HU208027B - Process for producing peptide compounds and pharmaceutical composition containing them as active components - Google Patents

Process for producing peptide compounds and pharmaceutical composition containing them as active components Download PDF

Info

Publication number
HU208027B
HU208027B HU895788A HU578989A HU208027B HU 208027 B HU208027 B HU 208027B HU 895788 A HU895788 A HU 895788A HU 578989 A HU578989 A HU 578989A HU 208027 B HU208027 B HU 208027B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
formula
group
asp
cys
glu
Prior art date
Application number
HU895788A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT58765A (en
Inventor
Ole Didrik Laerum
Original Assignee
Hafslund Nycomed Bioreg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hafslund Nycomed Bioreg filed Critical Hafslund Nycomed Bioreg
Publication of HUT58765A publication Critical patent/HUT58765A/hu
Publication of HU208027B publication Critical patent/HU208027B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4722—G-proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C07K7/067—Hemoregulatory peptides based on sequence Glp-Glu-Asp-Cys-Lys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás hatóanyagként bizonyos peptideket tartalmazó, sejtburjánzást gátló gyógyszerkészítmények előállítására. A találmány vonatkozik bizonyos új, specifikus és/vagy általános inhibitor hatású peptidek előállítására is.
Az emlősök teste a legkülönfélébb szerkezetű és funkciójú sejteket tartalmazza, számos tanulmány foglalkozik a differenciálódás és a fejlődés mechanizmusával. Ismeretes, hogy a folyamatos működésű sejtrendszereknél a mechanizmusnak általában része egy többfunkciós törzssejteket tartalmazó „tartály”, amely sejtek osztódnak és a rendszert folyamatosan ellátják új sejtekkel. A „tartály”-ból származó törzssejtek kezdetben homogének, de hamarosan valamilyen morfológia jellemzővé válik rájuk és ezután a kívánt működésű sejtté fejlődnek.
Az ilyen törzssejt rendszerekre példaként említhetjük a csontvelőben lévő vérképzőrendszert vagy a hámrendszert vagy az epidermiszrendszert.
Az EPA 0112656 sz. szabadalmi leírásból ismeretes, hogy egy szűk általános képletnek megfelelő peptidek gátolni képesek a vérképzést. Ugyancsak ismeretes a WO 88/03535 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésből, hogy egy valamivel, tágabb általános képletnek megfelelő dimer peptidek egy csoportja, amely diszulfid hídon át kapcsolódik, stimulálni képes a vérképzést. Mindkét esetben megállapították azonban, hogy a vérképző rendszertől eltérő rendszerekre hatást nem figyeltek meg.
A találmányunk azon a meglepő felismerésen alapul, hogy bizonyos peptidek, amelyek közé tartozik néhány az EP A 0112656 számú szabadalmi leírásban már ismertetett peptid is, általánosabb sejtburjánzást gátló hatással rendelkeznek, és hogyha az aminosav sorrendben kisebb módosításokat végzünk, és/vagy bizonyos kritikus oldallánc csoportokat módosítunk, akkor a peptidek hatását egy kívánt adott rendszerre irányíthatjuk. Megfigyeltük, hogy a fent említett szabadalmi bejelentésből ismert pentapeptid szekvenciák közül némelyek bizonyos ún. G-fehérjék, nevezetesen Gai-fehérjék. A G-fehérjék a sejtmembránok belső oldalán találhatók, és egy lényeges kapcsolatot jelentenek a transzmembrán receptorok és a G-fehérjékhez közel, a sejt belsejében elhelyezkedő effektorok között. Ezeknek számos sejtfunkcióban szerepük van, attól függően, hogy melyik effektorhoz kapcsolódnak. Ezek három kapcsolt alegységből, az a, a β és a gamma alegységből állnak, ahol az a szubegység a szomszédos effektor aktiválásában játszik szerepet. A G-fehérjékre kezdetben a működésük volt jellemző és a Grfehérjék alosztályai azok, amelyekről eredetileg felismerték, hogy gátolják az adenilát-ciklázt. Ez a felismerés vezetett bennünket arra, hogy megvizsgáljuk a peptidek szerepét az epitélium és epidermisz rendszerek burjánzásának és általában a sejtrendszerek burjánzásának a gátlásában.
A találmány tárgya tehát közelebbről eljárás a nem vérképző sejtburjánzást gátló hatású gyógyszerkészítmények előállítására, melyek hatóanyagként (I) általános képletű vegyületeket tartalmaznak. A (I) általános képletben
Ra jelentése (1) vagy (2) általános képletű csoport,
Rb jelentése egy (3) általános képletű vagy egy (4) vagy (5) képletű csoport,
Rc jelentése (6) általános képletű csoport,
Rd jelentése (7) általános képletű vagy (8) vagy (9) képletű csoport,
Re jelentése (10) általános képletű csoport és Rf jelentése (11), (12) vagy (13) általános képletű csoport, ahol n értéke 0 vagy 1, p és qértéke egymástól függetlenül 1 vagy 2,
R1 és R2 jelentése hidrogénatom vagy együttesen egy oxocsoportot alkot,
R5 jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkanoilcsoport vagy szerinből, treoninból, glicinből, alaninból, leucinból vagy izoleucinból képzett acilcsoport,
R6 jelentése hidroxil- vagy aminocsoport,
R7 jelentése hidroxilcsoport,
R8 jelentése hidrogénatom, 7-16 szénatomos karbociklusos aralkilcsoport, vagy egy metabolikusan labilis S védőcsoport,
R9 jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport,
R10 jelentése hidroxil- vagy aminocsoport;
ahol az glicin és az alanin kivételével, amely utóbbi D vagy L alakú is lehet, valamennyi említett aminosav csoport L alakú.
Amikor az N-terminális védőcsoport R5 jelen van, ez lehet például acetilcsoport.
A (I) általános képletű teljes peptid terminális aminocsoportja előnyösen védett, például alkanoil-, aralkanoil vagy aroilcsoporttal acilezve van.
Amikor R8 karbociklusos aralkilcsoportot jelent, ez előnyösen aril-metilcsoport, például benzil-, difenil2
HU 208 027 Β metil- vagy trifenil-metil-csoport. Amikor R8 metabolikusan labilis csoport, akkor ez lehet például 5-10 szénatomos aril-tiocsoport, például piridil-tio-csoport.
A találmány szerinti vegyületek előnyösen pentapeptidek, vagyis n előnyös értéke 0.
