy choroby (Karakola a další, Pharmacol. Toxicol., 67, 95-100, 1990), reserpinový model a model MPTP.

K pokusu byly užiti myší samci NMRI-Hannover (pro model MPTP) nebo myši obojího pohlaví (pro reserpinový model).

a) MPTP byl podán v dávce mg/kg i.p. jednou denně po šest po sobě následujících dnů a pak po další 4 po sobě následující dny ve vyšší dávce 50 mg/kg. Sledovaný peptid s řetězcem č. 4 byl podán v dávce 1,5 pg a 15,0 ng/kg i.p. 15 minut před každým podáním MPTP nebo 15 minut po něm.

b) Reserpin byl podáván v dávce 5 mg/kg i.p.. Zkoumaný peptid byl podán v dávce 10 pg nebo 10 ng/kg i.p. 15 minut před podáním reserpinu nebo 24 hodin po jeho podání v téže dávce.

Kontroly: stejný objem fyziologického roztoku chloridu sodného, 5 ml/kg i.p.

Po předběžném podání peptidu bylo možno pozorovat podstatné snížení hypokinesie, rigidity (katalepsie) a třesu.

U modelu MPTP došlo po předběžném podání peptidu k daleko menšímu vývoji katalepsie, snížena byla také akinesie a vznik třesu.

-6CZ 284972 B6

V případě, že byl peptid podán 15 minut po podání MPTP, došlo k zábraně dalšího vývoje katalepsie po MPTP a výrazně byla snížena také katalepsie a třes. Obvyklá vysoká mortalita (50 %) pozorovaná po jediném podání MPTP byla snížena jak u zvířat, jímž byl peptid podán předběžně, tak u zvířat, jimž byl podán po podání MPTP.

10. Vliv peptidu na haemorrhagický šok

Ke všem pokusům byly užity krysí samice bílého kmene Wistar s hmotností 150 až 180 g.

Účinek na haemorrhagický šok byl sledován ve dvou sériích pokusů.

a) Zvířatům byla odebrána krev (1 ml v prvních třech minutách, pak v průběhu 2 minut zbytek) až do uhynutí. Pak byl stanoven objem krve do uhynutí v případě, že byl podán 15 minut před odběrem krve peptid s řetězcem č. 4 v dávce 10,0 pg nebo 10 ng/kg i.p. nebo fyziologický roztok chloridu sodného v množství 5,0 ml/kg i.p.. Po podání peptidu s řetězcem č. 4 bylo zapotřebí k uhynutí zvířete odebrat daleko větší objem krve než v případě kontrol, zejména při použití vyšší dávky peptidu.

b) Krevní tlak byl snížen odebráním řízeného množství krve a pak byl udržován po dobu 5 minut na hodnotě 30-35 mm Hg.

Pak byl nitrožilně podán peptid s řetězcem č. 4 v dávce 10,0 pg nebo 10,0 ng/kg nebo 3,0 ml fyziologického roztoku chloridu sodného i.v. Na rozdíl od kontrol došlo po podání peptidu k podstatnému zvýšení krevního tlaku, který pak byl udržován, takže nedošlo k uhynutí zvířete.

Z uvedených pokusů tedy vyplývá, že sledovaný peptid je velmi účinný při zlepšení celkových příznaků v důsledku velké ztráty objemu krve.

11. Vliv na letální ozáření

K pokusům byly užity myši kmene NMRI-Hannover ve stáří 5 až 6 týdnů, obojího pohlaví. Syntetický peptid s řetězcem č. 4 byl podán v dávce 20 pg/kg i.p. jednu hodinu před nebo po ozáření. Kontrolním zvířatům byl současně podán stejný objem, 5,0 ml/kg fyziologického roztoku chloridu sodného i.p. Zdravými kontrolami byla zvířata, která nebyla ozářena a rovněž jim nebyl podán ani peptid ani fyziologický roztok. Ozáření: Tetron 80 (Co 60, 2200 Ci). Neanestetizované myši v klecích, 16 myší ve skupině byly vystaveny záření na celém povrchu, užita byla supralethální dávka 9 Gy na ploše 20x20 cm ze vzdálenosti 80 cm.

Uhynutí zvířat bylo odečítáno dvakrát denně po dobu 30 dnů.

Všechna kontrolní zvířata uhynula v časovém rozmezí 7 až 12 dnů (LD^o/12)·

U zdravých neozářených zvířat nebylo v průběhu této doby možno pozorovat žádné uhynutí.

