JPH04500666A - ペプチド化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド化合物 本発明は細胞の増殖に阻害作用を有するペプチドの使用、および特異的および／ または一般的抑制作用を有する新規ペプチドに関する。

哺乳動物の体は途方もなく様々な構造および機能を有する細胞を含んでおり、ま た分化および発育の機序は多くの研究の的となっている。連続的ターンオーバー を有する細胞の系については、その機序に共通的に分裂しかつ絶えず幹細胞をそ の系に供給する多能性幹細胞の貯蔵器（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）が関与しているこ とが知られている。この“貯蔵器°から供給された幹細胞は最初は均一であるが 、まもな（一つの、あるいは他の形態に変化することが決まり、引き続き所要の 機能細胞へと発育してい（。

かかる幹細胞系の例は貴髄の造血系および上皮系および表皮系である。

狭い一般式に対応するペプチドが造血（ＥＰ−＾−０１１２６５６参照）を阻害 でき、一方、わずかにそれより広い一般式に対応しそしてジスルフィド橋により 連結されている一部の二量体ペプチドが造血を刺激し得る（１０８ｇ１０３５３ ５参照）ことは既に報告されている。しかしながら、いずれの場合も、造血以外 の系に対しては何の効果も認められないと述べられている。

今般状々は驚くべきことに、ＥＰ−＾−０１１２６５６に開示されたペプチドの 一部を含め一部のペプチドがより一般的な細胞増殖阻害能を有していること、お よびアミノ酸配列のわずかな修飾および／または臨界的側鎖残基のブロッキング を行うことによって該ペプチドの作用を特徴とする特定の系に向けることができ ることを見出した。

我々の知見は、ある種のいわゆるＧ−プロティン、すなわちＧ１１１プロテイン の中に前述の我々の特許出願に開示されたペンクペプチド配列の一部が存在する という所見に基づいている。Ｇプロティンは、細胞膜の内側に存在しそして細胞 内側のＧプロティン近くに位置する膜内外の受容体および奏効体の間の不可欠な リンクを提供する。それらはそれらのリンクしている奏効体に応じて多くの細胞 機能に関与している。それらは三つのリンクしたサブユニットα、βおよびγよ り成りそのαサブユニットは隣接奏効体の活性化に関与している。Ｇプロティン は最初にそれらの機能によって特徴付けられ、またＧ。

プロティンのサブクラスはもともとアデニレートサイクラ−ぜを阻害することが 見出されたものである。この所見によって上皮および表皮系および細胞系一般の 増殖阻害におけるそれらペプチドの役割を考察するに到ったのである。

すなわち、本発明により、我々は式（Ｉ）Ｒ”−Ｒｂ−ＲＣ−Ｒ’−（Ｒｅ）ｎ −Ｒ’　（Ｉ　）Ｈａは Ｈｂは ｐｄは Ｂｆは または　−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＲ’・ （式中、ｎおよびｍは独立的に０または１を表わし；ｐおよびｑは独立的に１ま たは２を表わし；Ｒ１およびＲ２はいずれも水素原子であるかまたは一緒になっ てオキソ基を表わし； Ｒ３およびＲ４はいずれも水素原子であるかまたは一緒になって炭素−炭素結合 を表わし； Ｒ５は水素またはアシル基であり； Ｒ６およびＲ７は独立的にヒドロキシ基またはアミノ基を表わし； Ｒ８は水素；Ｃト、アルキル基；−個以上のヒドロキシ、アミノまたはメトキシ 置換分を有していてもよいｃ、−２゜アルアルキル基；または代謝的に不安定な Ｓ−保護基であり； Ｒ９は水素またはメチル基を表わし； Ｒ目はヒドロキシまたはアミノ基、アミノ酸グルタミンのまたはＮ−末端グルタ ミン単位を有するペプチドの残基を表わし；そしてＤまたはＬ型であってよいア ラニン、およびグリシンは別として、前記アミノ酸残基はすべてし型である）〕 で示される化合物を非造血細胞の増殖を阻害するための医薬の調製に使用するこ とに関する。

Ｎ−末端保護基Ｒ５が存在する場合、これは前示の如く、１〜２０個の炭素原子 を有するアシル基、例えば１〜５個の炭素原子を有する低級アルカノイル基例え ばアセチル基、または７〜２０個の炭素原子を有するアロイルまたはアルアルカ ノイル基例えばベンゾイルまたはフェニルアセチル基などであってよい。

Ｒ＠はアミノ酸またはペプチド鎖から導かれるアシル基であってよい。Ｒ８はセ リンから導かれるアシル基、または次のアミノ酸配列から順次Ｎ−末端アミノ酸 を除去したペプチドのいずれかから導かれるアシル基であってよい：　Ｌｙｓ− １１ｅ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ０以下詳述 するように、前述の配列またはその一部を有するペプチドは生長阻害を含む多（ の細胞機能をコントロールすることが知られているＧ１．プロティンと高レベル の相同性を有している。式（１）で示される全体ペプチドの末端アミノ基は好ま しくは、例えばアルカノイル、アルアルカノイルまたはアロイル基でアシル化す ることにより保護される。