A találmány szerinti pentapeptidek azon képessége, hogy számos sejt burjánzását meggátolják - a sejtek közé néha beletartozik, néha nem a vérképző rendszer - igen hasznos a gyógyászatban. Részben ott, ahol a túlzott sejtburjánzás igényel kezelést, például a psoriasis esetében, vagy olyankor, amikor a rák terápia valószínűleg károsít egy bizonyos sejtpopulációt. Sokféle sejttípus különösen érzékeny a citotoxikus gyógyszerekre vagy a rákellenes terápiában használatos sugárzásokra, ezért ismert eljárás, hogy a sejtburjánzás gátlására, például a vérképző rendszer burjánzásának gátlására a rákellenes terápia alatt egy gyógyszerhatóanyagot alkalmaznak, majd visszaállítják a normál burjánzást, amikor a gátló hatóanyag hatása eltűnt. A találmány szerinti peptideknek úgy tűnik megfelelően rövid a biológiai felezési idejük az ilyen terápiához. Hasonlóképpen a rák terápiára érzékeny kiválasztott sejtpopuláció burjánzását lehet gátolni együtt a ráksejtekkel, és a rákellenes terápiát csak akkor elkezdeni, amikor a ráksejtek már egy érzékeny burjánzás! fázist értek el, miközben a normál sejtek még egy kevésbé érzékeny fázisban vannak. A sejtburjánzás egyik típusa akkor fordul elő, amikor a sejteket, például a csontvelősejteket, fagocitákat vagy granulocitákat CSF hatóanyagok stimulálják terápia közben. A sejtnövekedés gátlása az ilyen sejtek növekedésének sebességét a normál értékre állíthatja vissza.
Számos autoimmun betegségben a betegben olyan leukociták keletkeznek, amelyek a saját szövetei ellen hatnak. A leukocita funkció gátlása révén, legalábbis időlegesen, az ilyen autoimmun reakciókat ennek megfelelően csökkenteni lehet.
A Ga;-fehérje transzcelluláris jelzőmechanizmus révén a Gai-fehérjék által szabályozott más funkciók is módosíthatók az aktív peptidekkel, például a kalciummetabolizmus, sejtmobilitás és a citoplazma sejtfolyamatok, amelyeket a Gai-fehérje közvetít.
A találmány körébe tartoznak tehát azok az új polipeptidek is, amelyek teljes vagy részleges szekvenciákat tartalmaznak, amelyek a fentebb ismertetet Gai-fehérjékkel homológok, nevezetesen -Lys-Ile-Ile-HisGlu-Asp-Gly-Tyr-Ser-Ra-Rb-Rc-Rd-Re-Rf-Gln-Tyrszekvenciát vagy ennek részeit vagy enyhén módosított változatait, amint azt az Ann. Rév. Biochem. 56 624-625. oldal (1987) és a Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 3066-3070 irodalmi helyeken ismertették. Az ilyen szekvenciák előnyösen tartalmaznak legalább egy Tyr-csoportot a polipeptidek megjelölésének elősegítésére. Az N-terminális NH2-csoport előnyösen védve van, például N-acilezéssel, amint azt a fentiekben ismertettük. Amikor az N-terminális aminosavcsoport az ilyen homológ szekvenciában Glu lenne, ez előnyösen d-Glu-val helyettesíthető.
Az ilyen polipeptideket (la) általános képletű vegyietekként nevezhetjük el, ezek olyan (I) általános képletű vegyületek, ahol R5 jelentése szerin-aminosavból képzett acilcsoport, vagy olyan peptidlánc, amelynek C-terminális szerin egysége van.
Általában előnyös, ha minden hozzáadott peptidszekvencia N-terminális aminocsoportja védve van, például acilezéssel. Ez hozzájárul a peptid enzimes degradációjának elkerüléséhez. A (I) általános képletben a legtöbb Ra csoport nem alkalmas aminosav hozzáadására a védőcsoport eltávolítása vagy hasonló olyan átalakítás nélkül, amelynek eredménye egy szabad NH^- csoportot tartalmazó csoport. Tehát amikor R5 jelentése olyan acilcsoport, amely egy aminosavból vagy pepiidből származó acilcsoporttól eltérő, akkor szükséges a dezacilezés. Ugyanúgy, amikor R1 és R2 együttesen oxocsoportot alkot, mint például a p-Glu egységekben, akkor szükség van a megfelelő nyitott láncú csoporttá, például a Glu vagy Gin csoporttá való átalakításra.
A találmány tehát a peptidek hatását használja fel a citoplazma sejtfolyamatokra, amelyeket a G^-fehérje közvetít.
A (I) általános képletű vegyületek közül csak a mi korábbi 112656. számú európai szabadalmi leírásunk ismertetett néhány gyógyászatban használható vegyületet. A (I) általános képletű vegyületek közül a többi vagy új vegyület vagy csak intermedierként volt ismert. A találmányunk további tárgya tehát eljárás (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol a szubsztituensek jelentése a fenti, kivéve a következő vegyületeket:
pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-Gly-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-Ala-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-LysNH2
A vegyületek sejtburjánzást szabályozó szerek.
A felsorolt vegyületeket ismert módon állítjuk elő.
„Ismert” eljáráson a bejelentésünk napjáig nyilvánosságra került eljárásokat értjük.
A (I) általános képletű vegyületek közül bizonyos peptidek újak és különlegesen kívánatos tulajdonságkombinációkkal rendelkeznek. A találmányunk tárgya tehát eljárás a (I) általános képletű vegyületek szűkebb körét alkotó (H) általános képletű vegyületek előállítására, ahol Ra, Rb, Rc, Re, Rf és n jelentése ugyanaz, mint az (I) általános képletben, R11 jelentése 7-16 szénatomos aralkilcsoport, és a képletben az aminosavak konfigurációja ugyanaz, mint a (I) általános képletben.
A (II) általános képletű vegyületek közül különösen előnyösek a következők:
pGlu-Glu-Asp-Benzilcys-Lys pGlu-Ala-Asp-Benzylcys-Lys Az ebbe a csoportba tartozó olyan vegyületek, amelyeknek védett a ciszteincsoportjuk, in vivő különösen stabilnak mutatkoztak és hosszú ideig tartó hatásuk van a sejtburjánzás gátlásában.
Előállíthatjuk a fent említett benzil-cisztein-vegyületek analógjait, ahol a fenil-szubsztituens kevésbé labilis; az ilyen vegyületek a 4-es helyzetben ciszteincsoport helyett fenilalanincsoportot tartalmaznak. A talál3
HU 208 027 Β mányunk további tárgya tehát eljárás a (I) általános képletű vegyületek szűkebb körét alkotó (III) általános képletű vegyületek előállítására, ahol Ra, Rb, Rc, Re, Rf és n jelentése ugyanaz, mint a (I) általános képletben, és valamennyi aminosav konfigurációja is ugyanolyan. Ezeknek a vegyületeknek is hosszan tartó in vivő aktivitásuk van, ezek közül különösen előnyösek a pGluGlu-Asp-Phe-Lys és a pGlu-Gly-Asp-Phe-Lys.
A fentiekkel ellentétben lehetséges olyan peptideket is előállítani, amelyek metabolikusan labilis védőcsoporttal rendelkeznek, úgy hogy a védőcsoport nélküli peptideket in vivő lehet lassan előállítani. A találmányunk további tárgya tehát eljárás a (I) általános képletű vegyületek szűkebb körét alkotó (IV) általános képletű vegyületek előállítására, ahol R\ Rc, Re, Rf és n jelentése ugyanaz, mint a (I) általános képletben, R12 jelentése metabolikusan labilis csoport, például 2-piridil-tio-csoport, és a vegyületben valamennyi aminosav konfigurációja ugyanaz, mint a (I) általános képletben. Ezek közül előnyös például a pGlu-Glu-Asp-(2-piridilditiocys)-Lys. Ennek a vegyületnek késleltetett gátló hatása van a vérképzésre, amely in vivő három nappal később jelentkezik, szemben a nem védett analógnál tapasztalható egy nappal.
