FI92209C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidiyhdisteiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

92209

MenetelmS terapeut ti sesti kSyttdikelpoisten peptidiyhdis-teiden valmistamiseksi

Keksinttt koskee menetelmSS uusien peptidien, joilla 5 on stimuloiva vaikutus hemopoieesiin, valmistamiseksi.

Luuytimen solut polveutuvat monipuolisesti kehitys-kelpoisista kantasoluista, jotka kypsyvSt muodostaen moni-puolisen populaation morfologisesti erilaisia soluja, ni-mittSin megakaryosyyttej3, erytrosyyttej3, granulosyyttejS 10 ja lymfosyyttej3. Ainoastaan noin 10 % kantasoluista 13pi-k3y kulloinkin solujen jakaantumista. Kypsymisen alkuvai-heessa kukin Iis33ntyvist3 kantasoluista "m33r3ytyy" tiet-tyyn morfologisesti erotettavaan muotoon, joka lopulta johtaa yhteen yll3 mainituista nelj3st3 kypsSstå solutyy-15 pists. Solujen Iis33ntyess3 ne menettSvSt vShitellen kyvyn Iis33nty3 edelleen, ja kypsSt solut, esimerkiksi erytro-syytit tai granulosyytit, eivSt en33 kykene jakautumaan. Koska siis kypsiS soluja jatkuvasti kuolee, on olennaisen tSrkeSS, ett3 vShemmSn kypsien solujen ja erityisesti mye-20 lopoieesiin mSSrSytyneiden kantasolujen lisSSntymiskyky sSilyy.

Olemme nyt lOytSneet ryhm3n uusia peptidejS, jotka kykenev3t stimuloimaan myelopoieettisten kantasolujen li-sSSntymistS.

25 Keksinttt koskee menetelmSS terapeuttisesti kSyttd- kelpoisten kaavan (I) mukaisten yhdisteiden ja niiden far-maseuttisesti hyvSksyttSvien suolojen valmistamiseksi

A-(NH-CH-CO)a-(NH-CH-CO)(NH-CH-CO)- B

30 «K'm ?h2 <I> COR COR' S -- 2 jossa kaikki aminohappoykslkdt ovat L-konfiguraatiossa, A edustaa ryhmSS NH-CH-CO-, NH-CH-CO-, NH,-CH-CO- tai vety-

35 O

conh2 2 92209 atomia; B edustaa ryhmaa -NH-CH-COR", -NH-CH-CO-R" tai (CH2)4 (CH2)3

NH, NH

5 HN NH2 hydroksiryhmaa; n ja m edustavat toisistaan riippumatta kokonaislukua 1 tai 2; a ja b edustavat toisistaan riip-pumatta kokonaislukua 0 tai 1; R, R1 ja R" edustavat toi-10 sistaan riippumatta hydroksiryhmaa tai aminoryhmaa; silia ehdolla, etta kun A ja B edustavat vastaavasti vetyatomia ja hydroksiryhmaa, b ei voi edustaa kokonaislukua 0.

Kaavan (I) mukaiset yhdisteet ovat siten symmetri-sia dimeereja.

15 Kun A edustaa glutamiinijaanndsta tai proliinijaan- nttsta, pidetdan parhaana, etta a=b=l, n=2, m=l, R ja R' edustavat hydroksiryhmia ja B edustaa lysiinijaanndsta.

Kun B edustaa arginiinijaannOsta, pidetaan parhaana, etta A edustaa pyroglutamaattijaannOsta, a=b=l, n=2, 20 m»l ja R ja R1 edustavat hydroksiryhmia.

Erityisen hyvana pidetty yhdisteryhma ovat sellai-set, joissa b«l, m-1 ja R, R1 ja R" edustavat hydroksiryhmia.

Aivan erityisen hyvina pidetty ja keksinndn mukaisia 25 yhdisteita ovat seuraavat (jolloin on kaytetty aminohappo-jen tavanomaista biokemiallista merkitsemistapaa ja luettu lahtien N-paasta): (Cys-Lys )2 (Asp-Cys-Lys )2 30 (Glu-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Glu-Asp-Cys)2 (pGlu-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)2 • 4 3 92209 (Gln-Glu-Asp-Cys-Lys >2 (Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)^

Vielå aivan erityisen hyvånå pidetty yhdiste on (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys>2, so. yhdiste, jossa a=b=l, m=l, 5 n=2, R ja R' edustavat hydroksiryhmiå, A edustaa pyro- glutamaattijåånndstå ja B edustaa lysiinijåånnOstå.

KeksinnOn mukaisten peptidien fysiologisesti hyvåk-syttåviå suoloja ovat sellaiset happoadditiosuolat kuin esimerkiksi hydrokloridi, hydrobromidi, sulfaatti jne. 10 samoin kuin sellaiset suolat emåsten kanssa kuin esimerkiksi alkalimetallisuolat, esim. natrium- tai kaliumsuo-lat, maa-alkalimetallisuolat, esim. kalsiumsuola, tai amiinisuolat.

Jotkut kaavan (I) mukaisista yhdisteitå ovat sel-15 laisten yhdisteiden dimeerejå, jotka on kuvattu ja esitet-ty patenttivaatimuksissa EP-patenttihakemuksessamme nro 83 307 210.1. Tåmå viimeksi mainittu patenttihakemus kos-kee pientå ryhmaa hemoregulatiivisia peptideja, joilla on eståva vaikutus granulopoieesiin.

20 Johtuen luonnon granulopoieesifaktorin erittåin pienistå saatavissa olevista mååristå ei luonnollisen ai-neen rakennetta ole koskaan mååritetty. Sita ei koskaan ole saatu kiteisesså tai tåysin puhtaassa muodossa eikå tiedetå, voitaisiinko tata aikaansaada kayttaen ainoastaan 25 luonnon lahteista peraisin olevaa materiaalia. Sen on ole-tettu omaavan rakenteen pyroGlu-Asp-Asp-Cys-LysOH, mutta kuten ylia mainitussa EP-patenttihakemuksessamme on selos-tettu, osoittautui taman rakenteen omaava synteettinen yhdiste inaktiiviseksi. On havaittu, etta kun luonnon gra-30 nulopoieesinestofaktori saatettiin hapettaviin olosuhtei-siin, muodostui yhdiste, jolla oli stimuloiva vaikutus. Myttskaan tata tuotetta ei ole kuitenkaan koskaan eristetty tai identifioitu. Sita vastoin voidaan taman keksinnOn mukaisia peptideja saada puhtaassa, farmaseuttiseen kåyt-35 tiJOn sopivassa muodossa ja suhteellisen suurina maarina.

• 4 92209

On myOs selostettu (Exp. Hematol. 12 7 (1981)), etta kun yhdelle ylia mainitussa EP-patenttihakemuksessam-me esitellyista peptideista, nimittain pyroGlu-Asp-Cys-LysOHtlle, suorltetaan jaadyttSminen ja sulattamlnen, se 5 osolttaa stimuloivaa aktiivisuutta, joka voldaan kumota kasittelemaiia merkaptoetanolilla. Stimuloivaa tuotetta el kuitenkaan ole koskaan saatu puhtaassa muodossa eikS sen rakennetta ole koskaan maaritetty.

