DE69012901T2

DE69012901T2 - Hämoregulierende Peptide.

Info

Publication number: DE69012901T2
Application number: DE69012901T
Authority: DE
Inventors: Pradip Kumar Bhatnagar; William Francis Huffman; James Edward Talmadge
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1989-07-14
Filing date: 1990-07-12
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2010-07-13
Also published as: PT94702B; NO177713C; AU638468B2; JPH0356498A; ATE112289T1; HU904201D0; NO903148L; PL286043A1; KR910002899A; PT94702A; AU5901490A; HU206889B; EP0408371A1; MA21902A1; MX21581A; NZ234501A; NO903148D0; IL95012A0; JP2638666B2; FI903571A0

Description

Umfang der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptide, die blutregulatorische Aktivitäten aufweisen und die zur Stimulierung der Blutbildung und zur Behandlung von durch Viren, Pilze und Bakterien verursachte Infektionskrankheiten verwendet werden können.

Hintergrund der Erfindung

Eine Vielzahl von regulatorischen Boten- und modifizierenden Stoffen, wie Kolonie-stimulierende Faktoren und Interferone, und verschiedene Arten von Peptiden sind für die Regulierung der Knochenmarkbildung verantwortlich. Metcalf, Cell 43 (1985), 5; Baserga R., Foa P., Metcalf D., Polli E.E. (Hrsg.), Biological Regulation of Cell Proliferation (1986); Nicola et al., J. Cell Physiol. 128 (1986), 501; Zoumbos et al. Proyr. Hemat. 1 (1986), Seite 341 und 14, Seite 201 und Werner et al., Experientia 42 (1986), 521. Vor zwanzig Jahren berichteten Rytomaa und Kivieniemi in Cell Tissue Kinet. 1 (1968), 329-340 und Rytomaa et al. in Control of Cellular Growth in Adult Organisms (1967), 106-138, daß Extrakte von reifen Granulocyten (granulocytisches Chalon) besonders die Zellvermehrung bei der Knochenmarkbildung der Ratte in Deckglaskulturen hemmen konnten. Später zeigten sie, daß der Faktor, der ein Molekulargewicht von weniger als 3000 Daltons aufwies, die Rückbildung einer transplantierbaren granulocytischen Leukämie der Ratte induzieren sowie das Wachstum von Leukämiezellen bei Menschen hemmen konnte. Paukovits und andere extrahierten einen ähnlichen Faktor aus Knochenmarkzellen der Ratte und zeigten, daß er die Aufnahme von Tritium-markiertem Thymidin durch Knochenmarkzellen hemmt; Paukovits W.R., Cell Tissue Kinet. 4 (1971), 539-547 und Naturforsch. 37 (1982), 1297. Im Jahr 1979 zeigten Boll et al. in Acta Haematologica 6 (1979), 130, die hemmenden Wirkungen der granulocytischen Extrakte der Ratte auf menschliche Knochenmarkzellen in Kultur; und eine Anzahl anderer Forscher zeigten, daß dieser rohe granulocytische Extrakt in vitro die Entwicklung von g-CFUC und/oder gm-CFUC in Knochenmarkzellen von Nagetieren hemmte.
Dieses biologische Mittel wurde als granulocytisches Chalon bezeichnet, das, gemäß diesem theoretischen Konzept, ein endogener Hemmstoff der Zellvermehrung sein sollte, der in dem gleichen Gewebe wirksam ist, in dem er sezerniert wurde. Es wurde festgestellt, daß das von den Rohextrakten erhaltene Material nicht artspezifisch, aber höchst gewebespezifisch ist. Weiter wurde festgestellt, daß es nicht-toxisch ist und reversible Aktivitäten aufweist.
Im Jahr 1982 wurde von einem synthetischen blutregulatorischen Pentapeptid mit der folgenden Struktur:
pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys
berichtet, das eine selektive hemmende Wirkung auf Knochenmarkzellen sowohl in vitro als auch in vivo aufweist, wobei die Hauptwirkung bei Stammzellen der Knochenmarkbildung (CFU-gm) zu liegen scheint; Paukovits et al., Z. Naturforsch. 37 (1982), 1297 und US-Patent 4,499,081. Von diesem Peptid nimmt man an, daß es ein Analog eines natürlich vorkommenden Hemmfaktors der Granulocytenbildung ist, der in winzigen Mengen in Knochenmarkextrakten gefunden wurde. Das Peptid verhindert durch Hemmung der Blutbildung und besonders der Granulocytenbildung, daß ruhende Zellen in die Zellteilung eintreten und so für den Angriff durch cytotoxische Krebsmedikamente empfindlich werden. Um eine Schutzfunktion bei einer Therapie unter Verwendung cytotoxischer Medikamente bereitzustellen, können die Peptide auch dazu verwendet werden, die Vermehrung der Krebszellen zu hemmen, die mit dem System der Knochenmarkbildung verwandt sind, d.h. Knochenmarkleukämie.
Im Jahr 1987 berichtete Laerum et al., daß das Oxidationsprodukt dieses Proteins ein Dimer (HP-5) war, das durch Disulfidbrückenbildung erzeugt wurde. Dieses Dimer weist die entgegensetzte Wirkung wie das Monomer auf, da es in vitro stark die Koloniebildung von CFU-gm-Zellen des Menschen und der Maus stimuliert und in vivo die Vermehrung von Zellen der Knochenmarkbildung der Maus steuert. Dies wird in der Europäischen Anmeldung EP-A-0267741 beansprucht.
Von dem Dimer wird berichtet, daß es zur Stimulierung der Knochenmarkbildung bei Patienten nützlich ist, die an einer verminderten Aktivität der Knochenmarkbildung leiden, einschließlich Knochenmarkschädigung, Agranulocytose und aplastische Anämie, einschließlich Patienten mit geschwächter Knochenmarkfunktion aufgrund immunsuppressiver Behandlung, um Gewebereaktionen zu unterdrücken, d.h. in der Knochenmarktransplantationschirugie. Die Verbindungen können auch dazu verwendet werden eine noch schnellere Regeneration des Knochenmarks nach einer cytostatischen Chemo- und Strahlungstherapie von neoplastischen und durch Viren verursachte Erkrankungen zu fördern. Sie können besonders wertvoll bei Patienten sein, die ernste Infektionen aufgrund einer mangelnden Immunantwort nach einer Knochenmarkinsuffizienz aufweisen.
Die Anwesenheit der Disulfidbrücke im HP-5-Dimer führt zu dem Schluß, daß das Monomer in vivo ein möglicher Metabolit ist. Da das Monomer die Blutbildung hemmt, ist die Stabilität des HP-5-Dimers kritisch, wenn es in vivo zur Stimulierung der Knochenmarkbildung verwendet wird. Die Identifizierung eines stabilen Dimers würde dieses potentielle Problem beseitigen.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung umfaßt Peptide, wie nachstehend in Formel (I) dargestellt, die blutregulatorische Aktivitäten aufweisen und die zur Stimulierung der Blutbildung verwendet werden können, sowie zur Behandlung von durch Bakterien, Viren und Pilze verursachte Krankheiten. Diese Peptide sind bei der Wiederherstellung der Leucocytenzahl bei Patienten mit erniedrigten Zellzahlen nützlich, die die Folge einer Vielzahl klinischer Zustände sind, wie einer operativ verursachten Suppression des Knochenmarks, AIDS, angeborene Myelodysplasie, Knochenmark- und Organtransplantation; beim Schutz von Patienten mit Leukopenie vor einer Infektion; bei der Behandlung von schwer verbrannten Patienten und bei der Verbesserung, der mit einigen Zellzyklus-spezifischen antiviralen Mitteln beobachteten Suppression des Knochenmarks. Die Peptide sind auch bei der Behandlung von durch Viren, Pilze und Bakterien verursachte Infektionskrankheiten nützlich, besonders Candida und Herpes in immunsupprimierten und "normalen" Patienten.
Diese Verbindungen können auch in Kombination mit den Monomeren des US-Patents 4,499,081 verwendet werden, um abwechselnd Peaks hoher und niedriger Aktivität in den Knochenmarkzellen zu schaffen und auf diese Weise den natürlichen circadischen Rhythmus der Blutbildung zu erhöhen. Auf diese Weise kann eine cytostatische Therapie in Zeiträumen niedriger Knochenmarkaktivität durchgeführt werden und so das Risiko einer Schädigung des Knochenmarks reduziert werden, während die Regeneration durch den nachfolgenden Aktivitätspeak gefördert wird.
Diese Erfindung ist ebenfalls ein Arzneimittel, das eine Verbindung der Formel (I) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einem Verfahren zur Stimulierung des Systems zur Knochenmarkbildung eines Tieres, einschließlich des Menschen, verwendet werden, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I) an ein Tier umfaßt, das es benötigt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einem Verfahren zur Behandlung von durch Viren, Pilze und Bakterien verursachte Infektionen in immunsupprimierten und normalen Tieren, einschließlich des Menschen, verwendet werden, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I) an ein Tier umfaßt, das es benötigt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Peptide werden durch die Formel (I) veranschaulicht:
in der:
Y&sub1; und Y&sub2; unabhängig voneinander eine CH&sub2;-Gruppe oder ein Schwefelatom bedeuten,
x den Wert 0, 1, 2, 3 oder 4 hat,
m den Wert 0, 1 oder 2 hat,