A vérképzés gátlásán kívül a leukocita funkció gátlása is (beleértve az immunrendszert is) elérhető, ha az aminosav szekvenciát enyhén módosítjuk, pontosabban a Glu2-csoportot Gly-csoporttal helyettesítjük. A találmány tárgya tehát továbbá eljárás a (I) általános képletű vegyületek szűkebb körét alkotó (V) általános képletű vegyületek előállítására, ahol Ra, Rc, Re, Rf és n jelentése ugyanaz, mint a (I) általános képletben, és az aminocsoportok konfigurációja is ugyanaz. Ebből a csoportból előnyösek például a pGlu-Gly-Asp-Phe-Lys és a pGlu-Gly-Asp-Cys-Lys, amelyek közül az utóbbi gátolja a granulociták és a makrofágok migrálását in vivő (tengerimalacoknál bőr ablakképzéssel és lokális BCG stimulálással) és gátolja a staphylococcus aureus felvételét a granulociták által in vitro (áramlásos citometriával mérve), azon kívül, hogy gátolja a vérképzést is.
Olyan peptideket, amelyeknél a vérképzést gátló hatás teljesen hiányzik, helyette epidermisz és epitélium sejtburjánzást gátló hatás tapasztalható, úgy állíthatunk elő, hogy a 4-es helyzetű ciszteincsoportot szerincsoporttal helyettesítjük. Ezek a vegyületek a (I) általános képletű vegyületek szűkebb körét alkotó (VI) általános képletű vegyületek, ahol Ra, Rb, Rc, Re, Rf és n jelentése ugyanaz, mint a (I) általános képletben, és valamennyi aminosav konfigurációja is ugyanolyan. Ezek közül előnyösek a következők:
pGlu-Glu-Asp-Ser-Lys pGlu-Asp-Glu-Ser-Lys pGlu-Glu-Glu-Ser-Lys.
Ezek a vegyületek igen hasznosak a nem vérképző sejt burjánzás gátlására, rosszindulatú vérképző sejtek kiválasztott citosztatikus kezelése során vagy rosszindulatú epidermisz és epitéliumsejtek szupressziójánál, amelyek például pikkelyes karcinómák vagy psoriasis előrehaladott stádiumában keletkeznek.
Végül a találmány szerinti peptideket fel lehet használni más molekulák „célzására” úgy, hogy a molekulát a peptidlánchoz kapcsoljuk.
Általában a citotoxikus gyógyszerhatóanyagok elleni védőhatáshoz a találmány szerinti peptideket humán betegeknek injektálással 1-10 mg, előnyösen 4-5 mg/70 kg testtömeg/nap dózisban adagoljuk. Ha infúzióval vagy hasonló eljárással végezzük az adagolást, akkor a dózis lehet 30-300 mg/70 kg testtömeg/nap, előnyösen 100 ng körüli érték hat napon keresztül. Elvileg kívánatos, ha a peptid koncentráció a beteg extracelluláris fluidumában 10-11 és ΙΟ-7 M közötti. Általában a citotoxikus hatóanyagokkal, például citozid-arabinoziddal kombinálva a terápiát, gondosan kell vigyázni az időzítésre annak érdekében, hogy a vérképző rendszer védve legyen miközben a citotoxikus hatóanyag még jelen van.
A találmány körébe tartozik az olyan gyógyászati készítmények előállítására szolgáló eljárás is, amelyek hatóanyagként egy vagy több (la), (II), (ΠΙ), (IV), (V) vagy (VI) általános képletű vegyületet tartalmaznak, ahol a szubsztituensek jelentése a fenti, vagy ezek fiziológiailag alkalmazható sóit gyógyszerészeti célra alkalmazható vivő- vagy hordozóanyaggal együtt. A találmány szerinti készítmények kiszerelési formája lehet orális, nazális, parenterális vagy rektális adagolásra alkalmas forma.
A találmány értelmében a „gyógyászati” az állatgyógyászati alkalmazást is magába foglalja.
A találmány szerinti vegyületek lehetnek hagyományos gyógyászati adagolásra alkalmas formában, például tabletta, bevont tabletta, orrspray, oldat, emulzió, por, kapszula vagy késleltetett hatóanyag-leadású formákban. Ezeknek a kiszerelési formáknak az előállításához ismert gyógyszerészeti vivőanyagokat és a szokásos előállítási eljárásokat alkalmazzuk. Tablettát például úgy állítunk elő, hogy a hatóanyagot vagy hatóanyagokat ismert vivőanyagokkal, például hígítószerekkel, például kalcium-karbonáttal, kalciumfoszfáttal vagy laktózzal, szétesést elősegítő szerekkel, például kukoricakeményítővel vagy algénsavval; kötőanyagokkal, például keményítővel vagy zselatinnal; kenőanyagokkal, például magnézium-sztearáttal vagy talkummal, és/vagy késleltetett hatóanyagleadást biztosító szerekkel, például karboxi-poli-metilénnel, karboxi-metil-cellulózzal, cellulóz-acetát-ftaláttal vagy polivinil-acetáttal összekeverjük.
Kívánt esetben a tabletták állhatnak több rétegből is. A bevont tablettákat úgy állítjuk elő, hogy a tablettához hasonló módon előállított magot bevonjuk valamely tabletta bevonásra általában használatos anyaggal, például polivinilpirrolidonnal vagy sellakkal, gumi-arábikummal, talkummal, titán-dioxiddal vagy cukorral. A késleltetett hatóanyag leadás elérésére vagy inkompatibilitások elkerülésére a mag ugyancsak több rétegből is állhat. A tablettabevonat ugyancsak állhat több rétegből a késleletett hatóanyag-leadás elérése érdekében, ebben az esetben a tablettáknál említett vivőanyagok alkalmazhatók.
Injekciós oldatokat is ismert módon állíthatunk elő,
HU 208 027 Β például úgy, hogy konzerválószereket, például parahidroxibenzoátokat, vagy stabilizátorokat, például EDTA-t adunk a hatóanyaghoz. Az oldatokat azután injekciós ampullákba töltjük. Késleltetett hatóanyagleadású injekciót készíthetünk az un. minipumpákkal.
Orrspray-ket készíthetünk ugyancsak vizes oldatból, amelyeket porlasztóval felszerelt edényekbe csomagolunk akár aeroszolos porlasztófejjel, akár kézi kompresszióra alkalmas eszközökkel ellátva. Egy vagy több hatóanyagot tartalmazó kapszulát állíthatunk elő, ha a hatóanyagot inért hordozóanyagokkal, például laktózzal vagy szorbittal összekeverjük és a keveréket zselatinkapszulákba töltjük.
Kúpot állíthatunk elő úgy, hogy a hatóanyagot vagy hatóanyag kombinációt az ilyen célra szokásosan alkalmazott hordozóanyagokkal, például természetes zsírokkal vagy polietilén-glikollal vagy ezek származékával összekeverjük.
A találmány szerinti vegyületeket tartalmazó adagolási egységek előnyösen 1-10 mg, még előnyösebben 4-5 mg peptidet tartalmaznak.
A találmány szerinti peptideket bármely alkalmas módon előállíthatjuk. Általában a jelenlévő reakcióképes oldallánc csoportokat (amino-, tio- és/vagy karboxilcsoportot) az általános szintézis kapcsolási reakciói alatt védjük, de néhány oldallánc csoportot nem feltétlenül kell védeni (ilyen például a hidroxilcsoport, imidazolcsoport, primer amidcsoportok vagy a gyűrűs aminosavakban, például a piro-Glu-csoportban lévő amincsoportok), a teljes szintézis alatt.
Az utolsó lépés tehát a (I) általános képletű peptid teljesen vagy részlegesen védett származékából a védőcsoport eltávolítása. Ez az eljárás is a találmány körébe tartozik.
A peptidlánc felépítése során vagy a C-terminális vagy az N-terminális oldalon indulhatunk el, bár a szokásosan elterjedt módszer a C-terminális oldalon való kezdés.