Uudet yhdisteet on testattu kemiallisesti puhtaassa 10 muodossa in vitro ja in vivo hemoregulatiivisten vaikutus-ten suhteen. Seka ihmisen etta hiiren myelopoieettisilla kantasoluilla suoritetut in vitro -tutkimukset ovat osoit-taneet kolonnioiden muodostuksen agarissa lisaantymista 1500 %:iin saakka. Stimuloiva vaikutus esiintyy konsent-15 raatioalueella 10-1^ - 10-1^ M. Hiirilia in vivo suorite-tuissa tutkimuksissa olemme havainneet, etta yksi ainoa ruiske voi suurentaa myelopoieettisten kantasolujen luku-maaran 50 %:lla 48 tunnin kuluessa ja jatkuvan infuusion tapauksessa kantasolujen lukumaara kaksinkertaistui 13 20 paivdn kuluessa.

KeksinnOn erityinen kayttOsovellutus on myelopoieen stimuloinnissa potilailla, jotka karsivat vahentyneesta myelopoieettisesta aktiivisuudesta, mukaan lukien luuydin-vaurio, agranulosytoosi ja aplastinen anemia. Tahan sisal-25 tyy sellaisten potilaiden hoito, joilla on vahentynyt luu-ytimen toiminta johtuen immunosuppressiivisesta hoidosta kudosreaktioiden tukahduttamiseksi, esim. luuydinsiirto-kirurgiassa.

Yhdisteita voidaan myOs kdyttaa nopeuttamaan luu-30 ytimen uudistumista kasvain- ja virussairauksien sytos-taattisen kemoterapian ja sadehoidon jaikeen.

Lisaksi uudet yhdisteet voivat olla erityisen ar-vokkaita tapauksissa, jolloin potilailla on vakavia infek-tioita johtuen immuunivasteen puutteesta seurauksena luu-35 ytimen toiminnan vajavuudesta.

• · 5 92209

Erds toinen kliinisen kaytOn mahdollisuus on yhdis-telmåsså vastaavien monomeerien tai vastaavien myelo-poieesin inhibiittoreiden kanssa, jollaisia on esitelty ylia mainitussa EP-patenttijulkaisussamme, jotta aikaan-5 saataisiin luuydinsoluissa vuorottelevia suuren ja alhai-sen aktiivisuuden huippuja vahvistaen siten hemopoieesin luonnollista vuorokausi (circadian) -rytmia. Taiia tavalla voidaan antaa sytostaattista hoitoa luuytimen alhaisen aktiivisuuden aikoina vahentaen siten luuytimen vaurioi-10 tumisen vaaraa, kun taas uudistumista edistaa seuraava aktiivisuuden huippu.

Huomattakoon, etta ei esiinny stimuloivaa vaikutus-ta muiden kudosten soluihin ja erityisesti ei kasvainso-luihin, jotka kuuluvat ei-myelopoieettisiin kudoksiin. 15 Uudet yhdisteet stimuloivat siten myelopoieettista jarjes-telmaa selektiivisesti.

Peptidit eivat ole merkittavasti myrkyllisia. Li-saksi kaikki havaitut hematologiset vaikutukset ovat pa-lautuvia ja elainten, joihin oli ruiskutettu peptidejå, 20 joissa elimissa ei havaittu makroskooppisia muutoksia.

Stimuloivan vaikutuksen aikaansaamiseksi voidaan keksinnOn mukaisia peptideja yleensa antaa ihmispotilaille ruiskeessa annoksen, joka on vaiilia 0,1 - 10 mg, esimer- kiksi 1 - 5 mg, 70 kg ruumiinpainoa kohden paivassa. An- 25 nettaessa infuusiona tai sen kaltaisen tekniikan avulla armos voi olla vaiilta 30 - 300 mg 70 kg ruumiinpainoa kohden, esimerkiksi noin 100 mg, kuuden paivan kuluessa.

Periaatteessa on toivottavaa aikaansaada peptidin konsent--13 -5 raatio noin 10 M - 10 M potilaan solujen ulkopuolisessa 30 nesteessa.

Taman keksinnOn vieia eraana lisdosana tarjotaan farmaseuttisia valmisteita, jotka sisaitavat aktiivisena aineosana yhta tai useampaa edelia maaritellyn mukaista kaavan (I) omaavaa yhdistetta tai sellaisten fysiologi-35 sesti sopivia suoloja yhdistettyna farmaseuttisen kantaja- « 6 92209 tai tayteaineen kanssa. KeksinnOn mukaiset valmisteet voi-daan tarjota esimerkiksi muodossa, joka sopii annettavaksi suun kautta, nen&n kautta, ruoansulatuskanavan ulkopuoli-sesti tai per£suoleen.

5 Tassa kaytettyna sisaitaa termi "farmaseuttinen" keksinnOn el&inia&kint&k&yttOmahdollisuudet.

KeksinnOn mukaiset yhdisteet voidaan tarjota tavan-omaisissa farmakologisissa antamismuodoissa, kuten esimerkiksi tabletteina, paailystettyina tabletteina, nenOsuih-10 keina, liuoksina, emulsioina, jauheina, kapseleina tai hitaasti vapauttavina muotoina. Naita muotoja valmistet-taessa voidaan kayttaa tavanomaisia farmaseuttisia tayte-aineita seka tavallisia valmistusmenetelmia. Tabletteja voidaan valmistaa esimerkiksi sekoittamalla aktiivinen 15 aineosa tai aineosat tunnettujen tayteaineiden, kuten esimerkiksi laimennusaineiden, kuten kalsiumkarbonaatin, kal-siumfosfaatin tai laktoosin, sellaisten hajottavien ainei-den kuin esimerkiksi maissitarkkelys tai algiinihappo, sellaisten sideaineiden kuin esimerkiksi tarkkelys tai 20 gelatiini, sellaisten liukastavien aineiden kuin esimerkiksi magnesiumstearaatti tai talkki ja/tai sellaisten aineiden kanssa, joiden avulla aikaansaadaan hidas vapaut-taminen, kuten esimerkiksi karboksipolymetyleenin, karbok-simetyyliselluloosan, selluloosa-asetaattiftalaatin tai 25 polyvinyyliasetaatin.

Tabletit voivat haluttaessa koostua useista kerrok-sista. Paailystettyja tabletteja voidaan valmistaa paai-lystamaiia ytimia, jotka on aikaansaatu samalla tavoin kuin tabletit, kéyttSen aineita, joita yleisesti k&yteta&n 30 tablettien paallystyksiin, esimerkiksi polyvinyylipyrroli-donia tai sellakkaa, arabikumia, talkkia, titaanidioksidia tai sokeria. Hitaan vapauttamisen aikaansaamiseksi tai jotta vSltettSisiin yhteensopimattomuuksia, voi myOs ydin koostua useista kerroksista.. Tabletin p&ållys voi myOs 35 koostua useista kerroksista, jotta aikaansaataisiin hidas • · vapauttaminen, jossa tapauksessa voidaan kayttaa ylia mai- nittuja tablettien tdyteaineita.

