SK278507B6

SK278507B6 - Biologically high active peptides, therapeutical preparation containing them and their use in therapy

Info

Publication number: SK278507B6
Application number: SK96-94A
Authority: SK
Inventors: Predrag Sikiric; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stjepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic
Original assignee: Predrag Sikiric; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stjepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic
Priority date: 1992-05-30
Filing date: 1993-05-28
Publication date: 1997-08-06
Also published as: FI940375A; RO112506B1; ATE155485T1; DK0601154T3; EP0572688A1; NO940299L; UA32523C2; HK1001004A1; CZ20594A3; EP0601154B1; DE69219590T2; ES2103854T3; DK0572688T3; DE69312232T2; FI120454B; ES2107033T3; CZ284972B6; KR0180256B1; NO310027B1; CA2114313A1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka peptidov, vyznačujúcich sa vysokou biologickou aktivitou rovnakého typu ,ako má známa prírodná zlúčenina BPC, ale s kratším aminokyselinovým reťazcom.

Doterajší stav techniky

Biologicky aktívny proteín s ochrannou aktivitou na organizmus, ktorý bol izolovaný z tela človeka alebo zvieraťa a pomenovaný BPC (Body Protecting Compound), bol opísaný v EP 0 432 400 a tiež publikovaný: P. Sikiric et al, Exp. Clin. Gastroenterol., 1, 15 -26, 1991. Tento proteín má vysokú molekulovú hmotnosť, asi 40 000 ± 5 000 Daltonov, a len čiastočne určenú štruktúru. Táto zlúčenina má veľmi široké spektrum biologickej aktivity, ako napríklad protivredová ochrana, ochrana pečene, antivírusová, antiedemická, všeobecne protizápalová a protinádorová aktivita a podobne. Možno ju použiť pri liečbe uvedených chorôb, ďalej v terapii chorôb a porúch nervového systému, porúch dopaminergického pôvodu, v chirurgii, stomatológii, pri liečení neplodnosti a vo veterinárnej medicíne. Ale toto široké spektrum aktivít môže byť pravdepodobne aj dôsledkom neurčenej štruktúry, alebo dokonca nedostatočnej čistoty, alebo homogenity izolovanej zlúčeniny BPC.

Podstata vynálezu

Vynálezom sú syntetické peptidy iba s 8 až 15 zvyškami aminokyselín s molekulovou hmotnosťou od 900 do 1 600 Daltonov, ktoré sa vyznačujú podobnou biologickou aktivitou ako prírodná zlúčenina BPC s ochranným účinkom na organizmus, ale so zvýšenou selektivitou. Naše nové peptidy sú pripravované ekonomicky výhodnejšie sú menej náchylné na účinky vedľajších reakcií, pretože obsahujú menej aminokyselinových zvyškov ako BPC.

V súlade s jedným aspektom predloženého vynálezu bola pripravená trieda syntetických peptidov, ktorá vykazuje prekvapujúco vysokú biologickú aktivitu najmä v smere ochrany organizmu. Tieto syntetické zlúčeniny s dobre definovanou štruktúrou majú v každom prípade veľkú výhodu v porovnaní s vysokomolekulovým, len čiastočne definovaným proteínom BPC, ktorý je možné získať komplikovaným postupom z málo definovaných prírodných zdrojov.

Tento vynález sa zvlášť týka novej skupiny biologicky vysoko aktívnych peptidov, obsahujúcich od 8 do 15 aminokyselinových zvyškov, znázornených nasledujúcim základným štruktúrnym vzorcom, v ktorom každá aminokyselina je vyznačená trojpísmenovým kódom a čísla pod každým aminokyselinovým zvyškom určujú polohu zvyšku v peptidickom reťazci:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15, kde jeden, alebo viac aminokyselinových zvyškov je substituovaných. Substituenty Xaa, Yaa a Zaa, ktoré možno použiť, sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 1.

Tab. 1
	Zvyáok	Substituent
	xaa	neutrálne alifatické aeinokyseliny: Ala, bAla, Leu, íle, Gly, Val, Nie, Nva
	Yaa	bárické aminokyseliny: Lys, Arg, orn, His
	Zaa	kyslé aminokyseliny: Glu, Asp, Aad, Apm

Ako výhodné peptidy možno uviesť nasledujúce:

Peptidický reťazec č. 1

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015

Peptidický reťazec č. 2

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val 1 5 1015

Peptidický reťazec č. 3

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015

V súlade s ďalším hľadiskom predloženého vynálezu boli pripravené analogické peptidy, ukončené amidickou alebo karboxylovou skupinou na koncovom uhlíku, s rovnakým opísaným štruktúrnym vzorcom, v ktorom najmenej jeden a najviac sedem aminokyselinových zvyškov je vynechaných v polohe 1-15 a najmenej jeden z ostávajúcich aminokyselinových zvyškov môže byť substituovaný v zhode so schémou substitúcie, opísanej v tab. 1.

