JPH06509588A - 有機保護活性を備えたペプチド、その調製方法及び治療におけるその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有機保護活性を備えたペプチド、その調製方法及び治療におけるその使用法 本発明は、公知の天然化合物ＲＰＣと同じタイプの高い生物活性を有しながらよ り短いアミノ酸連鎖を備えた新しいペプチドに関するものである。

発明の背景 人又は動物の体から分離されＲＰＣ（ボディ・プロチクティング・コンパウンド ）と名付けられた有機保護活性を備えた生物学的に活性なタンパク質は、ヨーロ ッパ特許第４３２４００号（ＥＰ０４３２４００）で開示され、公開もされてい る：Ｐ、シキリク他、Ｅｌ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｇａ５１＋ｏｅｎｌｅ＋ｏｌ、上、 １５〜２６．１９９１゜このタンパク質は、部分的にのみ決定された構造を備え 、約４００００±５０００ダルトンの高分子量を有する。この化合物は、潰瘍保 護の、肝臓保護の、抗ウイルス性の、抗浮腫性の、一般的な抗炎症性の活性、抗 悪性腫瘍の活性等のような生物学的活性の非常に広いスペクトルを有する。これ は、列挙された病気の治療の他、神経系の病気及び障害の治療に、ドーパミン作 用性の病因の障害、外科、口腔病学、生殖能力の医療に、及び獣医学に使用され る。

しかしながら、活性のこの広いスペクトルはおそらく、決定されない構造の、或 いは分離された化合物ＲＰＣの不十分な純度乃至均質性の結果であり得る。

□の概要 我々は、９００〜１６００ダルトンの分子量を備え僅かに８〜１５個のみの連鎖 アミノ酸残基を備えた合成ペプチドを発見し、これは化合物ＢＰＣを保護するけ れども選択性の増した天然体の生物学的活性を有する。我々の新しいペプチドは 、より経済的に生産され、ＢＰＣよりも少なくアミノ酸残基を有しているので、 副反応の影響を受けにくい。

発明の記載 本発明の一面に従って、とりわけボディ保護の意味で驚くほど高い生物学的活性 を呈する種類の合成ペプチドが提供される。いずれにせよ、適切に定義された構 造を備える当該合成化合物は、あいまいな天然源からの困難な手続きによっての み得られる部分的にのみ定義された高分子タンパク質ＢＰＣに比べて、大きな利 点を有する。

より詳しくは、本発明は、８〜１５個のアミノ酸残基を有した新しい種類の生物 学的に高い活性のあるペプチドに関するもので、残基は３文字のアミノ酸コード を用いた次の基礎的構造式によって表現され、各アミ、ノ酸残基の下の数字はペ プチド連鎖での当該残基の位置に関連する。

Ｘａａ　Ｚａａ　Ｐ「ｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｘａａ　Ｙａａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ａｓｐ　Ｚａａ　Ａｌａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａｌ　５　１０　１５ ここで、１以上のアミノ酸残基が置換される。使用されうる置換分Ｘａａ、Ｙａ ａ、Ｚａａは次の表Ｉに示される。

表１ 好適なペプチドは次のようになる。

Ｓｅ　、　ｌｄ、　Ｎｏ：　Ｉ Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｔｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＶａｌＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐ ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇ ｌｙ　Ｌｅｕ　ＶａｌＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙ ｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌｌ　５ 　１０　１５ 本発明の別の面に従って、上に記載された構造式を有しＣ末端でアミド乃至カル ボキシ終結形状での類推ペプチドが提供され、ｌ〜１５の部位で少なくと１１、 多くとも７個のアミノ酸残基が省かれ、残りのアミノ酸残基の少なくとも１個が 表Ｉでの置換の概要に従い置換可能である。

鉛工、　ｌｄ、　Ｎｏ：４− １、ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐ「ｏ　Ｐ「ｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ 　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌｌ　５　１０　１４ Ｓｅ　、　ｌｄ、　Ｎｏ：５ Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐ「ｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌｌ　５　１０　１４ Σクユｌｄ、　Ｎｏ：６ Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｔｏ　Ａｌａ＋　５　８ Ｓｅ　、ｌｄ、Ｎｏニア Ａｓｐ　Ｐ「ｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｌｌｅ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐｌ 　５　９ Ｓｅ　、　Ｉｄ、　Ｎｏ：８ Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｌ”ｔｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ ｌ　５　９ 別の実施例に従って、上に記載された構造式を有し、アミノ酸残基の少なくとも １個が省かれ得、残ったアミノ酸残基の少なくとも１個が表Ｉに指摘されたよう に置換され得るペプチドは、分子中の最初と最後のアミノ酸残基の間で新しい結 合ＣＯ−Ｎ　Ｈの構成によって環式形状に変形される。好適なペプチドは次の通 りＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｔｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ 　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌｃｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｔｏ　 Ｐｒｏ　ｃｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ出願人は、上に記載したよう なペプチドを用いる場合、そのようなペプチドが親タンパク質ＢＰＣのそれと等 しいかそれより大きい生物学的活性を示すことを発見した。