Voidaan myds kayttaa elinspesifisia kantajasystee- 7 92209 meja.

5 Ruiskeliuokset voidaan valmistaa esimerkiksi tavan- omaisesti, kuten lisåamaiia sailytysaineita, kuten esimerkiksi p-hydroksibentsoaatteja, tai stabiloimisaineita, kuten esimerkiksi EDTA: a. Liuokset pannaan sitten ruiske-pulloihin tai ampulleihin.

10 Nenasuihkeet voidaan sekoittaa samalla tavoin vesi- liuoksiksi ja pakata suihketiilkkeihin joko aerosoliponne-aineen kanssa tai jarjestaen keino kasin suoritettavaa puristamista vårten. Kapseleita, jotka sisaitavat yhden tai useampia aktiivisia aineosia, voidaan valmistaa esi-15 merkiksi sekoittamalla aktiiviset aineosat inerttien kan-taja-aineiden, kuten esimerkiksi laktoosin tai sorbitolin, kanssa ja tayttamaiia seoksella gelatiinikapseleita.

Sopivia laakepuikkoja voidaan valmistaa esimerkiksi sekoittamalla aktiivinen aineosa tai aktiivisten aineosien 20 yhdistelmia tavanomaisten tahan tarkoitukseen sopivien kantaja-aineiden, kuten esimerkiksi luonnon rasvojen tai polyeteeniglykolin tai sen johdannaisten kanssa.

Taman keksinndn mukaisia yhdisteita sisaitavat an-nostusyksikdt sisaitavat mieluimmin 0,1 - 10 mg, esimer-25 kiksi 1-5 mg, kaavan (I) mukaista peptidia tai sen suo-laa.

Vieia eraana taman keksinndn osana tarjotaan mene-telma myelopoieesin stimuloimiseksi, joka menetelma kasit-taa tehokkaan maardn ylia maaritellyn mukaista farmaseut-30 tista valmistetta antamisen henkildlle.

Vieia eras tarkea uusien peptidien kayttd on kui-tenkin materiaalin tuottamisessa immunologisia analyysi-tekniikkoja vårten. Peptidi voidaan silloin kiinnittaa kovalenttisesti sopivaan suurimolekyyliseen kantajaan, 35 kuten esimerkiksi albumiiniin, polylysiiniin tai polypro- 8 92209 liiniin, ruiskutettavaksi vasta-ainetta tuottaviin eiai-miin (esim. kaniinit, marsut tai vuohet). Voidaan myOs kayttaa in vitro -immunointitekniikkoja. Saadaan erittain spesifisiå antiseerumeja kayttamaiia tunnettuja absorptio-5 tekniikkoja, joissa kaytetaan suurimolekyylista kantaja-ainetta. Liittamaiia peptidimolekyyliin radioaktiivisuutta (3H, 14C, 1S) voidaan helposti suunnitella radioimmunoanal-yysi ja kayttaa sita peptidin maarittamiseen erilaisista biologisista nesteista, kuten esimerkiksi seerumista (pla-10 smasta), virtsasta ja aivoselkaydinnesteesta.

KeksinnOn mukaiselle menetelmaile on tunnusomaista, etta (a) poistetaan suojaus kaavan (II) mukaisesta yh-disteesta happaman hydrolyysin, hydrogenolyysin, ammono-15 lyysin tai entsymaattisen hydrolyysin avulla

A- (NH-CH-CO) a- (NH-CH-CO) (NH-CH-CO) -B

(?H2[n 9»2 (II) corl cor2 h --- 20 - _ 2 jossa A edustaa ryhmaa R3N-CH-C0-, R4N-CH-C0-,

U

25 R5NH-CH-CO-, vetyatomia tai amiinin suojaryhmaa; (CH2)2 CONHR6 B edustaa ryhmaa -NH-CH-COR8, -NH-CH-COR10, 30 (CH2)4 (CH2)3

NHR7 NH

A .

HN NHR9

II

• · hydroksiryhmaa tai karboksyylin suojaryhmaa; n ja m edus- 9 92209 tavat toisistaan riippumatta kokonaislukua 1 tal 2; a ja b edustavat toisistaan riippumatta kokonaislukua 0 tai 1; R1, R2, R8, ja R10 ovat amino-, hydroksi-, suojattuja ami-noryhmiS tai karboksyylin suojaryhmié; R3, R4, R5, R6, R7 ja 5 R9 ovat vetyatomeja tai amiinin suojaryhmia; silia ehdolla, etta kun A edustaa vetyatomia tai amiinin suojaryhmaa ja B edustaa hydroksiryhmaa tai karboksyylin suojaryhmaa, sil-loin b ei voi edustaa kokonaislukua nolla, tai (b) dimeroidaan kaavan (III) mukainen yhdiste 10 A-(NH-CH-CO) -(NH-CH-CO). -(NH-CH-CO)-B i a , b , (CH2) (ch2) (CH2) i n i * ra | 2 ίτττ\ COR COR' SR" ( } 15 jossa A, B, n, m, a, b, R ja R* ovat ylia maaritellyn mu-kaisia ja R" on vetyatomi tai tiolin suojaryhma, joka voi-daan poistaa hapettavissa olosuhteissa.

Yleensa suojataan lasna olevat reaktiiviset sivu-ketjuryhmat (amino, tioli ja/tai karboksyyli) kokonaissyn- 20 teesin kytkemisreaktioiden ajaksi ja viimeinen vaihe on siten suojauksen poistaminen kaavan (I) mukaisen yhdisteen suojatusta johdannaisesta. Yleensa suojataan kaikki -COOH -ryhmat, kaikki -NH2 -ryhmat ja pyroglutamyyli- tai prolii-nijaannOksen -NH -ryhmat; sellaiset peptidien suojatut , , 25 muodot ovat keksinnttn lisayskohta ja ne ovat seuraavan yleisen kaavan (II) mukaisia A-(NH-CH-CO) -(NH-CH-CO).-(NH-CH-CO)-B i a , b i ' (CH,) iCH9)m CH, (II) 30 i ^ln I 2 ' 1 COR1 COR2 S-- 2 jossa A edustaa ryhmaa R3N-CH-C0-, R4N-CH-C0-,

kJ

35 10 92209 R5NH-CH-CO-, vetyatomia tal amiinin suojaryhmaa; (CH2)2 CONHR6 B edustaa ryhmaa -NH-CH-COR8, -NH-CH-COR10, 5 (CH2)4 (i H2)3

NHR7 NH

A .

HN NHR9 10 hydroksiryhmaa tal karboksyylln suojaryhmaa; n ja m edus-tavat toisistaan riippumatta kokonalslukua 1 tal 2; a ja b edustavat toisistaan riippumatta kokonalslukua 0 tal 1; R1, R2, R8, ja R10 ovat amlno, hydroksi, suojattu amlno tal karboksyylln suojaryhma; R3, R4, R5, R6, R7 ja R9 ovat vetya-15 tomeja tal amiinin suojaryhmiå; silia ehdolla, etta kun A edustaa vetyatomia tal amiinin suojaryhmaa ja B edustaa hydroksiryhmaa tal karboksyylln suojaryhmaa, silloin b el vol edustaa kokonalslukua nolla.

