RO112506B1

RO112506B1 - Peptide cu activitate organo-protectoare

Info

Publication number: RO112506B1
Application number: RO94-00101A
Authority: RO
Inventors: Sikiric Predrag; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stiepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic
Original assignee: Sikiric Predrag; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stiepan Mise; Ernest Suchanek; Mildner Boris Zagreb Ch Udovic
Priority date: 1992-05-30
Filing date: 1993-05-28
Publication date: 1997-10-30
Also published as: DE69219590T2; JP2783681B2; HU9400252D0; FI120454B; DK0572688T3; GR3024379T3; CZ20594A3; NO940299D0; PL302304A1; AU4319693A; DE69312232T2; US6268346B1; BG61477B1; ES2103854T3; DK0601154T3; GR3024905T3; WO1993024521A1; ATE152734T1; NO940299L; BG98426A

Description

Prezenta invenție se referă la peptide cu activitate organo-protectoare, care au o activitate biologică superioară, de aceleși tip cu a produsului natural BPC.

Se cunoaște o peptidă biologic activă, cu activitate organo-protectoare, care a fost izolată din corpul uman sau animal și denumită BPC ( Body Protecting Compound = compus care protejează corpul) și care este descrisă în EP 0432400 și publicată: P. Sikiric et al., Exp. Clin. Gastroenterol., 1, 15-26, 1991. Această proteină are o greutate moleculară ridicată, de aproximativ 40.000 + 5.000 Daltoni, cu o structură numai parțial determinată. Acest compus are un spectru foarte larg de activități biologice, ca: hepatoprotector, antiviral, antiedemic, activitate antiinflamatoare generală, activitate antimalignă și altele. Este utilizată în terapia bolilor citate, în plus, în terapia bolilor și a tulburărilor sistemului nervos, a tulburărilor de etiologie dopaminergică, în tratamentul fecundității și în medicina veterinară. Acest spectru larg de activitate este, probabil, o consecință a structurii nedeterminate și chiar a purității sau omogenității insuficiente a compusului izolat BPC.

Problema pe care o rezolvă invenția este obținerea unor peptide sintetice cu 8 până la 15 resturi de aminoacid pe lanț, cu greutate moleculară între 900 și 1600 Daltoni, care au activitate biologică a compusului natural care protejează corpul BPC, dar au selectivitate mărită. Aceste noi peptide sunt produse mai economic și sunt mai puțin supuse efectului reacțiilor secundare, deoarece ele conțin mai puține resturi de aminoacid decât BPC.

Invenția înlătură dezavantajele peptidelor cunoscute, prin aceea că aceste peptide cu activitate organo-protectoare cuprind 8 până la 15 resturi de aminoacid și sunt reprezentate prin formula generală:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 15 10 15 în care:

Xaa reprezintă un rest de aminoacid alifatic neutru, precum Ala, bAla, Leu, lle, Gly, Val, Nle, Nva;

Yaa reprezintă un rest de aminoacid bazic, precum Lys, Arg, Orn, His;

Zaa reprezintă un rest de aminoacid acid, precum Glu, Asp, Aad sau Apm; unde cel puțin unul și cel mult șapte resturi de aminoacid din regiunea 1 până la 15 pot fi omise.

Mai exact, această invenție se referă la o clasă nouă de peptide active înalt biologic, care cuprind de la 8 la 15 resturi de aminoacizi, care sunt reprezentate prin următoarea formulă structurală de bază, care utilizează drept cod pentru aminoacid trei litere, iar numerele de sub fiecare rest de aminoacid se referă la poziția restului de aminoacid pe lanțul peptidic:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 15 10 15 în care unul sau mai multe resturi de aminoacid sunt substituite.

Substituenții Xaa, Yaa și Zaa care sunt folosiți sunt reprezentați în tabelul 1 care urmează

Tabelul 1

Resturi	Substituent
Xaa	un aminoacid alifatic neutru: Ala, bAla, Leu, lle, Gly, Val, Nle, Nva
Yaa	aminoacid bazic: Lys, Arg, Orn, His
Zaa	aminoacid acid : Glu, Asp, Aad, Apm

RO 112506 Bl

Peptidele preferate sunt:

Secv. ID nr. 1

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val55

1015

Secv. ID nr. 2

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val60

1015

Secv. ID nr. 3

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val65

1015

Totodată sunt prezentate peptide analoage care au o grupare amidică sau carboxil la atomul de carbon terminal, care au formula structurală descrisă anterior și în care cel puțin un rest aminoacid sau cel mult 7 resturi de aminoacid dîn regiunea 70 1-15 sunt omise, și cel puțin unul din resturile de aminoacid care rămân pot fi substituite în concordanță cu tabelul 1.

