DE68917837T2

DE68917837T2 - Peptid-Verbindungen.

Info

Publication number: DE68917837T2
Application number: DE68917837T
Authority: DE
Inventors: Ole Didrik Laerum
Original assignee: Hafslund Nycomed Bioreg AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1988-09-16
Filing date: 1989-09-13
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2009-09-14
Also published as: HUT58765A; EP0359338B1; US5484770A; DK39591A; LT3714B; GB8821785D0; AU4218389A; DE68917837D1; GEP19971041B; ES2058479T3; IE892954L; EP0434718A1; HU208027B; HU895788D0; LV10108B; IE64181B1; DK39591D0; MY104909A; CA1339947C; EP0359338A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Peptiden, die einen inhibitorischen Effekt auf die Zellproliferation ausüben, und neue Peptide, die spezifische und/oder allgemeine inhibitorische Wirkungen besitzen.
Der Körper eines Säugers enthält Zellen, die sehr verschiedenartige Strukturen und Funktionen besitzen, und deren Differenzierungs- und Entwicklungsmechanismen im Mittelpunkt vieler Untersuchungen gestanden haben. Es ist bekannt, daß bei Zellsystemen, die einen kontinuierlichen Stoffumsatz besitzen, zu den Mechanismen üblicherweise ein Reservoir an pluripotenten Stammzellen zählt, die sich teilen und das System ständig mit neuen Zellen versorgen. Die anfänglich homogenen Stammzellen, die von dem "Reservoir" bereitgestellt werden, werden bald darauf auf die eine oder andere Morphologie festgelegt und entwickeln sich im folgenden zu den benötigten funktionellen Zellen.
Zu Beispielen für diese Stammzellsysteme zählen das hämatopoetische System im Knochenmark und die epithelialen und epidermalen Systeme.
Es ist kürzlich darüber berichtet worden, daß Peptide, die einer enggefaßten allgemeinen Formel entsprechen, die Hämatopoese inhibieren können (siehe die EP-A-0112656), während eine Gruppe von dimeren Peptiden, die einer etwas breiter gefaßten allgemeinen Formel entsprechen und durch eine Disulfid-Brücke miteinander verbunden sind, die Hämatopoese stiinulieren können (siehe die WO88/03535). In beiden Fällen wurde jedoch angegeben, daß eine Wirkung auf andere Systeme als der Hämatopoese nicht beobachtet worden war.
Wir haben nun überraschend festgestellt, daß eine Peptidklasse, zu der bestimmte der in der EP-A-0112 656 offenbarten Peptide zählen, in der Lage ist, die Zellproliferation allgemein zu inhibieren, und daß geringfügige Modifikationen der Aminosäuresequenz und/oder die Blockierung von kritischen Seitenkettenresten die Wirkung der Peptide auf bestimmte Systeme, die von Interesse sind, lenken können.
Unsere Befunde basierten auf der Beobachtung, daß bestimmte der Pentapeptid-Sequenzen, die in oben genannten Patentanmeldungen offenbart sind, in bestimmten sogenannten G-Proteinen, nämlich den Gαi-Proteinen, vorkamen. Die G-Proteine befinden sich auf der Innenseite der Zellmembranen und bilden eine wesentliche Verbindung zwischen den Transmembran- Rezeptoren und den Effektoren, die nahe den G-Proteinen im Inneren der Zelle lokalisiert sind. Sie sind in Abhängigkeit von den Effektoren, mit denen sie verbunden sind, an vielen Zellfunktionen beteiligt. Sie bestehen aus 3 verbundenen Untereinheiten α, β und γ, wobei die α-Untereinheit an der Aktivierung des benachbarten Effektors beteiligt ist. Die G-Proteine wurden anfangs durch ihre Funktion charakterisiert, und die Unterklasse der Gi-Proteine ist diejenige, bei der ursprünglich festgestellt wurde, daß sie die Adenylatcyclase inhibiert. Dieser Befund führte zur Untersuchung der Rolle der Peptide bei der Inhibition der Proliferation von epithelialen und epidermalen Systemen und von Zellsystemen im allgemeinen.
Somit umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verbindungen der Formel (I)
Ra - Rb - Rc - Rd - (Re)n - Rf (I),
worin Ra
bedeutet,
Rb
bedeutet,
Rc
bedeutet,
Rd
bedeutet,
Re bedeutet und
Rf
bedeutet,
(worin n und m unabhängig voneinander 0 oder 1 bedeuten;
p und q unabhängig voneinander 1 oder 2 bedeuten;
R¹ und R² beide für ein Wasserstoffatom stehen oder zusammen eine Oxogruppe bedeuten;
R³ und R&sup4; beide für ein Wasserstoffatom stehen oder zusammen eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung bedeuten;
R&sup5; für Wasserstoff oder eine C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Acyl-Gruppe steht;
R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander eine Hydroxygruppe oder eine Aminogruppe bedeuten;
R&sup8; Wasserstoff; eine C&sub2;&submin;&sub6;-Alkylgruppe; oder eine C&sub7;&submin;&sub2;&sub0; Aralkylgruppe, die eine oder mehrere Hydroxy-, Amino- oder Methoxy-Substituenten tragen kann, bedeutet;
R&sup9; Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeutet;
R¹&sup0; eine Hydroxy- oder eine Aminogruppe, den Aminosäurerest Glutamin oder ein Peptid mit einer N-terminalen Glutamineinheit bedeutet;
wobei außer Alanin, das in der D- oder L-Form vorliegen kann, und Glycin, alle Aminosäuren die L-Form besitzen)
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung der nichthämatopoetischen Zellproliferation.
Wenn eine N-terminale Schutzgruppe R&sup5; vorliegt, steht diese für eine Acylgruppe mit 1-20 Kohlenstoffatomen und kann zum Beispiel für eine niedrige Alkanoylgruppe mit 1-5 Kohlenstoffatomen, wie eine Acetylgruppe, oder eine Aroyl- oder Aralkanoylgruppe mit 7 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie die Benzoyl- oder Phenylacetylgruppe, stehen.
R&sup5; kann weiterhin für eine Acylgruppe stehen, die von einer Aminosäure oder von einer Peptidkette stammt. Insbesondere kann R&sup5; für eine Acylgruppe stehen, die von Serin oder von einem der Peptide stammt, die sich von der folgenden Aminosäuresequenz durch sukzessive Entfernung der N-terminalen Aminosäuren ableitet:
