JPH02502905A - 粘膜による吸収を高める、ソルビン及び誘導ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 粘膜による吸収を高める、ソルビン及び誘導ぺ本発明は、粘膜による吸収、特に 水、電解質及び栄養素の吸収の増大をひきおこすことのできるポリペプチド及び これらのポリペプチドと共通のアミノ酸配列をもつペプチドをその目的としてい る。

とくに上述の物性を備えた豚の腸粘膜から得た生物ここて問題となっていたのは 、望ましくない副作用を誘発する可能性のある数多くの他の構成成分に単数又は 複数の有効成分が混合され、これらがその治療への応用を不適当にしているよう な化合物であった。豚の腸から抽出されたポリペプチドが報告されたが、このよ うな生成物の完全な獲得方法についても又その配列についてもいかなる指示も与 えられていない。

豚の腸から抽出されたポリペプチドの純化方法の完成により、発明者はＨＰＬＣ での唯一のピークに相応し上述の活性を備えたポリペプチドを分離することがで きた。このポリペプチドを、本記述中及びクレーム中でソルビンという語で呼ぶ 、こうして、利点の太きい生物学的活性を備えた特にソルビンの活性を呈する、 このポリペプチドの誘導体及びペプチドフラグメントを開発することができた。

従って、本発明の目的は、試薬及び薬剤の有効成分として使用可能な高純度の前 述のポリペプチドならびにその抗体を提供することにある９本発明は同様に、一 定の生物学的活性を有する誘導ペプチドすなわち、これらのポリペプチドの単数 又は複数のアミノ酸配列に特に相当するペプチドを提供することをもその目的と している。

同様に、本発明は、さまざまな方法、特に抽出、遺伝子工学又は特にペプチドに ついては化学的方法に従ってこｔらのポリペプチド及びその誘導体を獲得するこ ともその目的とする。

本発明のもう１つの目的は、これらのペプチド及びポリペプチドの生物学的特性 を薬剤組成物の中で活用することにある。

本発明に基づくポリペプチドは、これらを表現するヌクレオチド配列の少なくと も１部分が、アミノ酸についての以下の配列（Ｉ）のソルビンの遺伝子の少なく とも１部分と交雑できるということを特徴とする： ＞）ＪＲＡＡＴＰＬＱＴＶＤＲＰＸＤＴＹＫＴｍＦＫＱＩ）ＩＭＶＨＫＰＤＤＤ ＴＫＭＹＮＴＰＹＴＹＮＡＧＬＹＮＳＰＹＳＡＱＳ）ＩＰＡＡＫＴＱＴＹＲＰＬ ＳＫＳＨＳＤＮＧＴＤＡＦＫＤＡＳＳＰＶＰＰＰＨＶＰＰＰＶＰＰＬＲＰＲＤＲ ３ＳＴＥＫＨＤＲＤＰＰＤＲＫＶＤＴＲＫＦＲ５ＥＰＲＳＩＦＥＹＥＰＧＫＳＳ ＩＬＱＨＥＲＰＶＴＫＰＱＡ−ＮＨ２このようなポリペプチドは有利なことに、 粘膜特に消化粘膜による水、電解質及び栄養素の吸収の増大をひきおこすことが できる。

この配列及び以下に示されている配列を説明する上で、アミノ酸を１つの文字で 表わした以下のリストを利用する： アラニン＝ａβａ＝Ａ／、アルギニン＝ａｒｇ＝Ｒ／、アスパラギン＝ａｓｎ＝ Ｎ／、アスパラギン酸＝ａｓｐ＝Ｄ／、グルタミン酸＝ｇ　１　ｕ＝Ｅ／、グル タミン＝ｇｌｎ＝Ｑ／、グリシン＝ｇｌｙ＝Ｇ／、ヒスチジン＝ｈｉｓ＝Ｈ／、 インロイシン＝ｉｌｅ＝工／、ロイシン＝ｌｅｕ＝Ｌ／、リジン＝ｌｙｓ＝に／ 、メチオニン＝ｍｅｔ＝Ｍ／、フェニルアラニン＝ｐｈｅ＝Ｆ／、プロリン＝ｐ ｒｏ＝Ｐ／、セリン＝ｓｅｒ＝Ｓ／、スレオニン（トレオニン）＝ｔｈｒ＝Ｔ／ 、トリプトファン＝ｔｒｐ＝Ｗ／、チロシン＝ｔｙｒ＝Ｙ／、バリン＝ｖａｌ＝ Ｖ／。

好ましくは、本発明は、次の配列（ＩＩ）のヘプタペプチドを少な（とも一部分 含むポリペプチド及び誘導ペプチドを目的としている： Ｐ、Ｖ、Ｔ、に、Ｐ、Ｑ、Ａ、−ＮＨ＊本発明に基づくポリペプチド及びペプチ ドはさらに、それが以下のアミノ酸配列（ｍ）を満たすデカペプチドの少なくと も一部分を含み込んでいることを特徴とする： Ｈ，Ｅ、Ｒ，Ｐ、Ｖ、Ｔ、に、Ｐ、Ｑ、Ａ−ＮＨ。

もう一つの特徴に従うと、本発明に従ったポリペプチド及びペプチドは、４０の アミノ酸の次の配列（■）のすくなくとも一部分を含んでいる：Ｐ、　Ｐ、Ｄ、 　Ｒ，に、Ｖ、Ｄ、Ｔ、　Ｒ，に、Ｆ、　Ｒ，Ｓ、Ｅ、　Ｐ、　Ｒ，Ｓ、　１． Ｆ、　Ｅ、Ｙ、　Ｅ、　Ｐ。