記載したペプチドの薬理学的調査は、試験管内及び生体内の異なる一般的モデル に基づき行われ、次の薬理学的特性が発見された： １、）抑制ストレスにより引き起こされた胃潰瘍アルピノウィスター（雄）のネ ズミ（１８０〜２００ｇ）が実験に用いられた。この動物の全てが室温で４８時 間仰向は状態に固定された。その後ただちに供され、病変を測定された。ｍ工Ｉ ｄ、　Ｎｏ：４．６及び２のペプチドが、有害な手続きの前１時間１０μｇ又は １００ｇ／ｋｇ体重の適量で、腹膜を通して又は胃内で適用された。

１００ｇ／ｋｇ体重のように低い投与量でおいてすら胃内への及び腹膜を通して の適用の両方は、強く保護的であった。

２．）ｆｉ瘍のシステアミンモデル アルピノウィスター（雌）のネズミ（１８０〜２００ｇ）が実験に用いられた。

４００ｍｇ／ｋｇ体重の適量での（蒸留水に溶解された）塩酸システアミンが皮 下に適用された。２４時間後、当該動物は供された。Ｓｅ　、　Ｉｄ、　Ｎｏ： ４のペプチドが、１．０μｇ、１１００ｎ及び５０　ｎ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重の 適量で腹膜を通して及び胃内へ適用された。投与量に依存する強い保護が得られ た。同じ活性が施与の両方の腹膜を通して及び胃内経路にも見出された。

３、）テルペンチン誘発口内浮腫 動物　ウィスターの雄ネズミ（１８０〜２４０ｇ）、各群毎にＮ＝１０゜テルペ ンチンが粘膜内に０．０２ｍＱ／ネズミで与えられた。対照標準＝０．９％塩水 が粘膜内に（０，０２ｍＱ／ネズミ、２ｘ）。旦しユｄ、Ｎ五２ＲＵ±のペプチ ドが、テルペンチンの１時間前に１０ｐｇ及び１０ｎｇ／ｋｇの投与量で腹膜を 通して及び胃内に適用された。口内浮腫が、浮腫誘発後２４時間で測定された。

統計的な分析：マン・ウィツトニー試験（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｌｎｅｙ　１ｅｓｔ ）　ｏ調査されたペプチドが１０μｇ／ｋｇ体重の適量で有効であった。

４、）外科、皮膚切開での効果 雄のシロネズミ（各実験毎に１０匹、２００〜２５０ｇ体重）が実験に用いられ た。皮膚傷のあるネズミは、隔離したかごに個々に保持された。軽いエーテル麻 酔のかかった各動物に、背中に現れる３ｃｍの切り口が、正中線の各々の位置の 皮膚１．５ｃｍを通して平行につけられた。一方の傷はそして２個の外科用クリ ップで接合され、他方は処置されずにそのままにされた。１．０μｇ及び１．０ ｎｇ／ｋｇ体重の投与量で塩水に溶解された匠Ｉｄ、　Ｎｏ：４のペプチド、及 び対照標準で塩水０．５ｍＱ／ｋｇ体重が損傷後直ちに傷の間で皮膚内に施され た。

調査されたペプチドの顕著な癒合効果が、外科的処置をせずにそのままにされた 傷と外科的クリップをした傷の両方で明らかであった。５日後、処置された群は 、対照標準よりも炎症性細胞の数が少なく、著しく良好に改善された細網繊維を 呈した。

５、）実験的火傷での効果 ウィスター系の雄のシロネズミ（Ｎ＝１０．２００〜２５０ｇ体重）が実験に用 いられた。軽いエーテル麻酔をかけ、鼻の粘膜を５秒間白熱した焼灼器に曝した 。Ｓｅ　、　Ｉｄ、　Ｎｏ：４のペプチドが損傷する１時間前に１０μｇ　／　 ｋ　ｇ体重の適量で腹膜を通して用いられた。対照標準＋５．０ｍＱ／ｋｇ体重 の塩水を腹膜を通して。施された手続きは通常、鼻の著しい腫れ上がりを生じ、 損傷後９日以内で対照標準にとっては一様に致命的であった（しかし処置された 動物にはそうでなかった）。対照標準に比して、鼻の非常に僅かな外傷後の腫れ 上がりのみが観察された。その後、通常の鼻の呼吸がほんの僅かに害されるだけ で、生存は妨げられな６、）骨折治癒での効果 ウィスター系の雄のシロネズミ（２７０〜３００ｇ体重）が実験に用いられた。

エーテル麻酔をかけられ、左側の脛骨が、骨の真ん甲部分から手で折られた。固 定されずに動物はかごの中で自由に動けるようにされた。当該動物は、損傷され た後、５日目、８日目、１２２日目び３００日目供された。