Lys-Ile-Ile-His-Glu-Asp-Gly-Tyr-Ser.
Wie detailliert im folgenden ausgeführt wird, besitzen Peptide, die die obige Sequenz oder einen Teil davon aufweisen, einen hohen Homologiegrad zu Giα-Proteinen, die bekanntlich mehrere Zellfunktionen kontrollieren, zu denen die Inhibition des Wachstums zählt. Die terminale Aminogruppe des gesamten Peptides der Formel (I) ist vorzugsweise geschützt, z.B. durch Acylierung mit einer Alkanoyl-, Aralkanoyl- oder Aroylgruppe.
Wenn R&sup8; für eine C&sub2;&submin;&sub6;-Alkylgruppe steht, kann diese beispielsweise eine Ethyl-, Butyl- oder Hexylgruppe sein. Wenn R&sup8; für eine Aralkylgruppe steht, kann diese geeigneterweise eine Arylmethylgruppe, wie Benzyl, Diphenylmethyl oder Triphenylmethyl, sein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind vorzugsweise Pentapeptide, das heißt, n steht vorzugsweise für 0.
Die cyclischen Gruppen des Ra-Restes sind vorzugsweise fünf-gliedrig, das heißt, m steht vorzugsweise für 0.
Die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Pentapeptides, die Proliferation einer Vielzahl von Zellen zusätzlich zu dem oder sogar unter Ausschluß des hämatopoetischen System(s) zu inhibieren, ist in der Medizin dort wertvoll, wo entweder eine übermäßige Zellproliferation eine Behandlung erfordert, wie bei Psoriasis, oder wo eine Krebstherapie wahrscheinlich einer bestimmten Zellpopulation schaden würde. Viele Zelltypen sind besonders empfindlich gegenüber cytotoxischen Arzneimitteln oder Bestrahlungen, die bei einer Antikrebs-Therapie angewendet werden, und ein bekanntes Verfahren besteht darin, ein Arzneimittel zu verwenden, um die Proliferation von Zellen, wie denen des hämatopoetischen Systems, während der Antikrebs- Therapie zu inhibieren, wonach eine normale Proliferation wieder hergestellt wird, wenn die Wirkung des inhibitorischen Arzneimittels abgeklungen ist. Es hat sich herausgestellt, daß die erfindungsgemäßen Peptide eine ausreichend kurze biologische Halbwertszeit für eine solche Therapie besitzen. Entsprechend kann die Proliferation von ausgewählten Zellpopulationen, die empfindlich gegenüber einer Krebstherapie sind, zusammen mit den Krebszellen selbst inhibiert werden. Man beginnt erst dann mit der Krebstherapie, wenn die Krebszellen eine empfindliche Proliferationsphase erreicht haben, während sich die normalen Zellen in einer weniger empfindlichen Phase befinden.
Ein Zellproliferationstyp tritt auf, wenn Zellen, wie Kochenmarkzellen, Phagozyten oder Granulozyten während einer Therapie durch CSF-Arzneimittel stimuliert werden. Eine Inhibition des Zellwachstums kann solche Zellen zu normalen Wachstumsraten zurückführen.
Bei vielen Autoimmunkrankheiten produziert der Patient Leukozyten, die gegen eigene Gewebe wirken. Durch eine wenigstens zeitweise Inhibition der Leukozytenfunktion können solche Autoimmunreaktionen entsprechend reduziert werden.
Durch Aufnahme in den transzellulären Signalmechanismus der Gαi-Proteine können weitere Funktionen, die durch die Gαi- Proteine kontrolliert werden, durch die aktiven Peptide modifiziert werden, zum Beispiel der Calciummetabolismus, die Zellmobilität und cytoplasmatische zelluläre Prozesse, die durch das Gαi-Protein vermittelt werden.
Somit werden erfindungsgemäß neue Polypeptide bereitgestellt, die vollständige oder Teilsequenzen enthalten, die im wesentlichen homolog zu den oben besprochenen Gαi- Proteinen sind, nämlich
---Lys-Ile-Ile-His-Glu-Asp-Gly-Tyr-Ser-Ra'-Rb-Rc- Rd Re-Rf-Gln-Tyr---, oder Teile davon oder geringfügige Variationen davon, wie diejenigen, die in Ann. Rev. Biochem.56, S.624-625 (1987) und Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, S.3066-3070 (1988) beschrieben worden sind. Solche Sequenzen enthalten vorzugsweise wenigstens einen Tyr-Rest, um die Markierung der Polypeptide zu erleichtern. Wie im folgenden dargestellt wird, wird das N-terminale NH&sub2; vorzugsweise geschützt, zum Beispiel durch die oben besprochene N-Acylierung. Falls der N-terminale Aminosäurerest in einer solchen homologen Sequenz Glu ist, kann dieser vorteilhaft durch p-Glu ersetzt werden.
Solche Polypeptide werden als Verbindung der Formel (Ia) bezeichnet und können als Verbindungen der oben definierten Formel (I) dargestellt werden, worin R&sup5; für eine Acylgruppe, die von dem Aminosäurerest Serin stammt, oder für eine Peptidkette steht, die eine C-terminale Serineinheit besitzt, und/oder R¹&sup0; für den Aminosäurerest Glutamin oder ein Peptid, das eine N-terminale Glutamineinheit enthält, steht. Sie enthalten vorzugsweise insgesaint bis zu 12 Aminosäurereste, vorzugsweise 10 oder weniger.
Es ist allgemein bevorzugt, daß das N-terminale NH&sub2; einer zugeführten Peptidsequenz zum Beispiel durch Acylierung geschützt sein soll. Dies hilft, einen enzymatischen Abbau des Peptides zu verhindern. Die meisten der Ra-Reste, die für die Formel (I) in Frage kommen, sind ohne eine Entschützung oder eine entsprechende Überführung in Reste, die eine freie NH&sub2;- Gruppe besitzen, zur Addition von Aminosäuren nicht geeignet. Falls somit R&sup5; für eine andere Acylgruppe, als eine Acylgruppe, die von einer Aminosäure oder einem Peptid stammt, steht, ist eine Deacylierung erforderlich. Wenn entsprechend R¹ und R² zusammen eine Oxogruppe bilden, wie in p-Glu-Einheiten, ist eine Überführung in einen entsprechend offenkettigen Rest wie Glu oder Gln erforderlich.
Die Erfindung macht somit von den Wirkungen der Peptide auf cytoplasmatische, zelluläre Prozesse, die durch das Gαi- Protein vermittelt werden, Gebrauch.