Ｇ、に、Ｓ、Ｓ、１．Ｌ、Ｑ、Ｈ，Ｅ、Ｒ，Ｐ、Ｖ、Ｔ、に、Ｐ、Ｑ、Ａ−ＮＨ ！本発明は特に、前述の特性に加えて高い純度を呈するポリペプチド又はソルビ ンを目的とする。従って、このソルビンは、４０％のメタノールとトリフルオロ 酢酸（ＴＦＡ）０．１％から成る溶剤Ａ及び８０％のメタノールとＴＦＡｏ、１ ％から成る溶媒Ｂを用いて（なお溶剤Ｂの勾配は３０分で０〜７５％である）、 １分あたり１．５−の流量でＢｏｎｄａｐａｋ　　Ｃ１８（ｗａｔｅｒｓ）マイ クロカラム（３，９Ｘ３００ｍｍ）上で２０〜２２分の保持時間で唯一のＨＰＬ Ｃビークにより特徴づけられている。

上述のクロマトグラフィーカラムにおいて、同じ溶剤系を用いて（ただし勾配は ２０分で０〜１００％）、本発明に基づくソルビンは、１５〜１６分の保持時間 で得られたピークに相当する。

上述のようにＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ）により得られるもののよう な純化されたソルビンは、さらに特別に１５３のアミノ酸を有し、アミノ酸配列 （Ｉ）を満たす、このペプチド鎖の分子量は１７４８３である。

上述のポリペプチド特にツルビシがらはさまざまなペプチドフラグメントを得る ことができ、これらのフラグメントは、腸粘膜による吸収又は異なる生物学的活 性の面で、これらのポリペプチドと同じタイプの活性を有する。

好ましいペプチドは、配列（ＩＶ）の少なくとも一部分を含んでいる。

好ましいその他のペプチドは、上述のアミノ酸配列（ＩＩ）及び（ｍ）を満たす ヘプタペプチド及びデカペプチドを含むかもしくはこれに相当する。

当然のことながら、活性を変えることな（配列（Ｉ）乃至（ＴＶ）のいくつかの アミノ酸を置換することもできるし、又逆にこれらの変更のおかげで以下の例の １つが示しているように反対の効果をこれらに与えることにより置換することも できる。

特に、これらの配列の塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンの ような他の塩基性アミノ酸により置換されつる。

同様に、その代謝を遅延させその作用時間を改善するため、ペプチド鎖のアミノ 酸上に置換基を導入することも可能である。

本発明は同様に、上述のポリペプチド及びペプチドを特定的に認識することので きる抗体にも関するものである。

さらに、本発明は、上述のポリペプチド及びペプチドに相当するＲＮＡ−ｍ（伝 令ＲＮＡ）配列を目的とする０本発明は特にアミノ酸の配列（Ｉ）に相当するＲ ＮＡ−ｍ配列を目的とする。

上述のポリペプチド及びその誘導体の少なくとも一部分について暗号づけできる ＤＮＡのフラグメントも同様に、特に粘膜による吸収能力に対する活性をもつポ リペプチド及びペプチドといった暗号づけされた生成物と同じく、本発明の範囲 内に入る。

これらのヌクレオチド配列はまた、配列（Ｉ）のソルビンの少なくとも一部分を 表現することのできる遺伝子と交雑するその能力によっても特徴づけられる。

本発明は同様に、本発明に従ったソルビン及びその誘導体の獲得手段にも関する 。

一つの獲得方法は、哨乳動物の器官から抽出されたペプチドの液体クロマトグラ フィ及びＨＰＬＣによる純化を含んでいる。

従来の技術に従って、これらのペプチドは、酢酸により抽出され、塩化ナトリウ ムにより塩析され、次にアルコール沈殿により純化される。得られたペプチド沈 殿物は、本発明に基づく方法に従い次の段階に付されるニ ー０．０４Ｍの重炭酸アンモニウムによる溶出を伴ロマトグラフィによる純化。

−０，０３Ｍの重炭酸アンモニウムによる溶出を伴う、活性分画の回収と新たな ＣＭＣクロマトグラフィ。

−０，１％のトリフルオロ酢酸０．１％を含む水から成る溶剤Ａと０．１％のＴ ＦＡを含むアセトニトリルから成る溶剤ＢでのＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラ フィ）による純化を少なくとも受けた活性分画の回収。

好ましい一実施態様において、ＨＰＬＣによる連続的純化は以下のように行なわ れるニ ー　　Ｂｏｎｄａｐａｋ　　Ｃｌ　８　（Ｗａｔｅｒｓ）マイクロカラム（７， ８Ｘ３００ｍｍ）と、１０分で０〜２０％その後４０分で２０〜４０％の溶剤Ｂ の勾配を用い、保持時間３７〜３９分で活性生成物を溶出させる、 −流量１．５ｍ１ｌ／分のＢｏｎｄａｐａｋ　　ＣＮ　（Ｗａｔｅｒｓ）マイク ロカラム（３，９Ｘ　３００ｍｍ）及び、水と０．１％のＴＦＡから成る溶剤Ａ 及びアセトニトリルト０．１％のＴＦＡから成る溶剤Ｂを用い、１０分で０〜２ ０％、次に４０分で２０〜４０％の割合の勾配で溶剤Ｂを加え、３７〜４１分の 保持時間で活性分画を溶出させる、 −流量１．５１ｎ！／分のＢｏｎｄａｐａｋ　　Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）マイク ロカラム（３，９Ｘ３００ｍｍ）と、４０％のメタノール及び０．１％のＴＦＡ から成る溶剤Ａ、８０％のメタノール及びＯ，１％のＴＦＡから成る溶剤Ｂ（な おりの勾配は３０分で０〜７５％であり、ソルビンの保持時間は２０〜２２分で ある）を用いる。