Ha például a C-terminális oldalon indulunk el, akkor egy megfelelően védett származékot, például egy lizinszármazékot egy megfelelően védett ciszteinszármazékkal reagáltatunk. A lizinszármazék szabad alfaaminocsoporttal rendelkezik, míg a másik reagens vagy egy szabad vagy egy aktivált karboxilcsoporttal és egy védett aminocsoporttal rendelkezik. A kapcsolási reakció után az intermediert tisztítjuk, például kromatográfiás eljárással, majd szelektíven eltávolítjuk a nitrogénatomon lévő védőcsoportot, így lehetővé válik egy további N-védett és szabad vagy aktivált aminosav-csoporttal rendelkező csoport hozzáadása. Ezt az eljárást folytatjuk, amíg a kívánt aminosav szekvenciát el nem érjük.
A karbonsavat aktiváló szubsztituensek közül megemlítjük a szimmetrikus vagy vegyes anhidrideket vagy aktivált észtereket, például a para-nitro-fenil-észtert, a 2,4,5-triklór-fenil-észtert, az N-hidroxi-benzotriazol-észtert (OBt), az N-hidroxi-szukcinimidil-észtert (OSu) vagy penta-fluorfenil-észtert (OPFP).
A szabad amino- és karboxilcsoportok kapcsolását végezhetjük például diciklohexil-karbodiimid (DCC) alkalmazásával. Egy másik kapcsolást elősegítő szer lehet például az N-etoxi-karbonil-2-etoxi-l,2-dihidrokinolin (EEDQ).
Általában célszerű a kapcsolási reakciót alacsony hőmérsékleten, például -20 °C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten végezni, előnyösen megfelelő oldószer-rendszerben, például tetrahidrofuránban, dioxánban, dimetil-formamidban, metilén-kloridban vagy az említett oldószerek keverékében.
Előnyös lehet a szintézist szilárd fázisú gyanta hordozón végezni. Jól alkalmazható ilyen hordozó például a klórmetilezett polisztirol (amely 1 tömeg% divinilbenzollal térhálósítva van). Ebben az esetben a szintézist a C-terminális oldalon indítjuk, például úgy, hogy az N-védett lizint a hordozóhoz kapcsoljuk.
Számos megfelelő szilárd fázisú eljárás ismert, például az Eric Atherton, Christopher J. Logan és Róbert C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin I, 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng, és R. B. Merrifield: J. Am. Chem. Soc. /02,6117-27 (1980); JamesP. Tam, Richard D. Dimarchi és R. B. Merrifield, Int. J. Peptide Protein Rés. 16 412-25 (1980); Manfred Mutter és Dieter Bellof, Helvetica Chimica Acta 67 2009-16 (1984) irodalmi helyekről.
Igen sokféle aminosav védőcsoport ismeretes a szakirodalomból, például a következő helyekről: Schröder, E. és Lübke, K., The Peptides, 1. és 2. kötet, Academic Press, New York és London, 1965 és 1966; Pettit, G. R., Synthetic Peptides, 1-4. kötet, Van Nostrand, Reinhol, New York 1970, 1971, 1975 és 1976; Houben-Weyl, Methoden dér Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, 15. kötet, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, NY, 1983; The Peptides, Alalysis, synthesis, biology 1-7, ed: Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY, San Francisco, London; Solid phase peptide synthesis, 2. kiadás, John M. Stewart, Janis D. Young, Pierce Chemical Company.
így például az alkalmazható aminocsoportot védő csoportok közül megemlítjük a következőket: karbobenzoxi- (Z-), t-butoxi-karbonil- (Boc), 4-metoxi-2,3,6-trimetil-benzol-szulfonil- (Mtr-) és 9-fluorenil-metoxi-karbonil- (Fmoc-). Megjegyezzük, hogy amikor a peptidet a C-terminális végéről építjük fel, akkor egy aminocsoportot védő csoport jelen van valamennyi újonnan hozzáadott esoport alfa-aminocsoportján, és ezt a következő kapcsolási lépés előtt szelektíven el kell távolítani. Az ilyen időleges aminocsoport védésre igen alkalmas az Fmoc-csoport, amelyet szelektíven lehet eltávolítani piperidinnel való reakcióval szerves oldószerben.
Az alkalmazható karboxilcsoportot védő csoportok közül megemlítjük a könnyen hasítható észtercsoportokat, például a benzil- (-OBZ1), p-nitrobenzil- (-ONB) vagy terc-butil(-tOBu) csoportot, valamint a szilárd hordozóhoz való kapcsolást, például a polisztirolhoz kapcsolódó metilcsoportokat.
A tiolcsoportot védő csoportok közül megemlítjük a p-metoxi-benzil (Mob), tritil- (Trt) és acetamido-metilcsoportot (Acm).
Megemlítjük, hogy igen sokféle egyéb csoport is
HU 208 027 Β alkalmazható, amely a fent említett irodalmi helyekről ismert, természetesen valamennyi ilyen csoport alkalmazása eljárásunk során a találmány körébe tartozik.
Az amino- és karboxilcsoportokat védő csoportok eltávolítására igen sok eljárás létezik. Ezeknek azonban összhangban kell lenniük a felhasznált szintézisvezetéssel. Az oldalláncvédő csoportoknak stabilaknak kell lenni az olyan körülmények között, amelyek között a következő kapcsolási lépés előtt eltávolítjuk az ideiglenes alfa-amino-csoport védőcsoportokat.
Az aminocsoportot védő csoportok, például a Boc és a karboxilcsoportot védő csoportok, például a tOBu, egyidejűleg távolíthatók el savas körülmények között, például trifluor-ecetsavval. A tiolcsoportot védő csoportok, például a Trt, szelektíven távolíthatók el oxidálószerrel, például jóddal.
A ciszteintartalmú peptidek az említett eljárásokkal szintetizálhatok oly módon, hogy valamennyi védőcsoportot a tiol-védőcsoportot is beleértve az utolsó szintézislépésben távolítunk el.
A következőkben találmányunkat példákkal is illusztráljuk, de nem kívánjuk azokra korlátozni.
A példákban alkalmazott oldószereket kereskedelemben kapható termékekből desztilláltuk újra és tároltuk a következő módon: a dimetil-formamidot (DMF) 4A molekulaszitáról, a diklór-metánt (DCM) kalcium-kloridról, a trietil-amint (TEA) Ba/Pb ötvözetről (Baker) és a trifluor-ecetsavat (TFA) 4A molekulaszitáról desztilláltuk.
A vékonyréteg-kromatográfiás eljárást a következő anyagokkal végeztük:
Sp szilícium-dioxid; kloroform/metil-alkohol
98; 2 térfogatarányú keveréke;
S2: szilícium-dioxid; kloroform/metil-alkohol
95:5 térfogatarányú keveréke;
S3: szilícium-dioxid RP 8; 0,1 térfogat% TFA-t tartalmazó 5 térfogat%-os vizes etil-alkohol.
A tisztított végtermékeket reverz fázisú nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) elemeztük. A HPLC-rendszer egy HP 1090M kromatográfból állt, amely beépített mintavevővel és egy HP 1040 diódasorral rendelkezik (Hewlett-Packard, Waldbronn, FRG), valamint egy szupelkozil LC-18 oszloppal van ellátva (240x4,6 mm, 5 μ részecskeméretű). A mintákat 0,1 térfogat%-os vizes TFA-ban oldjuk és lineáris gradiens elúciót végzünk 0-30 térfogatai) acetonitril-tartalmú 0,1 térfogat%-os TFAval. Az áramlási sebesség 2 ml/perc. Az eluens kromatogramját 214 nm-nél 4 nm sávszélességnél felvesszük. Az oldószer kromatogramját elektronikusan kivonjuk és az eredményeket terület%-ban fejezzük ki.
Az aminosav-analízist a következőképpen végezzük:
A cisztintartalmú peptideket perhangyasavval oxidáljuk és így a savra labilis cisztincsoportot savra stabil cisztinsavvá alakítjuk, majd savas hidrolízist végzünk 6 mólos sósavban 110 °C-on 16 órán keresztül. A száraz hidrolizátumból azután fenil-izotio-cianáttal származékot készítünk és a Heinrikson által ismertetett módon (lásd Anal. Bioch. 136,65-74,1984) analizáljuk.
1. példa
L-piroglutamil-L-glutamil-L-aszpartil-L-ciszteinilL-lizin 1. sz. vegyület
a) t-Boc-(S-p-metoxi-benzil)-L-ciszteinil-(e-benziloxikarbonil)-L-lizin-benzil-észter (I) ε-Benzil-oxi-karbonil-lizin-benzil-észter-hidrokloridot 3 ml dimetil-formamidban feloldunk és TEA-t adunk hozzá, amíg szabad TEA mutatható ki a gőzfázisban egy nedves pH indikátor papírral. Az oldathoz hozzáadjuk 491 mg t-Boc-(S-p-metoxi-benzil)-L-cisztein-N-hidroxi-szukcinimid-észter 3 ml dimetil-formamiddal készített oldatát. Megfelelő időkben adagokban trietil-amint adagolunk az elegyhez, annak érdekében, hogy az oldat enyhe lúgosságát fenntartsuk. Az elegyet éjszakán át szobahőmérsékleten pihentetjük, majd a negatív ninhidrin reakció után közvetlenül 2,5x75 cm-es Sephadex LH20 oszlopra visszük, amely dimetil-formamiddal van kiegyensúlyozva és standard reagensekkel kalibrálva (az adott példában például tBoc-(gamma-benzil)-L-glutaminsav-p-nitrofenil-észterrel és p-nitro-fenollal). Az oszlop áramlását a gravitációs áramlással tartjuk fent, a kifolyó oldatot 280 nm-en vizsgáljuk, majd kb. 10 ml-es frakciókba gyűjtük. A terméket vékonyréteg-kromatográfiás eljárással azonosítjuk minden frakcióban, a megfelelő frakciókat összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk. 700 mg olajos terméket kapunk (100%), amely vékonyréteg-kromatográfiás eljárás alapján homogén termék. Eluálószerként kloroform/metanol 9:1 térfogatarányú keverékét használjuk. Rf: 0,64.
b) t-Boc-$-benzil)-L-aszpartil-(S-p-metoxi-benzil)-Lciszteinil-(e-benziloxi-karbonil)-L-lizin-benzil-észter (Π)
700 mg védett (I) általános képletű dipeptidet 25 ml vízmentes DCM-ben feloldunk és hozzáadunk 25 ml vízmentes TFA-t. 30 perc elteltével a savat és az oldószert vákuumban bepároljuk. A maradékot DCM-ben feloldjuk és újra bepároljuk. A maradék 3 ml dimetilformamiddal készített oldatához, amelyet trietil-aminnal enyhén meglúgosítunk, hozzáadjuk 488 mg t-Boc(P-benzil)-L-aszparaginsav-p-nitrofenil-észter 3 ml dimetil-formamiddal készített oldatát. A lúgosságot sűrűn megvizsgáljuk és kis mennyiségű trietil-amin hozzáadásával fenntartjuk. Miután a ninhidrin reakció negatívvá válik (mintegy 2 óra elteltével), a reakcióelegyet Sephadex LH-20 oszlopra visszük (2,5x75 cm) és a fentiekben leírt módon tisztítjuk. Vákuumban végzett bepárlás után 900 mg kristályos terméket kapunk (100%), amely a vékonyréteg-kromatográfiás elemzés szerint homogén. Eluálószerként kloroform/aceton 9:1 térfogatarányú keverékét használjuk, Rf=0,70.
c) t-Boc-(gamma-benzil)-L-glutamil-(P-benzil)-L-aszpartil-(S-p-metoxi-benzil)-L-ciszteinil-(E-benziloxi-karbonil)-L-lizin-benzil-észter (ΙΠ)
900 mg védett (II) általános képletű tripeptid származékot TFA-val a fentiekben leírtak szerint felszabadítunk, majd 3 ml dimetil-formamidban feloldunk és trietil-aminnal enyhén lúgossá tesszük. Ehhez az oldathoz hozzáadjuk 504 mg t-Boc-(gamma-benzil)-Lglutaminsav-p-nitrofenil-észter 3 ml dimetil-form6
HU 208 027 Β amiddal készített oldatát. Kb. 2,5 óra múlva a ninhidrin-próba negatív, ekkor a reakcióelegyet Sephadex LH20 oszlopra visszük és a fentiek szerint tisztítjuk. A komponensek elválasztását a reakcióelegyből és vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatát a fentiekben leírtak szerint végezzük. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük (ebben az esetben 9-15-ig), majd bepároljuk és szárítjuk. 1140 mg halvány sárgás olajat kapunk (kitermelés: 100%), amely vékonyréteg-kromatográfiásan homogén. Eluálószerként kloroform/aceton 9:1 térfogatarányú elegyét használjuk, Rf-0,73.
d) Benziloxi-karbonil-L-piroglutamil-(gamma-benzil)L-glutamil-(P-benzil)-L-aszpartil-(S-p-metoxi-benzil)-L-ciszteinil-(e-benzil-oxi-karbonil)-L-lizinbenzil-észter (IV)
1140 mg (ΠΙ) általános képletű tetrapeptid-származékról a védőcsoportot TFA-val DCM-ben a fentiek szerint eltávolítjuk, majd a vegyületet 3 ml dimetilformamidban feloldjuk. Az oldatot trietil-aminnal enyhén lúgosítjuk, majd hozzáadjuk 423 mg benziloxi-karbonil-L-piroglutaminsav-p-nitrofenil-észter 3 ml dimetil-formamiddal készített oldatát. A reakcióelegy lúgosságát ismételten megvizsgáljuk és szükség esetén trietil-amin hozzáadásával helyreállítjuk. Mintegy 3 óra elteltével a ninhidrid-próba negatívvá válik és a (IV) általános képletű pentapeptid-származékot a fentiekben leírtak szerint tisztítjuk. 1230 mg (96%) hal10 ványsárga olajat kapunk, amely a vékonyréteg-kromatográfiás elemzés eredménye alapján homogén termék. Eluálószerként kloroform/aceton 9:1 térfogatarányú keverékét használjuk. Rf=0,44 (elnyúló),
e) L-piroglutamil-L-glutamil-L-aszpartil-L-ciszteinilL-lizin mg védett (I) általános képletű pentapeptid-származékot 50 ml folyékony hidrogén-fluoridban 0 °C-on feloldunk, savmegkötőszerként hozzáadunk 500 mg metionint és a reakcióelegyet 1 órán keresztül állni hagyjuk. Ezután a hidrogénfluoridot vákuumban 0 ’Con lepároljuk és a maradékot etilacetáttal elkeverjük. Az etil-acetátos mosófolyadékot dekantáljuk és elöntjük. A visszamaradó anyagot hígított ecetsavban feloldjuk és liofilizáljuk. 2 mg liofilizált anyagot reverz fázisú HPLC eljárással tisztítjuk 10 mmxlO cm-es Cl8-as oszlopon, az áramlási sebesség percenként 2,8 ml és gradiens elúciót végzünk a következő oldószerekkel: A oldószer 0,1 térfogat% vizes trifluor-ecetsav; B oldószer: 0,1 térfogat% difluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril. 0,10 térfogat% B oldószert 30 percig adagoljuk. A detektálást ultraibolya abszorpcióval végezzük 214 nm-en vagy piridin-diszulfid reagenssel (az S H-csoportok kimutatására).
Hasonlóképpen állítjuk elő a következő peptideket: a vegyületeket és azonosító adataikat az 1. és 2. táblázatban foglaljuk össze.
1. táblázat
Példaszám Aminosav-analízis Tisztaság
2. pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys Glu: 2,00; Asp: 1,07; Cys: 0,87; Lys: 1,15 95%
3. Ac-Glu-Glu-Asp-Cys-Lys Glu: 2,00; Asp: 1,11; Cys: 0,84; Lys: 1,11 94%
4. pGlu-Glu-Glu-Cys-Lys Glu: 2,98; Cys: 1,00; Lys: 1,19 93%
5. pGlu-Glu-Asp-Cys-D-Ala-Lys Glu: 1,99; Asp: 1,00; Cys: 0,89; Lys: 1,12; Ala: 1,01 94%
6. pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys-NH2 Glu: 2,11; Asp: 0,8; Cys: 0,99,Lys: 0,92 97%
