DE69316974T2

DE69316974T2 - Bpc-peptide, deren herstellung und therapeutischen verwendung

Info

Publication number: DE69316974T2
Application number: DE69316974T
Authority: DE
Inventors: Marko Zagreb Duvnjak; Zeljko Zagreb Grabarevic; Boris Zagreb Mildner; Stjepan Split Mise; Marijan Zagreb Petek; Ivo Zagreb Rotkvic; Sven Zagreb Seiwerth; Predrag Dr.Sc. Zagreb Sikiric; Ernest Dr.Sc. Zagreb Suchanek; Branko Zagreb Turkovic; Ivan Stans Udovicic
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-11-16
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 1998-07-16
Anticipated expiration: 2013-11-17
Also published as: EP0624164A1; ATE163131T1; HUT66303A; EP0624164B1; AU5624994A; RU2116311C1; WO1994011394A2; RU94037232A; PL304666A1; BG61697B1; SK279227B6; BG98907A; SK85794A3; DE69316974D1; WO1994011394A3; SI9300595B; RO115733B1; HU211260A9; HUT67982A; GR3026478T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Peptiden mit hoher biologischer Aktivität vom gleichen Typ wie die bekannte natürliche Verbindung BPC, jedoch mit kürzeren Aminosäureketten, bei der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung verschiedener Krankheiten.

Hintergrund der Erfindung

Ein biologisch aktives Protein mit organschützender Aktivität, welches aus dem menschlichen oder tierischen Körper isoliert und als BPC (körperschützende Verbindung) bezeichnet wurde, wurde in EP 0 432 400 offenbart und auch von P. Sikiric et al., Exp. Clin. Gastroenterol. 1 (1991), 15-26, publiziert. Dieses Protein besitzt ein hohes Molekulargewicht von etwa 40 000 ± 5000 Dalton mit nur teilweise bestimmter Struktur. Diese Verbindung besitzt ein sehr breites Spektrum biologischer Aktivitäten wie: Ulcus-schützend, Leber-schützend, antiviral, antiödemisch, allgemeine entzündungshemmende Aktivität, Aktivität gegen bösartige Geschwüre und andere. Es sollte bei der Therapie der genannten Krankheiten und weiterhin bei der Therapie von Krankheiten und Störungen des Nervensystems, Störungen der dopaminergen Ethiologie, der Chirurgie, der Stomatologie, der Heilung von Infertilität und in der Veterinärmedizin verwendet werden. Jedoch kann dieses breite Aktivitätsspektrum vermutlich eine Konsequenz der unbestimmten Struktur oder selbst der ungenügenden Reinheit oder Homogenität der isolierten Verbindung BPC sein.
EP-A-572 688 offenbart N-terminale BPC-Peptide und bestimmte therapeutische Verwendungen dieser Peptide. Dieses Dokument ist nicht vor dem Prioritätstag der vorliegenden Erfindung veröffentlicht worden und ist daher nur für die Frage der Neuheit relevant.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf einer Klasse synthetischer Peptide, die eine überraschend hohe biologische Aktivität, insbesondere im Hinblick auf Körperschutz, zeigen, und verwendet diese. In jedem Fall besitzen diese synthetischen Verbindungen mit einer gut definierten Struktur einen großen Vorteil im Vergleich zu dem nur teilweise definierten hochmolekularen BPC- Protein, welches nur durch ein schwieriges Verfahren aus einer zweifelhaften natürlichen Guelle erhältlich ist.
Insbesondere basiert die vorliegende Erfindung auf einer Klasse biologisch hochaktiver Peptide, die aus 8 bis 15 Aminosäureresten bestehen, und verwendet diese, welche durch die folgende grundlegende Strukturformel unter Verwendung des Drei-Buchstaben-Aminosäure-Codes dargestellt werden, wobei die Zahlen unterhalb jedes Aminosäurerestes sich auf die Stellung des Restes in der Peptidkette beziehen:
worin ein oder mehrere Aminosäurereste substituiert sind. Die Substituenten Xaa, Yaa und Zaa, welche verwendet werden können, sind in der folgenden Tabelle I gezeigt. Tabelle I.
Bevorzugte Peptide sind die folgenden: Seq. Id. Nr.: 1 Seq. Id. Nr.: 2 Seq. Id. Nr.: 3
Die vorliegende Erfindung verwendet auch analoge Peptide in Amid- oder Carboxy-Endform am C-Ende mit obigen Strukturformeln beschrieben, worin wenigstens ein und höchstens 7 Aminosäurereste im Bereich 1 - 15 fehlen und wenigstens einer der verbleibenden Aminosäurereste gemäß dem in Tabelle 1 beschriebenen Substitutionsschema substituiert werden kann.
Bevorzugte Peptide sind die folgenden: Seq. Id. Nr.: 4 Seq. Id. Nr.: 5 Seq. Id. Nr.: 6 Seq. Id. Nr.: 7 Seq. Id. Nr.: 8
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Peptide mit den oben beschriebenen Strukturformeln verwendet, worin wenigstens einer der Aminosäurereste fehlen kann und wenigstens einer der verbleibenden Aminosäurereste, wie in Tabelle I gezeigt, substituiert werden kann, die in die cyclische Form durch Bildung einer neuen CO-NH-Bindung zwischen dem ersten und dem letzten Aminosäurerest im Molekül transformiert werden. Bevorzugte Peptide sind die folgenden: Seq. Id. Nr.: 9 Seq. Id. Nr.: 10
Die Anmelder haben gefunden, daß bei Verwendung der oben beschriebenen Peptide solche Peptide eine biologische Aktivität zeigen, die gleich oder größer ist als beim Stamm-Protein BPC.
Die pharmakologische Untersuchung der beschriebenen Peptide wurde mit verschiedenen gewöhnlichen Modellen "in vitro" und "in vivo" durchgeführt und folgende pharmakologische Eigenschaften wurden gefunden:

1.) Schutzwirkung auf Leber und Pankreas

Die Schutzwirkung neu synthetisierter Peptide, die von Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 codiert werden, ist mit Referenzstandards (Bromocriptin, Amantadin, Somatostatin) in verschiedenen experimentellen Modellen von Leber- und Pankreas-Verletzungen bei Ratten verglichen worden: einer 24-stündigen Gallengang-Ligatur, einer 24-stündigen Ligatur von Gallengang + Leberarterie, bei 48-stündigem beschränkten Stress, bei CCl&sub4;-Anwendung. Die verwendeten Peptide, die im Bereich von 10 ug - 10 ng/kg Körpergewicht entweder intragastral oder intraperitoneal angewendet wurden, verhindern signifikant sowohl Leber- und Pankreas-Nekrose als auch Fettveränderungen bei Tieren, die einer 24-stündigen Gallengang-Ugatur, einer 24-stündigen Ligatur von Gallengang und Leberartene, 48-stündigem beschränkten Stress oder einer CCl&sub4;-Anwendung unterworfen wurden. Die biochemischen Bilirubin-, SGOT- und SGPT-Werte stimmen mit den erwähnten makroskopischen/mikroskopischen Daten vollkommen überein.

2.) Die Wirkung auf Nierenläsionen

a) Unilaterale Nephrektomie

Bei den Experimenten wurden 190 g - 250 g schwere Wistar-Albino-Ratten beiderlei Geschlechts verwendet. Es wurde eine unilaterale Nephrektomie durchgeführt und dadurch wurde eine Zunahme des Gewichts der verbliebenen Niere sowohl bei der Kontrolle als auch bei den Gruppen beobachtet, die mit den Peptiden mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 behandelt wurden, die 1 h vor dem chirurgischen Eingriff in einer Menge von 10 ug/kg Körpergewicht intraperitoneal verabreicht wurden. Bei den mit den Peptiden behandelten Gruppen ist durchweg eine Abnahme der Nierenzunahme beobachtet worden.
In beiden Gruppen sind die biochemischen Parameter verglichen worden. Es scheint, daß alle verwendeten Peptide die Funktion der verbliebenen Niere verbessern.

b) Gentamycin-Anwendung

Bei den Experimenten wurden weibliche Wistar-Albino-Ratten verwendet. Durch Anwendung von Gentamycin, das in einer Dosierung von 40 mg/kg während einer Zeitspanne von 30 Tagen einmal täglich verabreicht wurde., wurden Tubularschäden induziert. Alle Tiere wurden 5 Tage nach der letzten Arzneimittel-Anwendung getötet. Bei den Kontrollgruppen sind signifikante Tubularläsionen beobachtet worden, während bei allen mit den obigen Peptiden behandelten Gruppen durchweg signifikant weniger mikroskopisch sichtbare Läsionen gefunden wurden.

c) Quecksilberchlorid

Bei den Experimenten wurden Wistar-Albino-Ratten verwendet. Quecksilberchlorid wurde in einer Dosierung von 2 mg/kg Körpergewicht intravenös verabreicht und die Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 wurden 1 h vor der quecksilberchlorid-Anwendung in einer Dosis von 20 ug/kg verabreicht. Im Gegensatz zu den Kontrolldaten zeigten sowohl die biochemischen Ergebnisse als auch die mikroskopischen Ergebnisse eine Schutzwirkung bei den mit den erwähnten Peptiden behandelten Gruppen.

3.) Der Einfluß auf Testikel-Läsionen

Der Einfluß der Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 auf Testikel-Läsionen ist mittels einer Anwendung von Ketoconasol (24 mg/kg intragastral), Testosteron (30 mg/kg intraperitoneal) oder einer 6 Gy-Bestrahlung untersucht worden. 1 h vorher wurden die Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 verabreicht. Die Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 zeigten eine Schutzwirkung.

4.) Fertilität/ kommerzielle Zucht

a) Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 und Fertilität: Der Einfluß auf Oligoasthenospermie. Die Untersuchung wurde an 10 Männern im Alter von 30 - 40 Tagen mit diagnostizierter Oligoasthenospermie durchgeführt. Von diesen Patienten wurden nach 3 bis 4 Tagen Abstinenz ein Ejakulat genommen. Nach Verflüssigung (30 min) wurde zu 0,5 ml Ejakulat eine Schicht von 0,5 ml Medium zugegeben. Das Kontrollmedium bestand aus HAM-F 10 mit 10% inaktiviertem chordalem Serum. Experimentelles Medium enthielt zusätzlich 2 ug/ml oder 4 ug/ml BPC. Nach einer 90-minütigen Verweilzeit bei 37ºC in einer 5% CO&sub2; enthaltenden Atmosphäre in einer Horwell-Fertilitätskammer wurde die Anzahl von Spermatozoen in 1 ml Ejakulat bestimmt, die sich progressiv bewegten, auf der Stelle bewegten und unbeweglich waren. Vorläufige Ergebnisse zeigen, daß eine geringere Konzentration der erwähnten Peptide keine Wirkung auf die Beweglichkeit von Spermatozoen hat. Bei einer höheren Konzentration (4 ug) wurde jedoch ein signifikanter Anteil beweglicher Spermatozoen gegenüber der Kontrolle bestimmt.

Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 und Reproduktionsprozesse

Die erwähnten Peptide wurden bei Mäusen mit drei Schwangerschaften in der Vergangenheit untersucht. 20 Tage nach dem Ende der letzten Laktation wurden die Tiere einer Kopulation unterworfen. Die verwendeten Peptide wurden während der gesamten Zeitdauer der Schwangerschaft (19 - 21 Tage) und Laktation (die folgenden drei Wochen) einmal täglich in einer Dosis von 10 ug/kg Körpergewicht intraperitoneal verabreicht. Die Kontrollgruppe erhielt gleichzeitig ein gleiches Volumen von Kochsalzlösung. Die Anzahl der Nachkommenschaft pro Weibchen und das Gewicht der Nachkommenschaft wurden erfaßt.
Eine sorgfältige statistische Analyse zeigte durchweg sowohl eine signifikant erhöhte Anzahl der Nachkommenschaft pro Weibchen als auch überraschenderweise in jedem untersuchten Zeitintervall keinen Unterschied im Körpergewicht. Allen Weibchen wurde gestattet, daß sie sich nach Einstellung der Laktation in den folgenden 25 Tagen erholten. Danach wurden sie zur Untersuchung der Wirkung auf die fünfte Schwangerschaft wieder einer Kopulation unterworfen.
In bezug auf die Kontrollgruppe wurde bei allen mit den erwähnten Peptiden behandelten Gruppen eine erhöhte Fertilitätsrate mit einer erhöhten Laktations-Fähigkeit registriert.
Es sollte erwähnt werden, daß die erwähnten Peptide die Fertilität in ziemlich alten Mäusen verbessern konnten. Folglich stimmen diese Ergebnisse mit der insgesamt vorteilhaften Kapazität der Peptide und den in vitro-Daten überein, die unter Verwendung von menschlichem Sperma erhalten wurden.

c) Kommerzielle Zucht

1419 gesunde Schweine (von insgesamt 4306 Schweinen) erhielten sofort nach der Geburt 10 ug der Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6, weitere 1440 Schweine am 13. Lebenstag 1 h vor Kastration, während die restlichen 1477 nur eine herkömmliche Fe-Therapie erhielten. Nach 4 Wochen wurden Prellungen, Ausfälle, Mortalität, Körpergewicht und Futterverbrauch bestimmt. Die verwendeten Peptide, die einmal verabreicht worden waren, senkten signifikant die Ausfallrate (in den mit Peptiden behandelten Gruppen sofort nach der Geburt) und die Prellungsrate (bei allen mit Peptiden behandelten Gruppen). Bei den mit Peptiden behandelten Tieren wurde bei deutlich geringerem Futterverbrauch das gleiche Körpergewicht erhalten. Einfluß auf Infektionen: 40 entwöhnte Schweine mit Befall von E. coli-Enterocolitis im Alter von 28 Tagen wurden untersucht. Die verwendeten Peptide wurden bei 20 Tieren angewendet (10 ug/kg Körpergewicht, intramuskulär). Einen Monat später wurde bei den mit Peptiden behandelten Tieren eine signifikant verringerte Mortalitätsrate festgestellt.
In einem anderen Experiment wurde bei einer Gesamtzahl von 1200 gesunden Schweinen die Mortalitätsrate nach der ersten Woche untersucht. 400 Tiere erhielten neben einer herkömmlichen Fe-Therapie die erwähnten Peptide sofort nach der Geburt. Bei den mit den erwähnten Peptiden behandelten Gruppen (10 ug/kg Körpergewicht, intramuskulär) wurde eine signifikant verringerte Mortalitätsrate festgestellt.

5.) Einfluß auf Amphetamin-Verhalten

Der Einfluß der Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 wurde bei einer Dosierung von 10 ug/kg oder 10 ng/kg Körpergewicht untersucht, die 5 Minuten vor Amphetamin-Anwendung oder gleichzeitig damit intraperitoneal verabreicht wurde. Bei den mit den erwähnten Peptiden behandelten Gruppen wurde eine signifikante Abnahme der Amphetamin-induzierten Verhaltensstörungen festgestellt.

6.) Blutungszeit

Der Einfluß der Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 wurde mit Hilfe üblicher Blutungstests (Abschneiden oder Einschneiden des Schwanzes) bei Mäusen und Ratten mit oder ohne Anwendung von Heparin (1000 IE/kg subcutan 3 h vor Blutung) untersucht. Die untersuchten Peptide (10 ug/kg oder 10 ng/kg intraperitoneal) wurden gleichzeitig mit der Herbeiführung der Blutung verabreicht. Bei allen mit den untersuchten Peptiden behandelten Tieren wurde eine signifikante Abnahme der Blutungszeit festgestellt.