Nur die Verbindungen, die in unserer früheren Europäischen Patentschrift Nr. 112 656 offenbart worden sind, sind vorher als in der Medizin verwendbar beschrieben worden. Alle anderen, oben beschriebenen Verbindungen der Formel I sind entweder neu oder sind nur als Zwischenprodukte beschrieben worden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden daher Verbindungen der oben definierten Formel (I), die nicht
pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys
sind, und mit der Maßgabe, daß, wenn Ra für p-Glu, Rb für Glu oder Gln, Rc für Asp und Rd für Cys stehen, Rf dann nicht für Lys oder Lys-NH&sub2; stehen kann, zur Verwendung als Mittel zur Kontrolle der Zellproliferation bereitgestellt.
Bestimmte, ausgewählte Peptide der obigen Formel (I) sind neu, und es ist festgestellt worden, daß sie besonders wünschenswerte Eigenschaftskombinationen besitzen. Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden somit Verbindungen der Formel
bereitgestellt,
worin Ra, Rb, Rc, Re, Rf und n wie bei der Formel I definiert sind, R¹¹ für eine C&sub2;&submin;&sub6;-Alkyl- oder eine C-&sub7;&submin;&sub2;&sub0;- Aralkylgruppe, die einen oder mehrere Hydroxy-, Amino- oder Methyl-Substituenten tragen können, steht, und alle Aminosäuren die für die Formel (I) angegebene chirale Form besitzen. Zu besonders bevorzugten Verbindungen dieser Formel zählen
pGlu-Glu-Asp-Benzylcys-Lys
und
pGlu-Ala-Asp-Benzylcys-Lys
Man hat festgestellt, daß Verbindungen, die einen geschützten Cysteinrest dieses Typus besitzen, eine verbesserte Stabilität in vivo und eine anhaltende Aktivität bei der Inhibition der Zellproliferation besitzen.
Es können Analoga der oben erwähnten Benzyl-Cystein- Verbindungen hergestellt werden, bei denen die Phenyl- Substitution weniger labil ist, wobei solche Verbindungen einen Phenylalaninrest anstelle des Cysteinrestes an der 4-Position besitzen. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden somit Verbindungen der Formel
bereitstellt, worin Ra, Rb, Rc, Re, Rf und n wie für die Formel I definiert sind und alle Aminosäuren die für die Formel (I) angegebene chirale Form besitzen. Solche Verbindungen besitzen weiterhin eine anhaltende in vivo-Aktivität, und zu besonders bevorzugten Beispielen zählen pGlu-Glu-Asp-Phe-Lys und pGlu- Gly-Asp-Phe-Lys.
Eine Inhibition der Leukozytenfunktion (einschließlich des Immunsystems) zusätzlich zur Hämatopoese kann durch geringfügige Modifikationen der Aminosäuresequenz, insbesondere durch Austausch von Glu² durch Gly², erreicht werden. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden somit Verbindungen der Formel
Ra - HN - CH&sub2; - CO - Rc - Rd - (Re)n - Rf (IV)
bereitgestellt, worin Ra, Rc, Rd, Re, Rf und n wie für die Formel (I) definiert sind und alle Aminosäurereste die für die Formel (I) angegebene chirale Form besitzen. Zu bevorzugten Verbindungen dieser Formel zählen pGlu-Gly-Asp-Phe- Lys und pGlu-Gly-Asp-Cys-Lys, wobei man bei letzterer festgestellt hat, daß sie zusätzlich zu ihren hämatopoetischen, inhibitorischen Wirkungen die Wanderung von Granulozyten und Macrophagen in vivo (durch Bildung einer Hautöffnung bei Meerschweinchen und lokaler BSG-Stimulierung) und die Aufnahme von Staphylococcus aureus durch Granulozyten in vitro (gemessen mittels Durchflußzytometrie) inhibiert.
Eine Gruppe von Peptiden, denen die hämatopoetischen, inhibitorischen Wirkungen völlig fehlen, die durch die Inhibition der epidermalen und epithelialen Zellproliferation ersetzt sind, kann durch Austausch des Cysteinrestes an der Position 4 durch einen Serinrest hergestellt werden. Solche erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen die Formel
worin Ra, Rb, Rc, Re, Rf und n wie für die Formel I definiert sind und alle Aminosäuren die für die Formel (I) angegebene chirale Form besitzen. Zu bevorzugten Verbindungen zählen
pGlu-Glu-Asp-Ser-Lys
pGlu-Asp-Glu-Ser-Lys
und pGlu-Glu-Glu-Ser-Lys.
Diese Verbindungen sind von großem Nutzen bei der Inhibition der nicht-hämatopoetischen Zellproliferation während einer ausgewählten zytostatischen Behandlung von malignen hämatopoetischen Zellen, und weiterhin bei der Suppression von malignen epidermalen und epithelialen Zellen, die beispielsweise in fortgeschrittenen Stadien von squamösen Karzinomen und Psoriasis auftreten.
Schließlich ist es möglich, die erfindungsgemäßen Peptide zum Lenken ("Target") anderer Moleküle zu verwenden, indem das Molekül an die Peptidkette gekoppelt wird. Dementsprechend werden bereitstellt:
(a) Verbindungen zur Verwendung bei einer Therapie, einer Diagnose oder einem Assay, die ein Radioisotop oder einen radiomarkierten Liganden umfassen, die direkt oder indirekt an ein erfindungsgemäßes Peptid kovalent gebunden sind;
(b) Verbindungen zur Verwendung bei einer Therapie, die einen zytotoxischen Liganden umfassen, der kovalent an ein erfindungsgemäßes Peptid gebunden ist; und
(c) Verbindungen zur Verwendung bei einer Diagnose oder einem Assay, die einen fluorochromen Liganden umfassen, der kovalent an ein erfindungsgemäßes Peptid gebunden ist.
Um einen Schutzeffekt gegen zytotoxische Arzneimittel auszuüben, können die erfindungsgemäßen Peptide im allgemeinen menschlichen Patienten durch Injektion in einem Dosisbereich von 1-10 ng, beispielsweise von 4-5 ng, pro 70 kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden. Bei Verabreichung durch Infusion oder ein entsprechendes Verfahren kann die Dosis im Bereich von 30-300 ng pro 70 kg Körpergewicht, beispielsweise bei etwa 100 ng, über sechs Tage hinweg liegen. Prinzipiell ist es wünschenswert, eine Peptidkonzentration von etwa 10&supmin;¹¹M bis 10&supmin;&sup7;M in der extrazellulären Flüssigkeit des Patienten herzustellen.