8. pGlu-Glu-Asp-Cys-Gly-Lys Glu: 2,12; Asp: 0,85; Cys: 0,9 ; Lys: 0,97; Gly: 1,11 96%
9. pGlu-Glu-Asp-(Benzyl-Cys)-Lys Glu: 2,11; Asp: 0,95; Cys: Bze: 1,07; Lys: 0,87 96%
10. pGlu-Ala-Asp-(Benzyl-Cys)-Lys Glu: 1,00; Asp: 1,00; Cys: 1,13; Lys: 0,97; Ala: 0,97 95%
11. pGlu-AIa-Asp-Cys-Lys Glu: 1,08; Asp: 0,95; Cys: 0,99; Lys: 1,03; Ala: 0,94 98%
12. pGlu-D-Ala-Asp-Cys-Lys Glu: 1,10; Asp: 0,95; Cys: 0,89; Lys: 1,03; Ala: 0,92 98%
13. Gln-Glu-Asp-Cys-Lys Glu: 2,00; Asp: 0,98; Cys: 0,81; Lys: 1,16 97%
14. pGlu-Glu-Asp-Cys-Gly Glu: 1,98; Asp: 1,0; Cys: 1,01; Gly: 1,01 88%
15. pGlu-Glu-Asp-(2-pyridylthio-Cys)-Lys Glu: 1,95; Asp: 1,0; Cys: 1,07; Lys: 0,93 97%
HU 208 027 Β
Példaszám Aminosav-analízis Tisztaság
16. pGlu-Gly-Asp-(Benzyl-Cys)-Lys Glu: 1,00; Asp: 1,00; Cys : 1,16; Lys: 0,99; Gly: 1,04 98%
17. pGlu-Glu-Glu-(Benzyl-Cys)-Lys Glu: 3,00; Cys: 1,1; Lys: 1,0 93%
18. pGlu-Gly-Asp-Phe-Lys Glu: 1,00; Asp: 1,00; Gly: 1,00; Phe: 1,00; Lys: 1,00 99%
21. pGlu-Glu-Asp-Ser-Lys Glu: 1,95; Asp: 1,0; Ser: 0,88; Lys: 0,94 >92%
22. pGlu-Gly-Asp-Cys-Lys Glu: 1,02; Asp: 1,09; Cys: 1,02; Lys: 0,95; Gly: 0,92 >95%
23. pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys Glu: 1,92; Asp: 1,08; Cys: 1,02; Lys: 1,00 100%
24. pGlu-Asp-Asp-Cys-Arg Glu: 1,96; Asp: 1,12; Cys: 1,00; Arg: - 99%
25. Glu-Glu-Asp-Cys-Lys Glu: 2,00; Asp: 0,98; Cys: 0,81; Lys: 1,10 97%
26. Pro-Glu-Asp-Cys-Lys Glu: 0,99; Asp: 1,04; Cys: 1,01; Lys: 0,99; Pro: - 98%
27. pGlu-Glu-Glu-Cys-Arg Glu: 2,93; Cys: 1,01; Arg: 1,03 100%
28. Ser-Glu-Glu-Glu-Cys-Arg Glu: 2,98; Ser: 0,97; Cys: 0,98; Arg: 1,08 95%
29. Ser-Gln-Glu-Glu-Cys-Arg Glu: 2,96; Ser: 0,96; Cys: 0,96; Arg: 1,11 98%
A peptideket vékonyréteg-kromatográfiás eljárással, HPLC-vel és aminosav analízissel azonosítottuk.
2. táblázat
Példaszám Vegyület Eredmények
3. Ac-Glu-Glu-Asp- Cys-Lys RT = 16,46 min
4. pGlu-Glu-Glu-Cys- Lys RT =15,50 min
5. pGlu-Glu-Asp-Cys- D-Ala-Lys RT =17,60 min
6. pGlu-Glu-Asp-Cys- Lys-NH2 RT =10,81 min, Rf-0,529
8. pGlu-Glu-Asp-Cys- Gly-Lys RT-12,54 min, Rf=0,445
9. pGlu-Glu-Asp-(Ben- zil-Cys)-Lys RT-16,03, Rf-0,176
11. pGlu-Ala-Asp-Cys- Lys Rf= 0,265
12. pGlu-D-Ala-Asp- Cys-Lys Rf-0,253
13. Gln-Glu-Asp-Cys- Lys RT =15,62 min
14. pGlu-Glu-Asp-Cys- Gly RT= 10,66 min
18. pGlu-Gly-Asp-Phe- Lys RT-24,72 min
21. pGlu-Glu-Asp-Ser- Lys RT =10,56 min
25. Glu-Glu-Asp-Cys- Lys RT-11,90 min
26. Pro-Glu-Asp-Cys- Lys Rf=0,57
Példaszám Vegyület Eredmények
27. pGlu-Glu-Glu-Cys- Arg RT = 13,7 min
28. Ser-Glu-Glu-Glu- Cys-Arg RT = 10,42 min
29. Ser-Gln-Glu-Glu- Cys-Arg RT = 9,36 min
A 6. és 8. példánál a vékonyréteg-kromatográfiás eljáráshoz oldószer rendszerként 0,1 térfogat% TFA-t tartalmazó 5:95 térfogatarányú metil-alkohol/víz elegyet használtunk.
A 9. példánál oldószer rendszerként 0,1 térfogat% TFA-t tartalmazó 20:80 térfogatarányú metil-alkohol/víz elegyet használtunk. A többi példánál az oldószerelegy butil-alkohol/ecetsav/víz 2:1:1 térfogatarányú elegye.
A retenciós időket (RT) Beckman HPLC rendszeren határoztuk meg.
Áramlási sebesség: 1 ml/perc.
Mobil fázis:
A: 0,1 térfogat% TFA vízben;
B: 0,1 térfogat% TFA 40 térfogat%-os vizes MeCN-ben;
Gradiens: a 6. és 8. példánál 0-30% B 20 perc alatt, 30-100% B, 5 perc alatt, a 9. példánál 20-50% B, 20 perc alatt és 50-100 B, 5 perc alatt, a többi példánál 0-30% B, 20 perc alatt.
Kolonna: a 6., 8. és 9. példánál Vydack C18 (mérete 0,46x25 cm, részecskeméret 5 pm, pórusméret 3xl0's m,
HU 208 027 Β a többi példánál Supekosil C-18 (részecskeméret: 5 pm, méret 0,46x25 cm, pórusméret lxlO'8 m).
FARMAKOLÓGIAI VIZSGÁLATOK EREDMÉNYE
In vivő csontvelösejtek vizsgálata
20-24 grammos egereknek intraperitoneálisan fiziológiai sóoldatban oldott peptideket adagolunk. A vizsgált peptidek a 15. és a 22. példa szerinti vegyületek. Az állatokat a nyak kicsavarásával leöljük és a combcsontjukat steril körülmények között eltávolítjuk. A combcsontból kiszívatjuk a csontvelőt és Coulter számolóberendezéssel meghatározzuk az összes sejtszámot. Giemsa festékkel festett, levegőn szárított csontvelő keneteken a sejttípusok differenciális számolását is elvégezzük. A perifériás vérkeneteket metanollal rögzítjük, Giemsa festékkel megfestjük és differenciálisán megszámoljuk.
Az eredményeket, amelyeket a kontroll százalékában fejezünk ki, a 3. táblázatban tüntetjük fel.
3. táblázat
15. sz. vegyület 22. sz. vegyület
CFUc 105 csontvelő sejtenként 12 gg/egér
3 óra - 97%
24 óra 83 % 66%
72 óra 64% -
perifériás vér limfocita 12 gg/egér
3 óra - 59%
24 óra 68% 95%
72 óra 151% -
Granulociták 12 gg/egér
3 óra - 135%
24 óra 98% 43%
72 óra 80% -
Az eredményekből látható, hogy ha a cisztein tiocsoportját metabolikusan labilis piridilcsoporttal védjük, az a CFUc értékben késleltetett csökkenést idéz elő, lényeges hatást három nap elteltével tapasztalunk. A 15. példa szerinti vegyület ezen kívül a perifériás limfocitákra rövid ideig tartó hatást gyakorol.
Ha a glutaminsavat a 2-es helyzetben glicinnel helyettesítjük, akkor elég gyors gátló hatást tapasztalunk a CFUc-re a csontvelőben. A perifériás vérre gyakorolt hatás rendkívül gyors és rövid életű.
30. példa pGlu-Glu-Asp-Ser-Lys-OH
A peptidet LKB Biolynx 4170 teljesen automata peptidszintetizátoron állítjuk elő és közben ultraibolya fényben 304 nm-nél ellenőrizzük. Időleges N-védelemre és UV nyomjelzőként Fmoc-t használunk. A C-terminális aminosavat a polimerhez egy savra spacerrel kapcsoljuk.
Az eljárást a következőképpen végezzük:
kapcsolás recirkulációval 30 perc
mosás dimetil-formamiddal 10 perc
védőcsoport eltávolítása 20 térfogat%
piperidint tartalmazó dimetil-form-
amiddal 10 perc
mosás dimetil-formamiddal 10 perc
A C-terminális aminosavat DCC-vel alkotott szimmetrikus anhidrid formájában aktiváljuk és a polimerhez katalizátorként Ν,Ν-dimetil-amino-piridint használva kapcsoljuk. 60 perces recirkuláció után a teljes szintézis során az általános eljárást alkalmazzuk.
A felhasznált aminosav-származékok:
Fmoc-Lys(e-N-Boc)-OH
Fmoc-Ser(O-t-B u) -ODB H
Fmoc-Asp(3-tOBu)-OPfp
Fmoc-Glu(v-tOBu)-OPfp pGlu-OPClp
A teljesen védett pentapeptid mosása után a polimert dietil-éterrel mossuk és levegőn szárítjuk.
A pepiidről az összes védőcsoportot eltávolítjuk és a polimerről lehasítjuk egyetlen lépésben 95 térfogat%-os vizes TFA-val egy órán keresztül reagáltatva. Szűrés: TFA-val végzett mosás, majd bepárlás után a végterméket RP8 oszlopon tisztítjuk, eluálószerként 0,1 térfogat% TFA-t tartalmazó etanolt használunk. Kitermelés: 44%. Tisztaság: több mint 92% (HPLC RP 18,214 nm). Aminosav-analízis: elfogadható.