Ve srovnání s kontrolními skupinami nebylo možno pozorovat žádný rozdíl ve skupině, jíž byl podán peptid 1 hodinu po ozáření. Avšak ve skupině, jíž byl peptid podán 1 hodinu před ozářením bylo možno pozorovat podstatné prodloužení doby přežití a 70% zvýšení LD_1Oo ve srovnání s kontrolami.

12. Účinek na vyvolané malformace

Pro všechny tyto pokusy byly užity myší samice kmene NMRI-Hannover ve stáří dvou měsíců s průměrnou hmotností 25 g bez předchozí kopulace. Pak byla u myších samic v estru uskuteč

-7CZ 284972 B6 něna kopulace přes noc při použití zkušených zdravých samců. Po 20 dnech březosti byly myši usmrceny.

Vitamin A byl podán v dávce 15 700 jednotek/kg i.m. desátého dne březosti v dávce 0,05 ml/kg).

Současně byl podán peptid s řetězcem č. 4 v dávce 10 pg nebo 10 ng/kg i.p.

Kontrolní zvířatům byl podán fyziologický roztok chloridu sodného, 5,0 ml/kg i.p.

Jako zdravé kontroly byla použita zvířata, kterým nebyl podán vitamin A, avšak byl jim podán v téže době i.p. fyziologický roztok chloridu sodného nebo roztok peptidů 4 v téže dávce.

Ve skupině zdravých zvířat (fyziologický roztok) ani ve skupině zvířat, jimž byl podáván peptid nebylo možno pozorovat žádné malformace.

Výsledky, které jsou shrnuty v následující tabulce III prokazují překvapivě vysoký a na velikosti dávky závislý ochranný účinek peptidů proti malformacím, vyvolaným podáváním vitaminu A.

Tabulka III - makroskopické pozorování

Ošetření	• Celkový počet plodů	• Celkový počet malformo- • váných plodů
Kontroly	ΐ 55	i 0
(fyz. roztok)		J
Vitamin A	Í 54	: 36
Vitamin A +
peptid 4	: 36	: 13
10 ng/kg
Vitamin A +
peptid 4	: 18	: 1
10 pg/kg

13. Akutní toxicita

Akutní toxicita syntetických peptidů byla stanovena u myších samic s hmotností přibližně 20 g. Pro každý pokus i kontrolu bylo užito 6 zvířat.

Peptidy s řetězci 2, 3, 4 a 6 byly podány v dávkách 8, 25 a 50 mg/kg i.v. Kontrolní skupině bylo podáno 5,0 ml/kg 0,9 % vodného roztoku chloridu sodného. Pak byla zvířata následujících 15 dnů pozorována na příznaky toxicity.

V použitých dávkách peptidů nebylo možno pozorovat žádné známky toxicity a žádné uhynutí. Bylo však možno pozorovat zajímavý jev významně zvýšené motility a živosti zvířat po dobu 2 hodin po podání peptidů.

Podle výsledků farmakologických zkoušek je možno uzavřít, že peptidy poskytují organismu ochranu proti stresům a chorobám a obecně normalizují funkce organismu.

-8CZ 284972 B6

Peptidy by tedy měly být účinné při prevenci a léčení řady onemocnění a poruch u lidí i u zvířat.. Zejména jde o následující typy poruch:

- poruchy a onemocnění vyvolaná stresem,

- gastrointestinální vředy různého původu,

- záněty a otoky různého původu,

- poranění, spáleniny, zlomeniny kostí a obecně chirurgické choroby a zákroky,

- virové infekce,

- šok,

- Parkinsonova nemoc,

- ochrana proti poškození a záření a

- ochrana proti vzniku malformací.

Obecně je možno uvedené peptidy použít u široké škály farmaceutických prostředků v kombinaci s netoxickým farmaceutickým nosičem nebo nosným prostředím, plnivem, netoxickým pufrem, nebo spolu s fyziologickým roztokem chloridu sodného. Farmaceutické prostředky s obsahem uvedených peptidů je možno použít místně nebo systemicky v kapalné formě, pevné formě, polotuhé formě, ve formě injekčního roztoku, tablety, mazání, lotionu, kapsle, tablety, určené k rozpuštění pod jazykem a podobně.

Peptidy budou obecně podávány v dávce 10'⁵ až 10‘² mg/kg hmotnosti v případě systemického podání. Při místním podání bude koncentrace vyšší, například 0,1 až 0,5%.

