JP2599947B2 - ペプチド化合物 - Google Patents
ペプチド化合物Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
- C07K7/067—Hemoregulatory peptides based on sequence Glp-Glu-Asp-Cys-Lys
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、造血において刺激作用を有する新規ペプチ
ドおよびその製造方法に関する。
ドおよびその製造方法に関する。
骨髄細胞は多能性幹細胞から誘導されるものであり、
この多能性幹細胞は成熟して形態学上異なる細胞からな
る複雑な集団即ち巨核球、赤血球、顆粒球およびリンパ
球を形成する。約10％の幹細胞のみがいつでも細胞分裂
中である。成熟の初期において各々の増殖幹細胞は特定
の形態学上異なる細胞形態への前駆細胞になり、それは
結果として上記４つの成熟細胞タイプの１つに導かれ
る。細胞が増殖するにつれて、それらはさらに増殖する
力を徐々に失い、そして成熟細胞、例えば赤血球または
顆粒球はもはや分裂することはできない。これら成熟細
胞は絶えず死んでいるので成熟度の低い細胞特に骨髄発
生用の前駆体となる幹細胞の増殖力が維持されることは
重要である。
この多能性幹細胞は成熟して形態学上異なる細胞からな
る複雑な集団即ち巨核球、赤血球、顆粒球およびリンパ
球を形成する。約10％の幹細胞のみがいつでも細胞分裂
中である。成熟の初期において各々の増殖幹細胞は特定
の形態学上異なる細胞形態への前駆細胞になり、それは
結果として上記４つの成熟細胞タイプの１つに導かれ
る。細胞が増殖するにつれて、それらはさらに増殖する
力を徐々に失い、そして成熟細胞、例えば赤血球または
顆粒球はもはや分裂することはできない。これら成熟細
胞は絶えず死んでいるので成熟度の低い細胞特に骨髄発
生用の前駆体となる幹細胞の増殖力が維持されることは
重要である。
本発明者らは今般造血幹細胞の増殖を刺激することが
できる新規なペプチド群を見い出した。
できる新規なペプチド群を見い出した。
従つて本発明によれば 式（Ｉ） （式中、すべてのアミノ酸単位はＬ−配置であり、 Ａは または水素原子であり、 Ｂは またはヒドロキシ基であり、 ｎおよびｍは独立して１または２の整数であり、 ａおよびｂは独立して０または１の整数であり、 Ｒ、Ｒ′およびＲ″は独立してヒドロキシ基またはア
ミノ基である。
ミノ基である。
但し、ＡおよびＢがそれぞれ水素原子およびヒドロキ
シ基である場合、ｂは整数０ではない） の化合物およびその生理学的に許容しうる塩が提供され
る。
シ基である場合、ｂは整数０ではない） の化合物およびその生理学的に許容しうる塩が提供され
る。
従つて式（Ｉ）の化合物は対称の二量体である。
Ａがグルタミン残基またはプロリン残基である場合、
ａ＝ｂ＝１、ｎ＝２、ｍ＝１、ＲおよびＲ′がヒドロキ
シ基、そしてＢがリジン残基であるのが好ましい。
ａ＝ｂ＝１、ｎ＝２、ｍ＝１、ＲおよびＲ′がヒドロキ
シ基、そしてＢがリジン残基であるのが好ましい。
Ｂがアルギニン残基である場合、Ａがピログルタミン
酸塩残基、ａ＝ｂ＝１、ｎ＝２、ｍ＝１、そしてＲおよ
びＲ′がヒドロキシ基であるのが好ましい。
酸塩残基、ａ＝ｂ＝１、ｎ＝２、ｍ＝１、そしてＲおよ
びＲ′がヒドロキシ基であるのが好ましい。
好ましい基の化合物はｂ＝１、ｍ＝１そしてＲ、Ｒ′
およびＲ″がヒドロキシ基である化合物である。
およびＲ″がヒドロキシ基である化合物である。
本発明の特に好ましい化合物は下記の化合物である
（アミノ酸について慣用の生化学記号法を用いてＮ−末
端から読み取つた）： (Cys-Lys)2 (Asp-Cys-Lys)2 (Glu-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Glu-Asp-Cys)2 (pGlu-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)2 (Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)2 (Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)2 さらに特に好ましい化合物は(pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)
2即ちａ＝ｂ＝１、ｍ＝１、ｎ＝２、ＲおよびＲ′がヒ
ドロキシ基であり、Ａがピログルタミン酸塩残基であ
り、そしてＢがリジン残基である化合物である。本発明
のペプチドの生理学的に許容しうる塩としては酸付加
塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩など並びに塩
基との塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩のような
アルカリ金属塩、カルシウム塩のようなアルカリ土類金
属塩またはアミン塩が包含される。
（アミノ酸について慣用の生化学記号法を用いてＮ−末
端から読み取つた）： (Cys-Lys)2 (Asp-Cys-Lys)2 (Glu-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Glu-Asp-Cys)2 (pGlu-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)2 (Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)2 (Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)2 さらに特に好ましい化合物は(pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)
2即ちａ＝ｂ＝１、ｍ＝１、ｎ＝２、ＲおよびＲ′がヒ
ドロキシ基であり、Ａがピログルタミン酸塩残基であ
り、そしてＢがリジン残基である化合物である。本発明
のペプチドの生理学的に許容しうる塩としては酸付加
塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩など並びに塩
基との塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩のような
アルカリ金属塩、カルシウム塩のようなアルカリ土類金
属塩またはアミン塩が包含される。
幾つかの式（Ｉ）の化合物は、EPA No. 83307210.1号
の記載中で特許を請求している化合物の二量体である。
その出願は顆粒球形成において抑制作用を有する血液調
整ペプチドの小群である。
の記載中で特許を請求している化合物の二量体である。
その出願は顆粒球形成において抑制作用を有する血液調
整ペプチドの小群である。
入手しうる天然の顆粒球形成因子がわずかな量である
ため、天然物質の構造はまだ決定されていない。それは
結晶または完全に純粋な形態ではまだ得られておらず、
しかも天然源由来の物質のみを用いるだけで得られるか
どうかもわかっていない。それは上記のEPAにおいて報
告されているように、構造式pyroGlu−Asp−Asp−Cys−
LysOHを有すると仮定されているが、この構造式を有す
る合成化合物は不活性であることが証明された。天然の
顆粒球形成抑制因子が酸化条件に付されると刺激作用を
有する化合物を生成することが観察されている。しかし
ながらこの生成物は単離もされていなければ同定もされ
ていない。一方、本発明のペプチドは医薬用途に適当な
純粋な形態でそして比較的多量に得られる。
ため、天然物質の構造はまだ決定されていない。それは
結晶または完全に純粋な形態ではまだ得られておらず、
しかも天然源由来の物質のみを用いるだけで得られるか
どうかもわかっていない。それは上記のEPAにおいて報
告されているように、構造式pyroGlu−Asp−Asp−Cys−
LysOHを有すると仮定されているが、この構造式を有す
る合成化合物は不活性であることが証明された。天然の
顆粒球形成抑制因子が酸化条件に付されると刺激作用を
有する化合物を生成することが観察されている。しかし
ながらこの生成物は単離もされていなければ同定もされ
ていない。一方、本発明のペプチドは医薬用途に適当な
純粋な形態でそして比較的多量に得られる。
また、上記のEPAにおけるペプチドの１種、すなわちp
yroGlu−Glu−Asp−Cys−LysOHは、凍結しそして解凍に
付した場合には刺激活性を示すが、メルカプトエタノー
ルで処理することにより逆転されうることが報告されて
いる（Exp. Hematol. 12, 7（1984））。しかしながら
その刺激生成物は純粋な形態では得られず、そしてその
構造は決定されなかった。
yroGlu−Glu−Asp−Cys−LysOHは、凍結しそして解凍に