Preferované peptidy sú nasledujúce:

Peptidický reťazec č. 4

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val 15 1014

Peptidický reťazec č. 5

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val 15 1014

Peptidický reťazec č. 6

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala 1 58

Peptidický reťazec č. 7

Asp Pro Pro Pro íle Arg Pro Ala Asp 1 59

Peptidický reťazec č. 8

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp 1 59

V súlade s ďalším opisom ide o peptidy s uvedenými štruktúrnymi vzorcami, v ktorých môže byť vynechaný aspoň jeden aminokyselinový zvyšok a aspoň jeden z ostávajúcich aminokyselinových zvyškov môže byť substituovaný podľa tab. 1, a ktoré sú transformované na cyklickú formu vytvorením novej CO-NH väzby medzi prvým a posledným aminokyselinovým zvyškom v molekule.

Výhodné peptidy sú nasledujúce:

Peptidický reťazec č. 9

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val

10 13

Peptidický reťazec č. 10

Gly Glu Fro Fro Fro Gly Arg Pro Ala Asp | 2_______________________5______________________________» |

Pri aplikáciách sa zistilo, že pri použití týchto typov peptidov sa dosiahla rovnaká alebo vyššia biologická aktivita ako pri pôvodnom proteíne BPC.

Farmakologický výskum opísaných peptidov sa vykonal na rôznych bežných modeloch „in vitro“ a „in víno“ a boli zistené nasledujúce farmakologické vlastnosti:

1. Žalúdočný vred vyvolaný imobilizačným stresom

Na experimenty sa použili krysy Albino Wistar (samce, 180-200 g). Všetky zvieratá boli znehybnené v polohe ležmo na znak 48 hod. pri izbovej teplote. Hneď potom boli usmrtené a meralo sa poškodenie. Peptidy s peptidickým reťazcom č. 4,6 a 2 boli aplikované v dávkach 10 pg alebo 10 ng/kg telesnej hmotnosti, i. p. alebo

1. g. 1 hodinu pred škodiacou procedúrou.

V obidvoch aplikáciách i. g. aj i. p. dokonca aj také nízke dávky ako 10 ng/kg mali silný ochranný účinok.

2. Cysteamínový model vredu

Na experimenty boli použité krysy Albino Wistar (samičky, 180-200 g). Aplikoval sa cysteamin hydrochlorid (rozpustený v destilovanej vode) v dávkach 400 mg/kg telesnej hmotnosti s. c. Po 24 hodinách boli zvieratá usmrtené. Peptid s peptidickým reťazcom č. 4 sa aplikoval v dávkach 1,0 pg, 100 ng a 50 ng/kg telesnej hmotnosti, i. p. a i. g. Pozoroval sa silný ochranný účinok, závislý od veľkosti dávky. Rovnaká aktivita bola zistená aj pri i. p., aj pri intragastrikálnom podaní.

3. Lícne opuchy vyvolané terpentínom

Zvieratá: krysy Wistar (samce, 180-240 g), N=10 v každej skupine. Terpentín bol podávaný intramukozálne 0,02 ml/krysa. Kontrola: 0,9 % vodný roztok soli intramukozálne (0,02 ml/krysa, 2x). Peptidy s peptidickým reťazcom č. 2 a 4 sa aplikovali v množstvách 10 pg a 10 ng/kg i. p. a i. g. 1 hodinu pred terpentínom. Liene opuchy sa merali 24 hodín po vyvolaní opuchu. Štatistická analýza: test Mann-Whitney. Skúmané peptidy boli efektívne v dávke 10 pg/kg telesnej hmotnosti.

4. Chirurgia: vplyv na kožné rezné rany

Na experimenty sa použili krysy Albino (samce, 10 na každý pokus, 200-250 g telesnej hmotnosti). Krysy s kožnými ranami boli umiestnené individuálne v oddelených klietkach. Na každom zvierati pod ľahkou éterovou narkózou boli v koži na chrbte urobené trojcentimetrové rezy, paralelne umiestnené 1,5 cm na každú stranu od stredovej línie. Jedna rana bola potom stiahnutá dvomi chirurgickými svorkami, ďalšia zostala neošetrená. Peptid s peptidickým reťazcom č. 4, rozpustený vo vodnom roztoku soli, v dávkach 1 pg a 1,0 ng/kg telesnej hmotnosti, alebo 0,5 ml vodného roztoku soli na kg telesnej hmotnosti v kontrolnej skupine, boli aplikované podkožné medzi ranami hneď po zákroku.

Na oboch ranách, a to na rane ošetrenej chirurgickými svorkami, ako aj na rane chirurgicky neošetrenej, bol zrejmý významný liečivý účinok. Po 5 dňoch takto ošetrená skupina vykazovala menší počet zápalových buniek a významne lepšie vyvinuté retikuláme vlákna ako kontrolná skupina.