Im allgemeinen erfordert eine Kombinationstherapie mit zytotoxischen Arzneimitteln wie Zytosin-Arabinosid einen genauen Zeitplan, um sicherzustellen, daß das myelopoetische System geschützt ist, während das zytotoxische Arzneimittel noch vorhanden ist.
Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden pharmazeutische Mittel bereitgestellt, die als aktiven Bestandteil wenigstens eine Verbindung der Formel (Ia), (II), (III), (IV), (V), die oben definiert sind, oder ein physiologisch verträgliches Salz davon, zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten umfassen. Die erfindungsgemäßen Mittel können beispielsweise in einer zur oralen, nasalen, parenteralen oder rektalen Verabreichung geeigneten Form vorliegen.
Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch" schließt tierärztliche Anwendungen der Erfindung ein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in den üblichen pharmakologischen Verabreichungsformen vorliegen, wie Tabletten, beschichteten Tabletten, Nasensprays, Lösungen, Emulsionen, Pulver, Kapseln oder Formen mit Langzeitwirkung. Zur Herstellung dieser Formen können übliche pharmazeutische Exzipienten sowie übliche Herstellungsverfahren angewendet werden. Tabletten können beispielsweise durch Vermischen des aktiven Bestandteils oder der Bestandteile mit bekannten Exzipienten hergestellt werden, wie zum Beispiel mit Verdünnungsmitteln, wie Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Lactose, Desintegratoren, wie Maisstärke oder Alginsäure, Bindemitteln, wie Stärke oder Gelatine, Lubrikantien, wie Magnesiumstearat oder Talkum, und/oder Mitteln, um eine Langzeitwirkung zu erzielen, wie Carboxypolymethylen, Carboxymethylcellulose, Celluloseacetatphthalat, oder Polyvinylacetat.
Falls gewunscht, können die Tabletten aus mehreren Schichten bestehen. Beschichtete Tabletten können durch die Beschichtung von Kernen, die entsprechend den Tabletten erhältlich sind, mit Mitteln, die üblicherweise zur Tablettenbeschichtung verwendet werden, wie zum Beispiel Polyvinylpyrrolidon oder Schellack, Gummi arabicum, Talkum, Titandioxid oder Zucker hergestellt werden. Um eine Langzeitwirkung zu erreichen oder um Unverträglichkeiten zu vermeiden, kann der Kern auch aus mehreren Schichten bestehen. Die Tablettenbeschichtung kann weiterhin aus mehreren Schichten bestehen, um eine Langzeitwirkung zu erreichen, wobei die oben erwähnten Exzipienten für die Tabletten verwendet werden können.
Injektionslösungen können beispielsweise auf übliche Weise hergestellt werden, wie durch die Zugabe von Konservierungsmitteln, wie p-Hydroxybenzoate, oder Stabilisatoren, wie EDTA. Die Lösungen werden sodann in Injektionsvials oder Ampullen gefüllt. Injektionen zur verzögerten Freisetzung können durch sogenannte Minipumpen bereitgestellt werden.
Nasensprays können entsprechend in wäßriger Lösung formuliert und in Spraybehälter gepackt werden, die entweder ein Aerosoltreibmittel enthalten oder mit Mitteln zur manuellen Kompression versehen sind. Kapseln, die einen oder mehrere aktive(n) Bestandteile(n) enthalten, können beispielsweise hergestellt werden, indem man die aktiven Bestandteile mit inerten Trägern, wie Lactose oder Sorbitol, vermischt und das emisch in Gelatinekapseln füllt.
Geeignete Suppositorien können beispielsweise hergestellt werden, indem man den aktiven Bestandteil oder Kombinationen von aktiven Bestandteilen mit üblichen Trägern, die für diesen Zweck vorgesehen sind, wie natürliche Fette oder Polyethylenglykol oder Derivate davon, vermischt.
Dosiseinheiten, die die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, enthalten vorzugsweise 1 bis 10 mg, beispielsweise 4-5 mg, des Peptides.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auf jede übliche Weise synthetisiert werden. Im allgemeinen werden die vorhandenen reaktiven Seitenkettengruppen (Amino, Thiol und/oder Carboxyl) während der Kopplungsreaktionen der gesamten Synthese geschützt werden, aber es ist möglich, einige Seitenkettengruppen (Hydroxygruppen, Imidazolgruppen, primäre Ainidgruppen, Amidgruppen in cyclischen Aminosäuren, wie pyroGlu) während des gesamten Syntheseverfahrens ungeschützt zu lassen.
Der abschließende Schritt wird damit die Entschützung eines vollständig oder teilweise geschützten Derivates eines Peptides der allgemeinen Formel I sein. Solche Verfahren bilden einen weiteren erfindungsgemäßen Aspekt.
Beim Aufbau der Peptidketten kann man prinzipiell entweder am C-Terminus oder am N-Terminus beginnen, wobei nur das Verfahren, das beim C-Terminus beginnt, üblicherweise verwendet wird.
Somit kann man am C-Terminus mit der Reaktion eines geeignet geschützten Derivates von beispielsweise Lysin mit einem geeignet geschützten Derivat von Cystein beginnen. Das Lysin-Derivat besitzt eine freie α-Aminogruppe, während der andere Reaktionspartner entweder eine freie oder eine aktivierte Carboxylgruppe und eine geschützte Aminogruppe besitzt. Nach der Kopplung können die Zwischenprodukte beispielsweise durch Chromatographie gereinigt und sodann N-entschützt werden, wodurch die Addition eines weiteres N-geschützten und freien oder aktivierten Aminosäurerestes möglich wird. Dieses Verfahren wird weitergeführt, bis die gewünschte Aminosäuresequenz vollständig ist. Zu Carbonsäureaktivierte Substituenten, die beispielsweise verwendet werden können, zählen symmetrische oder gemischte Anhydride oder aktivierte Ester, wie beispielsweise p-Nitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, N-Hydroxybenzotriazolester (OBt), N-Hydroxysuccinimidylester (OSu) oder Pentafluorphenylester (OPEP).