付した場合には刺激活性を示すが、メルカプトエタノー
ルで処理することにより逆転されうることが報告されて
いる（Exp. Hematol. 12, 7（1984））。しかしながら
その刺激生成物は純粋な形態では得られず、そしてその
構造は決定されなかった。
化学的に純粋な形態でのこの新規化合物についてイン
ビトロおよびインビボ血液調整効果に関する試験を行な
った。人間およびマウス双方の造血幹細胞のインビトロ
試験は寒天コロニー形成において1500％までの増大を示
した。刺激作用は10-13M〜10-5Mの濃度範囲で生じる。
マウスでのインビボ試験において本発明者らは１回の注
射で造血幹細胞の数を48時間以内で50％まで増大し、そ
して連続注入により幹細胞の数を13日間で２倍にするこ
とができることを見い出した。
ビトロおよびインビボ血液調整効果に関する試験を行な
った。人間およびマウス双方の造血幹細胞のインビトロ
試験は寒天コロニー形成において1500％までの増大を示
した。刺激作用は10-13M〜10-5Mの濃度範囲で生じる。
マウスでのインビボ試験において本発明者らは１回の注
射で造血幹細胞の数を48時間以内で50％まで増大し、そ
して連続注入により幹細胞の数を13日間で２倍にするこ
とができることを見い出した。
本発明は特に骨髄損傷、無顆粒球症および無形成貧血
を含む、造血活性の減少のために病んでいる患者におい
て造血を刺激するのに適用される。これは例えば骨髄移
植手術における組織反応を抑えるための免疫抑制処置に
より抑制された骨髄機能を有する患者の治療を含む。
を含む、造血活性の減少のために病んでいる患者におい
て造血を刺激するのに適用される。これは例えば骨髄移
植手術における組織反応を抑えるための免疫抑制処置に
より抑制された骨髄機能を有する患者の治療を含む。
本発明の化合物はまた新生物形成ないしウイルス性疾
患の細胞増殖抑制療法および放射線療法を施した後のよ
り迅速な骨髄再生を促進するために用いてもよい。
患の細胞増殖抑制療法および放射線療法を施した後のよ
り迅速な骨髄再生を促進するために用いてもよい。
さらに新規化合物は患者が骨髄疾患に伴って起こる免
疫応答の低下により深刻な感染症を有する場合特に有用
である。
疫応答の低下により深刻な感染症を有する場合特に有用
である。
他の臨床上の適用は、前記EPA明細書に開示された相
当する単量体または関連の造血抑制剤との組み合わせに
あり、それにより骨髄細胞における高い活性と低い活性
の交互のピークが生起され、造血の自然な概日リズムが
増加される。このようにして細胞増殖療法は骨髄活性の
低い期間で付与することができ、すなわち骨髄損傷の危
険を減少させることができ、一方再生は活性の連続ピー
クにより促進される。
当する単量体または関連の造血抑制剤との組み合わせに
あり、それにより骨髄細胞における高い活性と低い活性
の交互のピークが生起され、造血の自然な概日リズムが
増加される。このようにして細胞増殖療法は骨髄活性の
低い期間で付与することができ、すなわち骨髄損傷の危
険を減少させることができ、一方再生は活性の連続ピー
クにより促進される。
他の組織、特に非造血組織に関連した腫瘍細胞におけ
る刺激作用がないことは注目すべきである。従って新規
化合物は選択的に造血系を刺激する。
る刺激作用がないことは注目すべきである。従って新規
化合物は選択的に造血系を刺激する。
本発明のペプチドは有意な毒性を示さない。さらに観
察されるすべての血液学上の作用は可逆的であり、該ペ
プチドを用いて注射した動物の他の器官においては肉眼
で見える変化は観察されなかった。
察されるすべての血液学上の作用は可逆的であり、該ペ
プチドを用いて注射した動物の他の器官においては肉眼
で見える変化は観察されなかった。
一般に刺激作用を得るためには本発明のペプチドを１
日に体重70kgあたり0.1〜10mg、例えば１〜5mgの投与量
範囲で人間の患者に注射投与しうる。もし注入（infusi
on）または同様の手段により投与するならば、その投与
量は６日間にわたって、体重70kgあたり30〜300mgの範
囲、例えば約100mgであってもよい。原則として患者の
細胞外の液においてペプチドの約10-13M〜10-5Mの濃度
を生成させるのが望ましい。
日に体重70kgあたり0.1〜10mg、例えば１〜5mgの投与量
範囲で人間の患者に注射投与しうる。もし注入（infusi
on）または同様の手段により投与するならば、その投与
量は６日間にわたって、体重70kgあたり30〜300mgの範
囲、例えば約100mgであってもよい。原則として患者の
細胞外の液においてペプチドの約10-13M〜10-5Mの濃度
を生成させるのが望ましい。
本発明のさらに別の特徴によれば薬学的担体または賦
形剤と組み合わせて１種またはそれ以上の前述で定義し
た式（Ｉ）の化合物またはその生理学的に許容しうる塩
を活性成分として含有する医薬組成物を提供する。本発
明の組成物は例えば経口、経鼻、非経口的または直腸投
与に適当な形態であつてもよい。
形剤と組み合わせて１種またはそれ以上の前述で定義し
た式（Ｉ）の化合物またはその生理学的に許容しうる塩
を活性成分として含有する医薬組成物を提供する。本発
明の組成物は例えば経口、経鼻、非経口的または直腸投
与に適当な形態であつてもよい。
本明細書で用いる「薬学的」なる語は本発明の獣医学
用途を包含するものである。
用途を包含するものである。
本発明の化合物は慣用の薬理的投与形態、例えば錠
剤、コーチング錠、経鼻用スプレー剤、液剤、乳剤、散
剤、カプセル剤または持効性形態であつてもよい。慣用
の薬学的賦形剤並びに通常の製造方法が、これらの形態
を製造するのに用いることができる。錠剤は、例えば活
性成分（複数可）を既知の賦形剤、例えば炭酸カルシウ
ム、リン酸カルシウムまたはラクトースのような希釈
剤、コーンスターチまたはアルギニン酸のような崩壊
剤、スターチまたはゼラチンのような結合剤、ステアリ
ン酸マグネシウムまたはタルクのような滑沢剤および／
またはカルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセル
ロース、セルロースアセテートフタレートまたはポリビ
ニルアセテートのような持効性を得るための剤とともに
混合することにより製造できる。
剤、コーチング錠、経鼻用スプレー剤、液剤、乳剤、散
剤、カプセル剤または持効性形態であつてもよい。慣用
の薬学的賦形剤並びに通常の製造方法が、これらの形態
を製造するのに用いることができる。錠剤は、例えば活
性成分（複数可）を既知の賦形剤、例えば炭酸カルシウ
ム、リン酸カルシウムまたはラクトースのような希釈
剤、コーンスターチまたはアルギニン酸のような崩壊
剤、スターチまたはゼラチンのような結合剤、ステアリ
ン酸マグネシウムまたはタルクのような滑沢剤および／
またはカルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセル
ロース、セルロースアセテートフタレートまたはポリビ
ニルアセテートのような持効性を得るための剤とともに
混合することにより製造できる。
所望ならば錠剤は幾つかの層を成してもよい。コーチ
ング錠は錠剤の際と同様な方法で得られた核（core）を
錠剤コーチングに通常用いられる剤、例えばポリビニル
ピロリドンまたはシエラツク、アラビアゴム、タルク、
二酸化チタンまたは糖でコーチングすることにより製造
できる。持効性を得るために、または配合禁忌を避ける
ために核もまた幾つかの層を成してよい。コーチング錠
もまた錠剤用に上記の賦形剤が用いられた場合に持効性
を得るために幾つかの層を成してよい。
ング錠は錠剤の際と同様な方法で得られた核（core）を
錠剤コーチングに通常用いられる剤、例えばポリビニル
ピロリドンまたはシエラツク、アラビアゴム、タルク、
二酸化チタンまたは糖でコーチングすることにより製造
できる。持効性を得るために、または配合禁忌を避ける
ために核もまた幾つかの層を成してよい。コーチング錠
もまた錠剤用に上記の賦形剤が用いられた場合に持効性
を得るために幾つかの層を成してよい。
器官特異的担体系もまた使用してよい。
注射液は慣用の方法により例えばｐ−ヒドロキシベン
ゾエートのような保存剤またはEDTAのような安定剤を添
加することにより製造できる。溶液は次いで注射用バイ
アルまたはアンプルに充てんされる。
ゾエートのような保存剤またはEDTAのような安定剤を添
加することにより製造できる。溶液は次いで注射用バイ
アルまたはアンプルに充てんされる。
経鼻用スプレー剤は同様に水溶液中で製剤化され、エ
アゾル噴射剤と一緒に、または手動の圧縮装置を備えた
スプレー容器に詰められる。１種または数種の活性成分
を含有するカプセル剤は例えばその活性成分をラクトー
スまたはソルビトールのような不活性担体と混合し、該
混合物をゼラチンカプセル中に充てんすることにより製
造できる。
アゾル噴射剤と一緒に、または手動の圧縮装置を備えた