Ｓｅ　、　ｌｄ、　Ｎｏ：４のペプチドが、損傷の１時間前、その後日に一度（ 実験の２４時間前に最後の適用）１０．０μｇ／ｋｇ体重の適量で腹膜を通して 与えられた。対照標準の群には、同時に等量の塩水（０，９％、５．０ｍＱ／ｋ ｇ体重、腹膜を通して）が与えられた。著しく改善された治癒率が、調査された 間隔の各々においてペプチドで処置された動物のすべてで示された。注目すべき ことに、処置された動物のすべてで、対照標準の動物よりも、局部的な外傷後の 血腫が一貫して低く、障害の与えられた機能がほんのじきに回復した。

７、）抗つイスル性活性 抗つイスル性活性が、生まれたてのマウス、ＢＡＬＢＣ種、２４時間経過後の両 性のものについて調査された。

ＡＲＢＯ−ライスル：ＴＢＥ（＝ダニ媒介の脳炎）、バーニア環（Ｂｈａｎ　ｉ 　ａ）　、デング熱１．２．３．４、シンビス種（Ｓｉｎｂｉｓ）、西ナイル種 （Ｗｅｓ＋−Ｎｉｌｅ）、カローボ種（Ｃａｌｏｖｏ）、Ａ型肝炎、ＬＣＭ（リ ンパ性脈絡髄膜炎）及びヘルペス型■が、一般的に容認されるように調製され、 希釈状態１０−２（０，０２ｍＭ／マウス）でのウィルス懸濁液として適用され 、脳内に又は経口的（Ａ型肝炎）に注射された。毒性の相違の観点で、脳内への 投与量は１０−２希釈状態での０．２ｍＱ　（又は経口的に、Ａ型肝炎）の接種 材料におけるＬＤ＋ｏｏに関して比較可能であるように調整された。このように して、我々は、異なるライスル濃度の可能な接種にかかわらず、異なるライスル 感染の経路を比較できた。

Ｓｅ　、　ｌｄ、　Ｎｏ：４のペプチドが、０．９％塩水溶液での２０．０μｇ 　／　ｍ　Ｑの濃度で用いられ、２．ｏ７ｔｇ／ｋｇ体重の適量で、脳内に又は 腹膜を通してただ一度適用された：ａ）ライスル適用の２時間前（−２ｈ）ｂ） 接種と同時に（０） 対照標準コロじ量の塩水を脳内に又は腹膜を通して。結果は表ＩＩに要約されて いる： 当該表中の数字は、ペプチド又は塩水（対照標準）処置された群でのライスルを 接種されたマウスのすべてが死ぬまでの期間（日数）を示している。

ウィルス　塩　水　合成小片４ 感染　−２ｈ！　Ｏｆ　−２ｈ”　ＯＩｉ、、　ｉ、ｃ、　ｉ、、　ｉ、ｃ、　 ｉ、、　ｉ、ｃ、　ｉ、、　ｉ、ｃ。

ＴＢＥ　ａ　５　５　５　５　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、　２０　２０バーニアａ　５　 ５　５　５　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、２０　２０デング熱１ａ　５　５　５　５　ｎ、 ｄ、ｎ、ｄ、２０　２０デング熱２ａ　５　５　５　５　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、２０ 　２０デング熱３ａ　５　５　５　５　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、２０　２０デング熱４ ａ　５　５　５　５　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、２０　２０シンビス　ａ　５　５　５　 ５　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、２０２０西ナイル　ａ　５　５　５　５　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ 、２０　２０カローボ　ａ　５　５　５　５　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、１５　１５Ａ＋ 肝炎　５　５　５　５　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、２０　２ＯＬＣＭ　５　５　５　５　 ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、　２０　２０ヘルペス型１　５　５　５　５　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ 、２０　２０存−り１１ｆ）　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、ｎ、 ｄ、ｎ、↓　ｎ、ｄ、−ｎ、ｄ、−非決定：ウイスル適用後４０日間、動物は観 察された。

いずれも死に至らなかった。

ａ　−ＡＲＢＯウイスル ＋　−経［１ウイスル適用 Ｘ　−動物はライスル適用２時間前に（−２ｈ）処置されたか、つ、イスル施与 ど同時に（０）処置された。

Ｏｖｓ、塩水Ｐ＜０．００］　；各群毎に８匹のマウスなお１．ｐ、は腹膜を通 して差し込まれることを意味し、１．Ｃ０は脳内に差し込−まれることを意味す る。

８、）抗抑−活性 抗抑制活性の発現のために、ボーシルト等、Ｅｕｔ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