7.) Der Einfluß auf die Folgen einer Kastration

Es wurde ein modifiziertes Verfahren nach dem Allen-Doisy-Verfahren durchgeführt. Verschiedene Dosierungen wurden angewendet (10 ug/kg oder 10 ng/kg intraperitoneal), als Einzelverabreichung oder in einem Dosierungsschema von einmal täglich, entweder als Vorbehandlung oder als Nachbehandlung. Bei den mit den untersuchten Peptiden behandelten Gruppen erfolgte eine Prävention oder Reversion der unterschiedlichen Kastrationsfolgen (z.B. Scheidenepithel-Atrophie, Osteoporose).

8.) Bluthochdruck

Bluthochdruck wurde durch einen unilateralen Nierenarterien-Verschluß induziert. Nach 10 Tagen wurden die Tiere mit den Peptiden Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 oder 6 (10 ug/kg oder 10 ng/kg Körpergewicht, intraperitoneal) oder Kochsalzlösung unter Verwendung unterschiedlicher Vorgehensweisen (Einzel- oder kontinuierliche Verabreichung) behandelt. Bei den mit den untersuchten Peptiden behandelten Gruppen wurde eine signifikante Abnahme der erhöhten Blutdruckwerte beobachtet.

9.) Der Einfluß auf experimentell erzeugten Diabetes mellitus

Männliche Wistar-Albino-Ratten mit einem Körpergewicht von 175 g - 230 g wurden für einen mittels Streptozotocin oder Alloxan induzierten Diabetes mellitus verwendet. Die in einer Dosierung von 10ug/kg oder 100 ug/kg angewendeten Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 oder 6 verzögern bei den mit Streptozotocin behandelten Tieren signifikant den Ausbruch von Diabetes. Außerdem verlängerten sie signifikant die Überlebenszeit.

10.) Der Einfluß auf Thyreoparathyreoidektomie

Bei Wistar-Ratten wurde eine totale Schilddrüsen- und Nebenschilddrüsen- Entfernung durchgeführt. Unter Verwendung unterschiedlicher Vorgehensweisen (Einzel- oder wiederholte Behandlung) wurden danach die Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 (10 ng/kg Körpergewicht, intraperitoneal) oder physiologische Kochsalzlösung (5 ml/kg Körpergewicht, intraperitoneal) verabreicht. Bei den mit den untersuchten Peptiden behandelten Gruppen sind die Folgen der Drüsenentfernung signifikant verringert worden.

11.) Kopfschlagader-Ugatur

3 Stunden nach Ugatur beider Kopfschlagadern wurden die Tiere getötet. Eine Stunde vorher waren alle Tiere mit den Peptiden mit Seq. Id. Nr. :2, 3, 4 und 6 (10 ng/kg Körpergewicht, intraperitoneal) oder Kochsalzlösung (5 ml/kg Körpergewicht, intraperitoneal) behandelt worden. Bei den mit den untersuchten Peptiden behandelten Gruppen wurden signifikant weniger Gehirnödeme gefunden.

12.) Nebennieren

Zur Herbeiführung von Nebennieren-Verletzungen erhielten die Tiere Anilin (300 mg/kg subcutan während einer Zeitspanne von 7 Tagen). Alle Tiere wurden gleichzeitig mit den Peptiden mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 (10 ug/kg Körpergewicht, 10 ng/kg Körpergewicht, intraperitoneal) oder Kochsalzlösung (5 ml/kg Körpergewicht, intraperitoneal) behandelt. Es wurden das Gewicht der Nebennieren und mikroskopische Veränderungen bestimmt. Im Vergleich zu der Anilin-Kontrollgruppe verringerten beide Dosierungen der untersuchten Peptide signifikant die durch Anilin induzierte Zunahme des Nebennieren- Gewichts. Der mikroskopisch sichtbare Schutz war dosisabhängig. Da es allgemein anerkannt ist, daß die durch Anilin induzierten Störungen mit der ACTH-Sekretionsteigerung im Zusammenhang stehen, konnte eine kausale Beziehung zwischen den untersuchten Peptiden und ACTH bestimmt werden. Das scheint auch dadurch unterstützt zu werden, daß bei den mit den erwähnten Peptiden behandelten Gruppen das gleiche Gewicht gefunden wurde wie bei der nativen gesunden Kontrollgruppe.
Außerdem wurden die Tiere nach einer Vorbehandlung mit den untersuchten Peptiden (10 ug/kg oder 10 ng/kg intraperitoneal/intragastral) einem 48- stündigen Verfahren mit Immobilisierungsstress unterworfen. Die Abnahme des Nebennieren-Gewichts bei den mit den untersuchten Peptiden behandelten Tieren stimmte mit der entsprechenden mikroskopischen Beobachtung überein.

13.) Temperaturstörungen

Durch die Verabreichung einer Hefe-Lösung (4000 mg/kg, subcutan) wurde eine Erhöhung der Körpertemperatur hervorgerufen und durch Eintauchen in kaltes Wasser mit einer Temperatur von 4ºC oder durch Verabreichung von Reserpin (5 mg/kg, intraperitoneal) wurde eine Temperatursenkung herbeigeführt. Unterschiedliche Dosierungsschemata der Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 (10 ng/kg Körpergewicht, intraperitoneal), die sowohl bei erhöhter als auch bei gesenkter Temperatur untersucht wurden, zeigten, daß beide Temperaturstörungen durchweg normalisiert wurden.