スプレー容器に詰められる。１種または数種の活性成分
を含有するカプセル剤は例えばその活性成分をラクトー
スまたはソルビトールのような不活性担体と混合し、該
混合物をゼラチンカプセル中に充てんすることにより製
造できる。
適当な坐剤は例えば活性成分、または活性成分の組み
合わせをこの目的のために構想された慣用の担体、例え
ば天然脂肪またはポリエチレングリコールまたはその誘
導体と混合することにより製造できる。
合わせをこの目的のために構想された慣用の担体、例え
ば天然脂肪またはポリエチレングリコールまたはその誘
導体と混合することにより製造できる。
本発明の化合物を含有する投与単位は好ましくは0.1
〜10mg、例えば１〜5mgの式（Ｉ）のペプチドまたはそ
の塩を含有する。
〜10mg、例えば１〜5mgの式（Ｉ）のペプチドまたはそ
の塩を含有する。
本発明のさらに別の特徴によれば、患者に有効量の前
述で定義した医薬組成物を投与することからなる造血の
刺激方法が提供される。
述で定義した医薬組成物を投与することからなる造血の
刺激方法が提供される。
しかしながら、新規ペプチドのさらに主要な用途は免
疫学上のアツセイ技法用の物質の製造にある。ペプチド
は抗体産生動物（例えばウサギ、モルモツトまたはヤ
ギ）中に注射するためにアルブミン、ポリリジンまたは
ポリプロリンのような適当な高分子量の担体に共有結合
される。
疫学上のアツセイ技法用の物質の製造にある。ペプチド
は抗体産生動物（例えばウサギ、モルモツトまたはヤ
ギ）中に注射するためにアルブミン、ポリリジンまたは
ポリプロリンのような適当な高分子量の担体に共有結合
される。
インビトロ免疫感作技術もまた使用してもよい。高分
子量の担体を用いての良く知られた吸着技術を使用する
ことにより特異性の高い抗血清が得られる。ペプチド分
子に放射能（3H，14C，35S）を導入することにより放射
免疫検定法が容易に設計され、血清（血漿）、尿および
髄液のような異なる生物学的液におけるペプチドを決定
するために用いられる。
子量の担体を用いての良く知られた吸着技術を使用する
ことにより特異性の高い抗血清が得られる。ペプチド分
子に放射能（3H，14C，35S）を導入することにより放射
免疫検定法が容易に設計され、血清（血漿）、尿および
髄液のような異なる生物学的液におけるペプチドを決定
するために用いられる。
本発明のペプチドは何れかの都合の良い方法で合成す
ることができる。一般に存在する反応性側鎖基（アミ
ノ、チオールおよび／またはカルボキシル）は全体にわ
たる合成のカツプリング反応中、保護され従つて最終段
階は式（Ｉ）の保護された誘導体の脱保護化である。通
常、すべての−COOH基、すべての−NH2基およびピログ
ルタミルまたはプロリン残基の−NH基は保護され、この
ように保護された形態のペプチドは本発明の他の特徴を
形成し、そして 一般式（II） （式中、Ａは 水素原子、またはアミン保護基であり、 Ｂは ヒドロキシ基 またはカルボキシルブロツキング基であり、 ｎおよびｍは独立して整数１または２であり、 ａおよびｂは独立して整数０または１であり、 R1、R2、R8およびR10はアミノ、ヒドロキシ、保護さ
れたアミノまたはカルボキシル保護基であり、 R3、R4、R5、R6、R7およびR9は水素原子、またはアミ
ン保護基である。
ることができる。一般に存在する反応性側鎖基（アミ
ノ、チオールおよび／またはカルボキシル）は全体にわ
たる合成のカツプリング反応中、保護され従つて最終段
階は式（Ｉ）の保護された誘導体の脱保護化である。通
常、すべての−COOH基、すべての−NH2基およびピログ
ルタミルまたはプロリン残基の−NH基は保護され、この
ように保護された形態のペプチドは本発明の他の特徴を
形成し、そして 一般式（II） （式中、Ａは 水素原子、またはアミン保護基であり、 Ｂは ヒドロキシ基 またはカルボキシルブロツキング基であり、 ｎおよびｍは独立して整数１または２であり、 ａおよびｂは独立して整数０または１であり、 R1、R2、R8およびR10はアミノ、ヒドロキシ、保護さ
れたアミノまたはカルボキシル保護基であり、 R3、R4、R5、R6、R7およびR9は水素原子、またはアミ
ン保護基である。
但し、Ａが水素原子またはアミン保護基であり、そし
てＢがヒドロキシ基またはカルボキシルブロツキング基
である場合、ｂは整数の０ではない） を有する。
てＢがヒドロキシ基またはカルボキシルブロツキング基
である場合、ｂは整数の０ではない） を有する。
一般に式（II）の保護された誘導体はペプチド合成に
おいて適当な手段を用いて製造することができる。
おいて適当な手段を用いて製造することができる。
可能な合成ルートの１つはシスチンを利用するもので
あり、これを残留のアミノ酸残基とカツプリングさせ２
つの同一の二量体の鎖を集めシスチンにすでに存在して
いるジスルフイド結合を介して結合させる。別の手段と
してはＳ−保護されたシスチンを用いて、Ｓ−保護され
た形態での相当する単量体化合物を合成してＳ−保護基
を除去して二量体化を行なう方法がある。脱保護化段階
において直接ジスルフイド結合を生成する酸化剤により
除去することができるＳ−保護基を用いることが可能で
ある。すなわち例えばトリチル基は、好ましくはジメチ
ルホルムアミドのような適当な溶媒中でヨウ素により選
択的に除去することができる。このような二量体化はＣ
−およびＮ−保護された単量体上で行ない、次いでＣ−
およびＮ−保護基を除去するか、または最終合成段階と
して 式（III） （式中Ａ、Ｂ、ｎ、ｍ、ａ、ｂ、ＲおよびＲ′は上述の
通りであり、そしてＲ″は水素原子または酸化条件下で
除去されうるチオール保護基である） の化合物を用いて行なうことができる。
あり、これを残留のアミノ酸残基とカツプリングさせ２
つの同一の二量体の鎖を集めシスチンにすでに存在して
いるジスルフイド結合を介して結合させる。別の手段と
してはＳ−保護されたシスチンを用いて、Ｓ−保護され
た形態での相当する単量体化合物を合成してＳ−保護基
を除去して二量体化を行なう方法がある。脱保護化段階
において直接ジスルフイド結合を生成する酸化剤により
除去することができるＳ−保護基を用いることが可能で
ある。すなわち例えばトリチル基は、好ましくはジメチ
ルホルムアミドのような適当な溶媒中でヨウ素により選
択的に除去することができる。このような二量体化はＣ
−およびＮ−保護された単量体上で行ない、次いでＣ−
およびＮ−保護基を除去するか、または最終合成段階と
して 式（III） （式中Ａ、Ｂ、ｎ、ｍ、ａ、ｂ、ＲおよびＲ′は上述の
通りであり、そしてＲ″は水素原子または酸化条件下で
除去されうるチオール保護基である） の化合物を用いて行なうことができる。
ペプチド鎖を構築する場合原則としてＣ−末端または
Ｎ−末端のどちらかで開始することができるが、Ｃ−末
端開始方法のみが普通の方法である。
Ｎ−末端のどちらかで開始することができるが、Ｃ−末
端開始方法のみが普通の方法である。
すなわち例えばリジンの適当に保護された誘導体をシ
ステインまたはシスチンの適当に保護された誘導体と反
応させることによりＣ−末端で開始させることができ
る。リジン誘導体は遊離のα−アミノ基を有し、一方他
の反応体は遊離のまたは活性化されたカルボキシル基お
よび保護されたアミノ基を有するであろう。カツプリン
グ後、中間体を例えばクロマトグラフイーにより精製
し、次いで選択的にＮ−脱保護化してさらにアミノ酸残
基の付加をすることができる。この操作は要求するアミ
ノ酸シーケンスが完了するまで継続される。
ステインまたはシスチンの適当に保護された誘導体と反
応させることによりＣ−末端で開始させることができ
る。リジン誘導体は遊離のα−アミノ基を有し、一方他
の反応体は遊離のまたは活性化されたカルボキシル基お
よび保護されたアミノ基を有するであろう。カツプリン
グ後、中間体を例えばクロマトグラフイーにより精製
し、次いで選択的にＮ−脱保護化してさらにアミノ酸残
基の付加をすることができる。この操作は要求するアミ
ノ酸シーケンスが完了するまで継続される。
例えば使用されるカルボン酸活性化置換基は対称のま
たは混合無水物、または例えばｐ−ニトロフエニルエス
テル、2,4,5−トリクロロフエニルエステル、Ｎ−ヒド
ロキシベンゾトリアゾールエステル（OBt）、またはＮ
−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（OSu）のよう
な活性化エステルを包含する。
たは混合無水物、または例えばｐ−ニトロフエニルエス
テル、2,4,5−トリクロロフエニルエステル、Ｎ−ヒド
ロキシベンゾトリアゾールエステル（OBt）、またはＮ
−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（OSu）のよう
な活性化エステルを包含する。
遊離のアミノおよびカルボキシル基のカツプリングは