Die Kopplung der freien Amin- und Carboxylgruppen kann beispielsweise unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) bewirkt werden. Ein weiteres Kopplungsmittel, das verwendet werden kann, ist beispielsweise N-Ethoxycarbonyl-2- ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ).
Geeigneterweise werden im allgemeinen die Kopplungsaktionen bei niedrigen Temperaturen bewirkt, zum Beispiel bei -20ºC bis zur Umgebungstemperatur, üblicherweise in einem geeigneten Lösungsmittelsystem, zum Beispiel Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid, Methylenchlorid oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel.
Es kann günstiger sein, die Synthese an einem Festphasen- Harzträger durchzuführen. Chlormethyliertes Polystyrol (quervernetzt mit 1 % Divinylbenzol) stellt einen brauchbaren Trägertyp dar; in diesem Fall wird die Synthese am C-Terminus beginnen, zum Beispiel durch Kopplung des N-geschützten Lysins an den Träger.
Mehrere geeignete Festphasenverfahren sind beschrieben worden von Eric Atherton, Christopher J. Logan, und Robert C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin I, 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng, und R.B., Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 102, 6117-27 (1980); James P. Tam, Richard D. Dimarchi und R. B. Merrifield, Int. J. Peptide Protein Res. 16, 412-25 (1980); Manfred Mutter und Dieter Bellof, Helvetica Chimica Acta 67 2009-16 (1984).
Eine große Anzahl Schutzgruppen für Aminosäuren sind bekannt und beispielsweise erwähnt in Schröder, E., und Lübke, K., The Peptides, Vol. 1 und 2, Academic Press, New York und London, 1965 und 1966; Pettit, G.R., Synthetic Peptides, Vol. 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 und 1976; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, Band 15, Georg Thieme Verlag Stuttgart,NY, 1983; The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology 1-7, Herausg.: Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY, San Francisco, London; Solid phase peptide synthesis 2. Aufl., John M. Stewaet, Janis D. Young, Pierce Chemical Company.
So zählen zum Beispiel zu Aminschutzgruppen, die verwendet werden können, Schutzgruppen wie Carbobenzoxy (Z-), t- Butoxycarbonyl (Boc-), 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl (Mtr-), und 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc-). Es ist ersichtlich, daß, falls das Peptid vom C-terminalen Ende her aufgebaut wird, eine Aminschutzgruppe an der α-Aminogruppe jedes neuen, zugefügten Restes vorhanden ist, die selektiv vor dem nächsten Kopplungsschritt entfernt werden muß. Eine besonders geeignete Gruppe für einen solchen zeitweiligen Schutz eines Amins ist die Fmoc-Gruppe, die durch Behandlung mit Piperidin in einem organischen Lösungsmittel selektiv entfernt werden kann.
Zu Carboxylschutzgruppen, die verwendet werden können, zählen beispielsweise leicht spaltbare Estergruppen, wie Benzyl (-OBZl), p-Nitrobenzyl (-ONB), oder t-Butyl (-TOBu), sowie die Kopplung an feste Träger, zum Beispiel an mit Polystyrol verbundene Methylgruppen.
Zu Thiolschutzgruppen zählen p-Methoxybenzyl(Mob), Trityl (Trt) und Acetamidomethyl (Acm).
Es ist ersichtlich, daß eine große Anzahl weiterer solcher Gruppen existiert, wie sie beispielsweise in den oben erwähnten Veröffentlichungen detailliert erwähnt sind, und die Verwendung all dieser Gruppen in den vorher beschriebenen Verfahren fällt unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Es gibt eine große Anzahl Verfahren zur Entfernung von Amin- und Carboxylschutzgruppen. Diese müssen jedoch im Einklang mit der angewendeten Synthesestrategie stehen. Die Seitenkettenschutzgruppen müssen unter den verwendeten Bedingungen stabil sein, um die zeitweiligen α- Aminoschutzgruppen vor dem nächsten Kopplungsschritt zu entfernen.
Aminschutzgruppen, wie Boc und Carboxylschutzgruppen, wie tOBu können gleichzeitig durch Säurebehandlung, beispielsweise mit Trifluoressigsäure, entfernt werden. Thiolschutzgruppen, wie Trt, können selektiv unter Verwendung eines Oxidationsmittels, wie Jod, entfernt werden.
Die Cystein-enthaltenden Peptide können durch die im Text beschriebenen Verfahren synthetisiert werden, wobei alle Schutzgruppen, einschließlich der Thiolschutzgruppen, als letztem Syntheseschritt entfernt werden.
Die folgenden Beispiele dienen nur der Erläuterung.
Die Lösungsmittel wurden aus kommerziell erhältlichen Substanzen redestilliert und folgendermaßen gelagert: Dimethylformamid (DMF) über Molekularsieb 4A, Dichlormethan (DCM) über CaCl&sub2;, Triethylamin (TEA) über Na/Pb- Legierung(Baker) und Trifluoressigsäure (TFA) über Molekularsieb 4A.
Es wurden folgende TLC-Systeme verwendet:
S&sub1;: Silica/CHCl&sub3;: MeOH (98:2)
S&sub2;: Silica/CHCl&sub3;: MeOH (95:5)
S&sub3;: Silica RP 8/0.1% TFA in 5% EtOH (aq).
Die gereinigten Endprodukte wurden durch Reversed Phase- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Das HPLC-System bestand aus einem HP 1090M-Chromatographen mit einem eingebauten Autosampler und einem HP 1040 Diodenarray (Hewlet-Packard, Waldbronn, FRG), und einer Supelcosil LC-18- Säule (250 x 4,6 mm, 5 µm Teilchen). Die Proben wurden in 0,1 % (V/V) TFA (aq) gelöst und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 30 % Acetonitril in 0,1 % TFA (aq.) eluiert. Die Flußrate betrug 2ml/min. Der Eluent wurde bei 214 nm bei einer Bandbreite von 4nm überwacht. Das Chromatogramm des Lösungsmittels wurde elektronisch subtrahiert, und die Resultate wurden in Form von Flächenprozenten dargestellt.