もう１つの方法によると、ポリペプチド及びその誘導体は、本発明に従うと組み 換え型ＤＮＡ技法により得られる。

こうして、ソルビンに対して暗号づけするヌクレオチド配列（ソルビンのゲノム から直接又は相応するＲＮＡ−ｍから又は合成により得られた配列）から出発し て、遺伝子工学の分野において今や古典的になった技法を用いてこのタンパク質 の製造に着手する。

本発明は同様に、ポリペプチドの獲得に利用できる細菌株及びベクターといった 中間的手段をもその目的としている。

さらにもう１つの方法に従うと、ポリペプチドとその誘導体、さらに限定的に言 うとこれらのポリペプチドのペプチドフラグメントは、合成により調製される。

このためには古典的な技術、特に同相法を用いる。

特に適したこのタイプの方法は、Ｊ、０．Ｃ，３７，３４０４〜３４０９　（１ ９７２年）においてＣａｒｐｉｎｏ他によりそしてＩｎｔ。

Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏ、　Ｒｅｓ、（１９７８年１１：２４６〜２４９）に おいてＭｅｉｎｈｏｆｅｒにより開発されたアミノ酸ＦＭＯＣの技法から成る。

アミノ酸ＦＭＯＣ（フルオレニルメトキシカルボニル）は、無水物の形（従って 、不安定なもの、ジクロロメタン内でのジシクロへキシルカルボジイミドによる 活性化により応急に調製される）又はＤＭＦ　（ジメチルホルムアミド）内でＤ ＭＡＰ　（４−ジメチルアミノピリジン）とのエステル結合の形成を通しての活 性エステル［ペンタフルオロフェニル（ＰＰＰ）のエステル］の形で、用いられ る。

カップリングは、約２５分から６０分間樹脂カラム内で連続的に循環させること により行なわれる。ペプシンＫＡ樹脂（９５％のＴＦＡでの処理により遊離酸官 能基をもつアミノ酸で終結するペプチドを遊離するもの）、ペプシンＢ樹脂（ア ンモニアメタノールによる開裂の後、アミド化されたＣ末端をもつペプチドに開 裂の後、保護されたアミノ酸末端に導くもの）といった、Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ のマクロ孔質マトリクスの気孔内で重合されたポリアミドゲルとＫｉｅｓｅｌｇ ｕｈｒの複合物で構成されている市販の樹脂を用いると有利である。Ｎ末端の保 護解除は、ＤＭＦ内でピペリジン２０％を用いて行なわれる６次に続くアミノ酸 がＤＭＦ内で触媒が存在する中で又は存在しない状態で（ＨＯＢ　Ｔ、１−ヒド ロキシベンゾトリアゾル）１つずつ付加され、次に、その次のものが付加されな いうちに保護解除される。カップリングと保護解除の各段階の間で、余剰の試薬 はＤＭＦによる洗浄によって除去される。

合成の終了時点で、ペプチドは、上述のような樹脂タイプに応じて適当な溶剤に より、樹脂から離脱させられる。側面方向の基の保護は、ＴＦＡにより除去され る０次に不完全なペプチド又は不完全に保護解除されたペプチドを除去するため そしてその保持時間、そのアミノ酸組成及びその配列により完全に特徴づけされ たペプチドを得るため、高圧液体クロマトグラフィによる純化が行なわれる。

この技法は絶対的なものではなく、以下に記すような均質溶液又は固相での技法 といったその他の技法を利用することも可能である。

例えばＥ、　Ｗｅｎｓｃｈにより監修されたｒ　Ｍｅｔｈｏｄｅ　ｄｅｒｏｒｇ ａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｎ＋ｉｅ　（有機化学方法）」という題の書物におい てＨＯＵＢＥＮＷＥＹＬが記した均質溶液合成法（第１５−工及び■巻、ＴＨＩ ＥＭＥ％１９７４年、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）を利用することができる。

この合成方法は、必要な順序で連続するアミノアシルを２つずつ続けて縮合させ ること或いは又、アミノアシルと、予め形成されすでに適当な順序で複数のアミ ノアシル残基な含むフラグメント又はこうしてすでに予め調製された複数のフラ グメントを縮合させることから成る。ただし、この場合、ペプチド結合において 周知の方法に従い特にカルボキシル官能基の活性化の後、ペプチド結合の形成に 通常介入しなくてはならない、一方のアミン官能基ともう一方のカルボキシル官 能基又はその逆といった官能基を除くこれらのアミノアシル又はフラグメントが 有する全ての反応性官能基を予め保護する注意を払わなくてはならない、変形態 様としては、１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイ ミドといったカルボジイミドタイプの古典的なカップリング試薬を用いたカップ リング反応に助けを求めることもできる。利用されるアミノアシルが補足的アミ ノ官能基（例えばリジンの場合）又は他の酸官能基（例えばグルタミン酸の場合 ）を有する場合、これらの官能基は例えば、アミン官能基に関してはカルボベン ゾオキシ基又はｔ−ブチルオキシカルボニル基により、又カルボキシル官能基に 関してはｔ−ブチルエステル基により保護されることになる。その他の全ての反 応官能基の保護についても同様である０例えば、考慮中のアミノアシルの１つが ＳＨ官能基（例えばシスティン）を含んでいる場合、アセトアミドメチル又はパ ラメトキシルベンジルを利用することができる。

アミノ酸１つずつの漸進的合成の場合１合成は好ましくは、望ましい配列内での 隣接するアミノアシルに相当するアミノ酸とのアミノ酸Ｃ末端の縮合から始まり 同様に次々と近（のアミノ酸へと続き最終的にアミノ酸Ｎ末端に至る０本発明に 基づ（もう１つの技法によると、「固相ペプチド合成」と題された論文（Ｊ、　 Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　４５．２１４９−２１５４）中でＲ，Ｄ。

ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤが記したものを利用することができる。

ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤの方法によりペプチド鎖を製造するためには、きわめて多 孔質の重合体樹脂を用い、その上に鎖の最初のアミノ酸Ｃ末端を固定する。この アミノ酸はそのカルボキシル基を介して樹脂上に固定され、そのアミン官能基は 、例えばｔ−ブチルオキシカルボニルによって保護されている。

最初のアミノ酸Ｃ末端がこうして樹脂上に固定された時点で、１つの酸で樹脂を 洗うことによりアミン官能基の保護基をとり除く。

アミノ官能基の保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基である場合、これは、ト リフルオロ酢酸を用いて樹脂を処理することにより除去することができる。

次に、鎖上に固定された最初のアミノ酸Ｃ末端の保護解除されたアミン官能基上 のアミノアシル残基Ｃ末端から、求められる配列の第２のアミノアシルを提供す る第２のアミノ酸をカップリングする。好ましくは、この第２のアミノ酸のカル ボキシル官能基は例えばジシクロへキシルカルボジイミドなどによって活性化さ れ、アミン官能基は、例えばｔ−ブチルオキシカルボニルにより保護される。

こうして、２つのアミノ酸をもちその末端アミノ官能基が保護されているような 、求められるペプチド鎖の第１の部分が得られる。前述の場合と同様、アミン官 能基を保護解除し、次に、第２のアミノ酸Ｃ末端の付加の場合と同じような条件 の下で第３のアミノアシルの固定に着手することができる。

このようにして１つずつ次々とアミノ酸を固定し、これらは、すでに形成され樹 脂に再び結びつけられたペプチド鎖の部分のその度毎に予め保護解除されたアミ ン基上でペプチド鎖を構成することになる。

望ましいペプチド鎖全てが形成されると、ペプチド鎖を構成する異なるアミノ酸 の保護基を除去し、例えばフッ化水素酸などを用いて樹脂からペプチドを離脱ポ リペプチド及びその誘導体の薬学的特性の研究により、粘膜と（に消化粘膜によ る吸収特に水、電解質及び栄養素の吸収に対するその有利な効果が立証された。

実施された研究作業により、このソルビンは少ない量でかなり広く分布している が、脳下垂体、副腎、気管支及び十二指腸のレベルに著しい優越性がみられるこ とが示された。

さまざまな組織内にソルビンが存在するため、このペプチド及びそのフラグメン トには、電解質特に塩素のあらゆるレベルへ特に消化管、気管支分泌及び中枢神 経系レベルへの細胞輸送におけるユビキチン的役割が与えられている。中枢神経 系レベルでは、これは、特にイオン不均衡に結びつけられる行動障害に介入する 。

これらの有利な特性には、さらに高度の安全性が伴っている。

従って、本発明は、賦形剤と合わせて上述のような中に含む薬剤化合物をその目 的としている。

これらの薬剤化合物は、静脈内注射でも経口でも投与可能である。

静脈内注射による投与のためには、注射用アンプル剤を利用する。これらの製剤 には、有利には、−服用単位あたり１０〜５０ピコモル、好ましくは２ｏ〜４０ ピコモルが含まれている。

その他の投与形態は、遅延腸内遊離（腸溶性）の圧縮錠、錠剤、ゼラチン襄から 成り、５０〜５００ピコモル好ましくは１５０〜２５０ピコモルの有効成分な含 んでいる。

吸収に対するその特性を考慮すると、これらの化合物は、特に次の目的に使用す ることができるニー　水及び電解質の吸収の増大という有利な効果により、感染 性下痢及び急性乳児期中毒症の治療に、−特に消化器系の外科手術、感染性疾患 の減退期における腸内栄養補給の再導入に際しての非経口蘇生術の補助薬治療に 、 −水分及び電解質の吸収の増大と結びつく、グルシド及びアミノ酸の吸収の増大 による、慢性的な成る種の吸収不良の治療。

−汗腺、だ液腺、気管支、腸及びすい臓のレベルの電解質の再吸取の障害を特徴 とする、成る種の電解質障害特にムコピント−シス（襄胞性線維症）の治療。

−水分、電解質及び栄養素の吸収を抑制する本発明のポリペプチド及びペプチド の置換誘導体による肥満症及び水分過多症の治療に。

の有効成分が構成されている生物学的試薬にも関するものである。これらの生物 学的試薬は、水及び電解質の吸収に対する化合物の作用の研究における基準又は 尺度として用いることができる。

本発明のその他の特徴及び利点は、純粋ソルビン及びペプチドフラグンメントの 調製及びその生物学的活性に関する以下の例において明らかになるものと思わ一 這の作業ｌ）の間に、まず従来の技術に従って、豚の腸からの抽出により塩の形 でペプチド沈殿物を分離する。

得られた塩のケークを次に、ソルビンを分離するために純化プロセス２）に付す 。

１　）　　：　Ｖ、　ＭＵＴＴにより記述された技法（Ｃ１１ｎ。

Ｅｎｄｏｃｒｉ、　　１９７６年５．５ｕｐｐ　１７５５−１８３Ｓ）に従った 豚の腸からのペプチドの抽出 上部３分の１に当たる豚の腸を屠殺場で抜きとり、水中で煮沸して、冷凍保存す る６次にこれを細片に切り、１２時間０．５Ｍの酢酸中で浸軟処理する。浸軟物 をろ過し、アルギン酸上で吸着させ、０．２Ｍの塩酸（ＨＣＩ２）で溶離する。

飽和塩化ナトリウムにより溶出液からペプチドを沈殿させる。（１トンの腸で１ ｋｇの沈殿物が得られる）。

沈殿物を１００ｍ１につき２０ｇの割合で水中に溶かす、９５％のエタノール２ 体積を加える。溶液のｐＨは、ガラス製電極とｐＨ計を介して水酸化ナトリウム （ＮａＯＨ）で７．２に調整する。形筬した沈殿物をろ過し、取り分ける。−２ ０”Ｃの温度で９５％のエタノール１体積を次に清澄されたろ液に加える。混合 物を４８時間−２０℃で保存する。沈殿物を一２０℃でろ過により収集する。沈 殿物を、ｐＨ６，４での濃度で塩化ナトリウムを含む同じ緩衝液で溶離させる。