n den Wert 0, 1 oder 2 hat,
A Pyroglutaminsäure, Prolin, Glutamin, Tyrosin oder Glutaminsäure bedeutet,
B Glutaminsäure, Tyrosin oder Asparaginsäure darstellt,
C Glutaminsäure, Tyrosin oder Asparaginsäure bedeutet,
D Lysin, Arginin, Tyrosin, N-Methylarginin, Diaminohexinsäure oder das Carboxyamid oder das Hydroxymethylderivat davon darstellt,
E Glutaminsäure, Asparaginsäure, Tyrosin oder eine Peptidbindung bedeutet,
mit der Maßgabe daß:
wenn Y&sub1; und Y&sub2; Schwefelatome sind, x den Wert 2, 3 oder 4 und m und n den Wert 1 haben; oder
wenn Y&sub1; und Y&sub2; CH&sub2;-Gruppen sind, x den Wert 0, 1 oder 2 und m und n den Wert 0 haben; oder
wenn Y&sub1; ein Schwefelatom und Y&sub2; eine CH&sub2;-Gruppe ist, x den Wert 0 und n den Wert 1 hat; oder
wenn Y&sub2; ein Schwefelatom und Y&sub1; eine CH&sub2;-Gruppe ist, x den Wert 0 und in den Wert 1 hat;
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
In dieser Erfindung sind auch pharmazeutisch verträgliche Salzkomplexe der erfindungsgemäßen Verbindungen eingeschlossen.
Zu Formel (I) sollte angemerkt werden, daß A die terminale Aminogruppe des Aminosäurerests umfaßt, der Pyroglutaminsäure, Prolin, Glutamin, Tyrosin oder Glutaminsäure entspricht. Ähnlich umfaßt D die terminale Carboxylgruppe des Aminosäurerests, der Lysin, Arginin, Tyrosin, N-Methylarginin, Diaminohexinsäure oder dem Carboxamid oder dem Hydroxymethylderivat davon entspricht.
Die Abkürzungen und Symbole, die üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendet werden, werden hier verwendet, um die Peptide zu beschreiben:
pGlu = Pyroglutaminsäure
Pro = Prolin
Gln = Glutamin
Glu = Glutaminsäure
Asp = Asparaginsäure
Lys = Lysin
Arg = Arginin
Cys = Cystein
Tyr = Tyrosin
Sub = Diaminosuberinsäure
Hna = Diaminohexinsäure
Pim = Diaminopimelinsäure
Adp = Diaminoadipinsäure
In Übereinstimmung mit der üblichen Darstellung ist das Aminoende links und das Carboxyende rechts. Alle chiralen Aminosäuren können in der absoluten D- oder L-Konfiguration vorliegen.
Das Aminoende kann durch Acylierung geschützt werden.
Beispiele solcher Schutzgruppen sind die t-Butoxycarbonyl(t-Boc)-, CH&sub3;CO- und Ar-CO(Ar = Benzylgruppe)- Gruppe. Das C-Ende kann, wie bei der natürlichen Aminosäure, eine Carboxy- oder die Carboxyamid-
oder Hydroxymethylgruppe (-CH&sub2;-OH) sein.
Bevorzugte Verbindungen sind jene, in denen Y&sub1; und Y&sub2; CH&sub2;-Gruppen sind und x den Wert 1 oder 2 hat, oder wobei A pGlu, B Glu, C Asp, D Lys und E eine Peptidbindung darstellen und die chiralen Aminosäuren in der absoluten L-Konfiguration vorliegen.
Besonders bevorzugte Verbindungen sind
Die erfindungsgemäßen Verbindungen unterscheiden sich von Verbindungen, die dem Stand der Technik entsprechen, dadurch, daß das Dimer durch eine Brücke verknüpft ist, die im Gegensatz zu einer Disulfidbrücke, eine Kohlenstoff- Kohlenstoff-Bindung enthält. Die Kohlenstoff-Kohlenstoff- Bindung ist in vivo nicht einfach zu spalten und deshalb in vivo stabiler als die Verbindungen der Europäischen Anmeldung EP-A-0267741.
Die erfindungsgemäßen Peptide werden durch das Festphasen-Verfahren von Merrifield hergestellt, J. Am. Chem. Soc. 85 (1964), 2149; oder es können erfolgreich auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren in Lösung angewendet werden. Die Verfahren der Peptidsynthese, allgemein erläutert bei J. M. Stewart und J. D. Young in "Solid Phase Peptide Synthesis", Pierce Chemical Company, Rockford, I1 (1984) oder bei M. Bodansky, Y. A. Klauser und M. A. Ondetti in "Peptide Synthesis", John Wiley & Söhne, Inc., New York, N.Y. (1976), können zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide verwendet werden und sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Jede Aminosäure oder jedes Peptid wird geeignet geschützt, wie auf dem Peptidfachgebiet bekannt ist. Zum Beispiel werden der Fluorenylmethoxycarbonylrest (Fmoc) oder die t-Butoxycarbonylgruppe (t-Boc) zum Schutz der Aminogruppe bevorzugt, besonders an der α-Position. Ein geeignet substituierter Carbobenzyloxyrest kann jeweils für die &epsi;-Aminogruppe des Lysins und eine Benzylgruppe für die β- und γ-Carboxygruppen von Asp und Glu verwendet werden. Eine geeignete Substitution der Carbobenzyloxy-Schutzgruppe ist eine ortho- und/oder para-Substitution mit Chlor-, Brom-, Nitro- oder Methylgruppen und wird zur Modifizierung der Reaktivität der Schutzgruppe verwendet. Außer der t-Boc-Gruppe sind die Schutzgruppen üblicherweise solche, die nicht in einfacher Weise durch milde Säurebehandlung entfernt werden. Diese Schutzgruppen werden durch Verfahren, wie katalytische Hydrierung, Natrium in flüssigem Ammoniak oder HF-Behandlung, entfernt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Werden Festphasen-Verfahren angewendet, wird das Peptid aufeinanderfolgend beginnend vom Carboxyende und auf das Aminoende des Peptids zu aufgebaut. Die Festphasen-Synthese beginnt durch kovalente Anheftung des C-Endes einer geschützten Aminosäure an ein geeignetes Harz, wie ein Benzhydrylaminharz (BHA), Methylbenzhydrylaminharz (MBHA) oder Chlormethylharz (CMR), wie allgemein in dem US-Patent 4,244,946 erläutert wird, oder Phenylacetamidomethylharz (PAM). Ein BHA- oder MBHA-Trägerharz wird verwendet, wenn das Carboxyende des Peptidprodukts eine Carboxamidgruppe sein soll. Ein CMR- oder PAM-Harz wird im allgemeinen verwendet, wenn das Carboxyende des Peptidprodukts eine Carboxygruppe sein soll; diese Harze können auch dazu verwendet werden, ein Carboxamid oder einen Ester herzustellen.
Die Schutzgruppe an der α-Aminogruppe wird durch milde Säurebehandlung (d.h. Trifluoressigsäure) entfernt. Für Verbindungen, in denen Y&sub1; und/oder Y&sub2; CH&sub2;-Gruppen anstelle von Schwefelatomen darstellen, wird ein Di-Boc (Diaminodicarbonsäure) an zwei der Aminosäuren des Harzes unter Verwendung eines geeigneten Kupplungsmittels gekuppelt. Alle freien Carboxylgruppen werden mit geeignet geschützten Derivaten von D amidiert.
Geeignete Cyclen der Entfernung der Schutzgruppen, Neutralisation und Kupplung, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, werden dazu verwendet, die Aminosäuren aufeinanderfolgend ohne Isolierung der Zwischenprodukte hinzufügen, bis das gewünschte Peptid erzeugt wurde. Das fertiggestellte Peptid kann dann in beliebiger Reihenfolge von Schutzgruppen befreit und/oder vom Trägerharz abgespalten werden.
Die Behandlung eines Harz-getragenen Peptids mit HF oder HBr/Essigsäure spaltet das Peptid von dem Harz ab und stellt die Carboxy-terminale Aminosäure als eine Carbonsäure bereit.
Wenn ein Ester gewünscht wird, kann das CMR- oder PAM-Harz mit einem geeigneten Alkohol, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- Butyl- oder Benzylalkohol, in Gegenwart von Triethylamin behandelt werden, um das Peptid vom Harz abzuspalten und den Ester direkt herzustellen.
Die Ester der erfindungsgemäßen Peptide können auch durch herkömmliche Verfahren aus den Carbonsäurevorläufern hergestellt werden. Üblicherweise wird die Carbonsäure mit einem Alkohol in Gegenwart eines Säurekatalysators behandelt. In einer anderen Ausführungsform kann die Carbonsäure in ein aktiviertes Acylzwischenprodukt, wie ein Säurehalogenid, umgewandelt und mit einem Alkohol behandelt werden, vorzugsweise in Gegenwart einer Base.
Das bevorzugte Verfahren zur Abspaltung eines Peptids vom Trägerharz ist die Behandlung des Harz-getragenen Peptids mit wasserfreier HF in Gegenwart eines geeigneten Kationenfängers, wie Anisol oder Dimethoxybenzol. Dieses Verfahren entfernt gleichzeitig alle Schutzgruppen, außer einem Thioalkylrest, der das Schwefelatom schützt, und spaltet das Peptid vom Harz ab. Peptide, die auf diese Weise von den CMR- und PAM-Harzen hydrolysiert werden, sind Carbonsäuren; die vom BHA-Harz abgespaltenen Peptide werden als Carboxamide erhalten.
Die Modifizierung der terminalen Aminogruppe des Peptids erfolgt, wie allgemein auf dem Fachgebiet bekannt ist, durch Alkylierung oder Acylierung. Diese Modifizierungen können an der Aminosäure vor Einführung in das Peptid durchgeführt werden, oder am Peptid, nachdem es synthetisiert und die terminale Aminogruppe freigelegt wurde, aber bevor die Schutzgruppen entfernt wurden.