5. Vplyv na experimentálne popáleniny

V experimente sa použili samce bielych krýs kmeň Wistar (N=10, telesná hmotnosť 200-250 g). Pod ľahkou éterovou narkózou sa na nosnú sliznicu pôsobilo 5 sekúnd rozpáleným kauterom. Peptid s peptidickým reťazcom č. 4 sa aplikoval v dávkach 10 pg na kg telesnej hmotnosti i. p. 1 hodinu pred zranením. Kontrola: 5,0 ml vodného roztoku soli/kg telesnej hmotnosti i. p. Použitý postup obvykle vyvolá nápadné opuchy nosa, čo je spravidla smrteľné pre kontrolnú skupinu (ale nie pre ošetrené zvieratá!) v priebehu 9 dní po zranení. Na rozdiel od kontrolnej skupiny boli pozorované len veľmi mierne poúrazové opuchy nosa. Normálne nosové dýchanie po zranení bolo len mierne sťažené, k úhynu nedošlo.

6. Vplyv na liečenie zlomenín

V pokusoch boli použité samce bielych krýs kmeň Wistar (270-300 g telesnej hmotnosti). Pod éterovou narkózou bola ich ľavá holenná kosť manuálne zlomená v strednej časti kosti. Znehybnenie nebolo urobené a zvieratá sa mohli pohybovať voľne v klietke. Zvieratá boli usmrtené v 5., 8., 12. a 30. dni po zranení. Peptid s peptidickým reťazcom č. 4 sa aplikoval v dávke 10 pg na kg telesnej hmotnosti i. p. 1 hodinu pred zranením a potom raz denne (posledná dávka 24 hodín pred usmrtením). Kontrolná skupina dostávala súčasne rovnaké objemy vodného roztoku soli (0,9 %, 5,0 ml/kg i. p.). U všetkých zvierat, ošetrovaných peptidom, v každom zo sledovaných intervalov bolo pozorované významné zlepšenie rýchlosti liečby. Je pozoruhodné, že u všetkých ošetrených zvierat sa pozoroval menší lokálny poúrazový hematom ako u kontrolných zvierat a funkčnosť zranenej končatiny sa obnovila omnoho rýchlejšie.

7. Antivírusová aktivita

Antivirusová aktivita sa testovala na čerstvo vyliahnutých myšiach kmeň BALB-C, vek 24 hodín, obe pohlavia.

Arbovírusy: TBE (kliešťová eneefalitída), Bhania, Dengue 1, 2, 3, 4, Sinbis, Západný Níl, Calovo, hepatitída A, LCM (lymfatická choriomeningitída) a herpes typ I boli aplikované vo forme vírusovej suspenzie v zriedení 10'² (0,02 ml na myš), pripravené bežným postupom a dávkované i. c. (alebo p. o. pri hepatitíde A). V snahe zohľadniť rozdiely vo virulencii boli dávky adjustované tak, aby boli porovnateľné s ohľadom na LDioo v 0,02 ml i. c. (alebo p. o. pri hepatitíde A) inokula v zriedení 10'² Takýmto postupom sme boli schopní porovnávať priebeh infekcií, spôsobených rôznymi vírusmi bez ohľadu na možné rozdiely v koncentrácii vírusov v inokule.

Peptid s peptidickým reťazcom č. 4 sa použil v koncentrácii 20 gg/ml v 0,9 % vodnom roztoku soli a aplikoval sa len raz v dávke 2,0 pg/kg telesnej hmotnosti i. c. alebo i. p.:

a) 2 hodiny pred aplikáciou vírusu (-2 h)

b) súčasne s infekciou (0).

Kontrola: rovnaké objemy vodného roztoku soli i. c. alebo i. p. Výsledky sú sumarizované v tab. 2. Čísla v tabuľke udávajú čas (dni), za ktorý zahynuli všetky vírusmi infikované myši v skupine ošetrenej peptidom alebo vodným roztokom soli (kontrolná skupina).

Tab. 2

OŠETRENIE

Vírusové Vodný roztok soli Peptidický retazec č. 4

infekcie	- 2h^{* * * * x}	0*	- 2h^xi.p. i.c.	i.P.	C* i.C.
i.p	. i.c.	i.p.	i.c.
TBE	a	s	5	5	5	n.d. n.d.	20	20
Bbiania	a	5	5	S	5	n.d. n.d.	20	20
Dengue 1	a	5	5	5	5	n.d. n.d.	20	20
Dengue 2	a	5	5	5	5	n.d. n.d.	20	20
Dengue 3	a	5	5	5	5	n.d. n.d.	20	20
Dengue 4	a	5	5	5	5	n.d. n.d.	20	20
SlnbiB	a	5	5	5	5	n.d. n.d.	20	20
Záp. Níl	a	5	5	S	5	n.d. n.d.	20	20
Calovo	a	5	5	5	5	n.d. n.d.	15	15
Hepatitls	A⁺	5	5	5	5	n.d. n.d.	20	20
LCM		5	5	5	5	n.d. n.d.	20	20
Herpes typel	5	5	5	5	n.d. n.d.	20	20
žiadna (zdravé)		n.d.	, n.d.	n.d.	n.d.	n.d. n.d.	n.d.	n.d.

n. d. neurčené: zvieratá boli pozorované počas 40 dní po aplikácii vírusov a nedošlo k žiadnemu úhynu a arbovírusy + aplikácia vírusov perorálne x zvieratá boli ošetrené 2 hodiny pred aplikáciou vírusov (-2h), alebo súčasne s aplikáciou vírusov (0) oproti vodnému roztoku soli P < 0,001; 8 myší v každej skupine

8. Antidepresívna aktivita

Na zhodnotenie antidepresívnej aktivity sa použil vynútený plávací (swimming) test podľa Porsolta et al, Eur. J. Pharmacol., 47, 379-391, 1978.