Ｒ８がＣトロアルキル基である場合、これは例えばエチル、ブチルまたはヘキシ ル基であってよい。Ｒ８がアルアルキル基である場合、これは好都合には、アリ ールメチル基例えばベンジル、ジフェニルメチルまたはトリフェニルメチルなど であってよい。Ｒ８が代謝的に不安定な基である場合、これは例えば５〜１０個 の炭素原子を有するアリールチオ基、例えばピリジルチオ基、または前記定義に 係るようなアシル基であってよい。

本発明化合物は好ましくはペンタペプチドである、すなわちｎは好ましくは０で ある。

Ｈａ残基の環状基は好ましくは５員である、すなわちｍ（ｊ好ましくは０である 。

造血系に加えであるいは造血系が除かれていても広範囲に及ぶ細胞の増殖を本発 明のペンタペプチドが阻害できるということは、例えば幹癖の場合などのように 過剰の細胞増殖が治療を要する場合、あるいは癌療法が特定の細胞集団に傷害を 与えやすい場合の医療に価値がある。

多くの細胞タイプは抗癌療法に用いられる細胞傷害薬または放射線に対し特に影 響を受けやすい。知られている一つの方法は抗癌療法中に例えば造血系細胞のよ うな細胞の増殖を聞書する薬を使用後、その阻害薬の作用が消失した後正常増殖 を再開する方法である。本発明のペプチドはかかる療法に対して適度に短い生物 学的半減期を有するように思われる。同様に、癌療法の影響を受けやすい所定の 細胞集団の増殖を癌細胞と同時に阻害してもよく、そしてそれら癌細胞が影響を 受けやすい増殖期に達する一方正常細胞はそれ程影響を受けやす（ない期にある 場合にのみ抗癌療法を開始する。

一つのタイプの細胞増殖は、骨髄細胞、食細胞または顆粒球を治療中にＣＳＦ薬 で刺激した場合に起こる。細胞生長阻害はかかる細胞を正常生長速度に戻すこと ができる。

多（の自己免疫病において、患者は自身の組織に対して活性のある白血球を産生 ずる。白血球の機能を少（ともある時間阻害することによってかかる自己免疫反 応はそれに応じて低下する。

Ｇ＃、プロティンの細胞内外信号機序（ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａ ｌｌｉｎｇ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）に関与することによってＧ、、プロティンに よりコントロールされている他の機能、Ｇ、！プロティンの介在する例えばカル シウム代謝細胞可動性および細胞質細胞過程を活性ペプチドで改変することがで きる。

すなわち、本発明は前述のＧａＬプロティン、すなわち−−−Ｌｙｓ−１１ｅ− １１ｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｒａ′−Ｒｂ−Ｒ ’−Ｒ’−Ｒｅ−Ｒ’−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−−一またはその部分またはそれらのわ ずかなバリエージＢン、例えばＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５６ｐ ｐ、　６２４−６２５（１９８７）およびＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　 Ｓｃｉ、υ５Ａ８５　ｐｐ、　３０６６−３０７０（１９８釦に記載されている ようなものと実質的に相同の完全または部分配列を含む新規ポリペプチドを提供 する。かかる配列は該ポリペプチドの標識を助けるために少くとも一つのＴｙｒ 残基を含有する。以下に示されるとおり、Ｎ−末端ＮＵ、は好ましくは、例えば 前述の如きＮ−アシル化によって保護される。Ｎ−末端アミノ酸残基がかかる相 同配列におけるＧｌｕである場合には、これは有利にはｐ−Ｇｌｕによって置き 換えてもよい。

かかるペプチドは式（Ｉａ）の化合物と記すこととするが、前記定義に係る式（ １）（式中Ｒ８はアミノ酸セリンまたはＣ−末端セリン単位を有するペプチド鎖 から導かれるアシル基であり、および／またはＲＩＯはアミノ酸グルタミンまた はＮ−末端グルタミン単位を有するペプチドの残基である）の化合物として表わ すことができる。それらは好ましくは全部で１２個までの、より好ましくは１０ 個以下のアミノ酸残基を含む。

一般に付加されたいずれのペプチド配列もそのＮ−末端ＮＨ２は例えばアシル化 によって保護されるべきである。

このことはペプチドの酵素分解の回避を助ける。

式Ｄ）に許されたＨａ残基の大部分は脱保護高化または同様の遊離Ｎｌ２基への 転化なくしてはアミノ酸付加に適していない。すなわち、Ｒ５がアミノ酸または ペプチドから導かれたアシル基以外のアシル基である場合には脱アシル化が必要 となろう。同様に、ＲＩおよびＲ１が例えばｐ−Ｇｌｕ単位などの如く、−緒に なっでオキソ基を形成するときは対応する開放鎖残基例えばＧｌｕまたはＧ　１ ．ｎなど・・・の転化が必要である。

このように本発明はこれらペプチドのＧ＃Ｉ−プロティンの介在する細胞質細胞 過程に対する作用を利用するものである。

我々が既に得ている欧州特許明細書第１１２６５６号に記載されている化合物だ けが医療番号おける何がしかの用途を有するものとして既に記載されている。前 記定義に係る式Ｉの他のすべての化合物は新規であるか、または中間体として記 載されているにすぎない。従って本発明のもう一つの特徴に従って我々は、細胞 増殖調節剤として用いるための、 ｐＧｌｕ−＾５ｐ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＬｙｓｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ｃｙｓ −ＬｙｓｐＧ１ｕ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＬｙｓｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ −Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＬｙｓｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ｃｙｓ−＾１ａ−Ｌｙｓ ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ｃｙｓ−ＬｙｓＮＦ！２以外の前記定義に係る式（ Ｉ）の化合物を提供する。