この溶液から飽和塩化ナトリウムにより、生成物を沈殿させる。この段階の収量 は、先の抽出物１ｋｇについて２２．５ｇである。

次に生成物を０．２Ｍの酢酸緩衝液内で５ｅｐｈａｄｅｘＧ２５上のクロマトグ ラフィにより、複数の分画に分離する。生成物を、飽和塩化ナトリウムにより沈 殿させる。活性分画中の回収量は約９ｇである。

２）：純化段階：前段階で得た塩のケークを、１００Ｎｌに対して１０ｇの濃度 で水中に溶かす、９５％のエタノール２体積を加え、ｐＨを、ＩＭのＮａＯＨ１ 体積及び９５％のエタノール２体積を含む溶液を用いて７．２にする。−２０℃ の温度にされた、得られた新たな合計体積に等しい９５％のエタノール１体積を 、−２０℃で４８時間置かれる混合物に加える。沈殿物はろ過により収集され、 無水エタノール次にエーテルにより洗浄され、最後に数時間真空下で乾燥させら れる。その重量は約５ｇである。この段階により、生成物を乾燥させ、塩の一部 を除去することができる。

次に生成物を、０．０２Ｍの重炭酸アンモニウム中に溶解の後、カルボキシメチ ルセルロース（ＣＭＣ）上クロマトグラフィに付す、生成物を吸収させ、次−に 、０．０４Ｍの重炭酸アンモニウムにより溶離する。こうして溶離された活性分 画は３３５ｍｇである。

得られた分画な新たに０．０３Ｍの重炭酸アンモニウム中に溶解させ、新たなＣ ＭＣ上クロマトグラフィに付し、カラムの合計体積の２５倍から３５倍のところ に溶離された分画中で活性度を突きとめる。活性分画の重量は、約１９．２ｍｇ Ｌかない。

次の段階は、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水から成る溶剤Ａと ０．１％のＴＦＡを含むアセトニトリルから成る溶剤Ｂを用いて高圧液体クロマ トグラフィ（ＨＰＬＣ）により行なわれる＊　ＢｏｎｄａｐａｋＣ１８（Ｗａｔ ｅｒｓ）マイクロカラム（７，８ｘ３００＋ｎ＋＋＋）（溶剤Ｂの勾配は１０分 で０〜２０％次に４０分で２０〜４０％、流量は３−７分）上で、活性生成物を 、保持時間３７〜３９分で溶離させる。

次の段階は、水と０．１％のＴＦＡから成る溶剤Ａとアセトニトリル及び０．１ ％のＴＦＡを含む溶剤Ｂを用いた、１．５Ｍ！／分の流量でＢｏｎｄａｐａｋ　 　ＣＮ（ｗａｔｅｒｓ）マイクロカラム（３，９ｘ３００＋ｎｍ）上でのＨＰＬ Ｃから成る。溶剤Ｂは、１０分で０〜２０％、４０分で２０〜４０％の割合での 勾配で加えられる。活性分画は３７〜４１分の保持時間で溶離される。

最後の段階は、溶剤Ａ（４０％のメタノール＋０．１％のＴＦＡ）及び溶剤Ｂ（ ８０％のメタノール＋０．１％のＴＦＡ）を用いた、１．５ｍＦ／分の流量での Ｂｏｎｄａｐａｃｋ　　Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）マイクロカラム（３，９Ｘ３０ ０ｍｆｆ）上のＨＰＬＣから成る。Ｂの勾配は、３０分で０〜７５％である。こ のときソルビンの保持時間は２０〜２２分である。

同じ溶剤システムで２０分で０〜１００％の勾配で同じカラム上で行なわれた純 度検査は、その保持時間が１５〜１６分である唯一のピークが得られることを示 している。

１トンの腸に対する純化の終了時点で、０．４６２ソルビンの純度は、ＨＰＬＣ で唯一のピークがそしてアクリルアミドゲル上の電気泳動で唯一のバンドが得ら れたことにより立証された。

アミノ酸の組成は、２４時間１０６℃での０．５％のフェノールと６Ｎの塩酸に よる分子の加水分解とＢｅｃｋｍａｎ分析計での秤量の後、決定された。２つの ロッ、トを分析し、結果を、合計配列により得られるものと比較した。

決定は、工及び■と呼ばれる異なる２つのロットについて行なった。２つのロッ トの平均Ｍを得た。このと比較した。

Ｌｏｔ　　　　　Ｉ　　　　　　ＩＩ　　　　　Ｍ　　　　　Ｓｅｑ従来のグン シル化方法によるＮ末端の決定によって末端基を立証することはできず、このこ とは、末端基がＮ−アセチル基又はＮ−フォルミル基又は従来さほど遭遇しなか った基により遮断されることを表わしている。一方、イプシロン−リジンモチー フと０−チロシンモチーフが分子中に存在することは１反応が適切に経過したこ とを表わしている。というのもこれら２つのアミノ酸は、末端位置ではなくその 遊ｉ！ｉ！ＮＨ，又はＯＨ基でグンシル化をとるからである。

Ｃ０ソルビンの　告の゛ ソルビンの構造の決定は、１つの基によるＮ末端の遮断のために直接配列が不可 能であることから、異なる３つの方法により予め分裂させられた分子についてＡ ｐｐｌｉｅｄ　＆　Ｂｅｃｋｍａｎシーケンサを用いて行なわれた。