Peptidele preferate sunt:

Secv. ID nr. 475

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val

5 1014

Secv. ID nr. 58 o

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val

1014

Secv. ID nr. 685

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala

58

Secv. ID nr. 790

Asp Pro Pro Pro lle Arg Pro Ala Asp

59

Secv. Id nr. 895

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp

59

Peptidele cu formulele structurale descrise mai sus și în care cel puțin unul din 100 resturile de aminoacid poate fi omis și în care cel puțin unul din resturile de aminoacid care rămân pot fi substituite, așa cum este indicat în tabelul 1, sunt transformate întro formă ciclică prin formarea de noi legături CO-NH între primul și ultimul rest de aminoacid din moleculă.

Peptidele preferate sunt următoarele: 105

RO 112506 Bl

Secv. ID nr. 9

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val

1 i ¹	1 2	5	10	13 I
	Secv. ID nr. 10
	Gly Glu Pro Pro	Pro Gly Arg Pro Ala	Asp
1 ' ~	_	5 9	L

Peptidele conform prezentei invenții au următoarele avantaje:

- au o activitate biologică egală sau mai mare decât proteina de origine BPC, în special în sensul protejării corpului;

- se obțin mai ușor;

- au lanțul peptidic mai scurt.

Aceste peptide sintetice cu structură bine definită au un mare avantaj, comparativ cu proteina BPC cu moleculă mare, numai parțial definită, care se obține numai prin proceduri dificile, din surse naturale îndoielnice.

In continuare se dau următoarele exemple de realizare a invenției, în legătură fig. 1=7, care reprezintă:

sinteza peptidei sinteza peptidei sinteza peptidei sinteza peptidei sinteza peptidei liniare cu Secv. ID nr. 4 și a peptidei ciclice cu Secv. ID nr. 9,

1,

2,

3, cu cu cu cu

Secv. Secv. Secv. Secv.

ID ID

ID

ID nr. nr. nr. nr.

4, utilizând strategia Boc;

2, utilizând strategia Fmoc;

6, utilizând strategia Ddz;

4a parțial protejată, utilizând strategia Ddz;

Șl cu

-fig.

- fig. 4,

- fig- 5, pornind de la petida liniară 4a protejată;

- fig. 6, spectrul UV al peptidei cu Secv. ID nr. 4 și 6 ( apă, 1 mg/ml );

- fig. 7, spectrul IR al peptidei cu Secv. ID nr. 4 și 6 [ tabletă de KBr ]..

Peptidele din această invenție sunt sintetizate folosind condensarea în trepte ( pas cu pas j a aminoacizilor pretejați, în sistem lichid omogen sau, preferabil, utilizând metoda în fază solidă.

Pentru prepararea peptidelor ciclice, sunt preparate peptide liniare protejate parțial, de lungimea dorită, cu grupări ester alchilice la carbonul terminal, care sunt convertite în azide, urmată de cuplare și protejare. In mod alternativ, peptidă liniară protejată parțial cu grupări terminale libere sunt ciclizate de difenilfosforilazidă în soluții foarte diluate.

Exemplul 1. Sinteza peptidei utilizând strategia Boc

Sinteza peptidei este realizată pornind de la 1OO mg de rășină Boc-Val-PAM,' i-:l pentru a se produce o peptidă cu grupare carboxil terminală ( PAM este achiziționată de la Apllied Biosystems substituția 0,56 meq/g este un derivat de aminostiren al acidului amino-acil-4-(oximetilj-fenilacetic). Aminoacizii Boc ( Boc = terț-butoxicarbonil] sunt condensați unul după altul pe un purtător polimeric care uitlizează diizopropilcarbodiimidă ( DIPC ) drept agent de condensare. In fiecare etapă, gruparea n o Boc este îndepărtată cu soluție 50 % de acid trifluoracetic ( TFA ) în diclormetan.

Gruparea amino este apoi deprotonizată cu diizopropiletilamină.

Conversia în fiecare treaptă trebuie să fie mai mare de 99,5 %. Dacă nu se atinge această valoare, condensarea se repetă. După sinteza completă, scindarea este realizată utilizând HF diluat ( 2 ore la 0° C ). Pentru eliminarea ionului de carboniu io este utilizat anisolul. HF este evaporat sub atmosferă de azot.

Peptidă brută este apoi obținută prin turnarea reziduului uleios în eter uscat.

Apoi, peptidă brută este purificată prin metoda HPLC cu fază inversă care utilizează o coloană 5 x 150 mm umplută cu silicagel PP-18, gradient de eluare cu un sistem de solvenți 0,1 % TFA în apă / acetonitril. Detecție : absorbție în ultraviolet la

i.-.n 225 nm.

Sinteza peptidei Secv. ID nr. 4 este prezentată în fig. 1.