前記式（Ｉ）から選択された一部のペプチドは新規であり、そして特に望ましい 性質の組合せを有していることが見出された。すなわち、本発明の一面によれば 、式％式％（） （式中、Ｒａ、Ｒｈ、Ｒｅ、　Ｒ”、　Ｒｆオヨびｎは式■について定義したと おりであり、Ｒ１１は１個以上のヒドロキシ、アミノまたはメチル置換分を有し ていてもよい０２〜６アルキルまたは０７−２゜アルアルキル基であり、そして すべてのアミノ酸は式（Ｉ）について記載されたキラール型である） で示される化合物が提供される。この式による特に好ましい化合物は ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ｂｅｎｚｙｌｃｙｓ−ＬｙｓおよびｐＧｌｕ−＾１ ａ−Ａｓｐ−Ｂｅｎｚｙｌｃｙｓ−Ｌｙｓである。

このタイプのブロックされたシスティン残基を有する化合物では生体内安定性が 向上しそして細胞増殖阻害活性が持続することがわかった。

フェニル−置換分がさほど不安定ではない前記ベンジル−システィン化合物のア ナローブを製造することができるが、かかる化合物は４位システィン残基に代え てフェニルアラニン残基を有する。すなわち、本発明のもう一つの面によれば式 （式中Ｒ”、　Ｒｂ、　ＲＣ，Ｒｅ、　Ｒ’オヨＵ　ｎ　ハ式Ｉ　ｌ：ライｒ定 義したとおりであり、そしてすべてのアミノ酸は式（Ｉ）について記載されたキ ラール型である） で示される化合物が提供される。かかる化合物は持続生体内活性を有する。特に 好ましい例はｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＬｙｓおよびｐＧｌｕ−Ｇｌ ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓである。

これに対し、ブロックされていないペプチドの徐放を生体内で達成できるよう代 謝的に不安定なブロッキング基を有するペプチドを調製することもできる。すな わち、本発明のもう一つの面によれば式 ％式％（） （式中Ｒａ、　Ｒｂ、　ＲＣ，Ｒｅ、　Ｒ（およびｎは式１について定義したと おりであり、Ｒ目は代謝的に不安定な基、例えば２−ピリジルチオ基であり、そ してすべてのアミノ酸は式（Ｉ）について記載されたキラール型を有する）で示 される化合物が提供される。好ましい化合物の一例であるｐＧｌｕ　−Ｇｌｕ　 −Ａｓｐ　−（２−ピリジルチオＣｙｓ）　−Ｌｙｓは、ブロックされていない アナローブの場合は１日後であるのに３日後に生体内で起こる遅延造血阻害作用 を有していることが見出された。

造血に加えての白血球機能（免疫系を含む）の阻害はアミノ酸配列をわずかに修 飾する。詳細にはＧｌｕ”をｃｌｙ”で置き換えることによって達成することが できる。すなわち、本発明のもう一つの特徴によれば、式％式％（） （式中、Ｒ３、Ｈｅ、　ｐ、ｄＳＲｅＳＲｒおよびｎは式（Ｉ）について定義し たとおりであり、そしてすべてのアミノ酸残基は式（１）について記載されたキ ラール型を有する）で示される化合物が提供される。この式の好ましい化合物は ｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＬｙｓおよびｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ− Ｃｙｓ−Ｌｙｓであるが、後者はその造血阻害作用に加えて、生体内において（ モルモットに皮膚ウィンドーを形成しそしてＢＣＧで局所的に刺激することによ る）顆粒およびマクロファージの移動、および試験管内において（フローサイト メトリーにより測定）顆粒球による黄色ブドウ球菌造血阻害作用が完全に欠如し ていて表皮および上皮細胞増殖の阻害により置き換えられているペプチド群は、 ４位のシスティン残基をセリン残基で置き換えることにより製造できる。かかる 本発明化合物は式（式中、Ｒ”％　Ｆｌｂｓ　ＲＣＳＲｅ、　Ｒｆおよびｎは式 Ｉについて定義したとおりであり、そしてすべてのアミノ酸は式（Ｉ）について 記載されたキラール型を有する）で示される。好ましい化合物は ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−３ｅｒ−ＬｙｓｐＧｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−３ｅｒ −ＬｙｓおよびｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓである。

これらの化合物は、悪性造血細胞の選択された細胞静止治療中に非造血細胞増殖 を阻害するのに、そしてさらに例えば偏平上皮癌腫および乾癖の進行例に存在す る悪性表皮および上皮細胞を抑制するのに極めて有用である。

最後に、本発明によるペプチドは低分子をペプチド鎖に結合することにより該分 子を“標的”とするのに用いることができる。従って我々は （ａ）本発明によるペプチドに直接または間接に共有結合的に連結されたラジオ アイソトープまたは放射性標識リガンドより成る治療、診断または検定用化合物 ：（ｂ）本発明によるペプチドに共有結合的に連結された細胞傷害性リガンドよ り成る治療用化合物；および（Ｃ）本発明によるペプチドに共有結合的に連結さ れた蛍光色素性リガンドより成る診断または検定用化合物を提供する。