Na tento experiment sa použili samce krýs Wistar (180-240 g telesná hmotnosť). Testovaný peptid s peptidickým reťazcom č. 4 bol podávaný prvý deň po predbežnom zoradení na testovanie a v druhý deň 1 hodinu pred experimentom (i. p.). Kontrolná skupina: vodný roztok soli i. p.

Zvieratá sa pozorovali 5 minút. Meral sa čas znehybnenia (Tj).

Tj v kontrolnej skupine bol okolo 150 sekúnd, v skupine ošetrenej peptidom len 60-70 sekúnd. Tento efekt trval dlho: prejavoval sa ešte po 16 dňoch.

Účinok dávky: 10 pg až 10 ng/kg: plný efekt pg/kg: efekt sa ešte prejavuje pg/kg: efekt sa stráca.

9. Efekt na model Parkinsonovej choroby

Na skúmanie sa použil dobre známy model pre Parkinsonovu chorobu (Karakola S. et al, Pharmacol. Toxicol., 67, 95-100, 1990): rezerpínový model a MPTP model.

Použili sa samce myší NMRI-IIannover (pre MPTP model), alebo obe pohlavia (pre rezerpínový model).

a) MPTP sa aplikoval v dávkach mg/kg telesnej hmotnosti i. p. raz denne 6 dní za sebou a potom 4 ďalšie dni vo vyšších dávkach 50 mg/kg telesnej hmotnosti. Skúmaný peptid s peptidickým reťazcom č. 4 sa aplikoval v dávkach 1,5 pg a 15 ng/kg telesnej hmotnosti, i. p. 15 minút pred každou aplikáciou MPTP, alebo 15 minút po každom podaní MPTP.

b) Rezerpín sa aplikoval v dávke 5 mg/kg telesnej hmotnosti i. p. Testovaný peptid sa aplikoval v dávke 10 pg alebo 10 ng/kg telesnej hmotnosti i. p. 15 minút pred podaním rezerpínu, alebo v rovnakej dávke 24 hodín po podaní rezerpínu.

Kontroly: rovnaký objem vodného roztoku soli, 5 ml/kg telesnej hmotnosti i. p.

Po ošetrení s peptidom sa pozorovalo významné zníženie hypokinézy, strnulosti (katalepsie) a triašky.

Pri predbežnom ošetrení peptidom sa pri MPTP modeli silne potlačil rozvoj katalepsie a zmenšil sa výskyt akinézy a triašky.

Dodatočné ošetrenie (po 15 minútach) silne zamedzilo neskoršiemu rozvoju MPTP katalepsie a zjavne znížilo akinézu a triašku. Obyčajne vysoká úmrtnosť (50 %), pozorovaná po jedinej aplikácii MPTP, sa znížila rovnako u zvierat ošetrených peptidom predbežne aj dodatočne.

10. Vplyv podania peptidov pri hemoragickom šoku

Vo všetkých pokusoch sa použili dospelé samičky bielych krýs kmeň Wistar (150-180 g).

Vplyvy na hemoragický šok sa testovali v dvoch sériách pokusov.

a) Zvieratá vykrvácali (1 ml za 3 minúty, 2 minúty pokoj) až do úhynu. U zvierat, ošetrených peptidom s peptidickým reťazcom č. 4 (10,0 pg alebo 10 ng/kg telesnej hmotnosti i. p.), alebo vodným roztokom soli (5,0 ml na kg telesnej hmotnosti i. p.) 15 minút pred krvácaním, bol stanovený objem odobranej krvi, súvisiaci s fatálnym výsledkom. Pozorovala sa významne vyššia hodnota fatálneho objemu krvi v skupine ošetrenej vyššími dávkami peptidov v porovnaní s kontrolnou skupinou.

b) Tlak krvi sa znižoval riadeným odberom krvi a potom sa udržiaval 5 minút na hodnote 30-35 mm Hg. Potom sa aplikoval peptid s peptidickým reťazcom č. 4 (10,0 pg alebo 10 ng/kg telesnej hmotnosti), alebo vodný roztok soli (kontrola, 3,0 ml/kg telesnej hmotnosti). Na rozdiel od kontrolnej skupiny u zvierat ošetrených peptidom sa pozorovalo významné zvýšenie a ustálenie hodnoty tlaku krvi a nedošlo k úhynu.