14.) Einfluß auf Hämatopoese

Albino-Mäusen wurden Cytostatika (Endoxan, Vincristin, Adriablastin, Cytosinarabinosid) in LD&sub5;&sub0;-Dosen injiziert. Eine Stunde vor Verabreichung der Cytostatika wurden die Tiere mit den Peptiden Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 in einer Dosis von 10 ug behandelt, während die Kontrollen ein gleiches Volumen Kochsalzlösung erhielten. An den Tagen 3, 5, 7 und 11 des Experiments wurden die Tiere getötet. Es wurden Parameter von Blut (E, Hb, Htc, L, Tb, Gesamtzahl Neutrophiler) und Knochenmark sowie die Cytologie und Histologie von Leber und Milz beurteilt.
Im Gegensatz zu den intakten hämatopoetischen Zellen im Knochenmark der mit den Peptiden behandelten Tiere, die im starken Kontrast zu der bei den Kontrollen festgestellten Aplasie standen, wurde am dritten Tag des Experimentes zwischen beiden Gruppen kein Unterschied hinsichtlich der L-, E-, Tb- und Neutrophilen-Werte beobachtet.
Bei den mit den Peptiden behandelten Tieren erhöhte sich die Anzahl von Neutrophilen und Leukozyten bis zum fünften Tag signifikant und erreichte bis zum siebenten Tag die normalen Werte, anders als bei den Kontrollen, wo eine Normalisierung nicht vor dem 11. Tag beobachtet werden sollte.

15.) Schmerzverminderung

Durch eine intraperitoneale Verabreichung (0,2 ml/Maus) von 2% MgSO&sub4; oder 0,6% Essigsäure wurde Schmerz ausgelöst. Verschiedene Dosierungsschemata der Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6, bezogen auf die Dosis oder den Zeitpunkt der Verabreichung (10 ug/kg oder 10 ng/kg intraperitoneal, gleichzeitig oder 30 min vorher), verringern im Vergleich zu den Kontrollgruppen signifikant die Zeitdauer, in der sich die Tiere vor Schmerzen krümmen.

16.) Durch Rickettsien verursachte Infektion

0,2 ml einer Suspension von Coxiella burneti, das in einer Konzentration von 10&supmin;&sup9; gelöst worden war, wurden in geeignete Eier injiziert. In die Eier wurden auch die Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 (1 pg, 10 pg, 100 pg und 1 ng) injiziert. Die Überlebenszeit war bei den behandelten Gruppen signifikant länger als bei den Kontrollen.

17.) Einfluß auf Tumorzellen

a) Zwei Zellinien, L-924 und die Melanom-Zellinie B-16, wurden in vitro unter Standardbedingungen gezüchtet. In vitro wurde der Einfluß der Peptide mit Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 auf das Wachstum der erwähnten Zellkulturen untersucht. Zwei Tage nach Initiierung der Zellkulturen wurden die erwähnten Peptide in einer Konzentration von 3% (0,1 ml) zugegeben. Drei Tage später wurden die Zellzahlen pro Kultur mit Hilfe eines Zellzählgerätes bestimmt. Die Ergebnisse zeigten eine Hemmwirkung der erwähnten Peptide auf B-16- Melanomzellen.
b) Erlich-Aszitestumor (EAT) ist der Tumor, der in allen Mausstämmen wachsen kann, entweder aszitisch oder als fester Tumor, je nach Verabreichungsweg der Tumorzellen. Es wurde der Einfluß einer Inkubation von EAT-Zellen mit den Peptiden Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 auf die Überlebenszeit von Mäusen untersucht, denen diese Zellen subcutan oder intraperitoneal injiziert worden waren. Die Tiere wurden während eines Zeitraums von 45 Tagen beobachtet. Eine Kontrolle von 15 männlichen Mäusen, Stamm NMRI, erhielt 0,4 x 10&sup6; EAT- Zellen. Vor Injektion wurden die Tumorzellen eine Stunde bei 4ºC in Kochsalzlösung inkubiert. Das Injektionsvolumen betrug 0,2 ml. Die mittlere Überlebenszeit in dieser Gruppe betrug 36 Tage und nur 3 von 15 Tieren lebten länger als 45 Tage.
Eine experimentelle Gruppe von 15 männlichen NMRI-Mäusen erhielt die gleiche Dosis Tumorzellen im gleichen Volumen, die Zellen wurden jedoch vorher in einer Lösung der erwähnten Peptide (2 ug/ml) inkubiert. Nur 2 von 15 Mäusen starben im Beobachtungszeitraum (45 Tage), während alle anderen länger als 45 Tage lebten. Der Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der experimentellen Gruppe war statistisch signifikant (P < 0,01). Die gleichen Ergebnisse wurden festgestellt, wenn das gleiche Verfahren durchgeführt wurde und die FAT-Zellen intraperitoneal injiziert wurden (anstelle einer subcutanen Injektion).
c) Die Mäuse wurden zur Untersuchung des Einflußes der Peptide Seq. Id. Nr.: 2, 3, 4 und 6 (in einer Dosis von 10 ug/kg Körpergewicht intraperitoneal verabreicht) auf Lungenmetastasen verwendet, die durch Injektion von Melanom- oder aplastischen Mamma-Carcinomzellen induziert worden waren. Bei den mit Peptiden behandelten Gruppen wurde eine signifikante Abnahme der Anzahl von Lungenmetastasen ermittelt.
Auf der Basis der vorstehend beschriebenen Daten konnte festgestellt werden, daß die erwähnten Peptide die Überlebenszeit der Tiere mit Tumoren verlängerten und Antitumor-Aktivität zeigten.