Yleensa kaavan (II) mukaiset suojatut johdannaiset 20 voidaan valmistaa kayttamaiia peptidisynteesiin sopivia tekniikkoja.

Yhdessa mahdollisessa synteesireitissa kaytetaan hyvaksi kystiinia ja tama kytketaan muihin aminohappojaan-nOksiin niin etta dimeerin kaksi identtista ketjua kootaan 25 ja yhdistetaan kystiinissa jo lasna olevan disulfidisidok-sen avulla. Vaihtoehtoinen menettelytapa on syntetisoida vastaava monomeerinen yhdiste S-suojatussa muodossa kayt-taen S-suojattua kysteiinia, poistaa S-suojaryhma ja suo-rittaa dimerointi. On mahdollista kayttaa S-suojaryhmia, 30 jotka voidaan poistaa hapettavien aineiden avulla aikaan-saaden disulfidisidos suoraan suojauksenpoistamisvaihees-sa; siten esimerkiksi trityyliryhmat voidaan poistaa se-lektiivisesti jodin avulla, mieluimmin sopivassa liuot-timessa, kuten esimerkiksi dimetyyliformamidissa; sellai-35 nen dimerointi voidaan suorittaa C- ja N-suojatulle mono-meerille, mita seuraa C- ja N-suojaryhmien poistaminen, • 11 92209 tal se voidaan suorittaa viimeisena synteesin valheena kayttaen kaavan (III) mukalsta monomeeria

A- (NH-CH-CO) a- (NH-CH-CO) b~ (NH-CH-CO) -B

5 (CH-) (CH,)m (CH-) (III) i λ. n i i- in i i COR COR' SR" jossa A, B, n, m, a, b, R ja R' ovat ylia maaritellyn mukalsla ja R" on vetyatomi tal tiolin suojaryhmå, joka voi-10 daan polstaa hapettavlssa olosuhtelssa.

Peptldlketjuja rakennettaessa voidaan perlaatteessa alolttaa joko C-paasta tai N-paasta, vaikka alnoastaan C-paasta aloittamisen menettely on ylelsessa kaytOssa.

Siten voidaan alolttaa C-paasta antamalla esimer-15 kiksi lysiinin sopivasti suojatun johdannaisen reagoida kysteiinin tai kystiinin sopivasti suojatun johdannaisen kanssa. Lysiinijohdannaisessa on vapaa α-aminoryhma, kun taas toisessa reagoivassa yhdisteesså on joko vapaa tai aktivoitu karboksyyliryhma ja suojattu aminoryhma. Kytke-20 misen jaikeen vaiituote voidaan puhdistaa esimerkiksi kro-matografian avulla ja sen jaikeen poistaa selektiivisesti N-suojaus, jotta seuraavan aminohappojaannOksen lisååminen olisi mahdollista. Tata menettelya jatketaan kunnes vaa-dittu aminohapposekvenssi on saatu valmiiksi.

- 25 Karboksyylihapon aktivoivia substituentteja, joita voidaan esimerkiksi kayttaa, ovat symmetriset tai seka-anhydridit tai aktivoidut esterit, kuten esimerkiksi g-nitrofenyyliesteri, 2,4,5-trikloorifenyyliesteri, N-hyd-roksibentsotriatsoliesteri (OBt) tai N-hydroksisukkiini-30 imidyyliesteri (OSu).

Vapaiden amino- ja karboksyyliryhmien kytkeminen voidaan suorittaa esimerkiksi kayttaen disykloheksyylikar-bodi-imidia (DCC). Eras toinen kytkentaaine, jota esimerkiksi voidaan kayttaa, on N-etoksikarbonyyli-2-etoksi-l, 2-35 dihydrokinoliini.

12 92209

YleensS on soplvaa suorittaa kytkemisreaktio alhai-sissa 1ampOtiloissa, esimerklksi l&mpdtilassa -20 °C:sta ympSristbn lamptttilaan saakka, mleleliaan soplvassa liuot-timessa, kuten esimerklksi tetrahydrofuraanissa, dioksaa-5 nissa, dimetyyliformamidissa, metyleenikloridissa tal nSi-den liuotinten seoksessa.

Voi olla helpompaa suorittaa synteesi kiinteaa faa-sia olevan hartsikantajan pinnalla. Kloorimetyloitu poly-styreeni (ristiliitetty 1 %:lla divinyylibentseenia) on 10 yksi kayttdkelpoinen kantajatyyppi; tassa tapauksessa synteesi aloitetaan C-pSSsta, esimerklksi kytkemaiia N-suo-jattu lysiini kantajaan.

Muutamia sopivia kiintean faasin tekniikkoja ovat kuvanneet Eric Atherton, Christopher J. Logan ja Robert C. 15 Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin I, 538 - 546 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng ja R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 102, 6117 - 6127 (1980); James P. Tam, Richard D.

Dimarchi ja R. B. Merrifield, Int. J. Peptide Protein Res 16, 412 - 425 (1980); Manfred Mutter ja Dieter Bellof, 20 Helvetica Chimica Acta 67, 1009 - 2016 (1984).

Tunnetaan laaja valikoima aminohappojen suojaryh-mi& ja niistd on esimerkkejå julkaisuissa SchrOder, E. ja LUbke, K., The Peptides, osat 1 ja 2, Academic Press, New York ja London, 1965 ja 1966; Pettit, G. R., Synthetic 25 Peptides, osat 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 ja 1976; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, Band 15, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974; Amino Acids, Peptides and Proteins, osa 4-8, The Chemical Society, Lontoo 1972, 30 1974, 1975 ja 1976; Peptides, Synthesis-physical data 1 - 6, Wolfgang Voelter, Eric Schmidt-Siegman, Georg Thieme Verlag Stuttgart, NY, 1983; The Peptides, Analysis, synthesis, biology 1-7, toim. Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY, San Fransisco, Lontoo; 35 Solid phase peptide synthesis 2. painos, John. M. Stewart, Janis D. Young, Pierce Chemical Company.

92209 13

Siten esimerkiksi amiinin suojaryhmia, joita voi-daan kMyttaa, ovat sellaiset suojaryhmat kuin karbobent-soksi (merkitaan jaijempana myds Z), t-butoksikarbonyyli (merkitaan jaijempana myds Boc), 4-metoksi-2,3,6-trimetyy-5 libentseenisulfonyyli (Mtr) ja 9-fluorenyylimetoksikar-bonyyli (merkitaan jaijempana myOs Fmoc). On selvaa, etta kun peptidi rakennetaan aloittaen C-paasta, on kunkin li-satyn uuden jaanndksen α-aminoryhmassa lasna amiinin suo-jaryhma ja se taytyy poistaa selektiivisesti ennen seuraa-10 vaa kytkentavaihetta. Yksi erityisen hyddyllinen ryhma sellaista vaiiaikaista amiinin suojausta vårten on Fmoc-ryhma, joka voidaan poistaa selektiivisesti kasittelemaiia piperidiinilia orgaanisessa liuottimessa.