土７，３７９〜３９１頁（１９７８）に従う強制遊泳試験が用いられた。

雄のウィスターのネズミ（１８０〜２４０ｇ体重）が、この実験に用いられた。

調査されたＳｅ　、　ｌｄ、　Ｎｏ：４のペプチドが、予備試験期間後最初の日 と２日目の実験の１時間前に与えられた（腹膜を通して）。

対照標準群：塩水、腹膜を通して。

動物は５分間観察された。不動性の時間が測定された（Ｔ１）。

対照標準群のＴ、は約１５０秒で、ペプチド処置された群では僅かに６０〜７０ 秒であった。この効果は長く継続し、１６日後、なお存在していた。

投与量のレスポンス：１０／ｊｇ〜１０ｎｇ／ｋｇ：十分な効果１０ｐｇ／ｋｇ ：効果がなお存在する ｌｐｇ／ｋｇ：効果消失。

９、）パーキンソン病のモデルでの効果調査のために、パーキンソン病の公知モ デルが用いられた（カラコラＳ、他、薬理学・毒理学、６７．９５〜１００．１ ．９９０）゛レセルピンモデル及びＭＰＴＰモデル。

ＮＭＲＩ−ハノーバ一種の雄（Ｍ　Ｐ　Ｔ　Ｐモデルに対し）又は両性（レセル ピンモデルに対し）のマウスが用いられた。

ａ）ＭＰＴＰが、６連続日で１に一度３０．０ｍｇ／ｋｇ体重の適量で腹膜を通 して、次の４回間が５０ｍｇ／ｋｇ体重のより高い適量で適用された。調査され たＳｅ　、　Ｉｄ、　Ｎｏ：４のペプチドは、各ＭＰＴＰ施与１５分前又はＭＰ ＴＰ施与１５分後に１．５ｐｇど１５．Ｏｎｇ／ｋｇ体重の適量で、腹膜を通し て適用された。

ｂ）レセルピンは５　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重の投与で腹膜を通して適用された 。試験されたペプチドは、１０　ノＪｇ又はＩ　Ｑ　ｎ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重の 適量で腹膜を通して、レセルピン１５分前に、又は同じ投与量でのレセルピン施 与に続く２４時間で適用された。

対照標準等しい量の塩水、５　ｍ　Ｑ　／　ｋ　ｇ体重、腹膜を通して減動症、 硬直（強硬症）及びふるえの著しい減少が、ペプチドでの前処置後に観察された 。

ＭＰ　Ｔ　Ｐモデルにおいて、このペプチドでの前処置は、強硬症発現を強く抑 え、無運動及びふるえの出現を減らした。

（１５分後の）後処置は、ＭＰＴＰ強硬症の更なる発現を強く防ぎ、無運動及び ふるえを著しく減らした。通常、ＭＰＴＰの１回だけの適用後に示された高い死 亡率（５０％）は、ペプチド前処置された動物並びにペプチド後処置された動物 で減少した。

１０、）出血性ショックでのペプチド施与の効果ウィスタ一種の成長した雌のシ ロネズミが、すべての実験に用いられた。

出血性ショックでの効果が、２系列の実験で調査された。

ａ）動物は死ぬまで血を取られた（３分にわたり１　ｍ　Ｑ、２分の休止）。致 命傷な結果を招来する除去された血液量は、ＳｗユムＮｏ：４のペプチド（１０ ，０／ｊｇ又は１０ｎｇ／ｋｇ体重、腹膜を通して）で、又は塩水（５，０ｍＱ ／ｋｇ体重、腹膜を通して）で（出血１５分前に）前処置された動物において評 定された。致命的な血液量損失が対照標準の値に比べて著しく高くなることが、 より多いペプチド投与で処置された群で一貫して示された。

ｂ）血圧は、調節された血液量の除去によって低下し、その後５分間、３０〜３ ５ｍｍＨｇの値に維持された。

そしてＳｅ　、　Ｉｄ、　Ｎｏ：４のペプチド（１０，Ｏｐｇ又は１０ｎｇ／　 ｋ　ｇ体重）又は塩水（対照標準、３．０ｍ１２／ｋｇ体重）は静脈内に適用さ れた。対照標準と比較して、著しく上昇して維持された血圧値と完全死の回避が 、ペプチド処置された動物で示された。

したがって調査されたペプチドが、血液量損失の結果を改善するにつき、非常に 有効であると思われる。

１１、）致死放射での影響 両性の生後５〜６週間のＮＭＲＩ−ハノーバ一種のマウス（１８〜２２ｇ体重） が実験に用いられた。Ｓｅ　、　ｌｄ、　Ｎｏ：４の合成ペプチドが、照射１時 間前又は後に２０μｇ／ｋｇ体重の適量で、腹膜を通して適用された。対照標準 の動物は、同時に０．９％塩水（５、０ｍ　Ｑ　／　ｋ　ｇ　）の等量を腹膜を 通して与えられた。

無塩で健康な動物が通常の条件に保たれ、薬物又は照射処置を受けず、健康な対 照標準として供された。

照射：Ｔｒｅａｔｒｏｎ　８０　（商品名、コバルト６０．２２００キユーリー ）。１群当たり１６匹のかご内の麻酔をかけられていないマウスが、距離８０ｃ ｍ、２０Ｘ２０ｃｍの照射領域で９グレイの致死以上の投与量で全身照射に曝さ れた。