Üblicherweise wird die Acylierung an der freien Aminogruppe unter Verwendung des Acylhalogenids, Anhydrids oder des aktivierten Esters der entsprechenden Alkyl- oder Arylsäure in Gegenwart eines tertiären Amins durchgeführt. Mono-Alkylierung wird in der einfachsten Weise durch reduktive Alkylierung der Aminogruppe mit einem geeigneten aliphatischen Aldehyd oder Keton in Gegenwart eines milden Reduktionsmittels durchgeführt, wie Lithium- oder Natriumcyanoborhydrid. Dialkylierung kann durch Behandlung der Aminogruppe mit einem Überschuß eines Alkylhalogenids in Gegenwart einer Base durchgeführt werden.
Die Synthese von Peptiden in Lösung wird unter Anwendung herkömmlicher Verfahren durchgeführt, um Amidbindungen zu erzeugen. Üblicherweise wird eine geschützte t-Boc-Aminosäure, die eine freie Carboxylgruppe aufweist, unter Verwendung eines geeigneten Kupplungsmittels, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), an eine geschützte Aminosäure gekuppelt, die eine freie Aminogruppe aufweist, gegebenenfalls in Gegenwart von Katalysatoren, wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) oder Dimethylaminopyridin (DMAP). Andere Verfahren sind ebenfalls geeignet, wie die Erzeugung aktivierter Ester, Anhydride oder Säurehalogenide, und anschließende Umsetzung mit dem freien Amin einer geschützten Aminosäure, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base. Zum Beispiel wird eine geschützte Boc-Aminosäure oder -Peptid in einem wasserfreien Lösungsmittel, wie Methylenchlorid oder Tetrahydrofuran, in Gegenwart einer Base, wie N-Methylmorpholin, DMAP (Dimethylaminopyridin) oder einem Trialkylamin, mit Isobutylchlorformat behandelt, um das "aktivierte Anhydrid" zu erzeugen, das anschließend mit dem freien Amin einer anderen geschützten Aminosäure oder Peptid umgesetzt wird. Die Schutzgruppen des durch dieses Verfahren erzeugten Peptids, können selektiv unter Verwendung herkömmlicher Techniken am Amino- oder Carboxyende entfernt werden und das Peptid kann an andere Peptide oder Aminosäuren unter Verwendung ähnlicher Techniken gekuppelt werden. Nachdem das Peptid fertiggestellt ist, können die Schutzgruppen wie vorstehend beschrieben entfernt werden, wie durch Hydrierung in Gegenwart eines Palladium- oder Platinkatalysators, Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak, Fluorwasserstoffsäure oder einem Alkali.
Enthält das fertige Peptid, nachdem die Schutzgruppen abgelöst wurden, eine basische Gruppe, kann ein Säureadditionssalz hergestellt werden. Säureadditionssalze der Peptide werden in üblicher Weise in einem geeigneten Lösungsmittel aus der Ausgangsverbindung und einem Überschuß einer Säure hergestellt, wie Salz-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Malein-, Bernstein- oder Methansulfonsäure. Die Acetatsalzform ist besonders nützlich. Enthält das fertige Peptid eine saure Gruppe, können kationische Salze hergestellt werden. Üblicherweise wird die Ausgangsverbindung mit einem Überschuß eines alkalischen Reagens behandelt, wie ein Hydroxid, Carbonat oder Alkoxid, das das geeignete Kation enthält. Kationen, wie Na&spplus;, K&spplus;, Ca&spplus;&spplus; und NH&sub4;&spplus;, sind Beispiele für Kationen in pharmazeutisch verträglichen Salzen. Na&spplus; und NH&sub4;&spplus; werden besonders bevorzugt.
Um eine stimulierende Wirkung zu erzielen, können die erfindungsgemäßen Peptide im allgemeinen menschlichen Patienten im Dosisbereich von 0,1 bis 10 mg durch Injektion oder oral verabreicht werden, zum Beispiel 1 bis 5 mg pro 70 kg Körpergewicht pro Tag; erfolgt die Verabreichung durch Infusion oder ähnliche Techniken kann die Dosis im Bereich von 30 bis 300 mg pro 70 kg Körpergewicht liegen, zum Beispiel etwa 100 mg über sechs Tage. Im Prinzip ist es wünschenswert eine Konzentration des Peptids in der extrazellulären Flüssigkeit des Patienten von etwa 10&supmin;¹³M bis 10&supmin;&sup5;M herzustellen.
Gemäß einem noch weiteren erfindungsgemäßen Aspekt werden Arzneimittel bereitgestellt, die als aktiven Bestandteil eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I), wie vorstehend definiert, umfassen oder physiologisch verträgliche Salze davon, in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger oder Excipienten. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können zum Beispiel in einer Form dargestellt werden, die für die orale, nasale, parenterale oder rektale Verabreichung geeignet ist.
Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch" schließt die erfindungsgemäßen tierärztlichen Anwendungen ein.
Diese Peptide können eingekapselt, tablettiert oder in einer Emulsion oder Sirup zur oralen Verabreichung hergestellt werden. Pharmazeutisch verträgliche feste oder flüssige Träger können zugesetzt werden, um die Zusammensetzung zu verstärken oder zu stabilisieren oder um die Herstellung der Zusammensetzung zu erleichtern. Flüssige Träger schließen Sirup, Erdnußöl, Olivenöl, Glycerin, Kochsalzlösung und Wasser ein. Feste Träger schließen Stärke, Lactose, Calciumsulfatdihydrat, Porzellanerde, Magnesiumstearat oder Stearinsäure, Talkum, Pektin, Gummi arabicum, Agar oder Gelatine ein. Der Träger kann auch ein langzeitwirkendes Material einschließen, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder mit einem Wachs. Die Menge des festen Trägers variiert, liegt aber vorzugsweise zwischen etwa 20 mg bis etwa 1 g pro Dosierungseinheit. Die Arzneimittel werden mit den üblichen Techniken der Pharmazie hergestellt, einschließlich Mahlen, Mischen, Granulieren und Verpressen, wenn notwendig, für Tablettenformen; oder Mahlen, Mischen und Füllen für Hartgelatinekapselformen. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, wird das Präparat in Form eines Sirups, Elixirs, einer Emulsion oder einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Suspension vorliegen. Eine solche flüssige Formulierung kann direkt per os verabreicht oder in eine Weichgelatinekapsel gefüllt werden. Organspezifische Trägersysteme können ebenfalls verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform können Arzneimittel der erfindungsgemäßen Peptide oder Derivaten davon zur parenteralen Verabreichung als Lösungen oder gefriergetrocknete Puder formuliert werden. Puder können vor der Verwendung durch Zugabe eines geeigneten Verdünnungsmittels oder eines anderen pharmazeutisch verträglichen Trägers zubereitet werden. Die flüssige Formulierung ist im allgemeinen eine gepufferte isotonische wäßrige Lösung. Beispiele geeigneter Verdünnungsmittel sind normale isotonische Kochsalzlösung, 5%ige Standarddextroselösung in Wasser oder gepufferte Natrium- oder Ammoniumacetatlösung. Eine solche Formulierung ist besonders zur parenteralen Verabreichung geeignet, kann aber auch zur oralen Verabreichung verwendet werden oder in einem auf eine bestimmte Dosis einstellbaren Inhalator oder Zerstäuber zur Einblasung enthalten sein. Es kann wünschenswert sein, Excipienten zuzugeben, wie Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Hydroxycellulose, Gummi arabicum, Polyethylenglycol, Mannit, Natriumchlorid oder Natriumcitrat.
Für die rektale Verabreichung kann ein pulverisiertes Puder der erfindungsgemäßen Peptide mit Excipienten kombiniert werden, wie Kakaobutter, Glycerin, Gelatine oder Polyethylenglycole, und in ein Zäpfchen gepreßt werden. Die pulverisierten Puder können auch mit einem öligen Präparat, einem Gel, einer Creme oder Emulsion, gepuffert oder nicht gepuffert, verbunden und über ein percutanes Läppchen verabreicht werden.
Nasensprays können ähnlich in einer wäßrigen Lösung formuliert und in Spraybehälter verpackt werden, entweder mit einem Aerosol-Treibgas oder ausgestattet mit Mitteln zur manuellen Kompression. Kapseln mit einem oder mehreren aktiven Bestandteilen können hergestellt werden, zum Beispiel durch Mischen der aktiven Bestandteile mit inerten Trägern, wie Lactose oder Sorbit, und Abfüllen des Gemisches in Gelatinekapseln.
Dosierungseinheiten mit den erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten vorzugsweise 0,1 bis 10 mg, zum Beispiel 1 bis 5 mg des Peptids der Formel (I) oder ein Salz davon.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Stimulierung des Systems der Knochenmarkbildung bereitgestellt, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Arzneimittels, wie vorstehend definiert, an einen Patienten umfaßt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von durch Viren, Pilze und Bakterien verursachte Infektionen bei immunsupprimierten und normalen Tieren bereit, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Arzneimittels, wie vorstehend definiert, an ein Tier, das es benötigt.
Die biologische Aktivität der Verbindungen der Formel (I) werden durch den folgenden Test gezeigt.