Aminosäureanalyse:

Die Cystin-enthaltenden Peptide wurden mit Perameisensäure oxidiert, wodurch die säurelabilen Cystinreste in die säurestabile Cysteinsäure überführt wurde, bevor eine 16- stündige Säurehydrolyse in 6 M HCl bei 110ºC stattfand. Die trockenen Hydrolysate wurden sodann unter Verwendung von Phenylisothiocyanat derivatisiert und wie von Heinrikson beschrieben (Anal. Bioch. 136, 65-74, 1984) analysiert.

BEISPIEL 1

L-PYROGLUTAMYL-L-GLUTAMYL-L-ASPARTYL-L-CYSTEINYL-L-LYSIN:

Verbindung (1)

(a) t-Boc-(S-p-METHOXYBENZYL)-L-CYSTEINYL- (&epsi;-BENZYLOXYCARBONYL)-L-LYSIN BENZYLESTER (I)

&epsi;-Benzyloxycarbonyl-lysin-benzylester-Hydrochlorid (406 mg) wird in 3 ml DMF gelöst, und TEA wird zugegeben, bis freies TEA in der Dampfphase mit einem angefeuchteten Stück pH-Indikatorpapier nachgewiesen werden kann. Zu dieser Lösung wird t-Boc-(S-p-methoxybenzyl)-L-cystein-N-hydroxysuccinimidester (491 mg), gelöst in 3 ml DMF, zugegeben. In geeigneten Zeitintervallen werden TEA-Portionen zugegeben, um die leichte Alkalinität der Lösung aufrechtzuerhalten. Man läßt das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehen, und appliziert es, nach Überprüfung auf eine negative Ninhydrin-Reaktion, direkt auf eine 2,5x75 cm Sephadex LH-20-Säule, die mit DMF äquilibriert und mit Standardreaktionspartnern (z.B. in dem angegebenen Beispiel t-Boc-(γ-benzyl)-L-glutaminsäure-p-nitrophenylester und p-Nitrophenol) kalibriert worden war. Der Säulenfluß wird durch Schwerkraft aufrecht erhalten, und der Effluent wird bei 280 nm vor dem Sammeln in Fraktionen von ungefähr 10 ml überwacht. Das Produkt kann durch DC der jeweiligen Fraktion identifiziert werden, die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum verdampft; Ausbeute: 700 mg (100 %) eines öligen Produktes, bei DC homogen (Chloroform/Aceton (9/1), Rf = 0,64.