臭化シアンの作用は、メチオニン残基（Ｍ又はＭＥＴ）のレベルで分子を切断し た。５つのフラグメントが配列づけされた。

ＧＬＬＩ−ＰＲＯＴＥＡＳＥにより、リジン又はアルギニン残基の後、分子を切 断することができた＝３０のフラグメントが配列づけされた。

各々のフラグメントについて得られた異なる配列の重なり合いにより、ソルビン の分子全体を復元することができた。

匹ｌ：本発明に従った４０のアミノ酸のペプチドフラグメントの獲得方法。

４０の最後のアミノ酸を含み水分及び電解質を吸収した時点で分子全体の活性を 含み込んでいるペプチドフラグメントは、実験室の温度で７２時間の滞留の後７ ０％の蟻酸による非特異的開裂により得ることができ、臭化シアンによる開裂に より非特異的な形で生成させることができた。臭化シアンによる切断は、以下の ように行なわれる二ロータベーパ（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）　（真空が加わる冷却 装置の備わった球形フラスコ）に合ったすり合わせを備えたＬｏｏｍ／入りのナ シ形フラスコを用いる。隔離全体に標本を分布させ次に完全に乾燥させると、シ ステムを開いて、７００ｉＬｌの蟻酸、３００ｐの水及び０．２ｇの臭化シアン を加える。撹拌の後、２４時間常温で接触状態に放置する。翌日。

ロータベーパを用いて前のように標本を乾燥させる。標本が乾燥した時点で、０ ．５１ｎ１の蟻酸、０．５−の水でくり返し、新たに乾燥させる。臭化シアンに より切断された生成物を次に、上述の溶剤Ａ及びＢを含む一定の勾配をもつＢａ ｎｄａｐｋ　　Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）　マイクロカラム上のＨＰＬＣにより分 離させる。

４０分で０〜４０％の溶剤Ｂの勾配で、３８〜４０分の保持時点で活性ペプチド が分離された。このペプチドは指示された含有量に応じて以下のアミノ酸を含ん でいるニ ーリジン　０．６１ナノモル 一ヒスチジン　０．１８ 一アルギニン　０．７２ 一アスパラギン酸　０．３６ 一セリン　００７２ 一グルタミン酸　０．９２ 一プロリン　０．９５ 一バリン　０．３２ 一イソロイシン　０．１８ 一ロイシン　０．２０ 一チロシン　０．２５ −フェニルアラニン　０．２９ 匠旦：遺伝子工学によるソルビンの獲得方法。

ソルビンに対し暗号づけするヌクレオチド配列は、そのプロモータでクローニン グされた遺伝子（又は上流で異質プロモータが付加されているもの）のヌクレオ チド配列の中央で（そしていずれにせよ開始ＡＴＧの後ろ）段階的に挿入される 。アタック（「リンカ−」）の使用により、例えば以下に挙げるもののような、 考慮中のプロモータによって異なる複数のタイプの表現ベクタの使用を考えるこ とができるようになる。

ａ）細菌性プロモータ これは特に大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１）のラクトースオペロン（ｏｐｅｒｏｎ　１ ａｃ）のプロモーターオペレーク領域とその後に続くβ−ガラクトシダーゼの遺 伝子の５′部分を含むプラスミドの場合である。これらのｐＰＣクィブのベクタ ー（ＣＭＡＲＭＡＹ他、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ ）　１９７８年、第Ｖ巻、　　ｐ４４７９〜４４９４）は、β−ガラクトシダー ゼの開始ＡＴＧの後ろの２１のヌクレオチドにあるＥｃｏＲＩ部位におけるソル ビンに対して暗号づけするフラグメントの挿入を可能にする。このとき表現され たタンパク質はＮ末端に対して、ソルビンのアミノ酸が後に続（細菌性β−ガラ クトシダーゼの最初の７つ（又は８つ）のアミノ酸を有している。

ｂ）ファージ・プロモータ ここで問題になっているのは、特に、ファージ先の左オペロン（ＰＬ）又は右オ ペロン（ｐＨ）のプロモーターオペレータ領域を含むプラスミドである。これら のベクターは、それぞれｐ　Ｋ　Ｃ３０（ＲＯＳＥＮＢＥＲＧ。

ｒ　Ｎａｔｕｒｅ誌Ｊ　１９８１．２９２巻、ｐ１２８）又はｐＲＬ４４７（Ｚ ＡＢＥＡＵ　：　ｐ　ＲＣ５及びｐＬＧ４００（７）誘導体、コノｐＬＧ４００ はＣｅ１ｌ、１９８０、第２０巻、ｐ５４３〜５５３に記されている）タイプの ものであり、それぞれ遺伝子Ｎの生成物のＮ末端又は遺伝子ｃｒｏの生成物のＮ 末端に対して暗号づけするヌクレオチド配列の中に、ソルビンに対して暗号づけ するフラグメントを挿入することを可能にする。

これらのベクターシステムは、感温性リプレッサーファージλ（ｃＩ８５７）に より溶原化された細菌中で、或いは又感温性リプレッサに対し暗号づけする同じ 遺伝子（ｃＩ８５７）をもつプラスミドが存在する中で、３０℃で増殖する。こ れらは、媒養が３０℃に保たれているかぎり、リプレッサーのために、不活性状 態にとどまる。媒養を４２℃に移行させると、遺伝子ｃＩ８５７のリプレッサの 不活性化により組換え型プラスミドがもっていたえプロモータ（ＰＬ又はｐ＊） の活性化がそれに続いて起こる。