Claims (11)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (I) általános képletű vegyületek előállítására, a képletben
    Ra jelentése (1) vagy (2) általános képletű csoport,
    Rb jelentése egy (3) általános képletű vagy egy (4) vagy (5) képletű csoport,
    Rc jelentése (6) általános képletű csoport,
    Rd jelentése (7) általános képletű vagy (8) vagy (9) képletű csoport,
    Re jelentése (10) általános képletű csoport és Rf jelentése (11), (12) vagy (13) általános képletű csoport, ahol n értéke 0 vagy 1, p és qértéke egymástól függetlenül 1 vagy 2,
    R1 és R2 jelentése hidrogénatom vagy együttesen egy oxocsoportot alkot,
    R5 jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkanoilcsoport vagy szerbiből, treoninból, glicinből, alaninból, leucinból vagy izoleucinból képzett acilcsoport,
    R6 jelentése hidroxil- vagy aminocsoport,
    R7 jelentése hidroxilcsoport,
    R8 jelentése hidrogénatom, 7-16 szénatomos karbociklusos aralkilcsoport, vagy egy metabolikusan labilis S védőcsoport,
    R9 jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport,
    R10 jelentése hidroxil- vagy aminocsoport;
    ahol az glicin és az alanin kivételével, amely utóbbi D vagy L alakú is lehet, valamennyi említett aminosav csoport L alakú,
    HU 208 027 Β a következő vegyületek kivételével: pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-Gly-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-Ala-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-LysNH2 azzal jellemezve, hogy előállítjuk a vegyűlet védett származékát, és a származékból a védőcsoportokat eltávolítjuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol R5 szerinaminosavból képzett csoport és a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű vegyületek szűkebb körét alkotó (II) általános képletű vegyületek előállítására, a képletben Ra, Rb, Rc, Re, Rf és n jelentése ugyanaz, mint a (I) általános képletben, R11 jelentése 7-16 szénatomos karbociklusos aralkilcsoport, és a képletben az aminosavak konfigurációja ugyanaz, mint a (I) általános képletben, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű vegyületek szűkebb körét alkotó (III) általános képletű vegyületek előállítására, a képletben Ra, Rb, Rc, Re, Rf és n jelentése ugyanaz, mint a (I) általános képletben és az aminosavak konfigurációja szintén az 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű vegyületek szűkebb körét alkotó (IV) általános képletű vegyületek előállítására, ahol Ra, Rb, Rc, Re, Rf és n jelentése ugyanaz, mint a (I) általános képletben, R12 jelentése metabolikusan labilis csoport, előnyösen 2-piridil-tio-csoport, és az aminosavak konfigurációja az 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű vegyületek szűkebb körét alkotó (V) általános képletű vegyületek előállítására, a képletben Ra, Rc, Rd, Re, Rf és n jelentése az 1. igénypont szerinti és az aminosavak konfigurációja az 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű vegyületek szűkebb körét alkotó (VI) általános képletű vegyületek, a képletben Ra, Rb, Rc, Re, Rf és n jelentése az 1. igénypont szerinti és valamennyi aminosav konfigurációja az 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szintézist szilárd fázisú technológiával végezzük.
  9. 9. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy vagy több az 1. igénypont szerint előállított, a (I) általános képletű vegyületet, ahol ahol Ra Rb, Rc, Rd, Re, Rf és n jelentése az 1. igénypont szerinti, vagy gyógyászatilag alkalmas sóját gyógyszerészeti vivő- vagy hordozóanyagokkal és adott esetben egyéb segédanyagokkal összekeverünk és a keveréket gyógyszerkészítménnyé kiszereljük.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a keveréket sejtburjánzás gátló hatású készítménnyé alakítjuk.
  11. 11. Eljárás hatóanyagként (I) általános képletű vegyületek közül pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-Gly-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-Ala-Lys pGlu-Glu-Asp-Cys-LysNH2-t tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított vegyületeket szokásos gyógyszerészeti vivő- vagy hordozóanyagokkal és adott esetben egyéb segédanyagokkal összekeverjük és a keveréket nem vérképző, sejtburjánzás gátlására ható gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
HU895788A 1988-09-16 1989-09-13 Process for producing peptide compounds and pharmaceutical composition containing them as active components HU208027B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB888821785A GB8821785D0 (en) 1988-09-16 1988-09-16 Peptide compounds