Velmi příznivá je nepřítomnost jakýchkoliv známek toxicity až do dávek 50 mg/kg hmotnosti a také dobrá účinnost uvedených látek při perorálním podání (intragastricky).

Popsané peptidy je možno synthetizovat při použití postupné kondenzace chráněných aminokyselin v homogenním kapalném systému nebo s výhodou postupem s použitím pevné fáze. Pro přípravu cyklických peptidů se připraví částečně chráněné lineární peptidy s požadovanou délkou řetězce, například ve formě alkylesterů na C-terminálním konci s následným převedeným na azid, navázáním a odstraněním ochranných skupin. Je také možno cyklizovat částečně chráněný lineární peptid s volnými terminálními skupinami působením difenylfosforylazidu ve velmi zředěném roztoku.

Vynález bude nyní popsán ve svém praktickém provedení v následujících příkladech, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza peptidů s použitím ochranné skupiny Boc

Při syntéze peptidů bylo jako výchozí materiál užito 100 mg Boc-Val-PAM (PAM byl získán od Applied Biosystems, substituce 0,56 meq/g, jde o derivát kyseliny aminoacyl—4-(oxymethyl)fenyloctové a aminopolystyrenu). Boc-aminokyseliny (Boc = terc.butoxykarbonyl) byly jedna po druhé kondenzovány na polymemí nosič při použití diisopropylkarbodiimidu (DIPC) jako kondenzačního Činidla. V každém stupni byla skupina Boc odstraněna působením 50% roztoku kyseliny trifluoroctové (TFA) v dichlormethanu. Aminoskupina pak byla podrobena deprotonaci působením diisopropylethylaminu.

-9CZ 284972 B6

Přeměna by měla být v každém stupni vyšší než 99,5 %. V případě, že se to nepodaří, kondenzace se opakuje. Po ukončení syntézy se výsledný produkt odštěpí působením zředěné kyseliny fluorovodíkové (2 hodiny při 0 °C). Jako látka, která váže vznikající ionty se užije anisol. HF se odpaří v proudu dusíku. Surový peptid se izoluje vlitím olejovitého zbytku do 5 bezvodého etheru.

Surový peptid se čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografii HPLC v reversní fázi při použití sloupce s rozměrem 5x150 mm s náplní silikagelu RP-18, eluce se provádí při použití 0,1% TFA ve směsi vody a acetonitrilu. Detekce: UV absorpce při 225 nm.

io

Syntéza peptidu s řetězcem č. 4 je po jednotlivých stupních znázorněna na obr. 1.

Příklad 2

Syntéza peptidů při použití Fmoc

Při syntéze byly použity standardní aminokyseliny s ochrannou skupinou Fmoc (Fmoc = 9-fluorenylmethyloxykarbonyl). Skupiny na postranním řetězci byly chráněny jako O-terc.20 butyiestery (Asp, Apm, Glu, Aad) a jako deriváty Boc (Lys). První aminokyselina (Val) byla navázána na polymemí nosič - pryskyřici BHA (BHA = benzhydrylaminopryskyřice) při použití diisopropylkarbodiimidu jako vazného činidla. V každém ze stupňů byla ochranná skupina Fmoc odstraněna působením piperidinu. Pak byly stejným způsobem navázány aminokyseliny jedná po druhé až do ukončení syntézy. Odštěpení bylo uskutečněno při použití směsi TFA/TFMSA/ 25 anisol v objemovém poměru 2 : 17 : 52.

Peptid byl pak čištěn při použití HPLC tak, jak bylo popsáno v příkladu 1.

Syntéza peptidu s řetězcem č. 2 je znázorněna podrobněji na obr. 2.

Příklad 3

Syntéza peptidů při použití Ddz

Všechny použité aminokyseliny byly v tomto případě chráněny na aminoskupině v poloze alfa s použitím skupiny Ddz (Ddz - alfa, alfa-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxykarbonyl). Funkce na postranním řetězci byly chráněny skupinou Z (Z = benzyloxykarbonyl) v případě lysinu a skupinou O-terc.-Bu (terc.butylester) v případě kyseliny asparagové a kyseliny glutamové.