例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を用い
て行なうことができる。使用可能なその他のカツプリン
グ剤は例えばＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−
1,2−ジヒドロキノリンである。
例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を用い
て行なうことができる。使用可能なその他のカツプリン
グ剤は例えばＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−
1,2−ジヒドロキノリンである。
一般にカツプリング反応は好都合には適当な溶媒系、
例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホル
ムアミド、メチレンクロライドまたはこれらの溶媒の混
合物中低温、例えば−20℃、周囲温度までの温度で好都
合に行なうことができる。
例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホル
ムアミド、メチレンクロライドまたはこれらの溶媒の混
合物中低温、例えば−20℃、周囲温度までの温度で好都
合に行なうことができる。
固相樹脂支持体上でより好都合に合成することができ
る。クロロメチル化ポリスチレン（１％ジビニルベンゼ
ンで交叉結合させた）が１つの有用なタイプの支持体で
あり、この場合合成は例えば支持体にＮ−保護されたリ
ジンをカツプリングさせることによりＣ−末端で開始す
るであろう。
る。クロロメチル化ポリスチレン（１％ジビニルベンゼ
ンで交叉結合させた）が１つの有用なタイプの支持体で
あり、この場合合成は例えば支持体にＮ−保護されたリ
ジンをカツプリングさせることによりＣ−末端で開始す
るであろう。
多くの適当な固相技術が下記の文献に記載されてい
る。
る。
Eric Atherton,Christopher J.Logan,およびRobert
C.Sheppard J.Chem.Soc.Perkin I,538〜46（1981）;Jam
es P.Tam,Foe S.Tjoeng,およびR.B.Merrifield J.Am.Ch
em.Soc.102 6117〜27（1980）;James P.Tam,Richard D.
DimarchiおよびR.B.Merrifield Int.J.Peptide Protein
Res 16 412〜25（1980）;Manfred MutterおよびDieter
Bellof,Helvetica Chimica Acta 67 2009〜16（1984） アミノ酸のための保護基の広範囲な選択が知られてお
り、下記の文献に記載されている。
C.Sheppard J.Chem.Soc.Perkin I,538〜46（1981）;Jam
es P.Tam,Foe S.Tjoeng,およびR.B.Merrifield J.Am.Ch
em.Soc.102 6117〜27（1980）;James P.Tam,Richard D.
DimarchiおよびR.B.Merrifield Int.J.Peptide Protein
Res 16 412〜25（1980）;Manfred MutterおよびDieter
Bellof,Helvetica Chimica Acta 67 2009〜16（1984） アミノ酸のための保護基の広範囲な選択が知られてお
り、下記の文献に記載されている。
Schroder,E.,およびLubke,K.,The Peptides,Vols.1お
よび２、Academic Press,New YorkおよびLondon,1965お
よび1966;Pettit,G.R.,Synthetic Peptides,Vols.1〜
４、Van Nostrand,Reinhold,New York 1970、1971、197
5および1976;Houben−Weyl,Methoden der Organischen
Chemie,Synthese von Peptiden,Band 15、Georg Thieme
Verlag,Stuttgart 1974;Amino Acids,PeptidesおよびP
roteins,Vol.4〜８、The Chemical Socity,London 197
2、1974、1975および1976;Peptides,Synthesis−physic
al data 1〜６、Wolfgang Voelter,Eric Schmidt−Sieg
man,Georg Thieme Verlage Stuttgart,NY,1983;The Pep
tides,Analysis,synthesis,biology 1〜7,Ed:Erhard Gr
oss,Johannes Meienhofer,Academic Press,NY,San Fran
sisco,London;Solid phase peptide synthesis 2nd e
d.,John M.Stewart,Janis D.Young,Pierce Chemical Co
mpany. 従つて使用することのできるアミン保護基はカルボベ
ンゾキシ（以後Ｚと称す）、ｔ−ブトキシカルボニル
（以後Boc）、４−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼ
ンスルホニル（Mtr）および９−フルオレニルメトキシ
カルボニル（以後Fmocと称す）を包含する。ペプチドを
Ｃ−末端部から構築する場合、アミノ保護基が加えられ
た各各の新しい残基のα−アミノ基の上に存在し、そし
て次のカツプリング段階の前に選択的に除去する必要が
あると理解されよう。このような一時的なアミン保護の
ために特に有用な基の１つとして有機溶媒中ピペリジン
で処理することにより選択的に除去することのできるFm
oc基がある。
よび２、Academic Press,New YorkおよびLondon,1965お
よび1966;Pettit,G.R.,Synthetic Peptides,Vols.1〜
４、Van Nostrand,Reinhold,New York 1970、1971、197
5および1976;Houben−Weyl,Methoden der Organischen
Chemie,Synthese von Peptiden,Band 15、Georg Thieme
Verlag,Stuttgart 1974;Amino Acids,PeptidesおよびP
roteins,Vol.4〜８、The Chemical Socity,London 197
2、1974、1975および1976;Peptides,Synthesis−physic
al data 1〜６、Wolfgang Voelter,Eric Schmidt−Sieg
man,Georg Thieme Verlage Stuttgart,NY,1983;The Pep
tides,Analysis,synthesis,biology 1〜7,Ed:Erhard Gr
oss,Johannes Meienhofer,Academic Press,NY,San Fran
sisco,London;Solid phase peptide synthesis 2nd e
d.,John M.Stewart,Janis D.Young,Pierce Chemical Co
mpany. 従つて使用することのできるアミン保護基はカルボベ
ンゾキシ（以後Ｚと称す）、ｔ−ブトキシカルボニル
（以後Boc）、４−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼ
ンスルホニル（Mtr）および９−フルオレニルメトキシ
カルボニル（以後Fmocと称す）を包含する。ペプチドを
Ｃ−末端部から構築する場合、アミノ保護基が加えられ
た各各の新しい残基のα−アミノ基の上に存在し、そし
て次のカツプリング段階の前に選択的に除去する必要が
あると理解されよう。このような一時的なアミン保護の
ために特に有用な基の１つとして有機溶媒中ピペリジン
で処理することにより選択的に除去することのできるFm
oc基がある。
用いられるカルボキシル保護基は例えばベンジル（Bz
l）、ｐ−ニトロベンジル（ONb）、ペンタクロロフエニ
ル（OPClP）、ペンタフルオロフエニル（OPFP）または
ｔ−ブチル（OtBu）基のような容易に開裂されたエステ
ル基、並びに固体支持体上のカツプリング基、例えばポ
リスチレンに結合されたメチル基を包含する。
l）、ｐ−ニトロベンジル（ONb）、ペンタクロロフエニ
ル（OPClP）、ペンタフルオロフエニル（OPFP）または
ｔ−ブチル（OtBu）基のような容易に開裂されたエステ
ル基、並びに固体支持体上のカツプリング基、例えばポ
リスチレンに結合されたメチル基を包含する。
チオール保護基はｐ−メトキシベンジル（Mob）、ト