３０日間に日に２度死亡が記録された。

対照標準の動物はすべて７〜１２日以内に死亡した（ＬＤ、。。７．２）。

健康な（照射されていない）対照標準では死亡がなかった。

対照標準のデータに比して、照射の１時間後にペプチドで処置された群では違い が観察されなかった。しかしながら、化合物が照射の１時間前に適用された場合 には、著しい生存が示された。

対照標準に比してＬＤ＋ｏｏでの７０％増加が示され得た。

１２、）引き起こされた奇形での影響 ２５ｇ体重で予め種付けされていない生後２ケ月のＮＭＲＩ　−ハノーバ一種の 雌のマウスが全ての実験に用いられた。発情期の雌のマウスが、良好に体験を積 んだ健康な雄のマウスと夜通しつかわされた。妊娠の２０日後、当該マウスは供 された。

ビタミンＡが妊娠の１０日後に（０，０５ｍＱ／ｋ　ｇ体重）１５−７００Ｕ／ ｋｇ体重の投与量で、筋肉内に適用された。鉦Ｌｌｄ、　Ｎｏ：４のペプチドが 、同時に１０７２　ｇ又は１０　ｎ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重の適量で腹膜を通して 与えられた。

対照標準：塩水５．０ｒｎＱ／ｋｇ体重、腹膜を通して。

ビタミンＡで処理されず、同時に塩水又はペプチド↓を同量腹膜を通して与えら れた動物が、健康な対照標準として供された。

健康な（塩水）又はペプチド処置された群では奇形が示されなかった。

表ＩＩＩに纏められた結果は、驚くべきことに、ビタミンＡで引き起こされた奇 形に対する調査されたペプチドの著しく且つ投与量に依る保護効果を示している 。

表ＩＩ＋　肉眼での検査 処置　胎児総数　奇形胎児数 対照標準群（塩水）　５５　０ ビタミンＡ　５４　３６ １０ｎ／ｋ　□−□ １０　／に １３、）急性毒性 合成ペプチドの急性毒性が、雌のマウス（体重約２０ｇ）で決定された。６匹の 動物の群が、各実験と対照標準に用いられた。

Ｓｅ　、　ｌｄ、　Ｎｏ：２．３．１１及び６のペプチドが、８．２５及び５０ ｍｇ／ｋｇ体重の適量で静脈内に適用された。対照標準の群は塩水（０，９％、 ５．０ｍＱ／ｋｇ体重）で処置された。動物は次の１５日間で毒性の徴候が観察 された。

適用された適量において、毒性又は死亡の徴候が観察されなかった。ペプチドの 適用後２時間の間に著しく増加した運動性と活気の興味ある現象が観察された。

薬理学的調査の結果に続いて、これらペプチドは、ストレスと病気に対して生体 を保護する、即ち一般的に器質性機能を正常にする意味での活性を示す。

これらの使用は、各種の人間又は動物の病気と障害の予防と治療に作動でもある 。より詳しくは、これら化合物は次の処置に用いられよう。

一陣害と病気を誘発するストレス 一種々の病因の胃腸の潰瘍 一種々の病因の炎症と浮腫 一外傷、火傷、骨折及び外科上一般 −ライスル性感染 一ショノク 一パーキンソン病 一放射ダメージの保護に対して −奇形の保護に対して 一般的に、既述のペプチドは、充填剤、非毒性緩衝剤又は生理的食塩水のような 非毒性の薬剤キャリア又は媒介物と組み合わせて広い範囲の薬剤構成物において また使用されうる。そのような薬剤構成物は、局所的又は全身的に用いられ、ま た液体、固体、半固体、注射可能な溶液、錠剤、軟膏、ローション、カプセル、 舌下錠等のような適切な形態をとり得る。

これらペプチドは一般的に、全身に適用する場合、体重の１０−５〜１０”２ｍ 　ｇ　／　ｋ　ｇの適量で施与される。局所的に施与する場合には、より高い濃 度に、例えば０．１％〜０．５％で用いられる。

非常に好適に、５０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重の投与量まで何ら毒性の徴候がな く、経口施与によって（胃内に）化合物の良好な活性もある。

ここに記載されたペプチドは、均質な液体系中での保護アミノ酸の段々の濃縮を 用いて、又は好適には固相法を用いて合成されうる。環式ペプチドの調製のため に、所望の長さの部分的に保護された線形ペプチドが、Ｃ末端でアルキルエステ ル群とともに、そしてアジ化物に転化され、次いで結合され、保護群が取り除か れて調製される。あるいは選択的に、自由末端群を備えた部分的に保護された線 形ペプチドが、非常に希釈された溶液中でのジフェニルホスホリルアゾ化によっ て環状化されうる。