Zdá sa teda, že skúmaný peptid je vysoko účinný pri zlepšovaní dôsledkov straty krvi.

11. Vplyv na letálnu radiáciu

V pokusoch boli použité myši NMRI-Hannover, 5-6 týždňov staré, obe pohlavia (18-22 g telesná hmotnosť). Syntetický peptid s peptidickým reťazcom č. 4 sa aplikoval v dávkach 20 pg/kg i. p.l hodinu pred ožiarením alebo po ožiarení. Kontrolné zvieratá dostali súčasne rovnaké objemy 0,9 % vodného roztoku soli i. p. (5,0 ml/kg). Ďalšie zdravé zvieratá, udržiavané za normálnych podmienok, neošetrené liekmi a neožiarené, slúžili ako kontrolná zdravá skupina.

Ožiarenie: Teatron 80 (Co 60, 2200 Ci). Myši v klietkach bez anestézie, 16 myší v jednej skupine, boli vystavené celým telom ožiareniu supraletálnou dávkou 9 Gy na ožiarovacei ploche 20x20 cm, vzdialenosť 80 cm.

Úmrtia sa zaznamenávali dvakrát denne počas 30 dní. Všetky kontrolné zvieratá zahynuli počas 7-12 dní (LD_100/12). V kontrolnej skupine zdravých neožiarených zvierat nebol zaznamenaný žiadny úhyn.

Podľa výsledkov sa nepozoroval žiadny rozdiel medzi skupinou neošetrenou a ošetrenou peptidom 1 hodinu po ožiarení. Ale výrazné zvýšenie prežitia bolo pozorované v prípade, že zlúčenina bola aplikovaná 1 hodinu pred ožiarením. Zistilo sa 70 % zvýšenie LD₁₀₀oproti kontrolnej skupine.

SK 278507 Β6

12. Vplyv na vyvolanú malformáciu

Vo všetkých pokusoch sa použili samičky myší NMRI-Hannover, dvojmesačné, telesná hmotnosť 25 g, dovtedy nevystavené kopulácii. Samičky myší v estrálnej fáze boli spárené cez noc so skúsenými zdravými myšími samcami. Myši boli usmrtené po 20 dňoch tehotenstva.

Vitamín A sa aplikoval v dávkach 15 700 j./kg telesnej hmotnosti i. m. v desiatom dni tehotenstva (0,05 ml na kg telesnej hmotnosti). Súčasne sa podával v dávke 10 pg alebo 10 ng/kg telesnej hmotnosti i. p. peptid s peptidickým reťazcom č. 4.

Kontrola: vodný roztok soli 5,0 ml/kg telesnej hmotnosti i. p.

Zvieratá neošetrené vitamínom A, ktorým bol podaný v rovnakom čase vodný roztok soli alebo peptid s peptidickým reťazcom č. 4 v rovnakej dávke, slúžili ako zdravá kontrolná skupina. V skupine zdravých myší (vodný roztok soli), alebo ošetrených peptidom, sa nepozorovala malformácia.

Výsledky zhrnuté v tabuľke č. 3 ukazujú prekvapivo významný a od dávky závislý ochranný účinok skúmaného peptidu voči vitamínu A, vyvolávajúceho malformácie.

Tab. 3 Makroskopické skúšky
Ošetrenie	Celkový počet plodov	Počet poškodených plodov
kontrolní skupina (vodný rožtok soli)	55	0
vitamín A	54	36
vitaaín λ + peptid 4 10 ng/kg	36	13
vitamín A 4 peptid 4	18	1

ug/kg

13. Akútna toxicita

Akútna toxicita syntetických peptidov sa stanovila u samičiek myší (hmotnosť asi 20 g). Pri každom pokuse a kontrole sa použila skupina 6 zvierat.

Peptidy s peptidickým reťazcom 2, 3, 4 a 6 sa aplikovali v dávkach 8, 25 a 50 mg/kg telesnej hmotnosti i. v. Kontrolná skupina bola ošetrená vodným roztokom soli (0,9 %, 5,0 ml/kg telesnej hmotnosti). Na zvieratách sa nasledujúcich 15 dni sledovali znaky toxicity.

Pri aplikovaných dávkach neboli pozorované známky toxicity alebo úhynu. Pozoroval sa zaujímavý jav výrazného zvýšenia pohybovej aktivity a živosti, trvajúci dve hodiny po aplikácii peptidov.

Podľa výsledkov farmakologického výskumu sú tieto peptidy aktívne v zmysle ochrany organizmu proti stresom a chorobám a vo všeobecnosti normalizujú funkcie organizmu.

Ich použitie môže byť tiež efektívne pri prevencii a terapii viacerých chorôb a porúch zdravia ľudí a zvierat. Tieto zlúčeniny možno použiť predovšetkým pri liečení:

- chorôb a porúch zdravia vyvolaných stresom,

- gastrointestinálnych vredov rôznej etiológie,

- zápalov a opuchov rôzneho pôvodu,

- úrazov, popálenín, zlomenín kostí a všeobecne v chirurgii,

- vírusových infekcií,

- šoku,

- Parkinsonovej choroby,

- ako ochrana pred radiačným poškodením,

- ako ochrana pred poškodením plodu.