18.) Antidepressive Aktivität

Zum Aufzeigen der antidepressiven Aktivität wurde der erzwungene Schwimmtest gemäß Porsolt et al., Eur. J. Pharmacol., 47 (1978), 379-391, verwendet.
Männliche Wistar-Ratten (180 g - 240 g Körpergewicht) wurden für dieses Experiment verwendet. Das untersuchte Peptid Seq. Id. Nr.: 4 ist entsprechend der beschriebenen Vorgehensweise verabreicht worden. Kurz gesagt, erhielten Kontrolltiere Kochsalzlösung, die Bestimmung dauerte 5 min und es wurde die Zeit für die Bewegungsunfähigkeit berechnet. Die Zeit für die Bewegungsunfähigkeit betrug bei der Kontrolle 150 sek, während bei den mit dem Peptid behandelten Tieren Werte von nur 60 sek - 70 sek beobachtet wurden. Eine Dosis-Reaktions-Kurve konnte wie folgt berechnet werden: bei 10 ug/kg - 10 ng/kg volle Wirkung, bei 10 pg/kg Körpergewicht war die Aktivität noch vorhanden, bei 1 pg/kg war die Wirkung nicht vorhanden.
Die folgenden Ergebnisse einer pharmakologischen Untersuchung dieser Peptide zeigen eine Aktivität im Sinne eines Schutzes des Organismus gegen Stress und Krankheiten, wobei im allgemeinen die organischen Funktiönen normalisiert werden.
Ihre Verwendung sollte auch zur Vorbeugung und Therapie mehrerer menschlicher oder tierischer Krankheiten und Störungen wirksam sein. Insbesondere werden diese Verbindungen für die Behandlung von:
- Störungen und Läsionen von Leber und Pankreas
- Testikel-Atrophie und Spermien-Beweglichkeit
- Fertilitätstörungen
- Verbesserung der kommerziellen Zucht
- Rickettsien-Erkrankungen
- Thyreoparathyreoidektomie
- Diabetes mellitus
- Nebennierenstörungen
- Störungen des hämatopoetischen Systems
- Koagulationstörungen
- Blutungsstörungen
- Postkastrations-/Menopausen-Störungen
- ischämischen und toxischen Läsionen
- psychatrischen Störungen
- Bluthochdruck
- Störungen der Körpertemperatur
- Schmerz
- Tumor
verwendet.
Im allgemeinen können die beschriebenen Peptide auch für verschiedene pharmazeutische Zusammensetzungen in Kombination mit einem nicht- toxischen pharmazeutischen Träger oder Vehikel wie einem Füllstoff, einem nicht-toxischen Puffer, oder physiologischer Kochsalzlösung eingesetzt werden. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können lokal oder systemisch verwendet werden und können in jeder geeigneten Form, wie als Flüssigkeit, Feststoff, Halbfeststoff, injizierbare Lösung, Tablette, Salbe, Lotion, Kapsel, Lingualette oder ähnliches, vorliegen.
Diese Peptide werden im allgemeinen in einer Dosierung von 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;² mg/kg Körpergewicht verabreicht, wenn sie systemisch angewandt werden. Wenn sie topisch verabreicht werden, werden sie in einer höheren Konzentration, z.B. von 0,1% bis 0,5%, verwendet.
Die Abwesenheit jeglicher Anzeichen von Toxizität bis zu Dosen von 50 mg/kg Körpergewicht und auch die gute Aktivität der Verbindungen bei peroraler Verabreichung (intragastral) ist sehr vorteilhaft.
Die hier beschriebenen Peptide können unter Verwendung einer Schritt-für- Schritt-Kondensation geschützter Aminosäuren in einem homogenen flüssigen System oder vorzugsweise unter Verwendung des Festphasen-Verfahrens synthetisiert werden. Zur Herstellung cyclischer Peptide werden teilweise geschützte lineare Peptide gewünschter Länge mit einer Alkylester-Gruppe am C-Ende hergestellt, welche in ein Azid umgewandelt werden und nachfolgend gekuppelt und von der Schutzgruppe befreit werden. Alternativ können teilweise geschützte lineare Peptide mit freien Endgruppen mittels Diphenylphosphorylazid in sehr verdünnter Lösung cyclisiert werden.

Beispiel 1

Peptid-Synthese unter Verwendung der Boc-Strategie:

Die Peptid-Synthese wurde durchgeführt, beginnend mit 100 mg Boc-Val-PAM- Harz zur Erzeugung eines Carboxypeptids mit C-Ende (PAM, erworben von Applied Biosystems, Substitution 0,56 meq/g, ist ein Aminoacyl-4- (oxymethyl)phenylessigsäure-Derivat von Aminopolystyrol). Boc-Aminosäuren (Boc = tert.-Butoxycarbonyl-) wurden eine nach der anderen auf einem Polymerträger unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid (DIPC) als Kondensationsreagenz kondensiert. In jedem Schritt wurde die Boc-Gruppe mit einer 50%igen Trifluoressigsäure (TFA)-Lösung in Dichlormethan entfernt. Die Aminogruppe wurde anschließend mit Dusopropylethylamin deprotoniert.
Die Umwandlung in jedem Schritt sollte mehr als 99,5% betragen. Falls nicht, wurde die Kondensation wiederholt. Nach der vollständigen Synthese wurde die Spaltung unter Verwendung des niedrigen HF-Verfahrens (2 Stunden bei 0ºC) durchgeführt. Als Spülmittel für das Carboniumion wurde Anisol verwendet. HF wurde durch einen Strom von Stickstoff verdampft. Anschließend wurde das Rohpeptid durch Eingießen des öligen Rückstandes in trockenen Ether erhalten.
Danach wurde das Rohpeptid durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer 5 x 150 mm-Säule, welche mit Silikagel RP-18 gefüllt war, gereinigt, wobei eine Gradientenelution mit dem Lösungsmittelsystem: 01% TFA in Wasser/Acetonitril erfolgte. Nachweis: Ultraviolett-Absorption bei 225 nm. Die Synthese des Peptids Seq. Id. Nr.: 4 ist in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 2

Peptid-Synthese unter Verwendung der Fmoc-Strategie:

Standard-Fmoc-geschützte Aminosäuren wurden für die Synthese verwendet (Fmoc = 9-Fluorenylmethyloxy-Carbonyl-). Die Seitenkettenfunktionen wurden als O-tert-Butylester (Asp, Apm, Glu, Aad) und als Boc-Derivate (Lys) geschützt. Als erstes wurde die Aminosäure (Val) auf das polymere Träger-BHA-Harz (BHA = Benzhydrilaminoharz) unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid als Kupplungsreagenz gebunden. In jedem Schritt wurde die Fmoc-Schutzgruppe mit Piperidin entfernt. Danach wurden die zweite und sämtliche nächsten Aminosäuren unter Verwendung des gleichen Wegs bis zur Vervollständigung der Synthese eingeführt. Die Spaltung wurde mit einem Gemisch aus TFA/TFMSA/Anisol = 2 : 17 : 52 (Vol./Vol.) durchgeführt.
Danach wurde das Peptid unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen HPLC-Verfahrens gereinigt. Die Synthese des Peptids Seq. Id. Nr.: 2 ist in Fig. 2 veranschaulicht.

Beispiel 3

Peptid-Synthese unter Verwendung der Ddz-Strategie:

Sämtliche verwendeten Aminosäuren waren an ihrer α-Aminofunktion mittels Ddz (= α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl-) geschützt. Die Seitenfunktionen wurden durch die Z-Gruppe (= Benzyloxycarbonyl-) für Lysin und die O-t-Bu-Gruppe (t-Butylester) für Asparagin- und Glutaminsäure geschützt. Ein Merrifield-Träger (vernetztes chlormethyliertes Polystyrol-Gel) mit einer Kapazität von 1,4 mmol/g wurde für die Bindung der ersten Ddz-Aminosäure über deren Cäsiumsalz verwendet. Nach Kondensation mit Dicyclohexylcarbodimid (DCC) wurde die Ddz-Schutzgruppe in jedem Schritt mit 5% TFA in Dichlormethan entfernt, wobei anschließend mit 10% Triethylamin in Dichlormethan gewaschen und deprotoniert wurde. Nach der Deprotonierung wurde der nächste Kupplungsschritt unter Verwendung des gleichen Verfahrens vermittelt. Diese Kupplungsschritte wurden wiederholt, bis die Peptid-Sequenz vollständig war.
Schließlich wurde das Peptid vom polymeren Träger unter Verwendung eines Gemisches aus HBR/TFA/Anisol abgespalten. Nach Verdampfen des flüchtigen Teils wurde das gerade abgespaltene Peptid aus trockenem Ether ausgefällt und getrocknet. Das Rohpeptid wurde anschließend mittels des in Beispiel 1 beschriebenen HPLC-Verfahrens gereinigt.
Die Synthese des Peptids mit Seq. Id. Nr.: 6 ist in Fig. 3 angegeben.

Beispiel 4

Synthese eines cyclischen Peptids:

Ein Peptid in teilweise geschützter Form:
wurde zuvor gemäß dem in den Beispielen 1 oder 2 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Eine 0,0005-molare Lösung dieses Peptids in Dimethylformamid wurde nach Zugabe von Diphenylphosphorylazid und Triethylamin 12 Stunden bei 20ºC cyclisiert.
Danach wurde dieses Gemisch mit einem Wasserstoff/Palladium-Aktivkohle- Katalysator 8 Stunden bei 25ºC hydriert.
Das Lösungsmittel wurde vorsichtig eingedampft und das Rohprodukt wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen HPLC-Verfahrens gereinigt.
Ein cyclisches Peptid mit Seq. Id. Nr.: 10
wurde in einer Ausbeute von 10% erhalten.