リチル（Trt）およびアセトアミドメチル（Acm）を包含
する。
リチル（Trt）およびアセトアミドメチル（Acm）を包含
する。
例えば上記の引用文献に記載されているように広範囲
の他のこのような基が存在し、そして上記記載の工程に
おけるこのような基の使用は全て本発明の範囲内に入る
と理解されよう。
の他のこのような基が存在し、そして上記記載の工程に
おけるこのような基の使用は全て本発明の範囲内に入る
と理解されよう。
アミン−およびカルボキシル−保護基を除去するため
の広範囲な手段がある。しかしながらこれらの手段は使
用する合成方法と矛盾のないものでなければならない。
側鎖の保護基は次のカツプリング段階の前に一時的なα
−アミノ保護基を除去するために使用される条件に対し
て安定でなければならない。
の広範囲な手段がある。しかしながらこれらの手段は使
用する合成方法と矛盾のないものでなければならない。
側鎖の保護基は次のカツプリング段階の前に一時的なα
−アミノ保護基を除去するために使用される条件に対し
て安定でなければならない。
Bocのようなアミン保護基およびｔ−Buのようなカル
ボキシル保護基は例えばトリフルオロ酢酸を用いた酸処
理によつて同時に除去することができる。Trtのような
チオール保護基はヨウ素のような酸化剤を用いて選択的
に除去することができる。
ボキシル保護基は例えばトリフルオロ酢酸を用いた酸処
理によつて同時に除去することができる。Trtのような
チオール保護基はヨウ素のような酸化剤を用いて選択的
に除去することができる。
以下の実施例は単に例示するためのものである。
溶媒は商業上の物質から再蒸留し、次のようにして貯
蔵した； モレキュラーシーブ4A上のジメチルホルムアミド（DM
F）、CaCl2上のジクロロメタン（DCM）、Na/Pb合金（Ba
ker）上のトリエチルアミン（TEA）およびモレキュラー
シーブ4A上のトリフルオロ酢酸（TFA）。
蔵した； モレキュラーシーブ4A上のジメチルホルムアミド（DM
F）、CaCl2上のジクロロメタン（DCM）、Na/Pb合金（Ba
ker）上のトリエチルアミン（TEA）およびモレキュラー
シーブ4A上のトリフルオロ酢酸（TFA）。
TLC系は以下のようにした； S1：シリカ／CHCl3:MeOH（98:2） S2：シリカ／CHCl3:MeOH（95:5） S3：シリカRP8/5％エタノール中0.1％TFA（水溶液） 精製された最終生成物を逆相高速液体クロマトグラフ
イー（HPLC）により分析した。HPLC−系はHP 1090Mクロ
マトグラフで構成され、作り付けのオートサンプラーお
よびHP 1040ダイオードアレイ（Hewlett−Packard、Wal
d−bronn,FRG）、およびsupelcosil LC−18カラム（250
×4.6mm,5μ粒子）を備えた。資料を0.1％（v/v）TFA水
溶液中に溶解し、0.1％TFA中の０〜30％アセトニトリル
（水溶液）の直線的勾配で溶離した。流速は2ml/分であ
つた。溶離物を帯域幅4nmを有する214nmでモニターし
た。溶媒クロマトグラムを電子工学的に減じ、その結果
を面積％として表わした。
イー（HPLC）により分析した。HPLC−系はHP 1090Mクロ
マトグラフで構成され、作り付けのオートサンプラーお
よびHP 1040ダイオードアレイ（Hewlett−Packard、Wal
d−bronn,FRG）、およびsupelcosil LC−18カラム（250
×4.6mm,5μ粒子）を備えた。資料を0.1％（v/v）TFA水
溶液中に溶解し、0.1％TFA中の０〜30％アセトニトリル
（水溶液）の直線的勾配で溶離した。流速は2ml/分であ
つた。溶離物を帯域幅4nmを有する214nmでモニターし
た。溶媒クロマトグラムを電子工学的に減じ、その結果
を面積％として表わした。
アミノ酸分析： シスチン含有ペプチドを過ギ酸により酸化し、酸不安
定なシスチン残基を酸安定なシステイン酸に変換させ、
6M HCl中110℃で16時間の酸加水分解に付した。乾燥し
た加水分解物を次いでフエニルイソチオシアネートを用
いて誘導し、HeinriksonのAnal.Bioch.136、65〜74（19
84年）に記載のようにして分析した。
定なシスチン残基を酸安定なシステイン酸に変換させ、
6M HCl中110℃で16時間の酸加水分解に付した。乾燥し
た加水分解物を次いでフエニルイソチオシアネートを用
いて誘導し、HeinriksonのAnal.Bioch.136、65〜74（19
84年）に記載のようにして分析した。
実施例１ (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)2 (Fmoc-Cys-Lys(Nε-Boc)-OtBu)2（１）： 2g（2.275mM）の(Fmoc-Cys-OSu)2、2.18g（5.0mM）の
Lys（Ｎε−Boc）−OtBu・HClおよび0.58g（5mM）のＮ
−エチルモルホリンを7.5mlのDMFに溶解し、室温で３時
間攪拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固した。残留
物を50mlのCHCl3に溶解し、0.1N HCl 12ml（３回）、そ
して1M NaCl 12ml（３回）で洗浄した。有機相を相分離
ろ紙（Whatman）に通してろ過し、そして減圧下蒸発乾
固した。
Lys（Ｎε−Boc）−OtBu・HClおよび0.58g（5mM）のＮ
−エチルモルホリンを7.5mlのDMFに溶解し、室温で３時
間攪拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固した。残留
物を50mlのCHCl3に溶解し、0.1N HCl 12ml（３回）、そ
して1M NaCl 12ml（３回）で洗浄した。有機相を相分離
ろ紙（Whatman）に通してろ過し、そして減圧下蒸発乾
固した。
粗生成物（3.32g）を5mlの熱MeOH（15時間）から再結
晶してろ過し、MeOHおよびエーテルで洗浄し、そして風
乾した。収量:1.75g（61％）、白色の固形物はTLC上１
つの主点を示した。（UV254＋、Cl2／ジカルボキシジン
＋、ニンヒドリン÷、S1:Rf＝0.667、S2:Rf＝0.829） (Cys-Lys(Nε-Boc)-OtBu)2（２）： 1.5g（1.19mM）の化合物（１）をDMF中の20％ピペリ
ジン10mlに溶解し、室温で30分間攪拌した。TLC（S2）
はすべての出発物質が消費され、１つの新しい生成物の
みが生成したことを示した（UV254÷、Cl2／ジカルボキ
シジン＋ニンヒドリン＋）。溶媒を減圧下で蒸発させ
た。残留物を20mlのエーテルに溶解し、3mlの0.1N HCl
で２回、そして3mlの1M NaHCO3で洗浄した。有機相を相
分離ろ紙に通してろ過し、そして蒸発乾固した。収量:
1.2g、TLCは１つのニンヒドリン陽性成分のみを示した
（S2:Rf＝0.216）。
晶してろ過し、MeOHおよびエーテルで洗浄し、そして風
乾した。収量:1.75g（61％）、白色の固形物はTLC上１
つの主点を示した。（UV254＋、Cl2／ジカルボキシジン
＋、ニンヒドリン÷、S1:Rf＝0.667、S2:Rf＝0.829） (Cys-Lys(Nε-Boc)-OtBu)2（２）： 1.5g（1.19mM）の化合物（１）をDMF中の20％ピペリ
ジン10mlに溶解し、室温で30分間攪拌した。TLC（S2）
はすべての出発物質が消費され、１つの新しい生成物の
みが生成したことを示した（UV254÷、Cl2／ジカルボキ
シジン＋ニンヒドリン＋）。溶媒を減圧下で蒸発させ
た。残留物を20mlのエーテルに溶解し、3mlの0.1N HCl
で２回、そして3mlの1M NaHCO3で洗浄した。有機相を相
分離ろ紙に通してろ過し、そして蒸発乾固した。収量:
1.2g、TLCは１つのニンヒドリン陽性成分のみを示した
（S2:Rf＝0.216）。
(Fmoc-Asp(β-OtBu)-Cys-Lys(Nε-Boc)-OtBu)2（３）： 約1.19mMの化合物（２）および1.32g（2.6mM）のFmoc
−Asp（β−OtBu）−OSuを6mlのCH2Cl2に溶解し室温で
２時間攪拌した。TLC（S1）はすべてのニンヒドリン陽
性物質が消費され、そしてある新しい主要なUV254陽性
生成物が生成したことを示した。蒸発させた後残留物を
30mlのEtOAcに溶解し、10mlの1M NaClで４回洗浄し、ろ
過し、そして（１）に記載のようにして蒸発させた。粗
生成物をエーテル（2.5ml）に溶解し、4mlのｎ−ヘキサ
ンを加えて半結晶性固形物として沈殿させた（冷蔵庫16
時間）。溶媒をデカンテーシヨンし、生成物を5mlのｎ
−ヘキサンで洗浄し、そして減圧下で乾燥した。収量:
1.272g（67％）。TLCは１つの主点を示した（UV254＋、
Cl2／ジカルボキシジン＋、ニンヒドリン÷、S1:Rf＝0.