Opísané peptidy môžu byť celkove využité tiež v širokej palete farmaceutických prípravkov v kombinácii s netoxickým farmaceutickým nosičom alebo vehikulom ako je plnivo, netoxické pufre, alebo fyziologické soľné roztoky. Takéto farmaceutické prípravky môžu byť použité miestne alebo systémovo a môžu byť použité v každej vhodnej forme, a to kvapalnej, tuhej, polotuhej, v injekčných roztokoch, tabletách, mastiach, omývacich roztokoch, tobolkách, lingvetách a podobne.

Pri systémovej aplikácii môžu byť tieto peptidy podávané vo všeobecnosti v dávkach od 10'⁵do 10^-2mg/kg telesnej hmotnosti. Keď sa používajú miestne, môžu byť podané vo vyšších koncentráciách, t. j. 0,1 až 0,5 %.

Veľmi výhodná je neprítomnosť akýchkoľvek príznakov toxicity do dávok 50 mg/kg telesnej hmotnosti a tiež dobrá aktivita zlúčenín pri perorálnom užívaní (intragastrikálne).

Tu opísané peptidy môžu byť syntetizované postupnou kondenzáciou chránených aminokyselín v homogénnom kvapalnom systéme, alebo výhodne využitím metódy s tuhou fázou. Na prípravu cyklických peptidov sa pripravujú čiastočne chránené lineárne peptidy s požadovanou dĺžkou reťazca s alkylesterovou skupinou na koncovom uhlíku, ktorá sa prevedie na azid, nasleduje kondenzácia a uvoľnenie koncovej skupiny. Čiastočne chránený lineárny peptid s voľnými koncovými skupinami sa môže alternatívne cyklizovať s difenylfosforylazidom vo veľmi zriedených roztokoch.

Vynález je možné bližšie opísať pomocou nasledujúcich príkladov, ktoré však neohraničujú rozsah predloženého vynálezu.

Príklad 1

Syntéza peptidu Boe postupom

Syntéza peptidu sa začala so 100 mg Boc-Val-PAM živice s cieľom pripraviť peptid s koncovou karboxylovou skupinou (PAM získaný od Applied Biosystems, substitúcia 0,56 mekv/g je aminoacyl-4-(oxymetyl)-fenyloctový derivát aminopolystyrénu). Boe aminokyseliny (Boe = terc-butoxykarbonyl-) boli kondenzované jedna za druhou na polymémy nosič pomocou diizopropylkarbodiimidu (DIPC) ako kondenzačného činidla. V každom kroku sa Boe skupina odstránila s 50 % roztokom kyseliny trifluóroctovej (TFA) v dichlórmetáne. Aminoskupina sa potom deprotonizovala s diizopropyletylamínom.

Konverzia v každom kroku musí byť vyššia ako 99,5 %, v opačnom prípade sa kondenzácia opakovala. Po úplnej syntéze sa uskutočnilo za miernych podmienok štiepenie s HF (2 hodiny pri 0 °C). Na odstránenie karboniového iónu sa použil anizol. HF sa potom odparil v prúde dusíka. Surový peptid sa získal naliatím olejovitého zvyšku do suchého éteru.

Potom sa surový peptid čistil vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) s reverznou fázou na kolóne 5x150 mm, naplnenej silikagélom RP-18, gradientová elúcia s rozpúšťadlovým systémom: 0,1 % TFA v zmesi voda/acetonitril. Detekcia: ultrafialová absorpcia pri 225 nm.

Syntéza peptidu s peptidickým reťazcom č. 4 je vyznačená na obr. 1.

Príklad 2

Syntéza peptidu Fmoc postupom

Pri syntéze sa použili štandardné Fmoc chránené aminokyseliny (Fmoc = 9-fluorenylmetyloxykarbonyl-). Funkčné skupiny na bočnom reťazci sa chránili ako O-tercbutylestery (Asp, Apm, Glu, Aad) a ako Boe deriváty (Lys). Prvá aminokyselina (Val) sa nadviazala na polymémy nosič - BHA živicu (BHA = benzhydrilaminoživica) použitím diizopropylkarbodiimidu ako kopulačného činidla. V každom kroku sa ochranná Fmoc skupina odstránila piperidínom. Potom druhá a rovnako všetky ďalšie aminokyseliny boli nadviazané rovnakým postupom až do ukončenia syntézy. Štiepenie sa vykonalo zmesou TFA (TFMSA) anizol = 2:17:52 (obj.).

Peptid sa potom čistil metódou HPLC, opísanou v príklade 1.

Syntéza peptidu s peptidickým reťazcom č. 2 je ilustrovaná na obr. 2.