一般に、細胞傷害性薬剤に対する保護作用を発揮させるために、本発明ペプチド は患者に対し、１〜１０ｎ９例えば４〜５　ｎｙ／　７０に９　（体重）７日の 用量範囲で注射により投与することができる。インフュージョンまたは類似の方 法により投与する場合、その用量は３０〜３００ｎｇ／７０＆ｇ（体重）、例え ば約１０１００ｎ　５日としてもよい。原則的には、患者の細胞外液中のペプチ ド濃度を約１０−”Ｍ〜１０−７Ｍとするのが望ましい。

一般に、ントンンアラビノンドなどの細胞静止薬との組合せ療法は、該細胞静止 薬が依然として存在する間骨髄造血系が確実に保護されるようにするには注意深 いタイミングを必要とする。

本発明のもう一つの特徴によれば、活性成分として前記定義に係る式（Ｉａ）、 （ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＴＶ）、（Ｖ）または（Ｖｌ）で示される少くとも一 つの化合物またはその生理学的に許容し得る塩を薬学的担体または賦型剤と共に 含有し、て成る薬学的組成物が提供される。本発明による組成物は例えば経口、 経鼻、非経口または経直腸投与に適した剤形で提供することができる。

本明細書中に用いられる“薬学的”との用語は本発明を獣医学的に用いることも 包含するものである。

本発明による化合物は、慣用の薬理学的投与剤形、例えば錠剤、被覆錠、経鼻投 与用スプレー、溶液、乳濁液、粉末、カプセルまたは徐放剤型などとして提供す ることができる。これら剤形の調製には慣用の薬学的賦形剤および通常の製造方 法を用いることができる。錠剤は例えば活性成分（一種または複数種）を既知の 賦形剤、例えば希釈剤、例えば炭酸カルシウム、燐酸カルシウムまたはラクトー ス、崩壊剤、例えばコーンスターチまたはアルギン酸、結合剤例えばスターチま たはゼラチン、潤滑剤例えばステアリン酸マグネシウムまたはタルク、および／ または徐放性を得るための剤例えばカルボキシポリメチレン、カルボキンメチル セルロース、セルロースアセテートフタレートまたはポリビニルアセテートなど と混合することにより製造できる。

前記錠剤は所望によりいくつかの層で構成されていてもよい。被覆錠剤は、前記 錠剤と同様にして得られたコア部を錠剤被覆に通有的に用いられる剤、例えばポ リビニルピロリドンまたはンエラック、アラビアゴム、タルク、二酸化チタンま たは砂糖で被覆することにより製造することができる。徐放性を得るために、あ るいは非相容性（ｉｎ　ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）を回避するために、その コア部も数層に構成してもよい。徐放性を得るために錠剤コートを数層に構成し てもよく、その場合前述の錠剤用賦形剤を用いてもよい。

注射溶液は、例えば、常法により例えば保存剤、例えばｐ−ヒドロキシベンゾエ ート、または安定剤例えばＥＤＴ＾などを添加することにより製造できる。次い でそれら溶液を注射バイアルまたはアンプルに充填する。遅延放出注射をいわゆ るミニポンプにより提供できる。

経鼻投与用スプレーも同様に水性溶液として組成でき、そしてエアロゾル推進剤 を含む、または手動圧縮手段を設けたスプレー容器に充填できる。−以上の活性 成分を含むカプセルを、例えばそれら活性成分に不活性担体例えばラクトースま たはソルビトールなどと混合しそしてその混合物をゼラチンカプセルに充填する ことにより製造できる。

適当な坐薬は例えば活性成分または活性成分の組合せをこの目的に適した慣用の 担体、例えば天然脂肪またはポリエチレングリコールまたはそれらの誘導体と混 合することにより製造できる。

本発明の化合物を含む用量単位体は好ましくは１〜１０諺９、例えば４〜５ｍｇ のペプチドを含有する。

本発明のペプチドは任意の都合のよい方法によって合成できる。一般に存在する 反応性側鎖基（アミノ、チオールおよび／またはカルボキシル）は合成全体のカ ップリング反応中保護されるが、一部の側鎖基（ヒドロキシ基、イミダゾール基 、第一級アミド基、ｐｙｒｏＧｌｕのような環状アミノ酸におけるアミド基）は 全合成手順にわたって未保護のままにしておくこともできる。

従って最終工程は一般式Ｉのペプチドの完全に保護されたまたは一部保護された 誘導体の脱保護高化であり、そしてかかる方法は本発明の更なる一面を形成する 。

ペプチド鎖を逐次構築していくにあたり、原則的にＣ−末端またはＮ−末端のい ずれから出発してもよいがＣ−末端から出発する手順だけが汎用されている。

従って、例えばリジンの適当に保護された誘導体をシスティンの適当に保護され た誘導体と反応させることによりＣ−末端から出発することができる。リジン誘 導体は遊離α−アミノ基を有する一方、他方の反応体は遊離のまたは活性化され たカルボキシル基および保護されたアミノ基を有することとなろう。カップリン グの後、その中間体を例えばクロマトグラフィーにより精製でき、次いで更なる Ｎ−保護された遊離または活性化されたアミノ酸残基の付加を可能にする為に選 択的にＮ−説保護基化することができる。この手順を所要のアミノ酸配列が完成 するまで続ける。