本発明は、次の例に関して記載されるが、その範囲はこれに限定されるものでは ない。

貫上 Ｂｏｃ計画を用いるペプチド合成 ペプチド合成は、Ｃ−末端カルボキシベブチドを作るために、Ｂｏａ−Ｖａ　］ −ＰＡＭ樹脂１００　ｍ　ｇで始められて行われた（応用バイオ系から購入され たＰＡＭ、置換物０．５６ｍｅｑ／ｇはアミノポリスチレンのアミノ−アシル− ４−（オキシメチル）−フェニル酢酸誘導体である。）。Ｂｏｃアミノ酸（Ｂ　 ｏ　ｃ　＝第三級ブトキシカルボニル基−）は、濃縮試薬としてジイソプロピル カルボジイミド（ＤＩＰＣ）を用いて重合体キャリアにおいて次々に濃縮された 。各段階において、Ｂｏａ群はジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　 Ａ）の５０％溶液で除去された。アミノ群はそしてジイソプロピルエチルアミン で陽子を取り除がれた。

各段階での転化は９９．５％よりも高くなければならない。そうでない場合、濃 縮は繰り返された。完全な合成後、開裂が低い■ＩＦ手続き（０℃で２時間）で 行われた。カルボニウムイオン除去剤としてアニソールが用いられた。ＨＦは窒 素の流れによって蒸発された。未処理の生ペプチドがその後、油性残基をドライ エーテルに注ぐことによって得られた。

そして生ペプチドが、シリカゲルＲＰ−１８を充填した５×１５０ｍｍのコラム 、溶媒系での傾斜溶出：水／アセトニトリルでの０．１％ＴＦＡを用いて逆相） （ＰＬＣで浄化された。検出：２２５ｎｍでの紫外線吸収。

復」ユ」丈工及ヒ」ユでのペプチドの合成は図１に示される。

里Ｉ Ｆ　ｍ　ｏ　ｃ計画を用いるペプチド合成標準的なＦ　ｍ　ｏ　ｃ保護アミノ酸 がその合成に用いられた（Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメチルオキ−カルボニル 基−）。

側鎖機能は〇−第三級ブチルエステル（Ａｓ　ｐ、Ａｐｍ、Ｇ　Ｉ　ｕ、Ａａｄ ）として、及びＢｏｃ誘導体（Ｌｙｓ）として保護された。

第一アミノ酸（Ｖａｌ）は、カップリング試薬としてジイソプロピルカルボジイ ミドを用いて、重合体キャリアーＢＨＡ樹脂（ＢＨＡ−ベンゾヒドリルアミノ樹 脂）に結合された。各段階で、Ｆ　ｍ　ｏ　ｃ保護群はピペリジンと共に除去さ れた。その後、第二等、以降のすべてのアミノ酸は、合成が完了するまで、同じ ようにして導かれた。開裂はＴＦＡ、／’ｒｐＭｓＡ／７：ソール＝＝２：　１ ７　：５２　（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の混合物によって行われた。

ペプチドはそして例１に記載されたＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃ法を用いて浄化された。

Σ蛎ニー堕ユ」←ユ」工でのペプチドの合成は図２に示される。

例３ すべてのアミノ酸が、Ｄｄｚ（＝α、αジメチル−３，５〜ジメトキシベンジル オキシカルボニル基−）によってそのαアミノ機能で保護され用いられた。副機 能は２群（＝ベンジルオキシカルボニル基−）によってリジンが、０−ｔ−Ｂｕ 群（ｔ−ブチルエステル）によってアスパラギン酸及びグルタミン酸が保護され ｌこ。

１．４ｍｍｏ　ｌ／ｇのキャパシティーを備えた（クロロメチル化されたポリス チレンゲルを架橋された）メリフィールド文体（Ｍｅｒｔｉｆｉｅｌｄ　５ｕｐ ｐｏ＋ドポリマー樹脂）が、そのセシウム塩を介して第−Ｄｄｚ−アミノ酸の結 合に用いられた。ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）で濃縮後、Ｄｄｚ 保護群は、ジクロロメタン中で５％ＴＦＡを用いて、次いで洗浄し、ジクロロメ タン中で１０％トリエチルアミンで陽子を取り除かれる各段階で除去された。陽 子除去（ｄｅｐ＋ｏｔｏｎａｌｉｏｎ）後、次のカップリング段階が、同じ方法 を用いて媒介された。当該カップリング段階は、ペプチド連続が完了するまで繰 り返された。

最後ニペプチドは、ＨＢｒ／ＴＦＡ／アニソール混合物を用いて重合体キャリア から開裂された。揮発性部分の蒸発後、丁度開裂されたペプチドはドライエーテ ルから沈澱され、乾燥された。

生ペプチドはそして例１に記載されたようにＨＰＬＣ法によって浄化された。Ｓ ｅ　、　ｌｄ、　Ｎｏ：６でのペプチドの合成は図３に示される。

里ユ 環式ペプチドの合成 部分的に保護された形態でのペプチド：ＯＢｚ　Ｉ　ＮＯ２０Ｂｘ　Ｉ Ｇｌ　’ｆ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｒ　ｇ −Ｐｒｏ−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｐ−ＯＨは予め例１又は２に記載された方法に従っ て調製された。