333、S2:Rf＝0.658）。
−Asp（β−OtBu）−OSuを6mlのCH2Cl2に溶解し室温で
２時間攪拌した。TLC（S1）はすべてのニンヒドリン陽
性物質が消費され、そしてある新しい主要なUV254陽性
生成物が生成したことを示した。蒸発させた後残留物を
30mlのEtOAcに溶解し、10mlの1M NaClで４回洗浄し、ろ
過し、そして（１）に記載のようにして蒸発させた。粗
生成物をエーテル（2.5ml）に溶解し、4mlのｎ−ヘキサ
ンを加えて半結晶性固形物として沈殿させた（冷蔵庫16
時間）。溶媒をデカンテーシヨンし、生成物を5mlのｎ
−ヘキサンで洗浄し、そして減圧下で乾燥した。収量:
1.272g（67％）。TLCは１つの主点を示した（UV254＋、
Cl2／ジカルボキシジン＋、ニンヒドリン÷、S1:Rf＝0.
333、S2:Rf＝0.658）。
(Asp(β-OtBu)-Cys-Lys(Nε-Boc)-OtBu)2（４）： 1.0g（0.62mM）の化合物（３）をCH2Cl2中の20％ピペ
リジン5mlに溶解し、（２）に記載のように処理した。
収量:0.469g（65％）、TLCは１つのニンヒドリン陽性点
（S2:Rf＝0.22）のみを示した。
リジン5mlに溶解し、（２）に記載のように処理した。
収量:0.469g（65％）、TLCは１つのニンヒドリン陽性点
（S2:Rf＝0.22）のみを示した。
(Fmoc-Glu(γ-OtBu)-Asp(β-OtBu)-Cys-Lys(Nε-Boc)-O
tBu)2（５）： 0.469g（0.407mM）の化合物（４）および0.47g（0.90
mM）のFmoc−Glu（γ−OtBu）−OSuを5mlのCH2Cl2に溶
解し、室温で15時間攪拌した。（３）に記載の方法に従
つて後処理した。収量:0.62g（77％）。TLCは１つの主
点を示した（UV254＋、Cl2／ジカルボキシジン＋、ニン
ヒドリン÷、S1:Rf＝0.312、S2:Rf＝0.536）。
tBu)2（５）： 0.469g（0.407mM）の化合物（４）および0.47g（0.90
mM）のFmoc−Glu（γ−OtBu）−OSuを5mlのCH2Cl2に溶
解し、室温で15時間攪拌した。（３）に記載の方法に従
つて後処理した。収量:0.62g（77％）。TLCは１つの主
点を示した（UV254＋、Cl2／ジカルボキシジン＋、ニン
ヒドリン÷、S1:Rf＝0.312、S2:Rf＝0.536）。
(Glu(γ-OtBu)-Asp(β-OtBu)-Cys-Lys(Nε-Boc)-OtBu)2
（６）： 0.50g（0.25mM）の化合物（５）をCH2Cl2中の20％ピ
ペリジン2.5mlに溶解し、そして（２）に記載のように
処理した。
（６）： 0.50g（0.25mM）の化合物（５）をCH2Cl2中の20％ピ
ペリジン2.5mlに溶解し、そして（２）に記載のように
処理した。
TLCは１つのニンヒドリン陽性点（S2:Rf＝0.154）の
みを示した。
みを示した。
(pGlu-Glu(γ-OtBu)-Asp(β-OtBu)-Cys-Lys(Nε-Boc)-O
tBu)2（７）： 約0.25mMの化合物（６）および0.206g（0.546mM）のp
Glu−OPClPを2.5mlのDMFに溶解し、室温で15時間攪拌し
た。（３）に記載の方法に従つて後処理した。収量:0.2
59g（59％）、TLCは１点（UV254÷、ニンヒドリン÷お
よびCl2／ジカルボキシジン＋、S2:Rf＝0.117）および
痕跡量の不純物のみを示した。
tBu)2（７）： 約0.25mMの化合物（６）および0.206g（0.546mM）のp
Glu−OPClPを2.5mlのDMFに溶解し、室温で15時間攪拌し
た。（３）に記載の方法に従つて後処理した。収量:0.2
59g（59％）、TLCは１点（UV254÷、ニンヒドリン÷お
よびCl2／ジカルボキシジン＋、S2:Rf＝0.117）および
痕跡量の不純物のみを示した。
(pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)2（８） 0.110g（0.063mM）の化合物（７）を5mlの80％ TFA
（CH2Cl2）に溶解し、室温で30分間攪拌した。溶媒を蒸
発させ残留物を（4mlのH2O＋2mlのCHCl3）に溶解した。
水相を3mlのCHCl3で２回洗浄し、減圧下で蒸発乾固し
た。粗生成物（0.050g）を7.5％ EtOH（aq.）中の0.1％
TFAを溶離剤として用いてLobar（Ａ）RP8カラム上で精
製した。
（CH2Cl2）に溶解し、室温で30分間攪拌した。溶媒を蒸
発させ残留物を（4mlのH2O＋2mlのCHCl3）に溶解した。
水相を3mlのCHCl3で２回洗浄し、減圧下で蒸発乾固し
た。粗生成物（0.050g）を7.5％ EtOH（aq.）中の0.1％
TFAを溶離剤として用いてLobar（Ａ）RP8カラム上で精
製した。
生成物を凍結乾燥した後、５％ EtOH（aq.）中の0.1
％ TFAを溶離剤として用いて同じカラム上で再クロマト
グラフイー処理した。生成物を凍結乾燥した。収量:0.0
16g。ニンヒドリン＋、Cl2／ジカルボキシジン＋および
UV254÷生成物はTLCにより相同であり（S3:Rf＝0.43
6）、そしてHPLCにより痕跡量の不純物のみが検出され
た。
％ TFAを溶離剤として用いて同じカラム上で再クロマト
グラフイー処理した。生成物を凍結乾燥した。収量:0.0
16g。ニンヒドリン＋、Cl2／ジカルボキシジン＋および
UV254÷生成物はTLCにより相同であり（S3:Rf＝0.43
6）、そしてHPLCにより痕跡量の不純物のみが検出され
た。
アミノ酸分析:Asp（1.02）、Glu（1.91）、Cys（1.0
8）、Lys（0.93） 実施例２ (Cys-Lys)2（９）： 実施例（１）から得られる化合物（２）をTFAに溶解
し、周囲温度で40分間攪拌した。溶媒を減圧下（30℃）
で蒸発させ残留物の水溶性部分を５％ EtOH（aq.）中の
0.1％ TFA（aq.）を移動相として用いるLobar（Ｂ）RP8
カラム（Merck）上のクロマトグラフイーに付した。カ
ラムをUV220でモニターした。純粋な生成物を含有する
画分（TLC）をプールし凍結乾燥した。生成物はTLC
（S3:Rf＝0.57）により相同であり、そしてニンヒドリ
ンとの陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
8）、Lys（0.93） 実施例２ (Cys-Lys)2（９）： 実施例（１）から得られる化合物（２）をTFAに溶解
し、周囲温度で40分間攪拌した。溶媒を減圧下（30℃）
で蒸発させ残留物の水溶性部分を５％ EtOH（aq.）中の
0.1％ TFA（aq.）を移動相として用いるLobar（Ｂ）RP8
カラム（Merck）上のクロマトグラフイーに付した。カ
ラムをUV220でモニターした。純粋な生成物を含有する
画分（TLC）をプールし凍結乾燥した。生成物はTLC
（S3:Rf＝0.57）により相同であり、そしてニンヒドリ
ンとの陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
HPLC−分析:93.5％純粋（面積による） アミノ酸分析:Cys（1.01）、Lys（0.99） 実施例３ (Asp-Cys-Lys)2（10）： 化合物（４）を実施例２（移動相中２％ EtOH）に記
載のように処理して化合物（10）を得た。生成物はTLC
により相同であり（S3:Rf＝0.64）、ニンヒドリンとの
陽性反応を示し、UV254吸収がなかつた。
載のように処理して化合物（10）を得た。生成物はTLC
により相同であり（S3:Rf＝0.64）、ニンヒドリンとの
陽性反応を示し、UV254吸収がなかつた。
HPLC−分析:97.9％純粋（面積による） アミノ酸分析:Asp（0.99）、Cys（1.03）、Lys（0.98） 実施例４ (Glu-Asp-Cys-Lys)2（11）： 化合物（６）を実施例２に記載のように処理して化合
物（11）を得た。生成物はTLCにより相同であり（S3:Rf
＝0.83）、ニンヒドリンとの陽性反応を示し、UV254吸
収がなかつた。
物（11）を得た。生成物はTLCにより相同であり（S3:Rf
＝0.83）、ニンヒドリンとの陽性反応を示し、UV254吸
収がなかつた。
HPLC−分析:100％純粋（面積による） アミノ酸分析:Asp（1.08）、Cys（0.97）、Glu（0.9
8）、Lys（0.98） 実施例５ (pGlu-Glu-Asp-Cys)2（12）： 化合物（12）をBiolynx 4170自動ペプチド合成器およ
び溶媒としてのDMFを用いる連続フロー固相ペプチド合
成法によりモノマーとして合成した。
8）、Lys（0.98） 実施例５ (pGlu-Glu-Asp-Cys)2（12）： 化合物（12）をBiolynx 4170自動ペプチド合成器およ