Induktion der Kolonie-Stimulierungsaktivität durch Stroma- Zellen

Die menschliche Stroma-Knochenmarkzellinie C6 wird bis zur Konfluenz in Plastikgewebekulturschalen in RPMI-1640- Medium und 5% FBS gezüchtet. Einen Tag vor dem Experiment wird dieses Medium gegen DMEM ohne zugesetztem Serum ausgetauscht. Zu diesen Kulturen werden die Verbindungen für eine Stunde zugegeben und dann aus den Kulturen gewaschen. Das Medium wird durch frisches DMEM ersetzt und die Zellen werden 24 Stunden bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Nach 24 Stunden wird der Kulturüberstand der C6-Zellen gewonnen, steril filtriert und eingefroren, bis er auf das Vorhandensein der blutbildenden Kolonie-Stimulierungsaktivität (CSA) geprüft werden kann, wie nachstehend erläutert.

Weichagartest

Knochenmarkzellen werden aus Lewis-Ratten gewonnen. Sie werden auf 10&sup6; Zellen/ml in DMEM ohne Serum eingestellt. Ein Einzelschicht-Agarsystem wird unter Verwendung folgender Bestandteile verwendet: DMEM angereichert mit Nährstoffen (NaHCO&sub3;, Pyruvat, Aminosäuren, Vitamine und HEPES-Puffer), 0,3%igem Bacto-Agar und 20%igem Lewis-Rattenserum. Zu diesem wurden Verdünnungen des vorstehenden Überstandes der C6- Zellinie (10 bis 2,5%) zusammen mit Knochenmarkzellen der Ratte gegeben (Endkonzentration = 10&sup5; Zellen/ml). Die Agarplatten werden 7 bis 8 Tage bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Kolonien der proliferierenden Knochenmarkzellen (CFU-C) werden unter Verwendung eines Mikroskops gezählt. Die Anzahl der gezählten Agarkolonien ist proportional zu der Menge von CSA, die im Überstand der stromalen Knochenmarkzellinie C6 vorhanden ist. Tabelle 1 Blutbildende Kolonie-Stimulierungsaktivität unter Verwendung von 5%igem Überstand Dosis ng/ml Prozent der Kontrolle (pGlu-Glu-Asp)&sub2;-Sub-(Lys)&sub2; (Beispiel 2)

Herpes-Simplex-Maus-Modell

Sieben Tage vor der Infektion werden Balb/c-Mäuse einmal am Tag intraperitoneal mit einem Volumen von 0,2 ml bei Dosen von 10 und 1 ng/kg der Verbindung gespritzt. Kontrollmäuse erhalten Injektionen von 0,2 ml eines Gemisches des Verdünnungspuffers, DPBS und 0,5%igem Hitze-inaktiviertem normalen Mausserum.
Die Mäuse werden mit einem Herpes-Simplex-Virus (Stamm MS) durch Injektion von 5,0 x 10&sup5;/pfu, suspendiert in 0,05 ml PBS, in jeden Hinterfußballen infiziert. Die Mäuse erhalten bis sie im Sterben liegen (unfähig Futter oder Wasser aufzunehmen) weiter Injektionen der Verbindung oder der Kontrolle. Die gewöhnlich auftretende Lähmung des Hinterbeins tritt etwa acht Tage nach der Infektion auf. Die Lähmung schreitet fort, bis Encephalitis auftritt.
In einer anderen Ausführungsform wird das Virus über die Vagina überimpft. Ein Wattebausch mit 5,0 x 10&sup5;/pfu des MS-NAP-Stamms wird in die Vagina der Maus eingeführt.
Mit einem Wilcoxin-Test wird bestimmt, ob eine signifikante Erhöhung der Überlebensdauer in der behandelten Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe festzustellen ist.

Candida-Exposition

Der Candida albicans-Stamm B311a wird verwendet. Dieser Stamm wurde über Mäuse passagiert und dann bei -70ºC eingefroren. B311a ist im Bereich von 5,0 bis 8,0 x 10&sup4; cfu/Maus für immunsupprimierte Mäuse virulent und für normale Mäuse im Bereich von 1,0 bis 2,0 x 10&sup5; cfu/Maus. Eine Probe des gefrorenen Candida-Stamms wurde auf Sabouraud-Dextroseschrägkulturen gezüchtet und dann für 18 Stunden auf 50 ml Schüttelkulturen von Sabouroudbrühe übertragen. Die Zellen wurden dreimal gewaschen, dann mit einem Hämocytometer gezählt und die Lebensfähigkeit mit dem Methylenfarbstoff-Ausschlußverfahren bestimmt. Lebensfähigkeitszählungen wurden auf dem Impfmaterial durchgeführt, um die Zählungen zu bestätigen.
Alle mit Candida infizierten Mäuse (Balb/c) wurden intravenös mit in 0,2 ml Kochsalzlösung suspendierten Zellen infiziert. Bei einigen Mäusen wird das Knochenmark mit einer Bestrahlung von 300 Rad subletal geschwächt. Zwei Stunden nach der Betrahlung werden die Tiere täglich mit der Verbindung CSF als eine positive Kontrolle oder mit einem Excipienten gespritzt. Sieben Tage nach Bestrahlung und Behandlungsbeginn werden die Mäuse durch intravenöse Verabreichung Candida albicans ausgesetzt. Dies stellt für normale Mäuse etwa einen LD&sub7;&sub5;-Wert dar. In anderen Studien sind die Mäuse nicht immunsupprimiert. In diesen Studien werden die Mäuse sieben Tage nach der Infektion in der gleichen Weise wie die bestrahlten Mäuse behandelt. In beiden Modellen werden die Mäuse behandelt, bis sie im Sterben liegen und die Änderung der Überlebensrate wird unter Anwendung des Wilcoxin-Tests verglichen.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung. Die Beispiele beabsichtigen in keiner Weise den Schutzumfang dieser Erfindung zu begrenzen, aber zeigen, wie die erfindungsgemäßen Verbindungen hergestellt und verwendet werden.
In den Beispielen sind alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben. Die Aminosäureanalyse wurde mit einem Dionex Autoion 100 durchgeführt. Die Analyse des Proteingehalts basiert auf der Aminosäureanalyse. Die FAB-Massenspektren wurden auf einem VG-ZAB-Massenspektrometer unter Verwendung von FAB ("fast atom bombardment") durchgeführt. Die verwendeten Abkürzungen sind wie folgt:
Arg = Arginin
Asp = Asparaginsäure
t-BOC = tert. Butyloxycarbonyl
Bz = Benzyl
Cl-Z = p-Chlorcarbobenzyloxycarbonyl)
(Z = Carbobenzyloxycarbonyl)
DCC = Dicyclohexylcarbodiimid
DIEA = Diisopropylethylamin
EDC = (N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
Glu = Glutaminsäure
p-Glu = Pyroglutaminsäure
Tyr = Tyrosin
Hna = Diaminohexinsäure
HOBT = Hydroxybenzotriazol
Lys = Lysin
NMP = N-Methyl-2-pyrrolidinon
Pro = Prolin
Gln = Glutamin
Cys = Cystein
Pim = (Diaminopimelinsäure)
Sub = (Diaminosuberinsäure)
Adp =
N-MeArg = N-Methylarginin
Prc = Bis-BOC-S,S'-1,3-Propandiylcystein
Etc = Bis-BOC-S,S'-1,2-Ethandiylcystein
Buc = Bis-BOC-S,S'-1,4-Butandiylcystein

Beispiel 1

Herstellung von (p-Glu-Glu-Asp)&sub2;-Pim-(Lys)&sub2;

Ein halbes Gramm t-BOC-Lys(Cl-Z)-O-CH&sub2;-PAM-Harz (0,63 mMol/g) wurde in das Reaktionsgefäß eines Beckmann-990-B- Synthetisierers geladen. Bei der Entfernung der Schutzgruppen wurde die t-Boc-Gruppe unter Verwendung von 40%iger Trifluoressigsäure (TFA) in Methyenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) entfernt. Das Trifluoracetatsalz wurde durch 10%iges DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; neutralisiert. Zwei mMol (780 mg) Di-BOC-2,6-diaminopimelinsäure wurden unter Verwendung von 2 mM DCC und HOBT gekuppelt. Die Kupplung wurde zwei Stunden im Gemisch von 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 10 ml DMF bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Kaiser-Test wurde verwendet, um die Kupplung zu überwachen. Alle verbleibenden freien Carboxylgruppen wurden zweimal unter Verwendung von 3 mM (1.65 g) H-Lys(Z)-OBz.HCl, 3 mM DCC und 3 mM HOBT in 25 ml CH&sub2;Cl&sub2;/DMF (15/10) amidiert.
Nach zwei Stunden Kupplung wurde das Harz zweimal mit 15 ml CH&sub2;Cl&sub2;, zweimal mit 15 ml DMF, zweimal mit 15 ml MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; (1:1) und schließlich zweimal mit 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Nach Entfernung der Schutzgruppe t-Boc unter Verwendung von 40%igem TFA/CH&sub2;Cl&sub2; und der Neutralisation unter Verwendung von 10%igem DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; wurden 2 mM (0,646 g) Boc-Asp(Bzl), 2 mM DCC und 2 mM HOBT zugegeben und 2 Stunden in 25 ml CH&sub2;Cl&sub2;/DMF (15/10) gekuppelt. Das Harz wurde dann einem Waschschritt, wie früher beschrieben, unterzogen. Die Entfernung der Schutzgruppen und der Neutralisationsschritt wurden wiederholt, bevor 2 mM (0,674 g) Boc-Glu(Bzl), 2 mM DCC und 2 mM HOBT in 25 ml CH&sub2;Cl&sub2;/DMF (15/10) gekuppelt wurden. Nach Waschschritten, Entfernung der Schutzgruppen und Neutralisationsschritten wurden 2 mM (0,258 g) pGlu, 2 mM DCC und 2 mM HOBT zwei Stunden in 25 ml CH&sub2;Cl&sub2;/DMF (15/10) gekuppelt, bevor das Harz einem Waschschritt unterzogen wurde. Die Vollständigkeit der Kupplung wurde mit dem Kaiser-Test überwacht und bei jedem Schritt wurde nur eine einzelne Kupplung benötigt. Nach Abschluß der Synthese wurde das Harz getrocknet und gewogen. Ausbeute: 1,2 g.
Das Peptidharz (1,2 g) wurde in eine Spaltungsapparatur geladen und unter Verwendung von 10 ml Fluorwasserstoffsäure (HF) und 1 ml Anisol zwei Stunden bei -15ºC gespalten. Nach Entfernung der HF unter vermindertem Druck wurde das Gemisch von Harz und Peptid gründlich mit Ether gewaschen und das Peptid wurde in Eisessig (30 ml) extrahiert. Der größte Teil der Säure wurde aus den Extrakten auf einem Rotationsverdampfer entfernt und das Peptid wurde in Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Der Essigsäureextrakt wies 810 mg des Rohpeptids auf.
Das aus der Essigsäureextraktion gewonnene Rohpeptid (80 mg) wurde unter Verwendung einer präparativen C-18-Säule weiter gereinigt. Es wurde über eine vorher äquilibrierte (in 0,1%igem TFA/H&sub2;O) Säule geleitet. Das Peptid wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 80% Acetonitril, 20% H&sub2;O und 0,1% TFA eluiert.
Drei Isomere wurden zusammen eluiert (8,52 min). Diese wurden über 35 Minuten auf einer C-18-Säule unter Verwendung eines Gradienten von 30% (0,1% TFA in CH&sub3;CN), 70% (0,1% TFA in H&sub2;O) bis 80% (0,1% TFA in CH&sub3;CN), 20% (0,1% TFA in H&sub2;O) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 ml/min getrennt. Die folgenden Fraktionen wurden eluiert:
Fraktion 1: 18,69 min
Fraktion 2: 19,68 min
Fraktion 3: 22,95 min
Die Aminosäureanalyse ergab die folgenden Ergebnisse: Aminosäureanalyse Beobachtet Glu Asp Lys Bis-aminopimelinsäure Massenspektrum: 1157,5 (M+H)&spplus;