ジメチルホルムアミド中のこのペプチドの０．０００５モル溶液は、ジフェニル ホスホリルアジ化物及びトリエチルアミンを添加した後に２０℃、１２時間で環 化された。

そしてこの混合物が、水素／パラジウム木炭触媒で２５℃、８時間水素化された 。

溶媒は注意深く蒸発され、未処理の生成物は、例１に記載されたＨＰＬＣ法を用 いて浄化された。

Ｓｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ：　１０での環式ペプチドＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐ ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ＾ｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐが１０％収率で得られた 。

群を保護するＤｄｚでの同じ計画が、線形及び環式ペプチドを得るのに用いられ た。副機能は７群（リジン）で、及びＯ−ベンジルエステル群−０Ｂｚｌ−（グ ルタミン酸及びアスパラギン酸）で保護された。

重合体キャリアはＨＹＣＲＡＭＲ樹脂（ＯＲＰＥＧＥＮ社、ドイツ、ハイデル・ ＼ル５ヶの商標）で、これは４−ブロモクロトニル−β−アラニル−アミドメチ ル−ポリスチレンである。第一アミノ酸（Ｄｄｚ−バリン）はそのセシウム塩を 介して重合体キャリアに結合した。

そし、てＤｄｚ群はジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸（５％）を用いて除去 され、アミノ群はジイソプロピルエチルアミンで陽子を取り除かれた。

次の段階において、Ｄｄｚ−グリシンは、１−ヒドロキシベンシトリアゾ・−ル の存在でジイソプロピルカルボジイミドＣＤＩＰＣ）を用いて、ポリマーマトリ ックスのノくリン残基に結合した。

これらの段階は、ペプチド連鎖が完了するまで繰り返された。

合成された保護形態でのペプチドは、そして酸素のない無水テトラヒドロ−フラ ンに溶けたテトラキス−（トリフェニル−ホスフィノ）−パラジウム（０）でＨ ＹＣＲＡＭＲキャリアから注意深く開裂された。モルホリンのような添加剤がア リル群の受体分子として用いられた。

重合体キャリアが濾過され、テトラヒドロフランで洗浄された。

ペプチドの溶液がそしてシリカゲルの短いコラムを通して濾過され、パラジウム 触媒が除去された。

部分的に保護されたペプチド±土を含む溶出液が、溶媒の蒸発後、真空で乾燥さ れた。

エタノールに溶解され、木炭でのパラジウム（１０％）の存在において３０℃で 水素ガスによって水素化された。触媒が濾過され、溶媒が真空で蒸発された。未 処理の残基はそして例１に記載されたようなＨＰ　Ｌ　Ｃ法を用いて浄化された 。浄化後、とｈ」ム」〔ジクロロメタン（１１）に溶かされ、０．００１モル溶 液が形成された。環化のために、ＤＩＰＣとＨＯＢｔが加えられ、２０℃で１０ 時間おかれた。そして当該溶液は、濃縮され小さな容量となり、２．２．２−ト リフルオロエタノールで希釈され、５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　ＬＫＢ社の商品名）で充填されたコラムを通すことで浄化された。部 分的に保護された環式ペプチド９ａを含む留分は集められ、８時間の水素バブリ ングと激しい攪拌によって３０℃で木炭でのパラジウム（１０％）触媒で水素化 された。

そ１〜で触媒が濾過によって除去され、溶液は真空での溶媒蒸発によって乾燥さ れた。未処理の生ペプチドは、例１で記載された方法を用いるＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃに よって追加的に浄化された。得られた純環式ペプチドはＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ ：　９でのペプチドと同じである。

Ｉ）ｄｚ計画と環化を用いたＨＹＣＲＡＭＲ重合体キャリアでの合成は、図・１ 及び５に示された。合成されたペプチドのすべては、シリカゲルＲＰ−１８（オ クタデシルシラン化された）のコラムを用いてＨＰ　Ｌ　Ｃ法によってその純度 をチェックされ、通常の様式において水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸か らなる溶媒の混合物で傾斜して溶出された。

ペプチドはアミノ酸分析（値は理論の１０％以内であった）、連続分析、マスー ＦＡＢ分光測定法で決定された分子量、紫外線及び赤外線スペクトルで特徴づけ られた（図６及び７）。

我々の発明の成る実施例のみが特別詳細に記載されたが、所謂当業者にとって、 多くの他の特別な実施例も実施でき、多くの変更もすべて、本発明の精神と書き 添えられたクレームの範囲のうちで行いうろことも明らかである。