RO 112506 Bl

Exemplul 2. Sinteza peptidei utilizând strategia Fmoc

Pentru sinteză sunt utilizați aminoacizi protejați Fmoc Standard ( Fmoc = 9fluorenilmetiloxicarbonil-j. Funcțiunile catenei laterale sunt protejate sun formă de oterț-butil esteri (Asp, Apm, Glu, Aad ) și cu derivați Boc ( Lys ]. Primul aminoacid ( Val 165 ) este legat pe un purtător polimeric, rășină BHA ( BHA = benzhidrilamino rășină ] utilizând diizopropilimida drept agent de cuplare. In fiecare etapă gruparea protectoare Fmoc este îndepărtată cu piperidină. După aceea, al doilea aminoacid și următorii aminoacizi sunt introduși utilizând aceeași cale până când sinteza este completă. Scindarea este făcută cu un amestec de TFA / TFMSA / anisol= 2:1 7:52 ( vol/vol). ivo

Peptidă este apoi purificată utilizând metoda HPLC descrisă în exemplul 1.

Sinteza peptidei cu Secv. ID nr. 2 este ilustrată în fig. 2.

Exemplul 3. Sinteza peptidei utilizând strategia Ddz

Toți aminoacizii care sunt utilizați în această sinteză sunt protejați la funcțiunea α-amino prin Ddz ( Ddz = a,a-dimetil-3,5-dimetoxibenziloxicarbonil-J. Funcțiunile catenei 175 laterale sunt protejate prin gruparea Z ( Z = benziloxicarbonil- ) pentru lizină și gruparea O-t-butilester pentru acidul aspartic și acidul glutamic. Un suport de tip Merrifield ( gel de polistiren clormetilat ramificat) cu capacitatea de 1,4 mmol/g este utilizat pentru legarea primului aminoacid - Ddz prin intermediul sării sale de Cesiu. După condensarea cu diciclohexilcarbodiimidă ( Dcc) este îndepărtată gruparea i?n protectoare în fiecare etapă cu TFA 5 % în diclormetan, urmată de spălarea și deprotonarea cu trietilamină 10 %în diclormetan. După deprotonare, este mediată următoarea etapă de cuplare, utilizând aceeași metodă. Etapa de cuplare este repetată până când secvența de peptidă este completată.

In final, peptidă este scindată de purtătorul polimeric utilizând un amestec 1-5 Hbr/TFA/anisol. După evaporarea volatilelor, peptidă abia scindată este precipitată din eter uscat și uscată. Peptidă brută este apoi purificată prin metoda HPLC, așa cum este descris în exemplul 1.

Sinteza peptidei cu Secv. ID nr. 6 este ilustrată în fig. 3.

Exemplul 4. Sinteza peptidei ciclice

Peptidă în forma parțial protejată

Obzl NO₂ Obzl

Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Arg-Pro-Ala-Asp-OH este preparată înainte conform cu metodele descrise în exemplele 1 și 2.

Soluția 0,0005 molară a acestei peptide în dimetilformamidă este ciclizâtă după adăugarea difenilfosforilazidei și trietilaminei la 20 °C, timp de 12 ore. 207

Apoi acest amestec este hidrogenat cu hidrogen pe catalizator de Paladiu pe cărbune la 25 °C, timp de 8 ore.

Solventul este evaporat cu grijă și produsul brut este purificat utilizând metoda HPLC descrisă în exemplul 1.

Peptidă ciclică cu Secv. ID nr. 10 2 ^r

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

5 10 este obținută cu η = 10 %.

Exemplul 5. Sinteza peptidelor liniare și ciclice utilizând strategia Boc

Aceeași strategie cu grupări protectoare Ddz este utilizată pentru obținerea peptidelor liniare și ciclice. Funcțiunile laterale sunt protejate cu gruparea Z ( lizina ) și cu grupările O-benzilester-OBzl-[ acid glutamic și acid aspartic ).

RO 112506 Bl

Purtătorul polimeric este rășina HYCRAM ^R ( denumire comercială a ORPEGEN, Heidelberg, DE ), care este 4-bromcrotonil-p-alanilamidometilpolistiren. Primul aminoacid ( Ddz-valina ] este legat de purtătorul polimeric prin intermediul sării sale de Cesiu.

Apoi gruparea Ddz este îndepărtată utilizând acid trifluoracetic 5 % în diclormetan și gruparea amino protonată cu diizopropiletilamină.

In etapa următoare, Ddz-glicina este cuplată la restul de Valină din matricea polimerului utilizând diizopropilcarbodiimidă (DIPC), în prezență de 1-hidroxibenztriazol.

Aceste etape sunt repetate până când lanțul peptidic este completat. Peptidă sintetizată în formă protejată este apoi scindată cu grijă de purtătorul HYCRAM ^R cu tetra/c/s-(trifenilfosfino)-paladiu (O), dizolvat în tetrahidrofuran anhidru în absența oxigenului. Un aditiv ca morfolina este utilizat ca moleculă acceptoare pentru gruparea alilică.

Purtătorul polimeric este filtrat și spălat cu tetrahidrofuran. Soluția de peptidă este apoi filtrată printr-o coloană scurtă de silicagel pentru a îndepărta catalizatorul de Paladiu.

Eluatul care conține peptidă cu Secv. ID nr.4a parțial protejată este uscat după evaporarea solventului în vid.

Sinteza peptidei cu Secv. ID nr. 4a parțial protejată este ilustrată în fig. 4.

Sinteza peptidei liniare cu Secv. ID nr. 4

Peptidă cu Secv. ID nr. 4a parțial protejată este dizolvată în 2,2,2-trifluoretanol și hidrogenată în prezență de Paladiu pe cărbune ( 10 % ] cu hidrogen gazos la 3D °C. Catalizatorul este filtrat și solventul este evaporat în vid. Reziduul brut este apoi purificat utilizând metoda HPLC descrisă în exemplul 1. După purificare este obținută peptidă cu Secv. ID nr. 4. Produsul este identic cu cel obținut în cadrul exemplului 1.

Sinteza peptidei ciclice cu Secv. ID nr. 9

Peptidă cu Secv. ID nr. 4a protejată parțial este dizolvată în dimetilformamidă/diclormetan (1: 1], pentru a se obține o soluție O,DD1 molară. Pentru ciclizare este adăugat DIPC și HCBt și lăsate să stea la 2D °C, timp de 1D ore. Apoi soluția este concentrată la un volum mic, diluată cu 2,2,2-trifluoretanol și purificată prin trecere pe o coloană umplută cu Sephadox L.H-20. Fracțiunile care conțin peptidă ciclică cu Secv. ID nr. 9a parțial protejată sunt colectate și hidrogenate folosind Paladiu pe cărbune ( 10 % ) drept catalizator, la 3D °C, prin barbotare de hidrogen și agitare intensivă, timp de 8 ore.

Apoi catalizatorul este îndepărtat prin filtrare și soluția uscată prin evaporarea solventului în vid. Peptidă brută este purificată în mod adițional prin HPLC utilizând metoda descrisă în exemplul 1.

Peptidă ciclică pură obținută este identificată ca peptidă cu Secv. ID nr. 9.

Sinteza pe purtător polimeric HYCRAM ^H utilizând strategia Ddz și ciclizarea este ilustrată în fig. 4 și 5. Toate peptidele sintetizate sunt controlate din punct de vedere al purității prin metoda HPLC utilizând coloană cu silicagel RP-18 (octadecilsilanizat ] eluat cu un amestec de solvenți constituit din apă/acetonitril/acid trifluoracetic în mod uzual. In toate cazurile puritatea este mai mare de 95 %.

Peptidele sunt caracterizate prin analize ale aminocizilor ( valorile sunt cu + 1D % față de cele teoretice ], analiza de frecvență, determinarea greutății moleculare prin spectrometrie de masă FAB, spectre IR sau UV.

Astfel, în fig. 6 este prezentat spectrul UV al peptidei Secv. ID nr. 4 și 6, iar în fig. 7 spectrul IR al acelorași peptide.

Investigarea farmacologică a peptidelor din prezenta invenție este efectuată pe diferite modele in vitro și in vivo și s-a descoperit că au mai multe proprietăți farmacologice.

A. Ulcerul gastric indus prin stress de reținere în experimente sunt utilizați șobolani ( masculi) Albino Wistar cu o greutate de 180 - 200 g. Animalele sunt imobilizate în poziția culcat pe spate, timp de 48 de ore, la temperatura camerei. Imediat după aceea sunt sacrificați și sunt măsurate leziunile.

270

RO 112506 Bl

320

Peptidele cu Secv. ID nr. 4, 6 și 2 sunt aplicate, în doză de 10 pg sau 10 ng/kg greutate corp, intraperitoneal ( i.p. ) sau intragastric ( i.g. ) cu o oră înainte de procedura dăunătoare.

Atât aplicarea i.g, cât și i.p., chiar la doze mici, precum 10 ng/kg corp, determină o protecție puternică.

B. Modelul cisteaminic de ulcer

In experimente sunt utilizați șobolani (femele ] Albino Wistar cu o greutate de 180 - 200 g. Sunt aplicate subcutanat doze de 400 mg/kg corp de clorhidrat de cisteamină ( dizolvată în apă). După 24 de ore animalele sunt sacrificate. Peptidele cu Secv. ID nr. 4 sunt aplicate în doze de 1,0 pg, 100 ng și 50 ng/kg corp, intraperitoneal și intragastric. Este obținută o protecție puternică și dependentă de doză. Aceeași activitate a fost găsită atât pentru calea de administrare intraperitoneală, cât și intragastrică.

C. Edemele bucale induse de turpentină

In experimente sunt utilizați șobolani ( masculi) Albino Wistar cu o greutate de 180 - 200 g, în număr de 10 în fiecare grup. Turpentină este administrată în mucoasă, câte 0,02 ml/șobolan. Control: 0,9 % salin intramucos ( 0,02 ml/șobolan, de 2 ori). Peptidele cu Secv. ID nr. 2 și 4 sunt aplicate în doze de 10 pg și 10 ng/kg corp, intraperitoneal și intragastric, cu o oră înainte de administrarea de turpentină. Edemele bucale sunt măsurate după 24 de ore de la inducerea edemei. Analize statistice: test Mann-Whitney. Peptidele investigate sunt eficiente în doze de 10 pg /kg în greutate.

D. Chirurgie: efectul asupra inciziilor pe piele

In experimente sunt utilizați șobolani ( masculi) Albino Wistar cu o greutate de 200 - 250 g, în număr de 10 în fiecare grup.Șobolanii cu pielea rănită sunt menținuți individual în cuști separate. Pe fiecare animal, anesteziat ușor cu eter, sunt efectuate pe pielea de pe spate incizii de 3 cm, care sunt plasate paralel la o distanță de 1,5 cm de șira spinării. O rană este apoi prinsă cu două clipsuri chirurgicale și una este lăsată netratată. Peptidă cu Secv. ID nr.4, dizolvată în sare, în doză de 1,0 pg și 1,0 ng/kg corp sau în 0,5 ml/kg corp de sare de control, este aplicată intradermic între răni imediat după rănire.

Se observă un efect de vindecare evident datorat peptidelor atât asupra rănilor cu clipsuri chirurgicale, cât și asupra acelora ținute fără tratament chirurgical.

După 5 zile, grupurile tratate au avut un număr mai mic de celule inflamatorii și în mod semnificativ o mai bună dezvoltare a fibrelor de reticulină decât cele de control.

E. Efectul asupra arsurilor experimentale

In experimente sunt utilizați șobolani ( masculi ) Albino Wistar cu o greutate de 200 - 250 g, în număr de 10 în fiecare grup. Sub anestezie ușoară, mucoasa nazală este expusă la o cauterizare ( incandescentă ) fierbinte timp de 5 secunde. Peptidă cu Secv. ID nr. 4 este introdusă intraperitoneal în doze de 10 pg/kg corp. Procedura utilizată în mod uzual a condus la umflarea proeminentă a botului și a fost fatală pentru animalele de control ( dar nu și pentru animalele tratate ) în 9 zile după rănire. In contrast cu animalele de control, a fost observată numai o foarte modestă umflătură post-traumatică. In mod suplimentar, respirația normală nazală este doar ușor afectată și supraviețuirea nu este tulburată.

F. Efectul asupra vindecării fracturilor

In experimente sunt utilizați șobolani ( masculi ) Albino Wistar cu o greutate de 270 - 300 g. Tibia stângă este fracturată manual în partea de mijloc a osului sub anestezie cu eter. Nu a fost utilizată nici o imobilizare și animalelor li s-a permis să se miște libere în cuști. Animalele sunt sacrificate în a 5-a zi, a 8-a, a 12-a și a 30-a zi după provocarea rănirii. Peptidă cu Secv. ID nr.4 este aplicată intraperitoneal, în doze de 10,0 pg/kg corp, cu o oră înaintea rănirii și suplimentar o dată pe zi ( ultima aplicare efectuându-se cu 24 de ore înaintea sacrificării). Grupa de control a primit

275

280

285

290

295

300

305

310

315

325

RO 112506 Bl simultan un echivolum de sare ( 0,9 %, 5,0 ml/kg corp, intraperitoneal ). A fost observată o îmbunătățire semnificativă a vitezei de vindecare la toate animalele tratate cu peptidă, la fiecare din intervalele de timp investigate. Toate animalele tratate au prezentat hematoame post-traumatice mult mai scăzute decât animalele de control și ele și-au refăcut funcțiunile lezate chiar mai repede.

G. Activitatea antivirală

Activitatea antivirală este investigată pe șoareci nou-născuți de 24 de ore, rasa BALB-C, de ambele sexe.

Sunt aplicați ARBO-viruși: TBE ( = Tick Borne Encephalitis ), Bhanis, Dengue 1, 2, 3, 4, Sinbis, West - Nile, Calovo, Hepatitis A, LCM ( Simphatic choriomeningitis ) și Herpes tip I ca suspensie de viruși la o diluție de 1CT² ( 0,02 ml/șoarece ) acceptate în general și injectate intracutanat (i.c. ] sau perorai ( p.o. ) ( Hepatitis A ]. In funcție de diferența de virulență, dozele se ajustează astfel pentru a fi comparabile cu LD₁₀₀în 0,02 ml i.c. ( p.o.; Hepatitis A ), vaccin la diluție de 10‘². In acest mod, se poate compara desfășurarea infecțiilor cu diferiți viruși, indiferent de inocularea posibilă a concentrațiilor diferite de virus.

Peptida cu Secv. ID nr. 4 este utilizată la o concentrație de 20,0 pg/ml în soluție de sare 0,9 % și aplicată numai o doză de 2,0 pg/kg corp intracutanat ( i.c. ) sau intraperitoneal ( i.p.):

a] cu 2 ore înainte de aplicarea virusului (-2^h)

b] simultan cu infecția (O).

Control: același volum de sare i.c. sau i.p. Rezultatele sunt însumate în tabelul

2. Numerele din tabel indică perioada ( zile) în care toate grupurile de șoareci infectați cu virus, tratați cu peptidă sau sare ( control ) au sucombat.

Tabelul 2

Infecții cu viruși	Tratament
Sare	Fragment sintetic 4
-2h^x	O^x	-2h^x	O^x
i.p.	i.c.	i.p.	i.c.	i.p.	i.c.	i.p.	i.c.
TBE	a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Bhania	a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Dengue 1	a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Dengue 2	a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Dengue 3	a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Dengue 4	a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Sinbis	a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
West Nile	a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Calovo	a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Hepatitis	A⁺	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
LCM		5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Herpes tip 1		5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Niciunul (sănătos)		n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.

RO 112506 Bl

n.d. - nedeterminat: animalele sunt observate timp de 40 de zile după aplicarea virusului. Nu a fost observată moartea.

A - ARBO-viruși + - aplicarea perorală a virușilor # - animalele sunt tratate cu 2 ore înainte de aplicarea virușilor ( -2h ) sau simultan cu administrarea virușilor (O).

vs. sare p < 0,001; 8 șoareci în fiecare grup.

H. Activitatea antidepresivă

Pentru dezvăluirea activității antidepresive este utilizat testul de înot forțat conform cu Porsolt și colaboratorii, Eur. J. Pharmacol., 47, 379-391, 1978).

Pentru acest test sunt utilizați șobolani masculi Wistar cu o greutate corporală de 180-240 g. Peptidă investigată cu Secv. ID nr. 4 este administrată în prima zi după pretestare și a doua zi cu o oră înaintea experimentului ( i.p. ).

Grup de control: sare, intraperitoneal (i.p. ). Animalele sunt observate timp de 5 minute. Este măsurat timpul de imobilitate (TJ. T; în grupa de control este de aproximativ 150 de secunde, iar în grupul tratat cu peptidă este de numai 60-70 de secunde. Acest efect este de lungă durată: după 16 zile este încă prezent. Doza de răspuns este de:

pg la 10 ng/kg: efect complet pg/kg: efect încă prezent pg/kg: efect în dispariție.

/. Efectul pe modelul bolii Parkinson

Pentru investigații sunt utilizate bine cunoscutele modele pentru boala Parkinson ( Karakola S. Și colaboratorii, Pharmacol. Toxicol, 67, 95-100, 1990 ): model resepină și model MPTP.

Sunt utilizați șoareci masculi NMRI-HANNOVER ( pentru modelul MPTP ) sau șoareci de ambele sexe ( pentru modelul resepină ).

A] MPTP este aplicat în doze de 30 mg/kg corp intraperitoneal, o dată pe zi, timp de 6 zile consecutive și apoi pentru următoarele 4 zile într-o doză mai mare de 50 mg/kg corp. Peptidă investigată având Secv. ID nr. 4 este aplicată într-o doză de 1,5 pg și 15,0 ng/kg corp intraperitoneal, 15 minute înaintea fiecărei administrări de MPTP sau 15 minute după fiecare administrare de MPTP.

B] Resepină este aplicată într-o doză de 50 mg/kg corp intraperitoneal. Peptidă testată este aplicată într-o doză de 10 pg la 10 ng/kg corp, intraperitoneal, timp de 15 minute înaintea administrării resepinei sau 24 de ore după administrarea resepinei aceeași doză.

Control: un volum egal de sare, 5 ml/kg corp, intraperitoneal.

După tratamentul cu peptidă este observată o reducere semnificativă a hipochineziei, rigidității ( catalepsiei) și tremurului.

In pretratamentul după modelul MPTP cu această peptidă este abolită dezvoltarea catalepsiei, este diminuată achinezia și apariția tremurătorii.

Posttratamentul ( după 15 minute ) previne dezvoltarea suplimentară a catalepsiei MPTP și a diminuat în mod marcant achinezia și tremurul. In mod uzual, o mortalitate înaltă ( de 50 % ) înregistrată după numai o aplicare de MPTP este scăzută la animalele pretratate cu peptidă, precum și la animalele post-tratate.

J. Efectul administrării peptidei în stare de șoc hemoragie

In toate aceste experimente sunt utilizate femele adulte de șobolani Albino Wistar cu o greutate de 150-180 g.

370

375

380

385

390

395

400

405

410

415

420

RO 112506 Bl

Efectul șocului hemoragie este investigat în două serii de experimente.