Beispiel 2

Herstellung von (pGlu-Glu-Asp)&sub2;-Sub-(Lys)&sub2;

A. Synthese von BOC-Sub-Lys-(&epsi;-Z)COOBz:

Bis-BOC(1,1)diaminosuberinsäure (Sub) wurde unter Anwendung des R. Nutt-Verfahrens (J. Org. Chem 45 (1980), 3078) synthetisiert.
Zwei mM Boc-Sub (808 mg), 4 mM Lys-(&epsi;-Z)-CCOBz.HCl (1,56 g) und 4 mM HOBT (0,613 g) wurden in 10 ml Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) gelöst und die Lösung wurde unter Verwendung eines Eis/Acetonbades auf -15ºC gekühlt. Vier mM (0,692 ml) Diisopropylethylamin (DIEA) wurden zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,772 g (4 mM) wasserlöslichem Carbodiimid (EDC) Nach einer Stunde Rühren ließ man das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen. Nach drei Stunden wurde das Methylenchlorid abgedampft und der Rückstand in 200 ml Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde zuerst mit 1 N HCl, dann mit 1 N NaCH, gesättigter NaCl-Lösung und Wasser gewaschen. Die Waschschritte wurden dreimal wiederholt und jeder Waschschritt wurde mit etwa 100 ml durchgeführt. Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; gewaschen und abgedampft. Es wurden 1,86 g BOC-Sub-(&epsi;-Z)Lsy-COOBz (79% Ausbeute) gewonnen und ohne Reinigung weiter verwendet.

B. Synthese von BOC-Asp-(β-OBz)Sub-Lys-(&epsi;-Z)-COOBz:

BOC-Sub-Lys-(&epsi;-Z)-COOBz (1,8 g) wurde eine halbe Stunde in 4N HCl-Dioxan gelöst und dann bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ether gewaschen und über Nacht getrocknet. Das Hydrochloridsalz wurde in 30 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und BOC-Asp-(β-OBz) (1,292 g) zugegeben. Die Lösung wurde auf -15ºC gekühlt und 0,613 g HOBT, 0,554 ml DIEA und 0,772 g EDC wurden zugegeben. Nach zwei Stunden Rühren ließ man das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 18 Stunden (über Nacht) wurde das Reaktionsgemisch aufgearbeitet. Das CH&sub2;Cl&sub2; wurde verdampft und der Rückstand in 200 ml Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit 1N HCl, 1N NaCH, gesättigter NaCl-Lösung und Wasser gewaschen (Die Waschschritte wurden dreimal wiederholt und jeder Waschschritt wurde mit etwa 100 ml durchgeführt). Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet und verdampft. Es wurden 1,9 g (Ausbeute 73%) BOC-Asp-(β-OBz)Sub-Lys-(&epsi;-Z)-COOBz gewonnen. Dieses Peptid wurde ohne jede weitere Reinigung verwendet.

C.: Synthese von BOC-Glu-(γ-OBz)Asp-(β-BOz)Sub-Lys-(&epsi;-Z)COOBz:

In 15 ml 4N HCl-Dioxan wurden 1,8 g BCC-(β-BOz)Asp-Sub- (&epsi;-Z)Lys-COOBz gelöst. Nach fünfzehn Minuten wurde das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand mit Ether gewaschen und getrocknet. Das Hydrochloridsalz wurde in 15 ml N-Methylpyrrolidon (NMP) gelöst. Die Lösung wird auf -15ºC abgekühlt und 4 mM (1,338 g) BOC-Glu(γ-OBz), 0,204 ml DIEA, 0,772 g EDC und 0,612 g HCBT wurden hinzugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, während es sich schrittweise auf Raumtemperatur erwärmte. Das Reaktionsgemisch wurde in einen Kolben mit einem Liter gekühltem 10%igem Na&sub2;CO&sub3; in gesättigter NaCl-Lösung gegeben. Die Präzipitate wurden filtriert, mit Wasser gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet. BOC-(γ- OBz)Glu-(β-BOz)Asp-Sub-(&epsi;-Z)Lys-COOBz (1,3 g) wurde gewonnen und ohne jede weitere Reinigung verwendet.
Ausbeute: 68%.

D. Synthese von pGlu-(γ-OBz)Glu-(β-OBz)Asp-Sub-(&epsi;-Z)Lys-COOBz:

In 15 ml 4N HCl-Dioxan wurde 1,2 g BOC-(γ-OBz)Glu- (β-OBz)Asp-Sub-(&epsi;-Z)Lys-COOBz gelöst. Nach fünfzehn Minuten wurde das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand wurde mit Ether gewaschen und getrocknet. Das Hydrochloridsalz wurde in 15 ml NMP gelöst. Die Lösung wird auf -15ºC abgekühlt und 4 mM (0,516 g) Pyro-Glu (p-Glu), 0,106 ml DIEA, 0,772 g EDC und 0,612 g HOBT wurden zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, während es sich schrittweise auf Raumtemperatur erwärmte. Das Reaktionsgemisch wurde in einen Kolben mit einem Liter gekühltem 10%igem Na&sub2;CO&sub3; in gesättigter NaCl-Lösung gegeben. Die Präzipitate wurden filtriert, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. pGlu- (γ-OBz)Glu-(β-OBz)Asp-Sub-(&epsi;-Z)Lys-COOBz (0,830 g) wurde gewonnen und ohne jede weitere Reinigung verwendet. Ausbeute 69%.

E. Synthese von pGlu-Glu-Asp-Sub-Lys-COOH:

Die Schutzgruppen von pGlu-(γ-OBz)Glu-(β-OBz)Asp-Sub-(&epsi;- Z)Lys-COOBz (0,200 g) wurden unter Verwendung von 5 ml HF/1,5 ml Anisol bei 0ºC entfernt. HF wird entfernt und das Peptid mit Ether und 0,1N Essigsäure ausgeschüttelt. Die wäßrige Schicht wird gewaschen und gefriergetrocknet. Es werden 0,089 g pGlu-Glu-Asp-Sub-Lys-COOH gewonnen. Zwanzig mg dieses Peptids werden auf einer präparativen C-18-Vyadec-Säule unter isocratischen Bedingung (10% Acetonitril, 90% Wasser und 0,1% Trifluoressigsäure; Durchflußgeschwindigkeit 5,6 ml/Minute) gereinigt. FAB-Massenspektrum: M+H= 1171,4. Aminosäureanalyse: Asp (1,0), Glu (2,19), Lys (1,01), Sub N.D. . HPLC: Verweildauer auf der analytischen 0,23x25 mm großen C-18- Vyadec-Säule 7,01 Minuten (Durchflußgeschwindigkeit 1,5 ml, Gradient 0% bis 80% B; A = 0,1% TFA in Wasser und B = 0,1% TFA in Acetonitril).

Beispiel 3

Herstellung von (pGlu-Glu-Asp)&sub2;-Lan-(Lys)&sub2; [Lan = Lanthionin(SCH&sub2;CH(NH&sub2;)COOH)]

Ein halbes Gramm t-BOC-Lys(Cl-Z)-CH&sub2;-PAM (0,63 mM/g) wird in das Reaktionsgefäß eines Beckmann-990-Synthetisierers geladen. Die t-BOC-Gruppe wird unter Verwendung von 40%igem TFA in Methylenchlorid entfernt. Das Salz der Trifluoressigsäure wird durch 10%iges DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; neutralisiert. Zwei mM Bis-BOC-Lanthionin werden unter Verwendung von 4 mM DCC und HOBT in 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 10 ml DMF bei Raumtemperatur gekuppelt. Der Kaiser-Test wird zur Überwachung der Kupplung verwendet. Alle verbleibenden freien Carboxylgruppen werden unter Verwendung von 3 mM H-Lys-O-Bz.HCl, 3 mM DCC und HOBT in 25 ml CH&sub2;Cl&sub2;/DMF (15/10) amidiert. Nach der Kupplung wird das Harz gründlich mit CH&sub2;Cl&sub2;, 30%igem MeOH-CH&sub2;Cl&sub2; und CH&sub2;Cl&sub2; (3 x 25 ml) gewaschen; die Cyclen der Entfernung der Schutzgruppen, der Neutralisation und Kupplung werden mit den verbleibenden Aminosäuren in dem Zielpeptid (Asp, Glu, pGlu) wiederholt. Für jede Kupplung wurden vier mM jeder Aminosäure, DCC und HOBT verwendet. Jede Kupplung wurde mit dem Kaiser-Test überwacht. Nach Abschluß der Synthese wird das Harz getrocknet und gewogen.
Das Peptidharz wird in die Spaltungsapparatur geladen und zwei Stunden unter Verwendung von 10 ml Fluorwasserstoffsäure (HF) und 1 ml Anisol bei -15ºC gespalten. Nach Entfernung der HF wird das Harz gründlich mit Ether gewaschen und das Peptid mit Eisessig (30 ml) extrahiert. Der größte Teil der Essigsäure wird auf einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand wird in Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Nach der Reinigung durch HPLC wird das Peptid gewonnen.

Beispiel 4

Herstellung von (Pro-Asp-Asp)&sub2;-Sub-(Lys)&sub2;

Ein halbes Gramm t-BOC-Lys(Cl-Z)-CH&sub2;-PAM (0,63 mM/g) wird in das Reaktionsgefäß eines Beckmann-990-Synthetisierers geladen. Die t-BOC-Gruppe wird unter Verwendung von 40%igem TFA in Methylenchlorid entfernt. Das Salz der Trifluoressigsäure wird durch 10%iges DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; neutralisiert. Zwei mM Bis-BOC-diaminosuberinsäure werden unter Verwendung von 4 mM DCC und HOBT in 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 10 ml DMF bei Raumtemperatur gekuppelt. Der Kaiser-Test wird zur Überwachung der Kupplung verwendet. Alle verbleibenden freien Carboxylgruppen werden unter Verwendung von 3 mM H-Lys-O-Bz.HCl, 3 mM DCC und HOBT in 25 ml CH&sub2;Cl&sub2;/DMF (15/10) amidiert. Nach der Kupplung wird das Harz gründlich mit CH&sub2;Cl&sub2;, 30%igem MeOH-CH&sub2;Cl&sub2; und CH&sub2;Cl&sub2; (3 x 25 ml) gewaschen. Die Cyclen der Entfernung der Schutzgruppen, der Neutralisation und Kupplung werden mit den verbleibenden Aminosäuren in dem Zielpeptid (Asp, Asp und Pro) wiederholt. Für jede Kupplung werden vier mM der Aminosäure, DCC und HOBT verwendet. Jede Kupplung wird mit dem Kaiser-Test überwacht. Nach Abschluß der Synthese wird das Harz getrocknet und
gewogen. Das Peptidharz wird in eine Spaltungsapparatur geladen und zwei Stunden unter Verwendung von 10 ml Fluorwasserstoffsäure (HF) und 1 ml Anisol bei -15ºC gespalten. Nach Entfernung der HF wird das Harz gründlich mit Ether gewaschen und das Peptid mit Eisessig (30 ml) extrahiert. Der größte Teil der Essigsäure wird auf einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand wird in Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Nach der Reinigung durch HPLC wird das Peptid gewonnen.

Beispiel 5

Herstellung von (pGlu-Asp-Asp)&sub2;-Pim-(Lys)&sub2;

Ein halbes Gramm BOC-Lys(Cl-Z)-CH&sub2;-PAM (0,63 mM/g) wird in das Reaktionsgefäß eines Beckmann-990-Synthetisierers geladen. Die t-BOC-Gruppe wird unter Verwendung von 40%igem TFA in Methylenchlorid entfernt. Das Salz der Trifluoressigsäure wird durch 10%iges DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; neutralisiert. Zwei mM Bis-BOC-pimelinsäure werden unter Verwendung von 4 mM DCC und HOBT in 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 10 ml DMF bei Raumtemperatur gekuppelt. Der Kaiser-Test wird zur Überwachung der Kupplung verwendet. Alle verbleibenden freien Carboxylgruppen werden unter Verwendung von 3 mM H-Lys-C-Bz.HCl, 3 mM DCC und HOBT in 25 ml CH&sub2;Cl&sub2;/DMF (15/10) amidiert. Nach der Kupplung wird das Harz gründlich mit CH&sub2;Cl&sub2;, 30%igem MeOH-CH&sub2;Cl&sub2; und CH&sub2;Cl&sub2; (3 x 25 ml) gewaschen. Die Cyclen der Entfernung der Schutzgruppen, der Neutralisation und Kupplung werden mit den verbleibenden Aminosäuren in dem Zielpeptid (Asp, Asp und p-Glu) wiederholt. Für jede Kupplung werden vier mM der Aminosäure, DCC und HOBT verwendet. Jede Kupplung wird unter Verwendung des Kaiser- Tests überwacht. Nach Abschluß der Synthese wird das Harz getrocknet und gewogen.
Das Peptidharz wird in eine Spaltungsapparatur geladen und zwei Stunden unter Verwendung von 10 ml Fluorwasserstoffsäure (HF) und 1 ml Anisol bei -15ºC gespalten. Nach Entfernung der HF wird das Harz gründlich mit Ether gewaschen und das Peptid mit Eisessig (30 ml) extrahiert. Der größte Teil der Essigsäure wird auf einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand wird in Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Nach der Reinigung durch HPLC wird das Peptid gewonnen.

Beispiel 6

Herstellung von (pGlu-Glu-Asp)&sub2;-Pim-(Arg-CONH&sub2;)&sub2;

Ein halbes Gramm BOC-Tos-Arg-BHA (0,5 mM/g) wird in das Reaktionsgefäß eines Beckman-990-Synthetisierers geladen. Die BOC-Gruppe wird unter Verwendung von 40%igem TFA in Methylenchlorid entfernt. Das Salz der Trifluoressigsäure wird durch 10%iges DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; neutralisiert. Ein mM Bis-BOC-pimelinsäure wird unter Verwendung von 2 mM DCC und HOBT in 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 10 ml DMF bei Raumtemperatur gekuppelt. Der Kaiser-Test wird zur Überwachung der Kupplung verwendet. Alle verbleibenden freien Carboxylgruppen werden unter Verwendung von 3 mM H-Lys-OBz.HCl, 3 mM DCC und HOBT in 25 ml CH&sub2;Cl&sub2;/DMF (15/10) amidiert. Nach der Kupplung wird das Harz gründlich mit CH&sub2;Cl&sub2;, 30%igem MeOH-CH&sub2;Cl&sub2; und CH&sub2;Cl&sub2; (3 x 25 ml) gewaschen. Die Cyclen der Entfernung der Schutzgruppen, der Neutralisation und Kupplung werden mit den verbleibenden Aminosäuren im Zielpeptid (Asp, Glu und p-Glu) wiederholt. Für jede Kupplung werden 3 mM der Aminosäure, DCC und HOBT verwendet. Nach Abschluß der Synthese wurde das Harz getrocknet und gewogen.
Das Peptidharz wird in eine Spaltungsapparatur geladen und zwei Stunden unter Verwendung von 10 ml Fluorwasserstoffsäure (HF) und 1 ml Anisol bei -15ºC gespalten. Nach Entfernung der HF wird das Harz gründlich mit Ether gewaschen und mit Eisessig (30 ml) extrahiert. Der größte Teil der Essigsäure wird auf einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand wird mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Nach der Reinigung durch HPLC wird das Peptid gewonnen.

Beispiel 7

Synthese von Tyrosin-enthaltenden Analogen:

(Tyr-Glu-Asp)&sub2;-Sub-(Lys)&sub2;;
(pGlu-Tyr-Glu-Asp)&sub2;-Sub-(Lys)&sub2;;
(pGlu-Glu-Tyr-Asp)&sub2;-Sub-(Lys)&sub2;;
(pGlu-Glu-Asp-Tyr)&sub2;-Sub-(Lys)&sub2;;
Zwei Gramm BOC-Lys(Cl-Z)-O-Harz (Peninsula Labs , Substitution 0,49 mM/g) wurden in ein manuelles Schüttelgefäß gefüllt. Nach Entfernung der Schutzgruppen und Neutralisation wurden 2 mM (808 mg) Di-BOC-diamonisuberinsäure an das Harz gekuppelt unter Verwendung von 4 mM (824 mg) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 4 mM (612 mg) 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (HOBT) in 25 ml 50%igem N-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP) und Dichlormethan (DCM). Die Reaktion ließ man über Nacht ablaufen, anschließend erfolgte die Zugabe von 10 mM (4,06 g) H-Lys-(Z)-OBz.HCl, 10 mM (1,29 g) Diisopropylethylamin (DIEA), 10 mM (2,06 g) DCC und 10 mM (1,53 g) HOBT. Nach zwei Stunden wurden die nicht umgesetzten Aminogruppen unter Verwendung von 10%igem Essigsäureanhydrid in NMP/DCM (1:1) mit einer Schutzgruppe versehen ("capped"). Etwa ein Drittel des gewonnenen BOC-Sub-Lys-Harzes wurde in ein anderes Reaktionsgefäß überführt. Die Hauptfraktion des Harzes wird Fraktion I und die kleinere Fraktion wird Fraktion II genannt. Die Standardcyclen der Entfernung der Schutzgruppen, der Neutralisation und Kupplung wurden dazu verwendet, BOC- Tyr-(Br-Z), BOC-Asp(OBz), BOC-Glu(OBz) und p-Glu an das Harz in Fraktion II zu kuppeln. Es wurden 5 mM der Aminosäure, DCC und HCBT verwendet. Die Kupplung wurde in 25 ml NMP/DCM (1/1) durchgeführt und mit dem Kaiser-Test auf Vollständigkeit überwacht. Fünf mM BOC-Asp(OBz) wurden an das Harz in Fraktion I gekuppelt. Ein Viertel des gewonnenen BOC-Asp-Sub-Lys-Harzes wurde in ein anderes Gefäß überführt (Fraktion III). Das verbleibende Harz wird Fraktion IV genannt. Die Standardcyclen der Entfernung der Schutzgruppen, der Neutralisation und Kupplung wurden dazu verwendet, BOC-Tyr(Br-Z), BOC-Glu(OBz) und p-Glu an das Harz in Fraktion III zu kuppeln. Fünf mM der Aminosäure, DCC und HOBT wurden verwendet. Die Kupplung wurde in 25 ml NMP/DCM (1/1) durchgeführt und unter Verwendung des Kaiser-Tests auf Vollständigkeit überwacht. Fünf mM BOC-Glu(OBz) wurden an das Harz in der Hauptfraktion (IV) gekuppelt. Ein Drittel dieses Harzes wurde in ein anderes Gefäß überführt und 5 mM p-Glu wurden an diese Fraktion (Fraktion VI) gekuppelt, was zur Synthese des pGlu-Glu-Asp- Sub-Lys-Harzes führte. Fünf mM BOC-Tyr(Br-Z) wurden an die Hauptfraktion (Fraktion V) gekuppelt und das Harz wurde weiter in zwei Hälften aufgeteilt. Die eine Hälfte des Harzes wurde als solche aufbewahrt und an die andere Hälfte des Harzes (Fraktion VII) wurden 5 mM p-Glu gekuppelt, was zur Synthese des p-Glu-Tyr-Glu-Asp-Sub-Lys-Harzes führte. Das Schema ist auf der folgenden Seite beschrieben. Harz
Die Schutzgruppen dieser Harzpeptide wurden entfernt und die Peptide wurden eine Stunde unter Verwendung von HF/Anisol bei 0ºC gespalten. Die Rohpeptide (etwa 100 mg) wurden auf einer 2,5 cm x 30 cm großen präparativen C-18- Vydac-Säule unter Verwendung eines Wasser/0,1% Trifluoressigsäure (TFA)- und Acetonitril/0,01% TFA-Puffersystems gereinigt. Aminosäureanalyse*
* Die Zahlen in Klammer geben die theoretischen Verhältnisse an. Die experimentellen Verhältnisse wurden im Bezug auf Lys bestimmt.

Beispiel 8

Herstellung von (pGlu-Glu-Asp)&sub2;Prc(Lys)&sub2;

a) Synthese von Bis-BOC-S,S'-1-3-propandiylcystein:

Drei ml Methanol wurden mit trockenem Ammoniak gesättigt und 0,5 g BOC-Cystein in 0,5 ml Methanol wurden zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,35 ml 1,3-Dibrompropan. Zehn Minuten später wurden weitere 0,5 g BOC-Cystein in 0,5 ml Methanol zugegeben. Nach 4,5 Stunden wurde das Lösungsmittel verdampft und der ölige Rückstand wurde in Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 9 eingestellt und die Lösung wurde mit Ether extrahiert. Der pH-Wert der wäßrigen Schicht wurde auf 2 erniedrigt und die Lösung wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet und verdampft, wobei 1,12 g Bis-BOC-S-,S'-1,3-propandiylcystein gewonnen wurden. Die Aminosäure wurde ohne jede weitere Reinigung verwendet; FAB-Massenspektrum M+H = 469.

b) Herstellung von (pGlu-Glu-Asp)&sub2;Prc(LyS)&sub2;

BOC-Lys-Harz (0,53 g, Substitution 0,63 mM/g) wurde in einen manuellen Schüttler gefüllt und nach den Cyclen der Entfernung der Schutzgruppen und der Neutralisation wurde Bis-BOC-S-,S'-1,3-propandiylcystein (290 mg, 0,6 mM) unter Verwendung von 1 mM (206 mg) DCC und 1 mM (153 mg) HOBT in 10 ml NMP/DCM gekuppelt. Nach zwei Stunden wurde das Harz mit NMP und DCM gewaschen und 2 mM (765 mg) H-Lys-(Z)-OBz wurden zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 1,5 mM (390 mg) DCC und 1,5 mM (230 mg) HOBT in 4 ml NMP/DCM (1/1). Nach 18 Stunden wurde das Harz mit 20 ml NMP und DCM gewaschen. Die normalen Cyclen der Entfernung der Schutzgruppen, der Neutralisation und Kupplung wurden für die Kupplung von BOC-Asp(OBz), BOC-Glu(OBz) und p-Glu wiederholt. Ein mM der Aminosäure, DCC und HOBT wurden verwendet. Die Kupplung wurde in 5 ml NMP/DCM (1/1) durchgeführt. Die vollständigkeit der Kupplung wurde mit dem Kaiser-Test überwacht. Die Schutzgruppen des erhaltenen Harzpeptids (416 mg) wurden abgelöst und es wurde 2 Stunden unter Verwendung von 0,5 ml Anisol und 8 ml HF bei 0ºC gespalten. Die HF wurde verdampft und das peptid-Harz-Gemisch wurde mit Ether gewaschen und mit Eisessig extrahiert. Nach dem Gefriertrocknen wurden 130 mg des Rohpeptids gewonnen. Das Rohpetid (61,5 mg) wurde auf einer präparativen C-18-Vydac- Säule unter Verwendung eines Acetonitril-Wasser(O,1% TFA)- Puffersystems gereinigt. Es wurden 16,5 mg reines Peptid gewonnen.
FAB/MS: M+H = 1249,3

Aminosäureanalyse

Asp 2,0 (2)
Glu 4,28 (4)
Dpc 1,14
Lys 1,96 (2)

Beispiel 9 und 10

Mit dem Verfahren für Bis-BOC-S,S'-1,3-propandiylcystein (Prc) wurde Bis-BOC-S,S'-1,2-ethandiylcystein (Etc) und Bis-BOC-S,S'-1,4-butandiylcystein (Buc) hergestellt.
Mit dem für (pGlu-Glu-Asp)&sub2;Prc(Lys)2 beschriebenen Verfahren wurden 30 mg (pGlu-Glu-Asp)&sub2;Etc(Lys)&sub2; und 17 mg (pGlu-Glu-Asp)&sub2;Buc(Lys)&sub2; hergestellt.

Beispiel 11

Synthese von (pGlu-Glu-Asp)&sub2;Sub(N-MeArg)&sub2;

In DCM (5 ml) wurden 0,5 g (0,45 meq/g) Hydroxymethylharz suspendiert und mit 0,5 mM (221 mg) BOC-N-MeArg, 0,5 mM (61 mg) Dimethylaminopyridin und 0,5 mM (103 mg) DCC umgesetzt. Das acylierte Harz wurde mit DCM (3x), NMP (3x) und DCM (4x) gewaschen. Die nicht umgesetzten Hydroxygruppen wurden unter Verwendung von 0,5 ml Phenylisocyanat in 20 ml DCM mit einer Schutzgruppe versehen. Das Harz wurde gründlich mit DCM und NMP gewaschen. Die BOC-Gruppe wurde unter Verwendung von 40%igem TFA/DCM entfernt. Nach Neutralisation mit 10%igem DIEA in DCM wurden 0,05 mM (20,2 mg) BOC-Sub unter Verwendung von 0,125 mM (25,7 mg) DCC und 0,125 mM (19,1 mg) HOBT gekuppelt. Nach 72 Stunden wurde das Harz mit NMP und DCM gewaschen. Normale Cyclen der Entfernung der Schutzgruppen, der Neutralisation und Kupplung wurden für die Kupplung von BOC-Asp(OBz), BOC-Glu(OBz) und p-Glu wiederholt. Ein mM der Aminosäure, DCC und HOBT wurden verwendet. Die Kupplung wurde in 5 ml NMP/DCM (1/1) durchgeführt. Die Vollständigkeit der Kupplung wurde mit dem Kaiser-Test überwacht. Die Schutzgruppen des erhaltenen Harzpeptids (484 mg) wurden entfernt und es wurde zwei Stunden unter Verwendung von 0,5 ml Anisol und 10 ml HF bei 0ºC gespalten. Die HF wurde verdampft und das Peptid-Harz-Gemisch wurde mit Ether gewaschen und mit Eisessig extrahiert. Nach dem Gefriertrocknen wurden 12,5 mg des Rohpeptids gewonnen. Das Rohpeptid (6 mg) wurde auf einer präparativen C-18-Vydac-Säule unter Verwendung eines Acetonitril-Wasser(0,1% TFA)-Puffersystems gereinigt. Es wurden 2,2 mg reines Peptid gewonnen.

Beispiel 12

Synthese von (pGlu-Glu-Asp)&sub2;Sub(Hna)&sub2;

In DCM (5 ml) wurde 0,5 g (0,45 meq/g) Hydroxymethylharz suspendiert und mit 126 mg (0,335 mM) 2,N-BOC-6,N- Z-2,6-diamino-4-hexinsäure (Hna), 40 mg (0,335 mM) Dimethylaminopyridin (DMAP), 69 mg (0,335 mM) DCC und 50 mg (0,335 mM) HOBT umgesetzt. Das acylierte Harz wurde mit DCM (3x), NMP (3x) und DCM (4x) gewaschen. Nicht umgesetzte Hydroxygruppen wurden unter Verwendung von 0,5 ml Phenylisocyanat in 20 ml DCM mit einer Schutzgruppe versehen. Das Harz wurde gründlich mit DCM und NMP gewaschen. Die BOC-Gruppe wurde unter Verwendung von 40%igem TFA/DCM entfernt. Nach Neutralisation mit 10%igem DIEA in DCM wurden 44 mg (0,11 mM) BOC-Sub unter Verwendung von 50 mg (0,22 mM) DCC und 33,6 mg (0,11 mM) HOBT gekuppelt. Nach 16 Stunden wurde das Harz mit NMP und DCM gewaschen. Normale Cyclen der Entfernung der Schutzgruppen, der Neutralisation und Kupplung wurden für die Kupplung von BOC-Asp(OBz), BOC-Glu(OBz) und p-Glu wiederholt. Ein mM der Aminosäure, DCC und HOBT wurden verwendet. Die Kupplung wurde in 5 ml NMP/DCM (1/1) durchgeführt. Die Vollständigkeit der Kupplung wurde mit dem Kaiser-Test überwacht. Die Schutzgruppen des erhaltenen Peptids (608 mg) wurden entfernt und es wurde 2 Stunden unter Verwendung von 0,6 ml Anisol und 10 ml HF bei 0ºC gespalten. Die HF wurde verdampft und das Peptid-Harz-Gemisch wurde mit Ether gewaschen und mit Eisessig extrahiert. Nach dem Gefriertrocknen wurden 93,7 mg des Rohpeptids gewonnen. Das Rohpeptid (20,6 mg) wurde auf einer präparativen C-18-Vaydac-Säule unter Verwendung eines Acetonitril-Wasser(TFA)-Puffersystems gereinigt. Es wurden 7,5 mg reines Peptid gewonnen. Durch Aminosäureanalyse und FAB- Massenspektrum wurde die Struktur bestätigt.
FAB/MS: M+H = 1163

Aminosäureanalyse

Asp 2,0 (2)
Glu 4,01 (4)
Sub 2,01 (1)
Hna 1,44 (2)

Beispiel 13

Synthese von (pGlu-Glu-Asp)&sub2;Adp(Lys)&sub2;

a) Synthese von Bis-BOC-2,5(S,S)-diaminoadipinsäure

Bis-BOC-2,5(S,S)-diaminopimelinsäure wurde unter Anwendung des R. Nutt-Verfahrens synthetisiert (J. Org. Chem. (1980), 3078). Zu einem Gemisch aus 240 ml Methanol und 80 ml Pyridin wurden 192 mg NaOCH&sub3; und 57,56 g BOC-Asp(OBz) gegeben. War die Lösung homogen, wurde das Reaktionsgemisch auf 0ºC abgekühlt. Unter Verwendung von Platinelektroden wurde ein Strom (100 Volt) von etwa 1,5 amps durch das Reaktionsgemisch geleitet. Die Temperatur der Lösung wurde zwischen 15ºC und 25ºC gehalten. Das Verschwinden des Ausgangsmaterials wurde mit TLC verfolgt (Chloroform:Methanol:Essigsäure /95:4:1). Nach fünf Stunden wurde die Reaktion gestoppt. Das Lösungsmittel wurde auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Der ölige braune Rückstand wurde in 150 ml Methylacetat gelöst. Man ließ die Lösung 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Die Präzipitate wurden durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde verdampft. Der rohe Dibenzylester von BOC-2,5-diaminosuberinsäure (61,7 g) wurde gewonnen. Einundsechzig Gramm des Rohproduktes wurden auf eine in Hexan gepackte Silicagel-Säule geladen. Die Säule wurde aufeinanderfolgend mit 10%igem, 20%igem, 25%igem und 30%igem Ethylacetat in Hexan eluiert. Die Fraktionen wurden durch TLC analysiert. Fraktionen mit dem gewünschten Produkt wurden gepoolt und das Lösungsmittel wurde auf einem Rotationsverdampfer entfernt. Das gereinigte Produkt (3,78 g) wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Drei Gramm des Benzylesters wurden in 120 ml Methanol gelöst und in einem Parr- Apparat unter Verwendung von 378 mg 10%igem Pd/Holzkohle hydriert. Die Hydrierung war nach fünf Stunden abgeschlossen. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde auf einem Rotationsverdampfer konzentriert. Rohe Bis-BOC-2,5-diaminoadipinsäure wurde durch Silicagel-Flashchromatographie auf einer in Chloroform gepackten Säule gereinigt. Die Säule wurde aufeinanderfolgend mit 98:2:0,1-; 98:2:0,5-; 95:4:1-; 90:8:2-; 85:10:5- und 70:20:10-Gemischen von Chloroform, Methanol und Essigsäure eluiert. Die Fraktionen mit dem gewünschten Produkt wurden gepoolt und auf einem Rotationsverdampfer konzentriert; der Rückstand (1,07 g) wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Die Struktur des Produkts wurde durch NMR und Daten des Massenspektrums bestätigt.

b) Synthese von (pGlu-Glu-Asp)&sub2;Adp(Lys)&sub2;

Ein halbes Gramm BOC-Lys(Cl-Z)-PAM-Harz (0,63 mM) wird in ein manuelles Schüttelgefäß gefüllt. Die BOC-Gruppe wird mit 40%igem TFA in Methylenchlorid entfernt. Das Salz der Trifluoressigsäure wird mit 10%igem DIEA/DCM neutralisiert. Zwei mM Bis-BCC-2,5-diaminoadipinsäure (Adp) werden unter Verwendung von 4 mM DCC und HOBT in 15 ml DCM und 15 ml NMP gekuppelt. Alle freien Carboxylgruppen werden unter Verwendung von 3 mM H-Lys(Z)-OBz, 3 mM DCC und HOBT in 30 ml DCM/NMP (1/1) amidiert. Nach der Kupplung wird das Harz gründlich mit DCM und NMP gewaschen. Die Cyclen der Entfernung der Schutzgruppen, der Neutralisation und Kupplung werden mit den verbleibenden Aminosäuren in dem Zielpeptid (Asp, Glu und pGlu) wiederholt. Für jede Kupplung werden vier mM jeder Aminosäure, DCC und HOBT verwendet. Jede Kupplung wird mit dem Kaiser-Test auf Vollständigkeit überwacht. Nach Abschluß der Synthese wird das Harzpetid in eine Spaltungsapparatur geladen und zwei Stunden unter Verwendung von 10 ml HF und 1 ml Anisol bei -15ºC gespalten. Nach Entfernung der HF wird das Harz gründlich mit Ether gewaschen und das Peptid wird in Eisessig extrahiert. Der größte Teil der Essigsäure wird auf einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand wird mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Nach der Reinigung durch HPLC wird das gewünschte Peptid gewonnen.

Claims

1. Verbindung der folgenden Formel:

in der:

Y&sub1; und Y&sub2; unabhängig voneinander eine CH&sub2;-Gruppe oder ein Schwefelatom bedeuten,

x den Wert, 0, 1, 2, 3 oder 4 hat,

m den Wert 0, 1 oder 2 hat,

n den Wert 0, 1 oder 2 hat,

A Pyroglutaminsäure, Prolin, Glutamin, Tyrosin oder Glutaminsäure bedeutet,

B Glutaminsäure, Tyrosin oder Asparaginsäure darstellt,

C Glutaminsäure, Tyrosin oder Asparaginsäure bedeutet,

D Lysin, Arginin, Tyrosin, N-Methylarginin, Diaminohexinsäure oder das Carboxyamid oder das Hydroxymethylderivat davon darstellt,

E Glutaminsäure, Asparaginsäure, Tyrosin oder eine peptidbindung bedeutet,

mit der Maßgabe daß:

wenn Y&sub1; und Y&sub2; Schwefelatome sind, x den Wert 2, 3 oder 4 und m und n den Wert 1 haben, oder

wenn Y&sub1; und Y&sub2; CH&sub2;-Gruppen sind, x den Wert 0, 1 oder 2 und m und n den Wert 0 haben, oder

wenn Y&sub1; ein Schwefelatom und Y&sub2; eine CH&sub2;-Gruppe ist, x den Wert 0 und n den Wert 1 hat, oder

wenn Y&sub2; ein Schwefelatom und Y&sub1; eine CH&sub2;-Gruppe ist, x den Wert 0 und m den Wert 1 hat,

oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y&sub1; und Y&sub2; CH&sub2;-Gruppen sind.

3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei x den Wert 1 oder 2 hat.

4. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y&sub1; ein Schwefelatom ist.

5. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y&sub1; und Y&sub2; Schwefelatome sind.

6. Verbindung nach Anspruch 3, wobei A Pyroglutaminsäure, B Glutaminsäure, C Asparaginsäure, D Lysin und E eine Peptidbindung ist.

7. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich (pGlu-Glu-Asp)&sub2;-Pim-(Lys)&sub2;.

8. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich (pGlu-Glu-Asp)&sub2;-Sub-(Lys)&sub2;.

9. Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt aus:

(Tyr-Glu-Asp)&sub2;sub(Lys)&sub2;

(pGlu-Tyr-Glu-Asp)&sub2;Sub(Lys)&sub2;

(pGlu-Glu-Tyr-Asp)&sub2;sub(Lys)&sub2;

(pGlu-Glu-Asp-Tyr)&sub2;Sub(Lys)&sub2;

(pGlu-Glu-Asp)&sub2;Sub(N-MeArg)&sub2;

(pGlu-Glu-Asp)&sub2;Sub(HNA)&sub2;

(pGlu-Glu-Asp)&sub2;Prc(Lys)&sub2;

(pGlu-Glu-Asp)&sub2;Etc(Lys)&sub2;

(pGlu-Glu-Asp)&sub2;Buc (Lys)&sub2;

10. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung als Medikament.

11. Arzneimittel, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

12. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1 gemäß der Definition in Anspruch 1, umfassend

a) Kupplung geschützter Aminosäuren zur Erzeugung einer geeignet geschützten Verbindung der Formel

in der

x den Wert 0, 1, 2, 3 oder 4 hat,

m den Wert 0, 1 oder 2 hat,

n den Wert 0, 1 oder 2 hat,

A Pyroglutaminsäure, Prolin, Glutamin, Tyrosin oder Glutaminsäure darstellt,

B Glutaminsäure, Tyrosin oder Asparaginsäure bedeutet,

C Glutaminsäure, Tyrosin oder Asparaginsäure darstellt,

E Glutaminsäure, Asparaginsäure, Tyrosin oder eine Peptidbindung bedeutet,

mit der Maßgabe daß:

wenn Y&sub1; und Y&sub2; Schwefelatome bedeuten, x den Wert 2, 3 oder 4 und m und n den Wert 1 haben, oder

wenn Y&sub1; und Y&sub2; CH&sub2;-Gruppen bedeuten, x den Wert 0, 1 oder 2 und m und n den Wert 0 haben, oder

und [D'] ein Chlormethyl-, Methylbenzhydrylamin-, Benzhydrylamin- oder Phenylacetamidomethylharz ist, oder D Lysin, Arginin, Tyrosin, N-Methylarginin, Diaminohexinsäure oder das Carboxyamid oder das Hxydroxymethylderivat davon bedeuten;

b) Entfernung der vorhandenen Schutzgruppen und, falls notwendig, Abspaltung des Peptids vom Harz, und

c) gegebenenfalls Erzeugung eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon.

13. Verwendung einer Verbindung der Formel 1 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon gemäß der Definition in Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung des Systems zur Knochenmarkbildung.

14. Verwendung einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon gemäß der Definition in Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von durch Viren, Pilze und Bakterien verursachte Infektionen.