波　長　（ｎｍ） 波　長　（ｎｍ） （ＫＢｒ　タブレット） 波　数 、、ｌｌｌ＋　ＰＣＴ／ＥＰ　９３１０１３５２フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３７１０２　 ＡＢＮ ＣＯ７Ｋ　７１０８　８３１８−４Ｈ ／／　Ｃ０７Ｋ　９９：００ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ 、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、 　ＰＬ、　ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ。

ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳ （７１）出願人　ロックヴイク　イーヴオグロアチア　バーエル・４１０００　 ザグレブクヴエツノ　ナセリエ　１／２１ （７１）出願人　ドウヴニャク　マルコフロアチア　バーエル・４１０００　ザ グレブローザ　ルクセンブルグ　４ ＦＩ （７１）出願人　トウルコヴイク　ブランコクロアチア　バーエル・４１０００ 　ザグレブバウエロヴア　１９ （７１）出願人　ミーセ　ステバン クロアチア　バーエル・５８０００　スプリトルズヴエルトーヴア　３７ （７１）出願人　スチャネク　エルネストクロアチア　バーエル・４１０００　 ザグレブアレヤ　ファウ　ポポヴイカ　１２５ （７１）出願人　ミルトナー　ポリス クロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブコペルニコヴア　あ （７１）出願人　ウドヴイチク　イヴアンスイス　ツェーハー・６３７０　シュ タンスエンネトモーザーシュトラーセ　１６ フロントページの続き （７２）発明者　シキリク　プレドラググロアチア　バーエル・４１０００　ザ グレブユリシェヴア　５ （７２）発明者　ペテク　マリャン クロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブヴイスニカ　２９ （７２）発明者　サイヴエルト　ステバンクロアチア　バーエル・４１０００　 ザグレブパルモティチェヴア　１７ （７２）発明者　グラバレヴイク　ゼリコクロアチア　バーエル・４１０００　 ザグレブレルマノーヴア　１２アー （７２）発明者　ロックヴイク　ィーヴオクロアチア　バーエル・４１０００　 ザグレブクヴエッノ　ナセリエ　１／２１ （７２）発明者　ドゥヴニャク　マルコフロアチア　バーエル・４１０００　ザ グレブローザ　ルクセンブルグ　４ （７２）発明者　トウルコヴイク　ブランコクロアチア　バーエル・４１０００ 　ザグレブバウエロヴア　１９ （７２）発明者　ミーセ　ステバン クロアチア　バーエル・５８０００　スプリトルズヴエルトーヴア　３７ （７２）発明者　スチャネク　エルネストクロアチア　バーエル・４１０００　 ザグレブアレヤ　ファウ　ポポヴイカ　１２５ （７２）発明者　ミルトナー　ポリス クロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブコペルニコヴア　謁 （７２）発明者　ウドヴイチク　イヴアンスイス　ツェーハー・６３７０　シュ タンスエンネトモーザーシュトラーセ　１６

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．８〜１５個のアミノ酸残基を備え、次式【配列があります】 によって表される生物学的に高い活性の新しい種類のペプチド。 ここで、Ｘａａは、Ａｌａ、ｂＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｎｌ ｅ、Ｎｖａのような中性の脂肪族アミノ酸残基を示し、Ｙａａは、Ｌｙｓ、Ａｒ ｇ、Ｏｒｎ、Ｈｉｓのような塩基性のアミノ酸残基を示し、Ｚａａは、Ｇｌｕ、 Ａｓｐ、Ａａｄ又はＡｐｍのような酸性のアミノ酸残基を示し、残基Ｘａａ又は Ｚａａの少なくとも１つは省略可能である。
2. ２．分子が最初と最後のアミノ酸残基の間のアミド結合によって環化されるクレ ーム１のペプチド。
3. ３．式： 【配列があります】 のＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：１でのペプチド。
4. ４．式： 【配列があります】 のＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：２でのペプチド。
5. ５．式： 【配列があります】 のＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：３でのペプチド。
6. ６．式： 【配列があります】 のＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：４でのペプチド。
7. ７．式： 【配列があります】 のＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：５でのペプチド。
8. ８．式： 【配列があります】 のＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：６でのペプチド。
9. ９．式： 【配列があります】 のＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：９でのペプチド。
10. １０．式： 【配列があります】 のＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：１０でのペプチド。
11. １１．式： 【配列があります】 のＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：１１でのペプチド。
12. １２．薬学的に容認されうる固体乃至液体の媒体との混合でのクレーム１〜１１ のいずれかに従う１以上の化合物を含む治療構成物
13. １３．病気や障害で引き起こされるストレス、炎症、浮腫、外傷、火傷、ウイル ス性感染、イミュン系（ｊｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ）の病気、ＣＮＳ障害、各種 病因の胃腸の潰瘍、骨折、ショック及び外科一般、脳障害及びうつ病、パーキン ソン病の処置のため、放射障害及び化学剤によって引き起こされた奇形の保護の ため、及び体保護化合物として一般に、クレーム１〜１１に従う新規なペプチド の使用法。