び溶媒としてのDMFを用いる連続フロー固相ペプチド合
成法によりモノマーとして合成した。
試薬:FMOC−Cys（Trt）−SASRIN−RESIN（Bachem）;Fmo
c−Asp（β−OtBu）−OPFP;FMOC−Glu（γ−OtBu）−OP
FP;pGlu−OPCLP;触媒としてのHOBT。
c−Asp（β−OtBu）−OPFP;FMOC−Glu（γ−OtBu）−OP
FP;pGlu−OPCLP;触媒としてのHOBT。
FMOCは各カツプリング工程後DMF中の20％ピペリジン
により除去した。完全に保護されたペプチドを固体支持
体上でDMF中の0.1Mヨウ素（２〜３当量）を用いて15分
間処理することによりジスルフイド架橋、従つて二量体
が確立した。DMFで洗浄した後ペプチドを固体支持体か
ら分離し、残りの保護基を一工程でCH3Cl中50％ TFAを
用いて40分間処理して除去した。樹脂をろ去し、ろ液を
減圧下（30℃）蒸発乾固させた。残留物を0.1％ TFA（a
q.）に溶解し、移動相として４％プロパン−２−オール
（aq.）中の0.1％TFA（aq.）を用いるLobar（Ｂ）RP8カ
ラム上のクロマトグラフイーに付した。カラムをUV220
でモニターした。純粋な生成物（HPLC）を含有する画分
をプールし、凍結乾燥した。生成物はニンヒドリンと反
応せず、UV254吸収がなかつた。
により除去した。完全に保護されたペプチドを固体支持
体上でDMF中の0.1Mヨウ素（２〜３当量）を用いて15分
間処理することによりジスルフイド架橋、従つて二量体
が確立した。DMFで洗浄した後ペプチドを固体支持体か
ら分離し、残りの保護基を一工程でCH3Cl中50％ TFAを
用いて40分間処理して除去した。樹脂をろ去し、ろ液を
減圧下（30℃）蒸発乾固させた。残留物を0.1％ TFA（a
q.）に溶解し、移動相として４％プロパン−２−オール
（aq.）中の0.1％TFA（aq.）を用いるLobar（Ｂ）RP8カ
ラム上のクロマトグラフイーに付した。カラムをUV220
でモニターした。純粋な生成物（HPLC）を含有する画分
をプールし、凍結乾燥した。生成物はニンヒドリンと反
応せず、UV254吸収がなかつた。
HPLC−分析:96.9％純粋（面積による） アミノ酸分析:Asp（1.15）、Cys（0.99）、Glu（1.85） 実施例６ (pGlu-Glu-Cys-Lys)2（13）： 化合物（13）を合成し、その相当するアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。
を用いて実施例５記載のようにして精製した。
前記されていない試薬:FMOC−Lys（Ｎε−BOC）−SAS
RIN−RESIN;FMOC−Cys（Ｓ−Trt）−OPFP。生成物はTLC
により相同であり（S3:Rf＝0.49）、ニンヒドリンとの
陽性反応を示しUV254吸収はなかつた。
RIN−RESIN;FMOC−Cys（Ｓ−Trt）−OPFP。生成物はTLC
により相同であり（S3:Rf＝0.49）、ニンヒドリンとの
陽性反応を示しUV254吸収はなかつた。
HPLC−分析:100％純粋（面積による） アミノ酸分析:Cys（1.01）、Glu（1.98）、Lys（1.01） 実施例７ (pGlu-Asp-Cys-Lys)2（14）： 化合物（14）を合成し、その相当するアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.55）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.55）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
HPLC−分析:97.5％純粋（面積による） アミノ酸分析:Asp（1.04）、Cys（0.96）、Glu（0.9
7）、Lys（1.02） 実施例８ (pGlu-Asp-Glu-Cys-Lys)2（15）： 化合物（15）を合成し、その相当するアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.42）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
7）、Lys（1.02） 実施例８ (pGlu-Asp-Glu-Cys-Lys)2（15）： 化合物（15）を合成し、その相当するアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.42）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
HPLC−分析:99.3％純粋（面積による） アミノ酸分析:Asp（1.03）、Cys（0.96）、Glu（2.0
9）、Lys（0.94） 実施例９ (pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)2（16）： 化合物（16）を合成し、その相当するアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.38）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
9）、Lys（0.94） 実施例９ (pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)2（16）： 化合物（16）を合成し、その相当するアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.38）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
HPLC−分析:100％純粋（面積による） アミノ酸分析:Asp（2.06）、Cys（0.98）、Glu（0.9
8）、Lys（0.98） 実施例10 (pGlu-Glu-Glu-Cys-Lys)2（17）： 化合物（17）を合成し、その相当するアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.39）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
8）、Lys（0.98） 実施例10 (pGlu-Glu-Glu-Cys-Lys)2（17）： 化合物（17）を合成し、その相当するアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.39）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
HPLC−分析:99.9％純粋（面積による） アミノ酸分析:Cys（0.95）、Glu（2.90）、Lys（1.15） 実施例11 (pGlu-Glu-Asn-Cys-Lys)2（18）： 化合物（18）を合成し、その相当するアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。前記され
ていない試薬:FMOC−Asn−OPFP。生成物はTLCにより相
同であり（S3:Rf＝0.42）、ニンヒドリンとの陽性反応
を示し、UV254吸収はなかつた。
を用いて実施例５記載のようにして精製した。前記され
ていない試薬:FMOC−Asn−OPFP。生成物はTLCにより相
同であり（S3:Rf＝0.42）、ニンヒドリンとの陽性反応
を示し、UV254吸収はなかつた。
HPLC−分析:98.2％純粋（面積による） アミノ酸分析:Asx（1.1）、Cys（1.03）、Glu（1.9）、
Lys（0.96） 実施例12 (pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys)2（19）： 化合物（19）を合成し、その相当するアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。前記され
ていない試薬:FMOC−Gln−OPFP。生成物はTLCにより相
同であり（S3:Rf＝0.45）、ニンヒドリンとの陽性反応
を示し、UV254吸収はなかつた。
Lys（0.96） 実施例12 (pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys)2（19）： 化合物（19）を合成し、その相当するアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。前記され
ていない試薬:FMOC−Gln−OPFP。生成物はTLCにより相
同であり（S3:Rf＝0.45）、ニンヒドリンとの陽性反応
を示し、UV254吸収はなかつた。
HPLC−分析:98.3％純粋（面積による） アミノ酸分析:Asp（1.09）、Cys（1.06）、Glx（1.8