例えば使用し得るカルボン酸活性化置換分には対称または混合無水物、または活 性化エステル例えばｐ−ニトロフェニルエステル、２．４，５．　ｌ−リクロロ フェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル（ＯＢｔ）、Ｎ −ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル（ＯＳｕ）またはペンタフルオロフェ ニルエステル（０ＦＦＰ）などが含まれる。

遊離アミノ基とカルボキシル基のカップリングは、例えばジシクロへキシルカル ボジイミド（ＤＣＣ）を用いて行うことができる。使用できる他のカップリング 剤の一例はＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン （ＥＥＤＱ）である。

一般に、カップリング反応は低温、例えば−２０℃ないし周囲温度、都合よ（は 適当な溶媒系、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド 、メチレンクロライドまたはこれら溶媒の混合物中で行うのが都合よい。

合成は固相樹脂支持体上で行った方が都合よいものとなり得る。クロロメチル化 ポリスチレン（１％ジビニルベンゼンで架橋）は一つの有用なタイプの支持体で あり、この場合合成はＣ−末端から、例えばＮ−保護されたリジンを支持体にカ ップリングすることにより開始されることになろう。

多くの適当な固相法がＥｒ１ｅ　Ａｔｈｅｒｔｏｎ、ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＪ 、　Ｌｏｇａｎ、およびＲｏｂｅｒｔ　Ｃ，５ｈｅｐｐａｒｄ、Ｊ、　Ｃｈｅｗ 、　Ｓｏｃ。

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ＤｉｍａｒｃｈｉおよびＲ，ＢｌＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔ ｉｄｅ（１９８４）に記載されている。

アミノ酸の保護基は広範囲の選択肢が知られておりまた５ｃｈｒｏｄｅｒ、Ｅ、 、およびＬｌｌｂｋｅ、Ｋ、、Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、第１巻および第２巻 、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　ＹｏｒｋおよびＬｏｎｄｏｎ、１ ９６５および１９６６　：　Ｐｅｔｔｉｔ、Ｇ、　Ｒ，、５ｙｎｔｈｅｔｉｃＰ ｅｐｔｉｄｅｓ、第１〜第４巻、　Ｖａｎ　Ｎｏ５ｔｒａｎｄ、Ｒｅ１ｎｈｏｌ ｄ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７０．１９７１．１９７５および１９７６　；　Ｈｏｕ ｂｅｎ−１ｅｙｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｉｉｅ、　５ｙｎ ｔｈｅｓｅ　ｗｏｎＰｅｐｔｉｄｅｎ、　Ｂａｎｄ　１５、Ｇｅｏｒｇ　Ｔｈｉ ｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ。

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ｂｉｏｌｏｇｙ　１−７．　Ｅｄ　：　Ｅｒｈａｒｄ　Ｇｒｏｓｓ、　Ｊｏｈａ ｎｎｅｓ　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、　Ｌ ｏｎｄｏｎ；５ｏｌｉｄｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　２ ｎｄ　ｅｄ、、　Ｊｏｈｎ　Ｍ、Ｓｔｅｗａｅｔ。

Ｊａｎｉｓ　Ｄ、Ｙｏｕｎｇ、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎ ｙに例示されている。

すなわち、例えば、使用し得るアミン保護基には、カルボベンズオキシ（Ｚ−） 、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ〜）、４−メトキシ−２，３，６−１リメチ ルベンゼンスルボニル（Ｍｔｒ−）　、および９−フルオレニルメトキシカルボ ニル（Ｆａ＋ｏｃ−）などの保護基が包含される。ペプチドがＣ−末端から構築 される場合には、アミン保護基が付加された各新規残基のα−アミノ基に存在し そして次のカップリング工程に先立ち選択的に除去する必要があることが理解さ れよう。かがる一時的アミン保護に有用な一つの特定の基は、有機溶媒中ピペリ ジンで処理することにより選択的に除去できるＦｍｏｃ基である。

使用し得るカルボキシル保護基には例えば易分裂性エステル基例えばベンジル（ −０ＢＺｌ）　、ｐ−ニトロベンジル（−ＯＮＢ）　、またはｔ−ブチル（−ｔ ＯＢｕ）および固体支持上のカップリング例えばポリスチレンに結合したメチル 基などが包含される。

チオール保護基にはｐ−メトキシベンジル（ＭＯｂ）、トリチル（Ｔｒｔ）およ びアセトアミドメチル（Ａｃｍ）が包含される。

この種の他の基も前述の文献に詳述されているように広範囲に存在すること、お よびすべてのかかる基を前述の方法に使用することが本発明の範囲内に包含され ることは理解されよう。

アミン−およびカルボキシル−保護基の除去には広範囲にわたる様々な方法が存 在する。しかしながら、これらは使用される合成手順に合致したものでなければ ならない。側鎖保護基は、次のカップリング工程に先立ち一時的α−ア′ミノ保 護基を除去するのに用いられる条件に対し、て安定なものでなければならない。

Ｂｏａなどのアミン保護基およびｔＯＢすなどのカルボキシル保護基は例えばト リフルオロ酢酸で酸処理することにより同時に除去することができる。Ｔｒｔな どのチオール保護基は沃素など酸化剤を用いて選択的に除去することができる。