Príklad 3

Syntéza peptidu Ddz postupom

Všetky aminokyseliny boli použité v chránenej forme na ich aminoskupine pomocou Ddz (= a, a-dimetyl-3,5-dimetoxybenzyloxykarbonyl-). Vedľajšie funkčné skupiny sa chránili pomocou skupiny Z (= benzyloxykarbonyl-) pri lyzíne a O-t-Bu skupine (t- butylester) pri asparágovej a glutamovej kyseline. Na nadviazanie prvej Ddz aminokyseliny cez je céziovú soľ sa použil nosič Merrifielf (zosietený chlormetylovaný polystyrénový gél) s kapacitou 1,4 mmol/g. Po kondenzácii s dicyklohexylkarbodiimidom (DCC) sa v každom kroku odstránila ochranná skupina Ddz s 5 % TFA v dichlórmetáne, nasledovalo prepieranie a deprotonizácia s 10 % trietylamínom v dichlórmetáne. Po deprotonizácii bol sprostredkovaný ďalší kopulačný krok rovnakou metódou. Tieto kopulačné kroky sa opakovali až do skompletizovania peptidického reťazca.

Nakoniec bol peptid odštiepený z polymémeho nosiča zmesou HBr/TFA/anizol. Po odparení prchavých podielov sa práve odštiepený peptid vyzrážal zo suchého éteru a sušil. Surový peptid sa potom čistil HPLC metódou ako bolo opísané v príklade 1. Syntéza peptidu s peptidickým reťazcom č. 6 je ilustrovaná na obr. 3.

Príklad 4

Syntéza cyklického peptidu

Peptid v čiastočne chránenej forme:

OBzl NO₂ OBzl

Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Arg-Pro-Ala-Asp-OH bol najskôr pripravený rovnakou metódou ako bolo opísané v príklade 1 alebo 2.

0,0005 molárny roztok tohto peptidu v dimetylformamide sa cyklizoval po pridaní difenylfosfoiylazidu a trietylamínu 12 hodín pri 20 °C. Potom sa táto zmes hydrogenovala vodíkom v prítomnosti katalyzátora Pd/aktívne uhlie pri 25 °C 8 hodín. Rozpúšťadlo sa opatrne odparilo a surový produkt sa čistil metódou HPLC, opísanou v príklade 1.

Cyklický peptid s peptidickým reťazcom č. 10

Gly Glu Pro pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp 11 5 | 10 sa získal v 10 % výťažku.

Príklad 5

Syntéza lineárnych a cyklických peptidov Ddz postupom

Pri získavaní lineárnych a cyklických peptidov sa použil rovnaký postup s Ddz chránením skupín. Vedľajšie funkčné skupiny sa chránili Z skupinou (lyzín) a s O-benzylesterovými skupinami-OBzl-(glutámová a asparágová kyselina).

Polymémym nosičom bola živica HYCRAM^R(obchodná značka ORPEGEN, Heidelberg, Nemecko), čo je 4-bromkrotonyl-P-alanylamidometyl-polystyrén. Prvá aminokyselina (Ddz-valín) sa nadviazala na polymémy nosič cez jej céziovú soľ. Potom sa Ddz skupina odstránila pomocou roztoku trifluoroctovej kyseliny (5 %) v dichlórmetáne a deprotonizácia aminoskupiny sa vykonala s diizopropyletylamínom.

V ďalšom kroku sa nadviazal Ddz-glycín na valínový zvyšok na polymémej matrici s použitím diizopropylkarbodijgiidu (DIPC) v prítomnosti 1- hydroxy bcnz-lriazolu.

Tieto kroky sa opakovali až do úplného skompletizovania peptidického reťazca. Syntetizovaný peptid v chránenej forme sa potom opatrne odštiepil z nosiča HYCRAM^r s tetrakis-(trifenylfosfino)-paládiom (O), rozpusteným v bezvodom tetrahydrofuráne v neprítomnosti kyslíka. Ako akceptomá melekula pre alylskupiny sa použil aditív morfolínového typu.

Polymémy nosič sa odfiltroval a premyl tetrahydrofuránom. Roztok peptidu sa potom filtroval cez krátku silikagélovú kolónu, aby sa odstránil paládiový katalyzátor.

Eluát, ktorý obsahoval čiastočne chránený peptid s peptidickým reťazcom 4a, sa po odparení rozpúšťadla sušil vo vákuu.

Syntéza lineárneho peptidu s peptidickým reťazcom č. 4

Parciálne chránený peptid 4a sa rozpustil v 2,2,2-trifluoretanole a hydrogenoval vodíkom v prítomnosti paládia na aktívnom uhlí (10 %) pri 30 °C. Katalyzátor sa odfiltroval a rozpúšťadlo sa odparilo vo vákuu. Surový zvyšok sa potom čistil HPLC metódou, ako bolo opísané v príklade 1. Po čistení sa získal peptid s peptidickým reťazcom č. 4. Produkt bol identický so zlúčeninou, získanou v príklade 1.