Karboksyylin suojaryhmia, joita esimerkiksi voidaan 15 kayttaa, ovat helposti lohkaistavat esteriryhmat, kuten esimerkiksi bentsyyli (Bzl), p-nitrobentsyylli (ONb), pen-takloorifenyyli (OPC1P), pentafluorifenyyli (OPFP) tai t-butyyli (OtBu) -ryhma samoin kuin kiinteiden kantajien pinnalla olevat kytkemisryhmat, esimerkiksi polystyreeniin 20 sidotut metyyliryhmat.

Tiolin suojaryhmia ovat p-metoksibentsyyli (Mob), trityyli (Trt) ja asetamidometyyli (Acm).

On selvaa, etta on olemassa laaja joukko muita sel-laisia ryhmia, kuten on selostettu yksityiskohtaisesti 25 esimerkiksi ylia mainituissa kirjallisuusviitteissa, ja kaikkien sellaisten ryhmien kaytttt ylia kuvatuissa mene-telmissa sisaityy tamdn keksinndn piiriin.

On olemassa laaja joukko menetelmia amiinin ja karboksyylin suojaryhmien poistamiseksi. Naiden taytyy kui-30 tenkin sopia yhteen kaytetyn synteesisuunnitelman kanssa. Sivuketjujen suojaryhmien taytyy olla stabiileja olosuh-teissa, joita kaytetaan vdliaikaisen α-aminon suojaryhman poistamiseen ennen seuraavaa kytkemisvaihetta.

Sellaiset amiinin suojaryhmat kuin Boc ja karbok-35 syylin suojaryhmat kuin tBu voidaan poistaa samanaikaises- 14 92209 ti kasittelemaiia hapolla, esimerkiksi trifluorietikkaha-polla. Sellaiset tiolin suojaryhmat kuin Trt voidaan pois-taa selektiivisesti kayttamaiia sellaista hapettavaa ai-netta kuin esimerkiksi jodi.

5 Seuraavat esimerkit on tarkoitettu ainoastaan va- laiseviksi.

Liuottimet tislattiin uudelleen kaupallisesta ma-teriaalista ja s&ilytettiin seuraavasti: dimetyyliform- amidi (DMF) molekyyliseulan 4A ylia, dikloorimetaani (DCM) 10 CaC^^ ylia, trietyyliamiini (TEA) Na/Pb-lejeeringin (Baker) ylia ja trifluorietikkahappo (TFA) molekyyliseulan 4A ylia.

Ohutkerroskromatografia (TLC) -systeemit olivat seuraavanlaiset: 15 piidioksidi/CHCl3:MeOH (98:2) S2: piidioksidi/CHCl^:MeOH (95:5) S^: piidioksidi RP 8/0,1 % TFA 5 % EtOH:ssa (vesiliuos).

Puhdistetut lopputuotteet analysoitiin kaanteis-faasikorkeapainenestekromatografian (HPLC) avulla. HPLC-20 systeemi kasitti HP 1090M -kromatografin, jossa oli si-saanrakennettu automaattinen naytteenotin ja HP 1040 -di-odisarja (Hewlett-Packard, Waldbronn, Ldnsi-Saksa ja supercosil LC-18 -pylvaan (250 x 4,6 mm, 5 u:n hiukkasia). Naytteet liuotettiin 0,1 % (tilavuus/tilavuus) TFA:oon 25 (vesiliuos) ja eluoitiin kayttaen lineaarista gradienttia, jonka muodosti 0 - 30 % asetonitriili 0,1 % TFA:ssa (vesiliuos). Virtausnopeus oli 2 ml/min. Eluenttia tarkkailtiin aallonpituudella 214 nm kayttaen vyOn leveytta 4 nm. Liu-ottimen kromatogrammi vahennettiin elektronisesti ja tu-30 lokset esitettiin ilmaistuna pinta-alaprosentteina.

Aminohappoanalyysi:

Kystiinia sisaitavat peptidit hapetettiin permuura-haishapolla hapon suhteen labiilin kystiinij aannOksen muuttamiseksi haponkestavaksi kysteiinihapoksi ennen ha-35 panta hydrolyysia 6 M HCl:ssa 110 °C:ssa 16 tunnin aikana.

15 92209

Kuivista hydrolysaateista tehtiin sitten johdannaisia k&yttaen fenyyli-isotiosyanaattia ja analysoitiin kuten Heinrikson on kuvannut (Anal. Bioch. 136, 65 - 74, 1984).

Esimerkki 1: (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)^ 5 (Fmoc-Cys-Lys(N€-Boc)-OtBu2 (1): 2 g (2,275 mM) yhdistettS (Fmoc-Cys-OSu)2, 2,18 g (5,0 mM) yhdistetta Lys(N€-Boc)-OtBu.HCl ja 0,58 g (5 mM) N-etyylimorfoliinia liuotettiin 7,5 ml:aan DMF:a ja sekoi-tettiin huoneen låmpOtilassa kolmen tunnin ajan. Reaktio-10 seos haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa. jaSnnds liuotettiin 50 ml:aan CHCl^a ja pestiin 3 x 12 ml:11a 0,1 N HCl:a ja 3 x 12 ml:11a 1 M NaCl:a. Orgaaninen kerros suodatettiin faasinerotussuodatuspaperin (Whatman) lMvitse ja haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa.

15 Raaka tuote (3,32 g) uudelleenkiteytettiin 5 ml:sta l&mminta MeOH:a (15 tuntia), suodatettiin, pestiin MeOH:lla ja eetterilia ja ilmakuivattiin. Saanto: 1,75 g (61 %). Valkealla kiinte&lld aineella esiintyi yksi suuri taplå UV254+' Cl2/dikarboksidiini+, ninhydriini*) TLC:ssa 20 (S1: Rf - 0,667, S2: Rf - 0,829).

(Cys-Lys(N6-Boc)-0tBu)2 (2): 1,5 g (1,19 mM) yhdistetta (1) liuotettiin 10 ml:aan 20 % piperidiinia DMF:ssa ja sekoitettiin huoneen l&mpOtilassa 30 minuutin ajan. TLC (S2) osoitti, etta 25 kaikki lahtdaine oli kulunut ja oli muodostunut ainoastaan yksi uusi tuote (UV254*, Cl2/dikarboksidiini+, ninhydrii-ni+). Liuotin haihdutettiin alennetussa paineessa. Jaannds liuotettiin 20 ml:aan eetteria ja pestiin 2x3 ml:11a 0,1 N HCl:a ja 3 ml:11a 1 M NaHCO^a. Orgaaninen kerros 30 suodatettiin faasinerotussuodatuspaperin l&vitse ja haihdutettiin kuiviin. Saanto: 1,2 g. TLC osoitti ainoastaan yhden ninhydriinipositiivisen komponentin (S2: Rf = 0,216).