A) Animalelor li s-a luat sânge (1 ml în mai mult de 3 minute și în 2 minute restul ) până la moarte. Volumul de sânge îndepărtat care produce efectul fatal este fixat la animalele pretratate cu peptidă având Secv. ID nr. 4 (10,0 pg la 10 ng/kg corp intraperitoneal) sau la animalele tratate cu sare (5,0 ml/kg corp, intraperitoneal).

Animalele sunt pretratate cu 15 minute înainte de sângerare. Este observată o pierdere semnificativ mai mare de volum de sânge fatal la grupul tratat cu o doză mai mare de peptide.

B) Presiunea sângelui este scăzută prin îndepărtarea volumului de sânge controlat și apoi este menținută la o valoare de 30-35 mm Hg, timp de 5 minute.

Apoi peptidă cu Secv. ID nr. 4 ( 10,0 pg la 10 ng/kg corp ) sau sarea ( control, 3,0 ml/kg corp ) sunt aplicate intravenos (i.v. ).

Contrastând cu animalele de control, la animalele tratate cu peptidă au fost înregistrate valori crescute și susținute în mod semnificativ ale presiunii sângelui și abolirea completă a morții.

Deci, se pare că peptidă investigată este foarte eficientă în ameliorarea consecințelor scăderii volumului de sânge.

K. Influența asupra radiațiilor letale

In experimente sunt utilizați șoareci NMRI-HANNOVER, de 5-6 săptămâni, de ambele sexe , cu o greutate de 18-20 g. Peptidă sintetică cu Secv. ID nr. 4 este aplicată într-o doză de 20 pg/kg corp, intraperitoneal, la o oră înainte și după iradiere. Animalele de control primesc în mod simultan un echivolum de sare 0,9 % intraperitoneal ( 5,0 ml/kg ). Animalele sănătoase ținute în condiții uzuale, nesupuse tratamentului cu medicamente sau la iradiere, servesc drept animale de control al sănătății.

Iradiere: Teatron 80 ( Co 60, 2200 Ci ). Șoarecii neasteneziați, aflați în cuști, în grupe de câte 16, sunt expuși la iradierea întregului corp, cu o doză supraletală de 9 Gy pe o suprafață de iradiere de 20 x 20 cm, la o distanță de 80 cm.

Morțile sunt înregistrate de două ori pe zi, timp de 30 de zile.

Toate animalele de control au murit în 7-12 zile ( LD_1OO/12 ).

Animalele de control sănătoase (neiradiate) nu au murit.

Referitor la datele de control, nu au fost observate diferențe în grupurile tratate cu peptide la o oră după iradiere. Totuși, o supraviețuire semnificativă este observată când compusul este aplicat cu o oră înaintea iradierii.

□ creștere cu 70 % la LD₁₀₀ referitor la control se poate nota.

L. Influența asupra malformației induse

In toate experimentele sunt utilizați șoareci femele NMRI HANNOVER, de 2 luni, cu o greutate de 25 g, dar neexpuse anterior la cuplare. Șoarecii femelă în perioada estrus sunt împerecheate peste noapte cu șoareci masculi sănătoși apți pentru experiență. Șoarecii sunt sacrificați după 20 de zile de sarcină.

Vitamina A este aplicată în doză de 15700 U/kg corp, intramuscular (

i.m. ), în a 10-a zi de sarcină ( 0,05 ml/kg corp). Peptidă cu Secv. ID nr. 4 este aplicată într-un dozaj de 10,0 pg la 10 ng/kg corp, intraperitoneal ( i.p. ). Control: sare 5,0 ml/kg corp, intraperitoneal.

Animalele netratate cu vitamina A care au primit în același timp, intraperitoneal, sare sau peptidă cu Secv. ID nr. 4, în același dozaj, servesc drept control al sănătății.

RO 112506 Bl

Nici o malformație nu este observată în grupul sănătos tratat cu sare sau în grupul tratat cu peptidă.

Rezultatele expuse în tabelul 3 arată în mod surprinzător efectul semnificativ protector și dependent de doză al peptidei investigate, împotriva 475 malformațiilor induse de vitamina A.

Tabelul 3

Examinare macroscopică

Tratament	Număr total de fetuși	Număr de fetuși cu malformații
Grupa de control (cu sare)	55	0
Vitamina A	54	36
Vitamina A + peptidă cu Secv. ID nr.4 10 ng/kg	36	13
Vitamina A + peptidă cu Secv. ID nr. 4 10pg/kg	18	1

M. Toxicitate acută 490

Toxicitatea acută a peptidelor sintetice este determinată pe șoareci femele, cu o greutate de circa 20 g. Sunt utilizate grupe de animale de câte 6 pentru fiecare experiment și ca animale de control.

Peptidele cu Secv. ID nr. 2, 3, 4 și 6 se aplică într-o doză de 8, 25 și 50 mg/kg corp, intravenos ( i.v. ). Grupul de control este tratat cu sare ( 0,9 495 %, 5,0 ml/kg corp ). Animalele sunt ținute sub observație pentru semne de toxicitate timp de 15 zile.