Ｃ）ウィルス性ブロモーク 例えば、ベクターとしてウィルスＳＶ４０を用いる。この場合晩発性ウィルスプ ロモータを用い、ツル晩発性タンパク質に対して暗号づけする領域の全て又は一 部分の代りに挿入される。こうしてこのウィルスのカプシド−タンパク質に対し て暗号づけする配列が、この配列を上記プロモータの制御の下に置く条件の下で ソルビンに対して暗号づけする配列により置換されているような、置換されたＳ Ｖ４０のＤＮＡを構の細胞例えばＳＶ４０のプロモータを認識するポリメラーゼ をもつＣＨＯ細胞などを、ソルビンに対して暗号づけする配列の表現を可能にす る条件の下で形質転換させるために用いることができる。ソルビンは次に、形質 転換された細胞の抽出物から、例えば不溶性支持体の上に不動化された抗ソルビ ン抗体とこれらの抽出物の溶液を接触させることにより及び支持体上に保持され たソルビン−抗ソルビン複合体からソルビンを回収することにより、分離される 。

ｄ）細菌プラスミドがもつ動物性ウィルスプロモータ 使用可能なプラスミドは、ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼの遺伝子（ｐＡ Ｇｏ）　、Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢＳ抗原の遺伝子（ｐＡＣ−２又はｐＡＣ−１ ４）或いは又、アデノウィルス２の早発性又は晩発性遺伝子などのプロモータを 有する。そのプロモータとクローニングされたウィルス遺伝子のＡＴＧの後ろの ソルビンに対して暗号づけするフラグメントの挿入は、動物細胞内でのその表現 ［トランスフェクション、マイクロインジェクション（微量注入）又は細菌−原 形置体融合の後］又は試験管内での動物細胞抽出物によるその転写（Ｈｅ　Ｌ　 ａ細胞）を可能にし、こうして相応する伝令ＲＮＡの合成が導かれる。

Ｉ４：生物学的活性の研究 ａ）十二指腸の電解質及び水分の動きに対するＣ末端合成ペプチドとソルビンの 作用 ４５時間絶食させ、飲物は好きなだけ飲ませてきたラットにおいて、ベントパル ビタールナトリウムにより麻酔を行ない、頬にカテーテルをつけ、十二指腸、空 腸、回腸の３つのワナを２つの結紮間で構成する。　Ｎ　ａ　ＣＩ２７０　ＥＩ ＩＭ、　Ｋ　ＣＩ２５　、２　ｍＭ、　Ｃａ　ＣＩ２　ｔｌ、２ｍＭ％ＮａＣ０ ｌ　１０ｍＭ及びマンニトール１３６ｍＭを含むテスト溶液ＩＭｌを各ワナの中 に点滴注入し、吸収不可能な標識として１Ｈで標識づけされたＰＥＧ４０００を 用い、ナトリウム又は塩素の２方向性流東の標識として”Ｎ　ａ又はｓｓ（ρを 用いる。ソルビン又は合成ペプチドを、静脈注射により、０．９％のＮａＣｌ２ ．中で１時間３１ｎ１の流量で投与する。一時間の接触の後、ワナの空隙中に残 っている液体を収集し、Ｎａ、Ｃａ、に、ＣＪ２及びＨＣＯ、の濃度及び体積な らびに、三重水素、塩素又はナトリウムに結合した放射能を測定する。

得られた結果は、次の表に報告されている：吸収は（−）符号で、分泌は（＋） 符号で示され、これらの結果は８匹以上の動物のグループに関するものである。

ＭｔＳＥＭ′Ｐ＜Ｃ１，０５°−Ｐ＜０．０１表中に与えられている結果を検討 すると、ソルビン及び合成ペプチドが、ラットの十二指腸及び空腸内での電解質 及び水分の吸収を増大させることがわかる。また、十二指腸レベルでの得られた 異なるペプチドの効率が、基準ペプチドであるアンジオテンシンＨの４倍の投与 量、メチンケファリンアミドの５００倍有利なことに、ソルビン及びその末端ペ プチドは、アジオテンシン■と異なり、カロチドのカテーテル法により測定され る動脈張力の増大をひき起こさない、また、ソルビン及びそのＣ末端ペプチドは 、メチンケファリンアミドと異なり、電気的に増進された腸の収縮の抑制をひき おこさない、さらに、Ｃ末端位置に補足的アミノ酸すなわち特にそのアミド基が グリココールにより置換されたグリココル化されたモチーフを有するデカペプチ ドは、吸収の代わりに分泌を誘発することによりソルビン及びＣ末端ペプチドの 拮抗効果を有することがわかる。

Ｂ、　！！された胆の　に・する モルモットを頚部切断により屠殺した後、直ちにその胆のうを採取した。胆のう に、　ＫＲＥＢＳ溶液を満たし、ＫＲＥＢＳ溶液ベースの洛中に置き、９５％の 酸素と炭酸ガス５％の混合物の気泡を補給した。　　ＫＲＥＢＳ溶液にソルビン が加えられる５分毎に秤量された胆のうの重量曲線により吸収を見極めた。対照 期間との関係における重量損失の加速は、処理中の時間あたりの重量損失に対す る対照の時間あたりの重量損失の比の減少の形で現われる吸収の増大を表わして いる。