システィン含有ペプチドは本文に記載の方法により合成でき、そしてチオール保 護を含むすべての保護基は最終合成工程として除去される。

以下に実施例を例示のためにのみ示す。

溶媒は市販の物質を再蒸留しそして次のようにして貯蔵したニジメチルホルムア ミド（ＤＭＦ）はモレキュラーシーブ４Ａ上、ジクロロメタン（ＤＣＭ）はＣａ Ｃｌ　２上、トリエチルアミン（ＴＥＡ）はＮａ／Ｐｂ合金（Ｂａｋｅｒ）上、 そしてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はモレキュラーシーブ４Ａ上で貯蔵。

ＴＬＣ系は次のようなものとした： Ｓドシリカ／　ＣＨＣｌ３：　ＭｅＯＨ（９８：　２　）Ｓ２ニジリカ／　ＣＨ ＣＡ’ｓ　：　ＭｅＯＨ（９５：　５　）Ｓ３：シリ−ｈＲＰ８１５％ＥｔＯＨ （水性）中０．１ＸＴＦＡ精製最終生成物は逆相高速液体クロマトグラフィー（ ＨＰＬＣ）により分析した。このＩＩＩＰＬＣ系は組み込まれた自動式サンプラ ーおよびＨＰ　１０４０ダイオードアレーを有するＵＰ　１０９０Ｍクロマトグ ラフ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、　Ｗａｌｄ−ｂｒｏｎｎ、ＦＲＧ）　 、およびスペルコンシル（ｓｕｐｅｌｃｏｎｓｊ、１）ＬＣ−１８カラム（２５ ０Ｘ　４．６ｍｍ、５μ粒子）より構成した。サンプルをｏ、ｉ％（ｖ／ｖ）　 ＴＦＡ（水性）に溶解し、そしテ０．１％ＴＦ＾（水性）中０〜３０％アセトニ トリルの直線濃度勾配を用いて溶出した。流速は２＊ｌ／分とした。その溶出液 を帯幅を４ｎｍとする２１４ｎｍでモニターした。溶媒クロマトグラムを電子的 に差引いて、結果を面積率として示した。

アミノ酸分析ニ ジスティン含有ペプチドを過蟻酸により酸化して酸に不安定なシスチン残基を酸 に安定なシスティン酸に変えてから６ＭＦＩｔＪ中１１０℃で１６時間酸加水分 解した。次に乾燥加水分解物をフェニルインチオシアネートを用いて誘導体化し そしてＢｅＬｎｒｉｋｓｏｎ　（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ、１３６゜６５−７４． １９８４）の報告した方法により分析した。

ルーム−システイニル−し一リジン：化合物（１）（ａ）　ｔ　−Ｂｏｃ−（Ｓ 　−ｐ−メトキシベンジル）−Ｌ−システイニル−（ε−ベンジルオキシカルボ ニル）−Ｌ−リジンベンジルエステル（１） ε−ベンジルオキシカルボニル−リジンベンジルエステル塩酸塩（４０６Ｂ）を ３ＩＮのＤＭＦに溶解しそしてＴＥＡを湿ったｐＨ指示紙片により蒸気相中に遊 離ＴＥＡが検出され得るまで添加する。この溶液に３諺ｌのＤＭＦ中に溶解され たｔ−Ｂｏｃ−（Ｓ　−ｐ−メトキシベンジル）−Ｌ−システィンＮ−ヒドロキ シスクシンイミドエステル（４旧り）を添加する。適宜の時間間隔でＴＥＡを少 量ずつ添加して溶液の弱アルカリ性を維持する。その混合物を室温で一夜放置し 、そしてニンヒドリン反応陰性を確認後、ＤＭＦで平衡されそして標準反応体（ 例えば与えられた例ではｔ−Ｂｏｃ−（γ−ベンジル）−Ｌ−グルタミン酸−ｐ −ニトロフェニルエステルおよびｐ−ニトロフェノール）で検出された５ｅｐｈ ａｄｅｘ　ＬＨ−２０の２．５　Ｘ　１５ｃｍカラムに直接かける。

カラムフローは動フローに上り維持されそして約１０ＩＩｌのフラクションとし て集める前に２８Ｏｎ１１でモニターされる。

生成物は各フラクションのｔ、　１．　Ｃ，により同定でき、各フラクションは プールされ真空蒸発させる。収率：　７００ｍｇ（１００％）の油状生成物、ｔ Ｊ、ｃ、（クロロホルム／アセトン（９／］、））で均一、Ｒｆ＝　０．６４゜ １００ｍｑのブロック化され保護されたジペプチド（Ｉ）を’１５ｍ１の無水Ｄ ＣＭに溶解しそして２５Ｈ１の無水ＴＦ＾を添加する。