Synthese linearer und cyclischer Peptide unter Verwendung der Ddz-Strategie:

Es wurde die gleiche Strategie mit den Ddz-Schutzgruppen zum Erhalt linearer und cyclischer Peptide verwendet. Die Seitenfunktionen wurden mit der Z- Gruppe (Lysin) und mit O-Benzylestergruppen - OBzl - (Glutamin- und Asparaginsäure) geschützt. Der polymere Träger bestand aus HYCRAM -Harz (Markenname von ORPEGEN, Heidelberg, Deutschland), welches ein 4- Bromcrotonyl-β-alanylamidomethyl-Polystyrol ist. Die erste Aminosäure (Ddz- Valin) wurde auf dem Polymerträger über deren Cäsiumsalz gebunden.
Dann wurde die Ddz-Gruppe unter Verwendung von Trifluoressigsäure (5%) in Dichlormethan entfernt und die Aminogruppe wurde mit Dusopropylethylamin deprotoniert. Im nächsten Schritt wurde Ddz-Glycin mit dem Valinrest in der Polymermatrix unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid (DIPC) in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol gekuppelt.
Dies Schritte wurden wiederholt, bis die Peptidkette vollständig war. Das synthetisierte Peptid in geschützter Form wurde danach vorsichtig vom HYCRAM -Träger mit Tetrakis(triphenylphosphino)palladium (O) abgespalten und in wasserfreiem Tetrahydrofuran in Abwesenheit von Sauerstoff aufgelöst. Für die Allylgruppen wurde ein Additiv, wie Morpholin, als Akzeptormolekül verwendet.
Der polymere Träger wurde abfiltriert und mit Tetrahydrofuran gewaschen. Die Peptidlösung wurde anschließend über eine kurze Silikagel-Säule zur Entfernung des Palladium-Katalysators filtriert.
Das Eluat, welches das teilweise geschützte Peptid 4a. enthielt, wurde nach Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum getrocknet.

Synthese des linearen Peptids mit Seq. 4

Das teilweise geschützte Peptid 4a. wurde in 2,2,2-Trifluorethanol gelöst und in Gegenwart von Palladium auf Aktivkohle (10%) mit Wasserstoffgas bei 30ºC hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und und das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingedampft. Der Roh-Rückstand wurde dann unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen HPLC-Verfahrens gereinigt. Nach der Reinigung wurde das Peptid mit Seq. Id. Nr.: 4 erhalten. Das Produkt war identisch mit der in Beispiel 1 erhaltenen Verbindung.

Synthese des cyclischen Peptids mit Seq. Id. Nr.: 9

Das partiell geschützte Peptid 4a. wurde in Dimethylformamid/Dichlormethan (1:1) gelöst, wobei sich eine 0,001-molare Lösung bildete. Für die Cyclisierung wurden DIPC und HOBt zugegeben und 10 Stunden bei 20ºC stehengelassen. Danach wurde die Lösung auf ein kleines Volumen konzentriert, mit 2,2,2,- Trifluorethanol verdünnt und über eine mit Sephadex LH-20 gefüllte Säule geleitet und gereinigt. Die das partiell geschützte cyclische Peptid 9a enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und mit dem Katalysator Palladium auf Aktivkohle (10%) bei 30ºC durch Einleiten von Wasserstoff und intensives Schütteln 8 Stunden hydriert.
Dann wurde der Katalysator durch Filtration entfernt und die Lösung wurde durch Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum getrocknet. Das Rohpeptid wurde zusätzlich mittels HPLC unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens gereinigt. Das erhaltene cyclische Peptid wurde als Peptid mit Seq. Id. Nr.: 9 bestimmt.
Die Synthese auf einem HYCRAM -Polymerträger unter Verwendung der Ddz- Strategie und Cyclisierung ist in Fig. 4 und 5 angegeben. Sämtliche synthetisierten Peptide wurden bezüglich ihrer Reinheit mittels des HPLC- Verfahrens unter Verwendung einer Silikagel-Säule RP-18 (Octadecyl-siliert) überprüft, wobei mit einem Gemisch aus Lösungsmitteln, bestehend aus Wasser/Acetonitril/Trifluoressigsäure, auf übliche Weise eine Gradientenelution durchgeführt wurde. In sämtlichen Fällen war die Reinheit höher als 95%.
Die Peptide wurde mittels einer Aminosäure-Analyse (die Werte lagen innerhalb 10% der Theorie), Sequenz-Analyse, Massen-FAB-Spektrometrie für die Bestimmung des Molekulargewichts, Ultraviolett- und Infrarot-Spektren (Fig. 6 und 7) charakterisiert.

Claims

1. Verwendung biologisch hochaktiver Peptide umfassend 8 bis 15 Aminosäurereste mit der allgemeinen Formel:

in der:

Xaa einen neutralen, aliphatischen Aminosäurereste wie:

Ala, bala, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva

Yaa einen basischen Aminosäurerest wie:

Lys, Arg, Orn, His

Zaa einen sauren Aminosäurerest wie:

Glu, Asp, Aad oder Apm bedeutet;

und in der wenigstens einer der Reste Xaa oder Zaa fehlen kann, und/oder eines der Peptide mit den Seq.Id.Nr.1 bis 11 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Störungen und Schädigungen der Leber, Nieren und Pankreas, Atrophie der Hoden und Bewegungsfähigkeit des Sperma, Fruchtbarkeitsstörungen, Verbesserung in der kommerziellen Züchtung, Rickettsie, Schilddrüsen/Nebenschilddrüsenentfernung, Diabetes mellitus, Störungen der Nebenniere, Störungen des hämopoetischen Systems, Gerinnungsstörungen, Blutungsstörungen, Störungen nach der Kastrierung und der Menopause, ischämische und toxische Schädigungen, psychiatrische Störungen, Bluthochdruck, Körpertemperaturstörungen, Schmerzen oder Tumor.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Peptid mittels einer Amidbindung zwischen dem ersten und dem letzten Aminosäurerest zyklisiert ist.