(b) t-Boc-(β-BENZYL)-L-ASPARAGYL-(S-n-METHOXYBENZYL)- L-CYSTEINYL-(&epsi;-BENZYLOXYCARBONYL)-L-LYSIN-BENZYL-ESTER (II)

700 mg des blockierten und geschützten Dipeptides (I) werden in 25 ml wasserfreiem DCM gelöst, und 25 ml wasserfreie TFA werden zugegeben. Nach 30 Minuten werden die Säure und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in DCM gelöst und wiederum eingedampft. Zu einer Lösung des Rückstandes in DMF (3 ml), das mit TEA leicht alkalisch gemacht worden ist, wird eine Lösung von t-Boc-(β-benzyl)-L- asparaginsäure-p-nitrophenylester (488 mg) in 3 ml DMF zugegeben. Die Alkalinität sollte wiederholt überprüft und durch Zugabe von geringen Mengen TEA aufrechterhalten werden. Nachdem die Ninhydrinreaktion negativ geworden ist (nach etwa 2 Stunden), wird das Reaktionsgemisch auf eine Sephadex LH-20- Säule (2,5x75 cm) appliziert und, wie oben beschrieben, gereinigt. Die Ausbeute beträgt nach dem Verdampfen unter Vakuum: 900 mg (100 %) eines kristallinen Produktes, auf DC homogen (Chloroform/Aceton (9/1)), Rf = 0,70.

(c) t-Boc-(γ-BENZYL)-L-GLUTAMYL-(β-BENZYL)- L-ASPARAGYL-(S-p-METHOXYBENZYL)-L-CYSTEINYL-(&epsi;-BENZYLOXY- CARBONYL)-L-LYSIN-BENZYLESTER (III)

900 mg des blockierten Tripeptid-Derivates II werden mit TFA, wie oben beschrieben, entschützt, in 3 ml DMF gelöst und mit TEA leicht alkalisch gemacht. Zu dieser Lösung werden 504 mg t-Boc-(γ-benzyl)-L-glutaminsäure-p-nitrophenylester (in 3 ml DMF) zugegeben. Nach etwa 2,5 Stunden wird die Ninhydrinreaktion negativ, und das Gemisch wird auf eine Sephadex LH-20- Säule zur Reinigung, wie oben beschrieben, appliziert. Die Trennung der Bestandteile dieses Reaktionsgemisches und die Überwachung durch DC wird wie oben beschrieben durchgeführt. Geeignete Fraktionen (9-15 in diesem Fall) werden vereinigt, eingedampft und getrocknet. Ausbeute: 1140 mg (100%) eines blaβ-gelben Öles, auf DC homogen (Chloroform/Aceton (9/1)), Rf = 0,53.

(d) BENZYLOXYCARBONYL-L-PYROGLUTAMYL-(γ-BENZYL)- L-GLUTAMYL-(β-BENZYL)-L-ASPARAGYL-(S-p-METHOXYBENZYL)- L-CYSTEINYL-(&epsi;-BENZYL-OXYCARBONYL)-L-LYSIN-BENZYLESTER (IV)

1140 mg des Tetrapeptid-Derivates III werden mit TFA in DCM, wie bei I beschrieben, entschützt und in 3 ml DMF gelöst. Die Lösung wird mit TEA leicht alkalisch gemacht, und 423 mg Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutaminsäure-p-nitrophenylester werden in 3 ml DMF gelöst zugegeben. Die Alkalinität des Reaktionsgemisches sollte wiederholt überprüft, und falls notwendig, durch Zugabe von TEA wiederhergestellt werden. Nach etwa 3 Stunden wird der Ninhydrin-Test negativ, und das Pentapeptid-Derivat IV kann, wie oben beschrieben, gereinigt werden. Die Ausbeute beträgt 1230 mg (96 %) eines blaßgelben Öls, auf DC homogen (Chloroform/Aceton (9/1)), Rf = 0,44 (mit "Tailing").

(e) L-PYROGLUTAMYL-L-GLUTAMYL-L-ASPARAGYL-CYSTEINYL-L-LYSIN

50 mg des geschützten Pentapeptid-Derivates IV werden in 50 ml flüssigem Fluorwasserstoff bei 0ºC unter Zugabee von 500 mg Methionin als Scavenger gelöst und 1 Stunde stehengelassen. Sodann wird der Fluorwasserstoff bei 0ºC unter Vakuum zur Trockene verdampft und der Rückstand mit Ethylacetat gerührt. Die Ethylacetat-Waschlösung wird dekantiert und verworfen. Die verbleibende Substanz wird in verdünnter Essigsäure gelöst und lyophilisiert.
Die lyophilisierte Substanz (2mg) kann gereinigt werden durch Reversed Phase-HPLC unter Verwendung einer C18-Säule (10mm x 10cm) bei einer Flußrate von 2,8 ml pro Minute unter Verwendung einer Gradientenelution mit Lösung A: 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure, und Lösung B: 0,1 %Trifluoressigsäure in Acetonitril; wobei 0,10 % der Lösung B im Verlauf von 30 Minuten zugegeben werden. Die Detektion wird unter Verwendung der Ultraviolettabsorption bei 214 nm oder mit einem Pyridindisulphidreagens (für SH-Gruppen) durchgeführt.
Mehrere weitere Peptide können mit dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 1 synthetisiert werden. Diese sind in der folgenden Tabelle identifiziert und charakterisiert: TABELLE BEISPIEL AMINOSÄUREANALYSE REINHEIT/HPLC KEINE DATEN Die Peptide wurden durch DC, HPLC und Aminosäureanalyse charakterisiert. TABELLE (Fortsetzung) BEISPIEL AMINOSÄUREANALYSE REINHEIT/HPLC KEINE DATEN Die Peptide wurden durch DC, HPLC und Aminosäureanalyse charakterisiert.