16 92209 (Fmoc-Asp(β-OtBu)-Cys-Lys(N6-Boc)-OtBu)2 (3):

Suunnilleen 1,19 mM yhdistetta (2) ja 1,32 g (2,6 mM) yhdistetta Fmoc-Asp(β-OtBu)-OSu liuotettlin 6 ml:aan CH2C12:a ja sekoitettiin huoneen lampOtilassa 5 kahden tunnin ajan. TLC (S^) osoitti, etta kaikki ninhyd-riinipositilvinen materiaali oil kulunut ja etta oil muo-dostunut yksi p&éaslalllnen uusl UV2g4“POsitiivinen tuote. jaånnOs liuotettlin halhduttamlsen jaikeen 30 ml:aan EtOAcra, pestiin 4 x 10 ml:11a 1 M NaCl:a, suodatettlln 10 ja haihdutettiin kuten on kuvattu (l):ta vårten. Raaka tuote liuotettlin eetteriin (2,5 ml) ja saostettiin puoli-kiteisena kiinteana aineena lisaamaiia 4 ml n-heksaania (jaahdyttimessa 16 tunnin ajan). Liuotin dekantoitiin, tuote pestiin 5 ml:11a n-heksaania ja kuivattiin alenne-15 tussa paineessa. Saanto: 1,272 g (67 %). TLC osoitti yhden paatapian (uv254+/ Cl2(dikarboksidiini+, ninhydriinit, S^:

Rf - 0,333, S2: Rf - 0,658).

(Asp(β-OtBu)-Cys-Lys(N6-Boc)-0tBu)2 (4): 1,0 g (0,62 mM) yhdistetta (3) liuotettlin 5 ml:aan 20 20 % piperidiinia CH2Cl2:ssa ja kasiteltiin kuten on ku- vattu 2:ta vårten. Saanto: 0,469 g (65 %). TLC osoitti ainoastaan yhden ninhydriinipositiivisen tapian (S2: Rf = 0,22).

(Fmoc-Glu(Y-OtBu)-Asp(β-OtBu)-Cys-Lys(N€-Boc)-25 OtBu)o (5): 0,469 g (0,407 mM) yhdistetta (4) ja 0,47 g (0,90 mM) yhdistetta Fmoc-Glu(γ-OtBu)-OSu liuotettlin 5 ml:aan CH2Cl2:a ja sekoitettiin huoneen lampOtilassa 15 tunnin ajan. Kasittelya jatkettiin kuten (3):n tapaukses-30 sa. Saanto: 0,62 g (77 %). TLC (osoitti yhden paatapian (υν254+, Cl2/dikarboksidiini+, ninhydriini+, S^: Rf * 0,312, S2: Rf = 0,536).

17 92209 (Glu(/-OtBu)-Asp(β-OtBu)-Cys-Lys(N6-Boc)-OtBu)„ iiil 0,50 g (0,25 mM) yhdistettS (5) liuotettiin 2,5 ml:aan 20 % piperidiinié CI^C^:ssa ja kSsiteltiin 5 kuten on kuvattu (2):ta vårten.

TLC osoitti ainoastaan yhden ninhydriinipositiivi-sen tap1én (S2: Hf = 0,154).

(pGlu - Glu (y OtBu)-Asp( β-OtBu)-Cys-Lys (N6-Boc) -OtBu )^.

(7); 10 Suunnilleen 0,25 mM yhdlstetté (6) ja 0,206 g (0,546 mM) yhdistetta pGlu-OPCIP liuotettiin 2,5 ml:aan DMF:a ja sekoitettiin huoneen l&npbtilassa 15 tunnin ajan. KMsiteltiin edelleen kuten (3):n tapauksessa. Saanto: 0,259 g (59 %). TLC osoitti ainoastaan yhden t&pl&n, 15 ^254* Ja Cl2/<iikarboksidiini+ (S2: Rf = 0,117), ja aino astaan pienia méérié epépuhtauksia.

(pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)^ (8): 0,110 g (0,063 mM) yhdistettS (7) liuotettiin 5 mlraan 80 % TFA:a (CH2C12) ja sekoitettiin huoneen l&m-20 pbtilassa 30 minuutin ajan. Liuotin haihdutettiin ja jSén-nOs liuotettiin 4 ml:aan H20:ta + 2 ml:aan CHCl^ta. Vesi-faasia pestiin 2x3 ml:11a CHCl^a ja haihdutettiin kui-viin alennetussa paineessa. Raaka tuote (0,050 g) puhdis-tettiin kéyttéen Lobar (A) RB 8 -pylvésté (Merck) ja elu-25 oiden 0,1 % TFArlla 7,5 % EtOH:ssa (vesiliuos). Kun tuote oli lyofilisoitu, se kromatografoitiin uudelleen kéytt&en samaa pylv&sté ja eluoiden 0,1 % TFA:lla 5 % EtOHrssa (vesiliuos). Tuote lyofilisoitiin. Saanto: 0,016 g. Ninhyd-riini+, Cl2/dikarboksidiini+ ja ^254* “tuote oli TLC:n 30 perusteella homogeeninen (S^: Rf = 0,436) ja todettiin ainoastaan pienié médrié epSpuhtauksia HPLC:n avulla.

Aminohappoanalyysi: Asp (1,02), Glu (1,91), Cys (1,08), Lys (0,93).

18 92209

Esimerkki 2 (Cys-Lys),, (9);

Yhdiste (2) esimerkistå 1 liuotettiin TFA:oon ja sekoitettiin ympfiristOn l&mpOtilassa 40 minuutin ajan.

5 Lluotin haihdutettiin alennetussa paineessa (30 ’C) ja jaannOksen veteen liukeneva osa kromatografoitiin kayttaen lobar (B) RP8 -pylvasta (Merck) ja 0,1 % TFA:a (vesiliuos) 5 % EtOHrssa (vesiliuos) liikkuvana faasina. Pylvasta tarkkailtiin UV220:n aallonpituudella. Puhdasta tuotetta 10 sisaitavat fraktiot (TLC) yhdistettiin ja lyofilisoitiin.

Tuote oli TLC:n perusteella homogeenista (S3: Rf = ,57) ja antoi positiivisen reaktion ninhydriinin kanssa eika osoittanut UV254-absorptiota. HPLC-analyysi: 93,5 % puhdas pinta-alan mukaan. Aminohappoanalyysi: Cys (1,01), Lys 15 (0,99).

Esimerkki 3

Asp-Cys-Lys )7, (10);

Yhdistetta (4) kasiteltiin kuten on kuvattu esimer-kissa 2 (2 % EtOH liikkuvassa faasissa), jolloin saatiin 20 yhdiste (10). Tuote oli TLC:n perusteella homogeenista (S3: Rf = 0,64) ja antoi positiivisen reaktion ninhydriinin kanssa eika osoittanut UV254-absorptiota. HPLC-analyysi: 97,9 % puhdas pinta-alan mukaan. Aminohappoanalyysi: Asp (0,99), Cys (1,03), Lys (0,98).

25 Esimerkki 4 (Glu-Asp-Cys-Lys )7, (11):

Run yhdistetta (6) kasiteltiin kuten on kuvattu esimerkissa 2, saatiin yhdiste (11). Tuote oli TLC:n perusteella homogeenista (S3: Rf = 0,83) ja antoi positii-30 visen reaktion ninhydriinin kanssa eika osoittanut UV254-absorptiota. HPLC-analyysi: 100 % puhdas pinta-alan mukaan. Aminohappoanalyysi: Asp (1,08), Cys (0,97), Glu (0,98), Lys (0,98).