Merrifieldův nosič (zesítěný chlormethylovaný polystyrénový gel) s kapacitou l,4mmol/g byl užit pro vazbu první Ddz-aminokyseliny přes česnou sůl. Po kondenzaci s dicyklohexylkarbodiimidem DCC byla v každém stupni odstraněna ochranná skupina Ddz působením 5% roztoku TFA v dichlormethanu a pak byl materiál promyt a následovala deprotonace působením 10% 45 triethylaminu v dichlormethanu. Po deprotonaci byl uskutečněn následující vazný stupeň stejným způsobem. Tyto stupně byly opakovány až do dokončení požadovaného peptidového řetězce.

Nakonec byl peptid odštěpen od polymemího nosiče při použití směsi HBr/TFA/anisol. Po odpaření těkavého podílu byl odštěpený peptid vysrážen z bezvodého éteru a sušen. Pak byl 50 surový peptid čištěn pomocí HPLC stejným způsobem jako v příkladu 1. Syntéza peptidu s řetězcem č. 6 je podrobněji znázorněna na obr. 3.

-10CZ 284972 B6

Příklad 4

Syntéza cyklického peptidu

Způsobem podle příkladu 1 nebo 2 byl předem připraven peptid v částečně chráněné formě, vzorce

OBzl NO₂ OBzl

Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Arg-Pro-Ala-Asp-OH

0,0005-molámí roztok tohoto peptidu v dimethylformamidu byl použit k cyklizaci přidáním difenylfosforylazidu a triethylaminu při teplotě 12 °C po dobu 12 hodin.

Pak byla směs hydrogenována vodíkem v přítomnosti paladia na aktivním uhlí 8 hodin při teplotě 25 °C.

Rozpouštědlo bylo opatrně odpařeno a surový produkt byl čištěn při použití HPLC způsobem podle příkladu 1.

Tímto způsobem byl ve výtěžku 10 % získán cyklický peptid s řetězcem č. 10:

5 10

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

Příklad 5

Syntéza lineárních a cyklických peptidů při použití Ddz

Tentýž postup jako s použitím skupiny Ddz svrchu byl použit u lineárních i cyklických peptidů. Funkce na postranním řetězci byly chráněny skupinou Z (lysin) nebo O-benzylesterovou skupinou (kyselina glutamová a kyselina asparagová).

Jako polymemí nosič byl použit HYCRAM^r (ORPEGEN, Heidleberg SRN), jde o 4-bromkrotonyl-beta-alanylamidomethylpolystyrenovou pryskyřici. První aminokyselina (Ddz-valin) byla navázána na polymemí nosič jako česná sůl.

Pak byla skupina Ddz odstraněna při použití kyseliny trifluoroctové (5%) v dichlormethanu a aminoskupina byla podrobena deprotonaci působením diisopropylethylaminu.

V následujícím stupni byl na zbytek valinu na polymemí matrici navázán Ddz-glycin při použití diisopropylkarbodiimidu DIPC v přítomnosti 1-hydroxybenzotriazolu.

Tyto stupně byly opakovány tak dlouho, až byl dokončen peptidový řetězec. Synthetizovaný peptid v chráněné formě pak byl opatrně odštěpen z nosiče HYCRAM^r působením tetrakis(trifenylfosfin)paladia (0), rozpuštěného v bezvodém tetrahydrofuranu v nepřítomnosti kyslíku. Jako akceptorová molekula pro allylové skupiny byl užit například morfolin.

Pak byl polymemí nosič odfiltrován a promyt tetrahydrofuranem. Roztok peptidu pak byl zfiltrován přes krátký sloupec silikagelu k odstranění katalyzátoru (paladium).

-11 CZ 284972 B6

Eluát, který obsahoval částečně chráněný peptid 4a byl vysušen a rozpouštědlo bylo opařeno ve vakuu, v němž byl produkt dosušen.

Syntéza lineárního peptidu s řetězcem č. 4

Částečně chráněný peptid 4a byl rozpuštěn ve 2,2,2-trifluorethanoIu a hydrogenován v přítomnosti 10% paladia na aktivním uhlí působením plynného vodíku při teplotě 30 °C. Pak byl katalyzátor odfiltrován a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Surový odparek pak byl čištěn při použití HPLC obdobným způsobem jako v příkladu 1. Po čištění byl získán peptid s řetězcem č. 4. Tento produkt byl totožný s produktem, získaným podle příkladu 1.