BEISPIEL 30

pGlu-Glu-Asp-Ser-Lys-OH

Das Peptid wurde auf einer vollautomatischen Peptidsynthesemaschine LKB Biolynx 4170 unter Überwachung bei UV 304 nm synthetisiert. Fmoc wurde als zeitweiliger N-Schutz und UV-Tracer verwendet. Die C-terminale Aminosäure wurde an das Polymer über einen säureempfindlichen Spacerarm gebunden.
Das Standardprotokoll war wie folgt:
Kopplung unter Rezirkulation 30 min.
Waschen mit DMF 10 min.
Entschützen mit 20 % Piperidin(DMF) 10 min.
Waschen mit DMF 10 min.
Die C-terminale Aminosäure wurde als symmetrisches Anhydrid mit DCC aktiviert und an das Polymer mit N,N-Dimethylaminopyridin als Katalysator gekoppelt. Nach 60-minütigem Kreislauf wurde das Standardverfahren während der gesamten Synthese angewendet.
Verwendete Aminosäurederivate:
Fmoc-Lys(&epsi;-N-boc)-OH
Fmoc-Ser(O-tBu)-ODBH
Fmoc-Asp(β-tOBu)-Opfp
Fmoc-Glu(ν-tOBu)-OPfp
pGlu-OPClP
Nach dem abschließenden Waschschritt des vollständig geschützten Pentapeptides wurde das Polymer mit Diethylether gewaschen und an der Luft getrocknet.
Das Peptid wurde vollständig entschützt und von dem Polymer in einem Arbeitsschritt durch einstündige Behandlung mit 95 % wäßrigem TFA abgespalten. Nach einer Filtration, Waschen mit TFA und Verdampfen wurde das erhaltene Peptid auf einer RP-8-Säule gereinigt und mit Ethanol in 0,1 % TFA eluiert.
Ausbeute: 44 %
Reinheit: Mehr als 92 % (HPLC RP18, 214 nm).
Aminosäureanalyse: Akzeptabel.

Claims

1. Verwendung von Verbindungen der Formel (I)

Ra - Rb - Rc - Rd - (Re)n - Rf (I),

worin Ra

bedeutet,

Rb

bedeutet,

Rc

bedeutet,

Rd

bedeutet,

Re

bedeutet und

Rf

bedeutet,

(worin n und m unabhängig voneinander 0 oder 1 bedeuten;

p und q unabhängig voneinander 1 oder 2 bedeuten;

R¹ und R² beide für ein Wasserstoffatom stehen oder zusammen eine Oxogruppe bedeuten;

R³ und R&sup4; beide für ein Wasserstoffatom stehen oder zusammen eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung bedeuten;

R&sup5; für Wasserstoff oder eine C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Acyl-Gruppe steht;

R&sup6; und R&sup7; unabhängig voneinander eine Hydroxygruppe oder eine Aminogruppe bedeuten;

R&sup8; Wasserstoff; eine C&sub2;&submin;&sub6;-Alkylgruppe; oder eine C&sub7;&submin;&sub2;&sub0;- Aralkylgruppe, die eine oder mehrere Hydroxy-, Amino- oder Methoxy-Substituenten tragen kann, bedeutet;

R&sup9; Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeutet;

R¹&sup0; eine Hydroxy- oder eine Aminogruppe, den Aminosäurerest Glutamin oder ein Peptid mit einer N-terminalen Glutamin- Einheit bedeutet;

und außer Alanin, das in der D- oder L-Form vorliegen kann, und Glycin, alle Aminosäurereste die L-Form besitzen) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung der nicht-hämatopoetischen Zellproliferation.

2. Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch 1, außer pGlu- Asp-Asp-Cys-Lys, und mit der Maßgabe, daß, falls Ra für p- Glu, Rb für Glu oder Gln, Rc für Asp und Rd für Cys steht, Rf dann nicht Lys oder Lys-NH&sub2; bedeuten kann, zur Verwendung als Mittel zur Kontrolle der Zellproliferation.

3. Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch 1, wobei R&sup5; für den Aminosäurerest Serin oder für ein Peptid mit einer C- terminalen Serin-Einheit steht, und/oder R¹&sup0; für den Aminosäurerest Glutamin oder für ein Peptid mit einer N- terminalen Glutamin-Einheit steht.

4. Verbindungen der Formel (II)

worin Ra, Rb, Rc, Re, Rf und n wie in Anspruch 1 definiert sind, R¹¹ für eine C&sub2;&submin;&sub6;-Alkyl- oder eine C&sub7;&submin;&sub2;&sub0;-Aralkyl-Gruppe, die eine oder mehrere Hydroxy-, Amino- oder Methyl- Substituenten tragen können, steht, und alle Aminosäuren die in Anspruch 1 definierte chirale Form besitzen.

5. Verbindungen der Formel (III)

worin Ra, Rb, Rc, Re, Rf und n wie in Anspruch 1 definiert sind und alle Aminosäuren die in Anspruch 1 definierte chirale Form besitzen.

6. Verbindungen der Formel (IV)

Ra - HN - CH&sub2; - CO - Rc - Rd - (Re)n - Rf (IV)

worin Ra, Rc, Rd, Re, Rf und n wie in Anspruch 1 definiert sind, und alle Aminosäure-Reste die in Anspruch 1 definierte chirale Form besitzen.

7. Verbindungen der Formel (V)

worin Ra, Rb, Rc, Re, Rf und n wie in Anspruch 1 definiert sind, und alle Aminosäuren die in Anspruch 1 definierte chirale Form besitzen.

8. Pharmazeutisches Mittel, umfassend als aktiven Bestandteil wenigstens eine der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7 oder ein physiologisch verträgliches Salz davon, in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger oder Excipienten.

9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei man ein vollständig oder teilweise geschütztes Derivat der Verbindung bildet, und das Derivat entschützt.