19 92209

Esimerkki 5 (pGlu-Glu-Asp-Cys)7, (12):

Yhdiste (12) syntetisoitiin monomeerina jatkuvatoi-misen kiinteån faasin peptidisynteesimenetelman avulla 5 kayttaen Biolynx 4170 - automaattista peptidisyntetisoijaa (LKB) ja DMF:a liuottimena.

Reagensseja: FM0C-Cys(Trt)-SASRIN-RESIN (Bachem);

Fmoc-Asp(β-OtBu)-OPFP; FMOC-Glu( -OtBU)-OPFP? pGlu-OPCLP; HOBT katalysaattorina. FMOC poistettiin kunkin kytkemis-10 vaiheen jaikeen kayttaen 20 % piperidiinia DMF: ssa. Disul-fidisilta ja siten dimeeri aikaansaatiin kasittelemaiia kiinteån kantajan pinnalla olevaa taysin suojattua pepti-dia 0,1 M jodilla (2-3 ekv. ) DMF:ssa 15 minuutin ajan. Sen jaikeen kun oli pesty DMF:11a, peptidi irrotettiin 15 kiinteasta kantajasta ja jaijelia olevat suojaryhmat pois-tettiin yhden vaiheen avulla kasittelemaiia 50 % TFA:lla CH3Cl:ssa 40 minuutin ajan. Hartsi suodatettiin pois ja suodos haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa (30 °C). jaannds liuotettiin 0,1 % TFA:iin (vesiliuos) ja 20 kromatografoitiin kayttaen lobar (B) RP8 -pylvasta ja 0,1 5 TFA:a (vesiliuos) 4 % propan-2-olissa (vesiliuos) liikuvana faasina. Pylvasta tarkkailtiin UV220:n aallonpi-tuudella. Puhdasta tuotetta sisaltavat fraktiot (HPLC) yhdistettiin ja lyofilisoitiin. Tuote ei osoittanut reak-25 tiota ninhydriinin kanssa eika UV254-absorptiota. HPLC- analyysi: 96,9 % puhdas pinta-alan mukaan. Aminohappo- analyysi: Asp (1,15), Cys (0,99), Glu (1,85).

Esimerkki 6 (pGlu-Glu-Cys-Lys),, (13): 30 Yhdiste (13) syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten on kuvattu esimerkissa 5 kayttaen vastaavia aminohappo-johdannaisia. Reagensseja, joita ei ole aikaisemmin kuvattu: FM0C-Lys(N6-B0C)-SASRIN-RESIN; FM0C-Cys(S-Trt)-OPFP.

Tuote oli TLC:n perusteella homogeenista (S3: Rf = 0,49) 20 92209 ja antoi positiivisen reaktion ninhydriinin kanssa eika osoittanut UV2g4~absorptiota.

HPLC-analyysi: 100 % puhdas pinta-alan mukaan Ami-nohappoanalyysi: Cys (1,01), Glu (1,98), Lys (1,01).

5 Esimerkki 7 (pGlu-Asp-Cys-Lys)^, (14):

Yhdiste (14) syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten on kuvattu esimerkissa 5 kayttaen vastaavia aminohappojoh-dannaisia. Tuote oli TLC:n perusteella homogeenista (S^: 10 Rf = 0,55) ja antoi postiiivisen reaktion ninhydriinin kanssa eika osoittanut UV2g4-absorptiota.

HPLC-analyysi: 97,5 % puhdas pinta-alan mukaan.

Aminohappoanalyysi: Asp (1,04), Cys (0,96), Glu (0,97),

Lys (1,02).

15 Esimerkki 8 (pGlu-Asp-Glu-Cys-Lys)2/ (15):

Yhdiste (15 ) syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten on kuvattu esimerkissa 5 kayttaen vastaavia aminohappojoh-dannaisia. Tuote oli TLC:n perusteella homogeenista (S^: 20 Rf = 0,42) ja antoi positiivisen reaktion ninhydriinin kanssa eika osoittanut UVjg^-absorptiota.

HPLC-analyysi: 99,3 % puhdas pinta-alan mukaan.

Aminohappoanalyysi: Asp (1,03), Cys (0,96), Glu (2,09),

Lys (0,94).

25 Esimerkki 9 (pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)^, (16):

Yhdiste 16) syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten on kuvattu esimerkissa 5 kayttaen vastaavia aminohappojoh-dannaisia. Tuote oli TLC:n perusteella homogeenista (S^: 30 Rf = 0,38) ja antoi positiivisen reaktion ninhydriinin kanssa eika osoittanut UV2g4-absorptiota. HPLC-analyysi: 100 % puhdasta pinta-alan mukaan. Aminohappoanalyysi: Asp (2,06), Cys (0,98), Glu (0,98), Lys (0,98).

i 21 92209

Esimerkki 10 (pGlu-Glu-Glu-Cys-Lys) ^, (17)ϊ

Yhdiste (17) syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten on kuvattu esimerkissS 5 kayttaen vastaavla aminohappojoh-5 dannaisia. Tuote oil TLC:n perusteella homogeenista (: Rf » 0,39) ja antoi positiivisen reaktion ninhydriinin kanssa eika osolttanut lA^^-absorptiota.

HPLC-analyysi: 99,9 % puhdasta pinta-alan mukaan. Amlnohappoanalyysl: Cys (0,95), Glu (2,90), Lys (1,15).

10 Esimerkki 11 (pGlu-Glu-Asn-Cys-LysK, (18):

Yhdiste (18) syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten on kuvattu esimerkissa 5 kayttaen vastaavla aminohappojoh-dannaisia. Reagensseja, joita ei ole aikaisemmin kuvattu: 15 FMOC-Asn-OPFP. Tuote oli TLC:n perusteella homogeenista (S^: Rf * 0,42) ja antoi positiivisen reaktion ninhydriinin kanssa eika osolttanut UX^g^-absorptiota.

HPLC-analyysi: 98,2 % puhdasta pinta-alan mukaan. Amlnohappoanalyysl: Asx (1,1), Cys (1,03), Glu (1,9), Lys 20 (0,96).

Esimerkki 12 (pGlu-Gln-Asp-Cys-LysK, (19):

Yhdiste (19) syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten on kuvattu esimerkissa 5 kayttaen vastaavla aminohappojoh-, 25 dannaisia. Reagenseja, joita ei ole aikaisemmin kuvattu: FMOC-Gln-OPFP. Tuote oli TLC:n perusteella homogeenista (S^: Rf = 0,45) ja antoi positiivisen reaktion ninhydriinin kanssa eika osolttanut UV2g4~absorptiota.

HPLC-analyysi: 98,3 % puhdasta pinta-alan mukaan. 30 Amlnohappoanalyysl: Asp (1,09), Cys (1,06), Glx (1,89), Lys (0,96).