La dozajul aplicat nu sunt observate semne de toxicitate sau de moarte. Este observat un fenomen interesant de creștere semnificativă a motilității și vioiciunii după 2 ore de la aplicarea peptidelor. 500

Urmărind rezultatele testelor de investigare farmacologică, aceste peptide prezintă activitate în sensul protejării organismului împotriva stresului și îmbolnăvirilor, în general pentru normalizarea funcțiunilor organice.

Utilizarea acestor peptide este, de asemenea, eficientă pentru prevenirea și terapia diferitelor boli și tulburări la om și la animale. Mai exact, 505 acești compuși sunt utilizați pentru tratamentul:

- tulburărilor și bolilor induse de stress,

- ulcerelor gastrointestinale de diferite etiologii;

- inflamațiilor și edemelor de diferite etiologii;

- traumelor, arsurilor, fracturilor de oase și, în general, în chirurgie; 510

- infecțiilor virale;

- șocului;

- bolii lui Parkinson;

- pentru protecția împotriva radiațiilor;

- pentru protecția împotriva malformațiilor. 515

In general, peptidele descrise pot fi utilizate într-o mare varietate de compoziții farmaceutice în combinații cu purtători farmaceutici netoxici sau vehiculi, precum o umplutură, un tampon netoxic sau o soluție de ( sare ) ser

RO 112506 Bl fiziologic. Astfel de compoziții farmaceutice pot fi utilizate topic sau sistemic și pot fi în orice formă adecvată, precum un lichid, solid, semisolid, soluție injectabilă, tabletă, unguent, loțiune, capsule, lingualete sau altele similare.

Aceste peptide pot fi în general administrate într-o doză de la 1Q⁵ la 1CT²mg/kg corp, când sunt aplicate sistemic. Când se aplică topic, ele pot fi utilizate în concentrație mai mare, de exemplu de la 0,1 % la 0,5 %.

Este observată absența oricărui semn de toxicitate până la doze de 50 mg/kg corp și, de asemenea, o bună activitate a compușilor administrați perorai (intragastric).

Claims

Revendicări

1. Peptide cu activitate organo-protectoare, caracterizate prin aceea că ele cuprind 8 până la 15 resturi de aminoacid și care sunt reprezentate prin formula generală:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 15 10 15 în care:

Xaa reprezintă un rest de aminoacid alifatic neutru, precum Ala, bAla, Leu, lle, Gly, Val, Nle, Nva;

Yaa reprezintă un rest de aminoacid bazic, precum Lys, Arg, Orn, His;

Zaa reprezintă un rest de aminoacid acid, precum Glu, Asp, Aad sau Apm;

unde cel puțin unul și cel mult șapte resturi de aminoacid din regiunea 1 până la 15 pot fi omise.
2. Peptide cu activitate organo-protectoare, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că ele cuprind 8 până la 15 resturi de aminoacid și care sunt reprezentate prin formula generală:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 15 10 15 în care:

Xaa reprezintă un rest de aminoacid alifatic neutru, precum Ala, bAla, Leu, lle, Gly, Val, Nle, Nva;

Yaa reprezintă un rest de aminoacid bazic, precum Lys, Arg, Orn, His;

Zaa reprezintă un rest de aminoacid acid, precum Glu, Asp, Aad sau Apm;

unde cel puțin unul din resturile Xaa sau Zaa poate fi omis.
3. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că molecula este ciclizată prin legătura amidică între primul și ultimul rest de aminoacid.
4. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt reprezentate de formula:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 10 15

RO 112506 Bl
5. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt reprezentate de formula:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val 15 1015
6. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt reprezentate de formula:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015
7. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt reprezentate de formula:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val

1 5 1014
8. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt reprezentate de formula:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val

15 1014
9. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt reprezentate de formula:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala

1 58
10. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt reprezentate de formula:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val

2 5 __________________________10 13
11. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt reprezentate de formula:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

2 59
12. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt reprezentate de formula:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asn

1 59
13. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt reprezentate de formula:

Asp Pro Pro Pro lle Arg Pro Ala Asp

1 59

RO 112506 Bl
14. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt reprezentate de formula:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp

1 5 9
15. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că se 625 utilizează în compoziții terapeutice împreună cu un purtător solid sau lichid, acceptabil farmaceutic.
16. Peptide conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că se utilizează pentru tratarea bolilor și tulburărilor induse de stress, inflamații,

6.?c edeme, traume, arsuri, infecții virale, boli ale sistemului imunitar, boli ale sistemului nervos central, ulcere gastrointestinale de diverse etiologii, fracturi ale oaselor, în general în chirurgie și în starea de șoc, boli cerebrale și depresii, boala lui Parkinson, pentru protecția împotriva radiațiilor și a malformațiilor induse de agenți chimici și, în general, drept produși care -5 protejează organismul.