Syntéza cyklického peptidu s řetězcem č. 9

Částečně chráněný peptid č. 4a byl rozpuštěn ve směsi dimethylformamidu a dichlormethanu v poměru 1:1, čímž vznikl 0,001-molámí roztok. K dosažení cyklizace byl přidán DIPC a HOBt a směs byla ponechána 10 hodin při teplotě 20 °C. Pak byl roztok odpařen na malý objem, zředěn 2,2,2-trifluorethanolem a čištěn průchodem sloupcem s náplní Sephadexu LH-20. Frakce s obsahem částečně chráněného cyklického peptidu 9a byly odděleny a hydrogenovány v přítomnosti 10% paladia na aktivním uhlí jako katalyzátoru při teplotě 30 °C za probublávání vodíkem a intensivního protřepávání celkem 8 hodin.

Pak byl katalyzátor odfiltrován a roztok byl vysušen a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Surový peptid byl pak čištěn pomocí HPLC způsoben podle příkladu 1. Získaný čistý cyklický peptid měl řetězec č. 9.

Syntéze na polymemím nosiči HYCRAM^r při použití Ddz a cyklizace je podrobněji znázorněna na obr. 4 a 5. Všechny synthetizované peptidy byly kontrolovány na čistotu pomocí HPLC při použití sioupce silikagelu RP-18 (oktadecylsilanizovaný sloupec), eluce se provádí směsí vody, acetonitrilu a kyseliny trifluoroctové při použití gradientu obvyklým způsobem. Ve všech případech byla čistota vyšší než 95 %.

Peptidy byly charakterizovány analýzou aminokyselin (hodnoty byly v rozsahu 10% teoretického množství), analýzou řetězce, molekulovou hmotností, stanovenou pomocí hmotové FAB spektrometrie a také pomocí UV a IR-spekter, výsledky jsou znázorněny na obr. 6 a 7.

Vynález byl osvětlen na několika specifických provedeních, je však zřejmé, že by bylo možné navrhnout ještě řadu dalších modifikací a změn, které by rovněž spadaly do rozsahu vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Peptidy s organoprotektivním účinkem, obsahující 8 až 15 zbytků aminokyselin, obecného vzorce

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa ίο 1 5 10 15 kde

Xaa znamená zbytek neutrální alifatické aminokyseliny Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva,

Yaa znamená zbytek bazické aminokyseliny Lys, Arg, Om nebo His,

Zaa znamená zbytek kyselé aminokyseliny Glu, Asp, Aad nebo Apm,

20 přičemž alespoň jeden ze zbytků Xaa nebo Zaa může být vynechán a současně mohou být vynechány zbytky v polohách 10 až 15, molekula peptidu je popřípadě cyklizována amidovou vazbou mezi prvním a posledním zbytkem aminokyseliny.

25
2. Peptidy podle nároku 1, v nichž je molekula cyklizována amidovou vazbou mezi prvním a posledním zbytkem aminokyseliny.
3. Peptid podle nároku 1, s řetězcem č. 1, vzorce

30 Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val

15 1015
4. Peptid podle nároku 1, s řetězcem č. 2, vzorce

35 Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val

15 1015
5. Peptid podle nároku 1, s řetězcem č. 3, vzorce

40 Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val

1 5 1015
6. Peptid podle nároku 1, s řetězcem č. 4, vzorce

45 Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val

15 1014
7. Peptid podle nároku 1, s řetězcem č. 5, vzorce

50 Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val

15 1014

-13 CZ 284972 B6
8. Peptid podle nároku 1, s řetězcem č. 6, vzorce

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala

1 58
9. Peptid podle nároku 1, s řetězcem č. 7, vzorce

Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Ala Asp

1 59
10. peptid podle nároku 1, s řetězcem č. 8, vzorce

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp

1 59
11. Peptid podle nároku 1, s řetězcem č. 9, vzorce

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val | 2_____________5 ______________10_____________13|
12. Peptid podle nároku 1, s řetězcem č. 10, vzorce

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

I 2 59 i
13. Peptid podle nároku 1, s řetězcem č. 11, vzorce

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asn

1 59
14. Farmaceutický prostředek, určený pro léčení onemocnění a poruch, způsobených stresem, zánětů, otoků, úrazů, spálenin, virových infekcí, chorob imunologického systému, poruch CNS, gastrointestinálních vředů různého původu, zlomenin kosti, šoku a obecně stavu po chirurgických zákrocích, mozkových poruch a deprese, Parkinsonovy choroby, k ochraně proti poškození zářením a proti malformacím, vyvolaným chemickými látkami, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje alespoň jeden peptid podle nároků 1 až 13 spolu s farmaceuticky přijatelným pevným nebo kapalným nosičem.