３０分後に酸と溶媒を真空除去する。残留物をＤＣＭに溶解しそして再び蒸発さ せる。ＴＥＡで弱アルカリ性にした残留物のＤＩｉｌＦ　（３ｍｌ）中の溶液に 、ｔ−Ｂｏａ−（β−ベンジル）−Ｌ−アスパラギン酸ｐ−ニトロフェニルエス テル（４８８ｍ１９）の３ＩＮのＤＭＦ中の溶液を添加する。アルカリ度は時々 チェックして少量のＴＥＡの添加により維持されるべきである。ニンヒドリン反 応が陰性になった後（約２時間後）、反応混合物を５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２ ０カラム（２，５Ｘ７５ｃｍ）にかけ、そして前述の如く精製する。真空蒸発後 の収率：　９００−９　（１００％）の結晶性生成物、ｔ、　１．　ｃ、　（ク ロロホルム／アセトン（９／１））で均一、Ｒｒ＝０．７０゜−ベンジル）−Ｌ −アスパルチル−（Ｓ−ｐ−メト９００＋＋ｗのブロック化されたトリペプチド 誘導体■を前述の如＜　ＴＦＡで脱ブロックし、３ＩＮのＤＭＦに溶解しそして ＴＥＡで弱アルカリ性とする。この溶液に（３ｍｌのＤＭＦ中の）５０４ｍ９の ｔ−Ｂｏｃ−（γ−ベンジル）−Ｌ−グルタミン酸ｐ−ニトロフェニルエステル を添加する。約２．５時間後、ニンヒドリン反応は陰性となり、そしてその混合 物を前述の如く精製のために５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０カラムにかける。

この反応における成分分離およびｔ、　１．　ｃ、によるそのモニタリングは前 述の如く行うことができる。適切なフラクション（この場合には９−１５）をプ ールし、蒸発させ乾燥する。収率：　１１４０翼９（１００％）の淡黄色油、ｔ 、　１．ｃ、　（クロロホルム／アセトン（９／１）　）で均一、Ｒｒ＝０．５ ３゜１ｉ４０ｍｐのテトラペプチド誘導体■をＤＣＭ中のＴＦＡを用いてＩにつ いての記載の如（脱ブロツク化しそして３Ｗ、ｌのＤＭＦに溶解する。その溶液 をＴＥＡで弱アルカリ性としそして４２３翼９のベンジルオキシカルボニル−ミ ン酸ｐ−ニトロフェニルエステルをＤＩＩＦ３ｍｊｊ中の溶液として添加する。

反応混合物のアルカリ性をくり返しチェックしそして必要に応じてＴＥＡ添加に より回復させる。

約３時間後、ニンヒドリン試験は陰性となり、そしてペンタペプチド誘導体■を 前述の如く精製することができる。収率：　１２３０藁９（９６％）、淡黄色油 状物、ｔ．Ｉ！．ｃ．　（クロロホルム／アセトン（９／１）　）で均一、Ｒ， ＝０．４４（テーリングを伴う）。

５０Ｉ９の保護されたペンタペプチド誘導体■を５００ｍｐのメチオニンをスカ ベンジャーを添加した５（ｈｊ！の０℃の液体弗化水素に溶解しそして１時間放 置する。次に弗化水素を０℃で真空蒸発乾固し、そして残留物を酢酸エチルと共 に撹拌する。酢酸エチル洗液を傾瀉し・捨てる。残留物質を希酢酸に溶解しそし て凍結乾燥する。

その凍結乾燥物質（　２　ｍｇ）は、Ｃ１８−カラム（　１０ｍｍ　ｘｌｏｃｍ ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより、２．　１３Ｍｌ１分の流速で溶液Ａ：０．１％ 水性トリフルオロ酢酸および溶液Ｂニアセトニトリル中の０．１％トリフルオロ 酢酸を用いた勾配溶出を用いて精製できるｃｏ．ｉｏ％の溶液Ｂは３０分にわた り添加する）。検出は２１４％ｍでの紫外吸収またはピリジンジスルフィド試薬 （ＳＨ基検出用）を用いて行われる。

多くの更なるペプチドを実施例１の一般手順により合成できる。これらを次表で 同定し特徴付けする。

実施例　３０ ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＯＢこのペプチドはＵＶ　３０４ ｎｍでモニターしながらＬＫＢＢｉｏｌｙｎｘ　４１７０完全自動式ペプチド合 成装置で合成した。

一時的Ｎ−保護基化およびＵＶ−トレーサーとしてＦｍｏｃを用いた。Ｃ−末端 アミノ酸をポリマーに酸に不安定なスペーサーアンムを介して結合させた。

標準プロトコールは以下のとおり： 再循環を伴うカップリング　３０分間 ＤＭＦ洗浄　１０分間 ２０％ピペリジン／　ＤＭＦによる脱保護高化　１０分間ＤＭＦ洗浄　１０分間 Ｃ−末端アミノ酸をＤＣＣで対称無水物として活性化しモしてＮ、Ｎ−ジメチル アミノピリジンを触媒として用いてポリマーに結合した。６０分間再循環後、全 合成にわ、たって標準的手順を用いた。

使用アミノ酸誘導体： Ｆｗｏｃ−Ｌｙｓ（ｔ　−Ｎ　−Ｂｏｃ）−０ＨＦｍｏｃ−３ｅｒ（０−ｔＢｕ ）−００ＢＨＦｍｏｃ−Ａｓｐ（β−ｔＯＢｕ）−０ＰｆｐＦｍｏｃ−ＧｌｕＣ ｖ　−ｔＯＢｕ）−０ＰｆｐｐＧ１ｕ−ＯＰＣＩＰ 完全に保護されたペンタペプチドの最終洗浄後、ポリマーをジエチルエーテルで 洗浄しそして空気乾燥した。