ヒト　び　にオレる　然ソルビンの ソルビンと、ヘプタペプチドからイコサペブチドに至る合成フラグメントを、特 異的抗体が得られるまで何度もウサギに注射した。放射免疫測定法を完成させる ことができ、これにより、組織内でソルビンの量を測定することができた。ソル ビンは、少量でかなり広域にわたり分布しているが、脳下垂体、副腎、気管支及 び十二指腸のレベルで著しい優越性を示している。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）特に粘膜による吸収の増大をひきおこすことのできるポリペプチド及び誘 導ペプチドにおいて、これらを表現するヌクレオチド配列の少なくとも一部分が 、アミノ酸についての以下の配列（Ｉ）のソルビンの遺伝子の少なくとも一部分 と交雑することができることを特徴とするポリペプチド及び誘導ペプチド：【配 列があります】 （２）特に粘膜による吸収の増大をひきおこすことのできるポリペプチド及び誘 導ペプチドにおいて、以下の配列ＩＩのヘプタペプチドの少なくとも一部分を含 み込んでいることを特徴とするポリペプチド及び誘導ペプチド：Ｐ．Ｖ．Ｔ．Ｋ ．Ｐ．Ｑ．Ａ．−ＮＨ２（３）特に粘膜による吸収の増大をひきおこすことので きるポリペプチド及び誘導ペプチドにおいて、アミノ酸について以下の配列（Ｉ ＩＩ）を満たすデカペプチドの少なくとも一部分を含み込んでいることを特徴と するポリペプチド及び誘導ペプチド：Ｈ．Ｅ．Ｒ．Ｐ．Ｖ．Ｔ．Ｋ．Ｐ．Ｑ．Ａ −ＮＨ２ （４）特に粘膜による吸収の増大をひきおこすことのできるポリペプチド及び誘 導ペプチドにおいて、４０のアミノ酸の次の配列（ＩＶ）の少なくとも一部分を 含み込んでいることを特徴とするポリペプチド及び誘導ペプチド： 【配列があります】 （５）ＴＦＡ０．１％で４０％のメタノールで構成された溶剤ＡとＴＦＡ０．１ ％で８０％のメタノールから成る溶媒Ｂを用いて（なお溶剤Ｂの勾配は３０分で ０〜７５％である）、１分あたり１．５ｍｌの流量でＢｏｎｄａｐａｋＣ１８（ Ｗａｔｅｒｓ）マイクロカラム（３．９×３００ｍｍ）上で２０〜２２分の保持 時間で唯一のＨＰＬＣピークを呈することを特徴とする、請求項（１）乃至（４ ）のいずれか１項に記載の特徴を満たす、特に粘膜による吸収の増大をひきおこ すことのできる高純度のソルビン。 （６）ＴＦＡ０．１％で４０％のメタノールで構成された溶剤Ａと、ＴＦＡ０． １％で８０％のメタノールから成る溶媒Ｂを用いて（なお溶剤Ｂの勾配は２０分 で０〜１００％である）、１分あたり１．５ｍｌの流量でＢｏｎｄａｐａｋＣ１ ８（Ｗａｔｅｒｓ）マイクロカラム（３．９×３００ｍｍ）上で１５〜１６分の 保持時間で唯一のＨＰＬＣピークを呈することを特徴とする、請求項（１）乃至 （４）のいずれか１項に記載の特徴を満たす、特に粘膜による吸収の増大をひき 起こすことのできる高純度のソルビン。 （７）請求項（１）の配列（Ｉ）を満たすことを特徴とする請求項（５）又は（ ６）に記載のソルビン。 （８）請求項（２）に記載の配列（ＩＩ）を満たすデカペプチド。 （９）請求項（１）乃至（８）のいずれか１項に記載のポリペプチド又はペプチ ドを特異的に認識することのできる抗体。 （１０）請求項（１）乃至（８）のいずれか１項に記載のポリペプチド及び誘導 ペプチドに相応するＲＮＡ−ｍ配列。 （１１）配列（Ｉ）のソルビンの少なくとも１部分を表現することのできる遺伝 子との交雑能力をもつことを特徴とする、請求項（１）乃至（８）のいずれか１ 項に記載のポリペプチド及びその誘導体の少なくとも一部分について、暗号づけ できるＤＮＡフラグメント。 （１２）酢酸のような酸を用いて哺乳動物の器官からペプチドを抽出し、塩化ナ トリウムといった塩により塩析し、次にアルコール沈殿により純化させることに よって請求項（１）乃至（８）のいずれか１項に記載のポリペプチドを得る方法 において、沈殿物が−０．０４Ｍの重炭酸アンモニウムによる溶出を伴う、カル ボキシエチルセルロース（ＣＭＣ）上のクロマトグラフィによる純化、 −０．０３Ｍの重炭酸アンモニウムによる溶出を伴う、活性分画の回収と新たな ＣＭＣ上クロマトグラフィ、 −トリフルオロ酢酸０．１％を伴う水から成る溶剤ＡとＴＦＡ０．１％を含むア セトニトリルから成る溶剤ＢでのＨＰＬＣによる純化を少なくとも受けた活性分 画の回収、 といった段階に付されることを特徴とする方法。 （１３）ＨＰＬＣによる連続的純化が以下のように行なわれることを特徴とする 、請求項（１２）に記載の方法： −ＢｏｎｄａｐａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）マイクロカラム（７．８×３００ｍ ｍ）と、１０分で０〜２０％その後４０分で２０〜４０％の溶剤Ｂの勾配を用い 、保持時間３７〜３９分で活性生成物を溶離させる、 −流量１．５ｍｌ／分のＢｏｎｄａｐａｋＣＮ（Ｗａｔｅｒｓ）マイクロカラム （３．９×３００ｍｍ）及び、水と０．１％のＴＦＡから成る溶剤Ａ及びアセト ニトリルト０．１％のＴＦＡから成る溶剤Ｂを用い、１０分で０〜２０％、次に ４０分で２０〜４０％の割合の勾配で溶剤Ｂを加え、３７〜４１分の保持時間で 活性分画を溶離させる、 −流量１．５ｍｌ／分のＢｏｎｄａｐａｋＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ）マイクロカラ ム（３．９×３００ｍｍ）と、４０％のメタノール及び０．１％のＴＦＡから成 る溶剤Ａ、８０％のメタノール及び０．１％のＴＦＡから成る溶剤Ｂ（なおＢの 勾配は３０分で０〜７５％であり、ソルビンの保持時間は２０〜２２分である） を用いる。 （１４）請求項（１）乃至（８）のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリ ペプチド又は誘導ペプチドを有効量含み込んでいることを特徴とする、薬剤組成 物。