Esimerkki 13 (pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)^, (20):

Yhdiste (20) syntetisoitiin ja puhdistettiin (5 % 35 propan-2-oli liikkuvassa faasissa) kuten on kuvattu esi- 9220 9 22 merkissa 5 kayttaen asiaankuuluvia aminohappoj ohdannaisia. Lopullinen suojauksen poistaminen suoritettiin 10 % tioni-sollssa TFA:ssa.

Reagensseja, joita el ole aikaisemmin kuvattu: 5 FMOC-Arg(Mtr)-SASRIN-RESIN.

Tuote ei osoittanut reaktiota ninhydriinin kanssa eika UV2g^-absorptiota.

HPLC-analyysl: 99,4 % puhdasta plnta-alan mukaan. Aminohappoanalyysi: Arg (0,92), Asp (1,12), Cys (1,00), 10 Glu (1,96).

Eslmerkkl 14

Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)^, (21):

Yhdiste (21) syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten on kuvattu esimerkissa 5 kayttaen asiaankuuluvia aminohap-15 pojohdannaisia. Tuote oli TLC:n perusteella homogeenista (S^: Rf - 0,57) ja antoi positiivisen reaktion ninhydriinin kanssa eika osoittanut UVjg^-absorptiota.

HPLC-analyysi: 94,7 % puhdasta pinta-alan mukaan. Aminohappoanalyysi: Asp (1,00), Cys (1,01), Glx (2,02), 20 Lys (0,96).

Esimerkki 15 (Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)^, (22):

Yhdiste (22) syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten on kuvattu esimerkissa 5 kayttaen asiaankuuluvia aminohap-25 pojohdannaisia. Tuote oli TLC:n perusteella homogeenista (S3: Rf * 0,57) ja antoi positiivisen reaktion ninhydriinin kanssa eika osoittanut UVj^-absorptiota.

HPLC-analyysi: 98,2 % puhdasta pinta-alan mukaan. Aminohappoanalyysi: Asp (1,06), Cys (1,01), Glu (0,99), 30 Lys (0,99), Pro (0,96).

Il

Claims (5)

92209

1. MenetelmS terapeuttisesti kSyttdkelpoisen kaavan I mukaisen yhdisteen ja sen fysiologisesti hyvSksyttSvien 5 suolojen valmistamiseksi, — — A-(NH-CH-CO)a-(NH-CH-CO)fa-(NH-CH-CO)- B (?H2>n 4H2}m (I) COR COR' S--

10 L. J 2 jossa kaikki aminohappoyksikOt ovat L-konfiguraatiossa, A edustaa ryhmSS NH-CH-CO-, NH-CH-CO-, NH2CH-CO- tai 15 (^2)2

0 CONH2 vetyatomia; B edustaa ryhmaS -NH-CH-COR", -NH-CH-CO-R" tai (CH2)4 (CH2)3

20 NH, NH HN NH2 hydroksiryhmSa; n ja m edustavat toisistaan riippumatta 25 kokonaislukua 1 tai 2; a ja b edustavat toisistaan riippumatta kokonaislukua 0 tai 1; R, R1 ja R" edustavat toisistaan riippumatta hydroksiryhmSS tai aminoryhmSS; silia ehdolla, ettS kun A ja B edustavat vastaavasti vetyatomia ja hydroksiryhmSS, b ei voi edustaa kokonaislukua 0. 30 tunnettu siita, ettS (a) poistetaan suojaus kaavan (II) mukaisesta yh-disteestS happaman hydrolyysin, hydrogenolyysin, ammono-lyysin tai entsymaattisen hydrolyysin avulla « 92209 A-(NH-CH-CO)a-(NH-CH-CO)(NH-CH-CO)-B (CH-) (CH-) CH, (II) I 4. π I 2_m i 2 cora cor έ-- 5 2 jossa A edustaa ryhmaa R3N-CH-CO-, R4N-CH-CO-,· jj u

10 R5NH-CH-CO-, vetyatomia tai amiinin suojaryhmaa; (ch2)2 CONHR6 B edustaa ryhmaa -NH-CH-COR8, -NH-CH-COR10, 15 (CH2)4 (CH2)3 NHR7 NH A , HN NHR9 20 hydroksiryhmaa tai karboksyylin suojaryhmåå; n ja m edus-tavat toisistaan riippumatta kokonaislukua 1 tai 2; a ja b edustavat toisistaan riippumatta kokonaislukua 0 tai 1; R1, R2, R8, ja R10 ovat amino-, hydroksi-, suojattuja ami-noryhmia tai karboksyylin suojaryhmia; R3, R4, R5, R6, R7 ja 25 R9 ovat vetyatomeja tai amiinin suojaryhmiå; silia ehdolla, ' etta kun A edustaa vetyatomia tai amiinin suojaryhmaa ja B edustaa hydroksiryhmaa tai karboksyylin suojaryhmaa, sil-loin b ei voi edustaa kokonaislukua nolla, tai (b) dimeroidaan kaavan (III) mukainen yhdiste 30 A-(NH-CH-CO)a-(NH-CH-CO)(NH-CH-CO)-B ‘fan ‘fan ‘fa (HI) COR COR' SR" 35 92209 jossa A, B, n, m, a, b, R ja R' ovat ylia maaritellyn mu-kaisia ja R" on vetyatomi tai tiolin suojaryhma, joka voi-daan poistaa hapettavissa olosuhteissa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, 5 tunnettu siita, etta b edustaa kokonaislukua 1, m edustaa kokonaislukua 1 ja R, R* ja R" edustavat hydroksi-ryhmia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta valmistetaan 10 (Cys-Lys)2 (Asp-Cys-Lys)2 (Glu-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Glu-Asp-Cys)2 (pGlu-Asp-Cys-Lys)2 15 (pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)2 (pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)2 (Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)2 tai (Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)2.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, 20 tunnettu siita, etta valmistetaan (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)2.

5. Kaavan (II) mukainen yhdiste

25 A-(NH-CH-CO) -(NH-CH-CO).-(NH-CH-CO) -B I a , b , (CH~) (CH0) CH, (II) I η I 2_m i 2 COR·1· CORZ S-- 2 30 lossa A edustaa ryhmaa R3N-CH-CO-, R4N-CH-C0-, o JJ U R5NH-CH-CO-, vetyatomia tai amiinin suojaryhmaa; (CH2)2

35 CONHR6 92209 B edustaa ryhitiSS -NH-CH-COR8, -NH-CH-COR10, (CH2)4 (CH2)3 NHR7 NH

5 HN NHR9 hydroksiryhmåa tai karboksyylin suojaryhmSa; n ja m edus-tavat toisistaan riippumatta kokonaislukua 1 tai 2; a ja b edustavat toisistaan riippumatta kokonaislukua O tai 1; 10 R1, R2, R8, ja R10 ovat amino-, hydroksi-, suojattuja ami- noryhmiS tai karboksyylin suojaryhmia; R3, R4, R5, R6, R7 ja R9 ovat vetyatomeja tai amiinin suojaryhmiS; sillS ehdolla, etta kun A edustaa vetyatomia tai amiinin suojaryhmåa ja B edustaa hydroksiryhmaå tai karboksyylin suojaryhmaa, sil-15 loin b ei voi edustaa kokonaislukua nolla. i II tu 9