9）、Lys（0.96） 実施例13 (pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)2（20）： 化合物（20）を合成し、その関連したアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製（移動相として
５％プロパン−２−オール）した。最後にTFA中の10％
チオアニソールを用いて脱プロトン化した。
9）、Lys（0.96） 実施例13 (pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)2（20）： 化合物（20）を合成し、その関連したアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製（移動相として
５％プロパン−２−オール）した。最後にTFA中の10％
チオアニソールを用いて脱プロトン化した。
記載されていない試薬:FMOC−Arg（Mtr）−SASRIN−R
ESIN。生成物はニンヒドリンとの反応を示さず、UV254
吸収はなかつた。
ESIN。生成物はニンヒドリンとの反応を示さず、UV254
吸収はなかつた。
HPLC−分析:99.4％純粋（面積による） アミノ酸分析:Arg（0.92）、Asp（1.12）、Cys（1.0
0）、Glu（1.96） 実施例14 (Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)2（21）： 化合物（21）を合成し、その関連したアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.57）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
0）、Glu（1.96） 実施例14 (Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)2（21）： 化合物（21）を合成し、その関連したアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.57）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
HPLC−分析:94.7％純粋（面積による） アミノ酸分析:Asp（1.00）、Cys（1.01）、Glx（2.0
2）、Lys（0.96） 実施例15 (Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)2（22）： 化合物（22）を合成し、その関連したアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.57）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
2）、Lys（0.96） 実施例15 (Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)2（22）： 化合物（22）を合成し、その関連したアミノ酸誘導体
を用いて実施例５記載のようにして精製した。生成物は
TLCにより相同であり（S3:Rf＝0.57）、ニンヒドリンと
の陽性反応を示し、UV254吸収はなかつた。
HPLC−分析:98.2％純粋（面積による） アミノ酸分析:Asp（1.06）、Cys（1.01）、Glu（0.9
9）、Lys（0.99）、Pro（0.96）
9）、Lys（0.99）、Pro（0.96）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 5/117 Ｃ０７Ｋ 7/06 7/06 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＹ
Claims (9)
- 【請求項１】式（Ｉ） （式中、すべてのアミノ酸単位はＬ−配置であり、 Ａは または水素原子であり、 Ｂは またはヒドロキシ基であり、 ｎおよびｍは独立して１または２の整数であり、 ａおよびｂは独立して０または１の整数であり、 Ｒ、Ｒ′およびＲ″は独立してヒドロキシ基またはアミ
ノ基である。 但し、ＡおよびＢがそれぞれ水素原子およびヒドロキシ
基である場合、ｂは整数の０ではない） の化合物およびその生理学的に許容しうる塩。 - 【請求項２】ｂが整数１であり、ｍが整数１であり、そ
してＲ、Ｒ′およびＲ″がヒドロキシ基である請求項１
記載の化合物。 - 【請求項３】(Cys-Lys)2 (Asp-Cys-Lys)2 (Glu-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Glu-Asp-Cys)2 (pGlu-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)2 (Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)2 (Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)2 である請求項２記載の化合物。
- 【請求項４】(pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)2である請求項２
記載の化合物。 - 【請求項５】式（II） （式中、Ａは 水素原子またはアミン保護基であり、 Ｂは ヒドロキシ基またはカルボキシルブロッキング基であ
り、 ｎおよびｍは独立して整数１または２であり、 ａおよびｂは独立して整数０または１であり、 R1、R2、R8およびR10はアミノ、ヒドロキシ、保護され
たアミノまたはカルボキシル保護基であり、 R3、R4、R5、R6、R7およびR9は水素原子またはアミン保
護基である。 但し、Ａが水素原子またはアミン保護基であり、そして
Ｂがヒドロキシ基またはカルボキシルブロッキング基で
ある場合、ｂは整数０ではない） の化合物を脱保護化することからなる式（Ｉ） （式中、すべてのアミノ酸単位はＬ−配置であり、 Ａは または水素原子であり、 Ｂは またはヒドロキシ基であり、 ｎ、ｍ、ａおよびｂは前述の定義を有し、 Ｒ、Ｒ′およびＲ″は独立してヒドロキシ基またはアミ
ノ基である。 但し、ＡおよびＢがそれぞれ水素原子およびヒドロキシ
基である場合、ｂは整数の０ではない） の化合物の製造方法。 - 【請求項６】脱保護化が酸加水分解、水素化分解、アン
モノリシスまたは酵素加水分解により行われる請求項５
記載の方法。 - 【請求項７】式（III） （式中Ａは または水素原子であり、 Ｂは またはヒドロキシ基であり、 ｎおよびｍは独立して１または２の整数であり、 ａおよびｂは独立して０または１の整数であり、 ＲおよびＲ′は独立してヒドロキシ基またはアミノ基で
あり、そして Ｒ″は水素原子または酸化条件下で除去されうるチオー
ル保護基である。 但し、ＡおよびＢがそれぞれ水素原子およびヒドロキシ
基である場合、ｂは整数の０ではない） の化合物を二量化することからなる式（Ｉ） （式中、すべてのアミノ酸単位はＬ−配置であり、 Ａは または水素原子であり、 Ｂは またはヒドロキシ基であり、 ｎ、ｍ、ａおよびｂは前述の定義を有し、 Ｒ、Ｒ′およびＲ″は独立してヒドロキシ基またはアミ
ノ基である。 但し、ＡおよびＢがそれぞれ水素原子およびヒドロキシ
基である場合、ｂは整数の０ではない） の化合物の製造方法。 - 【請求項８】式（II） （式中、Ａは 水素原子またはアミン保護基であり、 Ｂは ヒドロキシ基またはカルボキシルブロッキング基であ
り、 ｎおよびｍは独立して整数１または２であり、 ａおよびｂは独立して整数０または１であり、 R1、R2、R8およびR10はアミノ、ヒドロキシ、保護され
たアミノまたはカルボキシル保護基であり、 R3、R4、R5、R6、R7およびR9は水素原子またはアミン保
護基である。 但し、Ａが水素原子またはアミン保護基であり、そして
Ｂがヒドロキシ基またはカルボキシルブロッキング基で
ある場合、ｂは整数０ではない） の化合物。 - 【請求項９】式（Ｉ） （式中、すべてのアミノ酸単位はＬ−配置であり、 Ａは または水素原子であり、 Ｂは またはヒドロキシ基であり、 ｎおよびｍは独立して１または２の整数であり、 ａおよびｂは独立して０または１の整数であり、 Ｒ、Ｒ′およびＲ″は独立してヒドロキシ基またはアミ
ノ基である。 但し、ＡおよびＢがそれぞれ水素原子およびヒドロキシ
基である場合、ｂは整数の０ではない） の化合物またはその生理学的に許容しうる塩を薬学的担
体または賦形剤とともに含有する人間または動物被験体
の造血系を刺激するための医薬組成物。
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