Syntéza cyklických peptidov s peptidickým reťazcom č. 9 Čiastočne chránený peptid 4a sa rozpustil v roztoku dimetylformamid/dichlórmetán (1:1) tak, aby vznikol 0,001 molárny roztok. Na cyklizáciu sa pridal DIPC a HOBt a reakčná zmes sa nechala stáť 10 hodín pri 20 °C. Potom sa roztok zakoncentroval na malý objem, zriedil 2,2,2-trifluoretanolom a čistil prechodom cez kolónu, naplnenú Sephadexom LH-20. Frakcie obsahujúce čiastočne chránený cyklický· peptid 9a sa spájali a hydrogenovali v prítomnosti paládia na aktívnom uhlí (10 %) pri 30 °C prebublávaním vodíkom 8 hodín za intenzívneho trepania.

Potom sa katalyzátor odstránil filtráciou a roztok sa sušil odparením rozpúšťadla vo vákuu. Surový peptid sa dodatočne čistil metódou HPLC opísanou v príklade 1. Získaný čistý cyklický peptid bol identifikovaný ako peptid s peptidickým reťazcom č. 9.

Syntéza na polymémom nosiči HYCRAM^r Ddz postupom a cyklizácia sú ilustrované na obr. 4 a 5. Pri všetkých syntetizovaných peptidoch sa stanovovala ich čistota metódou HPLC na silikagélovej kolóne RP-18 (oktade-cyl-silanizovaný) a elučným činidlom bolo zmesové rozpúšťadlo voda /acetronitril/trifluoroctová kyselina, gradientovo bežným postupom. Vo všetkých prípadoch bola čistota vyššia ako 95 %.

Peptidy boli charakterizované analýzou aminokyselín (hodnoty boli v rámci 10 % teórie), sekvenčnou analýzou, stanovením molekulovej hmotnosti hmotnostnou FAB spektrometriou, ultrafialovými a infračervenými spektrami (obr. 6 a 7).

I keď tu boli opísané len určité charakteristiky nášho vynálezu v špecifických detailoch, odborník v tejto oblasti bude schopný vykonať ďalšie špecifické vylepšenia a mnohé zmeny, tieto však budú vždy v duchu vynálezu a v rozsahu pripojených patentových nárokov.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Biologicky vysoko aktívne peptidy. vyznačujúce sa tým, že obsahujú od 8 do 15 aminokyselinových zvyškov a sú prezentované všeobecným vzorcom:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15, v ktorom

Xaa znamená neutrálny zvyšok alifatickej aminokyseliny vybranej zo skupiny pozostávajúcej z Ala, bAla, Leu, íle, Gly, Val, Nie, Nva,

Yaa znamená bázický zvyšok aminokyseliny vybranej zo skupiny pozostávajúcej z Lys, Arg, Om, His, Zaa znamená kyslý zvyšok aminokyseliny vybranej zo skupiny pozostávajúcej z Glu, Asp, Aad alebo Apm;

a v ktorom môže byť vynechaný najmenej jeden a vynechaných najviac sedem z aminokyselinových zvyškov.
2. Peptidy podľa nároku 1, molekuly ktorých sú cyklizované amidickou väzbou medzi prvým a posledným aminokyselinovým zvyškom.
3. Peptid s peptidickým reťazcom so vzorcom:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015
4. Peptid s peptidickým reťazcom so vzorcom:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val 15 1015
5. Peptid s peptidickým reťazcom so vzorcom:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015
6. Peptid s peptidickým reťazcom so vzorcom: Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val

15 1014
7. Peptid s peptidickým reťazcom so vzorcom:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val 15 1014
8. Peptid s peptidickým reťazcom so vzorcom:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala

1 58
9. Peptid s peptidickým reťazcom so vzorcom:

Asp Pro Pro Pro íle Arg Pro Ala Asp 1 59
10. Peptid s peptidickým reťazcom so vzorcom:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp

1 59
11. Peptid s peptidickým reťazcom so vzorcom:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val | 2_______________5___________________________10______________13|
12. Peptid s peptidickým reťazcom so vzorcom:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Ar? Pro Ala Asp
13. Peptid s peptidickým reťazcom so vzorcom:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asn 1 59
14. Terapeutický prípravok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje jednu alebo viac zlúčenín podľa nárokov 1 až 13 v prímesí s farmaceutický akceptovateľným tuhým alebo kvapalným vehikulom.
15. Použitie peptidov podľa nárokov 1 až 13 na výrobu liečiv na liečenie chorôb a porúch zdravia, vyvolaných stresmi, na liečenie zápalov, opuchov, úrazov, popálenín, vírusových infekcií, chorôb imunitného systému, porúch centrálnej nervovej sústavy, gastrointestinálnych vredov rôzneho pôvodu, zlomenín kostí, šokov a všeobecne v chirurgii, mozgových porúch a depresií, Parkinsonovej choroby, na ochranu pred radiačným poškodením a malfomáciami, vyvolanými chemickými činidlami a všeobecne ako látky chrániace organizmus.