９５％水性ＴＦＡで１時間処理することにより一つの操作でペプチドを完全に脱 保護高化すると共にポリマーから分離した。濾過、ＴＦＡ洗浄および蒸発後、最 終ペプチドをＲＰＳカラムで精製しそして０．１％ＴＦＡ中エタノールで溶出し た。

収率：４４％ 純度：９２％以上（ＨＰＬＣＲＰ　１ｇ、　２１４ｎｍ）。

アミノ酸分析：許容可 国際調査報央 ＰＣτ／ＥＰ　８９１０１０７１

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉ Ｒａ−Ｒｂ−Ｒｃ−Ｒｄ−（Ｒｅ）ｎ−Ｒｆ（Ｉ）〔式中、Ｒａは、 ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼を表わし 、Ｒｂは、 ▲数式、化学式、表等があります▼または−ＨＮ−ＣＨ２−ＣＯ−を表わし、Ｒ ｃは、▲数式、化学式、表等があります▼を表わし、Ｒｄは、 ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ま たは▲数式、化学式、表等があります▼を表わし、Ｒｅは▲数式、化学式、表等 があります▼を表わし、そしてＲｆは、 ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ま たは−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＲ１０ （式中、ｎおよびｍは独立的に０または１を表わし；ｐおよびｑは独立的に１ま たは２を表わし；Ｒ１およびＲ２はいずれも水素原子であるかまたは一緒になっ てオキソ基を表わし； Ｒ３およびＲ４はいずれも水素原子であるかまたは一緒になって炭素−炭素結合 を表わし； Ｒ５は水素またはアシル基であり； Ｒ６およびＲ７は独立的にヒドロキシ基またはアミノ基を表わし； Ｒ５は水素；Ｃ２−６アルキル基；一個以上のヒドロキシ、アミノまたはメトキ シ置換分を有していてもよいＣ７−２０アルアルキル基；または代謝的に不安定 なＳ−保護基であり； Ｒ９は水素またはメチル基を表わし； Ｒ１０はヒドロキシまたはアミノ基、アミノ酸グルタミンのまたはＮ−末端グル タミン単位を有するペプチドの残基を表わし；そしてＤまたはＬ型であってよい アラニン、およびグリシンは別として前記アミノ酸残基はすべてＬ型である）〕 で示される化合物を非造血細胞の増殖を阻害するための医薬の調製に使用する方 法。
2. ２．細胞増殖調節剤として用いるための、【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 以外の請求項１記載の式（Ｉ）の化合物。
3. ３．Ｒ５がアミノ酸セリンのまたはＣ−末端セリン単位を有するペプチドの残基 であり、および／またはＲ１０がアミノ酸グルタミンのまたはＮ−末端グルタミ ン単位を有するペプチドの残基である請求項１記載の式（Ｉ）の化合物。
4. ４．式（ＩＩ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ、 Ｒｆおよびｎは請求項１において定義されたとおりであり、Ｒ１１は一個以上の ヒドロキシ、アミノまたはメチル置換分を有していてもよいＣ２−６アルキルま たはＣ７−２０アルアルキル基であり、そしてすべてのアミノ酸は請求項１にお いて定義されたキラール型を有する） で示される化合物。
5. ５．式（ＩＩＩ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）（式中Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ、 Ｒｆおよびｎは請求項１において定義されたとおりであり、そしてすべてのアミ ノ酸は請求項１において定義されたキラール型を有する）で示される化合物。
6. ６．式（ＩＶ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）（式中Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ、Ｒ ｆおよびｎは請求項１において定義されたとおりであり、Ｒ１２は代謝的に不安 定な基であり、そしてすべてのアミノ酸は請求項１において定義されたキラール 型を有する） で示される化合物。
7. ７．式（Ｖ） ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ）（式中、Ｒａ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒ ｆおよびｎは請求項１において定義されたとおりであり、そしてすべてのアミノ 酸残基は請求項１において定義されたキラール型を有する） で示される化合物。
8. ８．式（ＶＩ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ＶＩ）（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｅ、 Ｒｆおよびｎは請求項１において定義されたとおりであり、そしてすべてのアミ ノ酸は請求項１において定義されたキラール型を有する） で示される化合物。
9. ９．請求項３〜８のいずれかにおいて定義された少くとも一つの化合物またはそ の生理学的に許容し得る塩を活性成分として薬学的担体または賦形剤と共に含ん で成る薬学的組成物。
10. １０．請求項３〜８のいずれかにおいて定義された化合物の完全または部分的に 保護された誘導体を形成しそして該誘導体を脱保護基化に付すことより成る前記 化合物の製造方法。
11. １１．人間または動物の患者に有効量の請求項１において定義された式（Ｉ）の 化合物を投与することより成る前記患者における非造血細胞の増殖を阻害する方 法。
12. １２．人間または動物の患者に有効量の請求項３〜６のいずれかにおいて定義さ れた式（Ｉ）の化合物を投与することより成る前記患者における細胞の増殖を阻 害する方法。
13. １３．人間または動物の患者に有効量の請求項７において定義された式（Ｖ）の 化合物を投与することより成る前記患者における細胞増殖および／または白血球 機能を阻害する方法。
14. １４．人間または動物の患者に有効量の請求項８において定義された式（ＶＩ） の化合物を投与することより成る表皮および／または上皮細胞の増殖を阻害する 方法。