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT58765A HUT58765A (en) 1992-03-30
HU208027B true HU208027B (en) 1993-07-28

Family

ID=10643722

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU895788A HU895788D0 (en) 1988-09-16 1989-09-13 Process for producing peptides and medical products containing them
HU895788A HU208027B (en) 1988-09-16 1989-09-13 Process for producing peptide compounds and pharmaceutical composition containing them as active components

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU895788A HU895788D0 (en) 1988-09-16 1989-09-13 Process for producing peptides and medical products containing them

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5484770A (hu)
EP (2) EP0434718A1 (hu)
JP (1) JPH04500666A (hu)
KR (1) KR900701828A (hu)
CN (1) CN1041159A (hu)
AT (1) ATE110742T1 (hu)
AU (1) AU641366B2 (hu)
CA (1) CA1339947C (hu)
DE (1) DE68917837T2 (hu)
DK (1) DK39591D0 (hu)
ES (1) ES2058479T3 (hu)
GB (1) GB8821785D0 (hu)
GE (1) GEP19971041B (hu)
HU (2) HU895788D0 (hu)
IE (1) IE64181B1 (hu)
LT (1) LT3714B (hu)
LV (1) LV10108B (hu)
MY (1) MY104909A (hu)
NZ (1) NZ230654A (hu)
RU (1) RU2079509C1 (hu)
WO (1) WO1990002753A1 (hu)
ZA (1) ZA896980B (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5620957A (en) * 1989-07-14 1997-04-15 Smithkline Beecham Corporation Hemoregulatory peptides
HU206372B (en) * 1990-09-03 1992-10-28 Richter Gedeon Vegyeszet Process for producing new oligopeptides which selectively inhibit proliferation of haemopoietic cells and pharmaceutical compositions comprising same
HU206374B (en) * 1990-09-03 1992-10-28 Richter Gedeon Vegyeszet Process for producing pentapeptide and its salts specifically inhibiting proliferation of epidermic cells, as well as pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient
TW222280B (hu) * 1991-11-26 1994-04-11 Smithkline Beecham Corp
IL104323A0 (en) * 1992-01-10 1993-05-13 Smithkline Beecham Corp Hemoregulatory peptides
GB9211677D0 (en) 1992-06-02 1992-07-15 Nycomed Bioreg As Peptide compounds
GB9211674D0 (en) 1992-06-02 1992-07-15 Nycomed Bioreg As Peptide compounds
GB9211668D0 (en) 1992-06-02 1992-07-15 Nycomed Bioreg As Peptide compounds
GR1001502B (el) * 1992-11-26 1994-02-28 Smithkline Beecham Corp Αιμορυ?μιστικά πεπτίδια.
CN1034735C (zh) * 1993-01-02 1997-04-30 史密丝克莱恩比彻姆公司 血调节肽
US5521284A (en) * 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
US5504191A (en) * 1994-08-01 1996-04-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide methyl esters
CN1403474A (zh) * 2001-09-05 2003-03-19 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种短肽及以其为活性成份的药物
EP2258381A3 (en) * 2002-07-23 2011-11-02 Ipsen Pharma Ghrelin analogs

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI77875C (fi) * 1982-11-26 1989-05-10 Nyegaard & Co As Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara peptider.
NO860752L (no) * 1985-06-26 1986-12-29 Bio Tech As Pentapeptider med cellevekstregulerende virkning og fremgangsmaate for fremstilling derav.
US4748154A (en) * 1985-12-24 1988-05-31 Takeda Chemical Industries, Ltd. Peptide derivatives, their production and use
GB8626539D0 (en) * 1986-11-06 1986-12-10 Nycomed As Peptide compounds

Also Published As

Publication number Publication date
IE892954L (en) 1990-03-16
AU641366B2 (en) 1993-09-23
LV10108B (en) 1994-10-20
JPH04500666A (ja) 1992-02-06
WO1990002753A1 (en) 1990-03-22
HU895788D0 (en) 1991-08-28
EP0359338B1 (en) 1994-08-31
NZ230654A (en) 1991-10-25
EP0359338A1 (en) 1990-03-21
AU4218389A (en) 1990-04-02
US5484770A (en) 1996-01-16
GEP19971041B (en) 1997-11-26
IE64181B1 (en) 1995-07-12
LV10108A (lv) 1994-05-10
CN1041159A (zh) 1990-04-11
KR900701828A (ko) 1990-12-04
HUT58765A (en) 1992-03-30
ATE110742T1 (de) 1994-09-15
DK39591A (da) 1991-03-06
RU2079509C1 (ru) 1997-05-20
ES2058479T3 (es) 1994-11-01
DE68917837T2 (de) 1994-12-22
MY104909A (en) 1994-06-30
EP0434718A1 (en) 1991-07-03
ZA896980B (en) 1990-06-27
CA1339947C (en) 1998-07-07
LT3714B (en) 1996-02-26
GB8821785D0 (en) 1988-10-19
DE68917837D1 (de) 1994-10-06
LTIP610A (en) 1994-12-27
DK39591D0 (da) 1991-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4499081A (en) Peptide compounds
ES2404052T3 (es) Péptidos que tienen actividad farmacológica para el tratamiento de trastornos asociados con la migración celular alterada, tal como el cáncer
WO2004020462A1 (ja) Ｃｘｃｒ４拮抗薬およびその用途
HU208027B (en) Process for producing peptide compounds and pharmaceutical composition containing them as active components
HUT77118A (hu) Immunmodulátor hatásokkal rendelkező új peptidek
EP0267741B1 (en) Peptide compounds
NO177713B (no) Analogifremgangsmåte ved fremstilling av hemoreguleringspeptider
AU2021200731B2 (en) Pro-drug peptide with improved pharmaceutical properties
EP1937710B1 (en) Kinin b1 receptor peptide agonists and uses thereof
EP2051991B1 (en) Cardioprotective compounds
DK171992B1 (da) Peptider, farmaceutiske præparater indeholdende dise peptider, anvendelse af peptiderne til fremstilling af et farmaceutisk præparat til anvendelse ved stimulering af myelopoieesesystemet hos mennesker eller dyr, fremgansmåde til fremstilling af peptiderne og forbindelser med anvendelse som mellemprodukter herved

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: NYCOMED IMAGING AS, NO

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee