PL165133B1 - Sposób wytwarzania nowych peptydów PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowych peptydów o wzo- rze 1, w którym Y1 i Y 2 niezaleznie od siebie oznaczaja grupe CH2 lub atom S , x oznacza liczbe 0, 1,2,3 lub 4, m oznacza liczbe 0, 1 lub 2, n oznacza liczbe 0, 1 lub 2, A oznacza kwas piroglutaminowy, proline, glutamine, tyrozyne lub kwas glutaminowy, B oznacza kwas gluta- minowy, tyrozyne lub kwas asparaginowy, C oznacza kwas glutaminowy, tyrozyne lub kwas asparaginowy, D oznacza lizyne, arginine, tyrozyne, N-metyloarginine, kwas dwuaminopentynokarboksylowy lub j ego karbo- nam id lub pochodna hydroksymetylowa, E oznacza kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, tyrozyne lub wiazanie peptydowe, pod warunkiem, ze gdy Y1 i Y2 oznacza atom S, to x oznacza liczbe 2, 3 lub 4 i m i n oznaczaja liczbe 1, albo gdy Y1 i Y2 oznaczaja grupe CH2. to x oznacza liczbe 0, 1 lub 2 i m i n oznaczaja liczbe 0, albo gdy, Y1 oznacza atom S a Y2 oznacza grupe CH2, to x oznacza 0 a n oznacza liczbe 1, albo gdy Y2 oznacza atom S a Y1 oznacza grupe CH2, to x oznacza liczbe 0 , a m oznacza liczbe 1, lub ich farmaceutycznie do- puszczalnych soli, znam ienny tym, ze (a) zabezpiecza sie funkcyjna grupe lancucha bocznego oraz grupe a - aminowa aminokwasów ozna- czonych symbolem D za pomoca F-moc lub t-Boc: (b) kowalencyjnie przylacza sie C koncem am i- nokwas z zabezpieczonymi grupami funkcyjnymi z eta- pu (a) do zywicy, takiej j ak zywica benzhydrylowa, oznaczonej skrótem BHA, zyw ica............................. W Z Ó R 1 PL PL PL PL PL PL

Description

Przemiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych peptydów o działaniu hemoregulującym, które mogą być stosowane do stymulowania tworzenia się krwinek i do leczenia infekcyjnych chorób wirusowych, grzybiczych i bakteryjnych.

Różne regulatory informujące i modyfikujące, takie jak kolonie hodowlane czynników stymulujących, interferony i różne typy peptydów odpowiedzialne są za regulowanie tworzenia się szpiku. Metcalf, Cell, 43:5 (1985); Baserga R., Foa P., Metcalf D, Poili EE (eds), Biological Regulation of Cell Proliferation (1986); Nicola i wsp., J. Cell Physiol. 128:501 (1986), Zoumbos i wsp., Proyr.Hemat. 1:341 i 14:201 (1986); Werner i wsp., Experientia 42:521 (1986). Dwadzieścia lat temu Rytomaa i Kivieniemi. Cell Tissue Kinet 1:329-340 (1968); Rytomaa i wsp., Control of Cellular Growth in Adult Organisms str. 106 - 138 (1967) podali, że ekstrakty granulocytów (antyhormony granulocytowe) mogły specyficznie inhibitować namnażanie się komórek szpikowych szczura w nakrytych hodowlach rozmazowych. Później wykazali oni, że czynnik, który miał ciężar cząsteczkowy mniejszy niż 3.000 daltonów, zdolny był do indukowania regresu przeszczepialnej białaczki granulocytowej u szczura, jak również opóźniają rozwój komórek białaczkowych u ludzi. Paukovits i inni wyekstrahowali podobny czynnik z komórek szpiku kostnego szczura i wykazali, że inhibituje pobieranie trytowanej tymidyny z komórek szpiku kostnego, Paukovits, W.R., Cell Tissue Kinet 4:539-547; Naturforsch 37:1297 /1982/. W 1979 roku Boll i wsp., Acta Haematologica 6:130Ι19Ί9Ι wykazali działania inhibitujące ekstraktów z granulocytów szczura na komórki ludzkiego szpiku kostnego w hodowli a wielu innych badaczy wykazało, że ten surowy ekstrakt granultrcytowy inhibitowai rozwój g-CFUC iźlub gm-CFUC in vitro z komórek szpiku kostnego gryzonia.

165 133

Ten środek biologiczny był określany antyhormonem granulocytowym, który zgodnie z tym założeniem teoretycznym, powinien być wewnątrzpochodnym inhibitorem rozmnażania komórek działając w tej samej tkance jak został wydzielony. Stwierdzono, że materiał otrzymany z surowych ekstraktów jest nie-gatunkowo specyficzny, ale wysoce tkankowo specyficzny. Ponadto stwierdzono, że jest nietoksyczny i ma działanie odwracalne.

W 1982 r. opisano syntetyczny hemoregulacyjny pentapeptyd o następującej budowie: pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys który ma selektywne działanie inhibitujące na komórki szpikowe zarówno in vitro jak i in vivo, gdzie głównym działaniem wydaje się być działanie na szpikowe komórki pnia /CFU-gm/, Paukovits i wsp., Z. Naturforsch 37:1297 /1982/ i amerykański opis patentowy nr 4 499 081. Przypuszcza się, że peptyd ten jest analogiem naturalnie występującego czynnika inhibitowania tworzenia się granulocytów, który został znaleziony w minimalnych ilościach w ekstraktach szpiku kostnego. Peptyd ten przez inhibitowanie tworzenia się krwinek a w szczególności tworzenia się granulocytów wykazuje tendencję do zapobiegania aby nieruchome komórki nie wchodziły do komórkowego podziału stając się w ten sposób podatne na zaatakowanie przez cytotoksyczne leki przeciwrakowe. Poza zapewnieniem działania ochronnego w terapii stosującej leki cytotoksyczne, peptydy mogą również być stosowane do zatrzymania rozmnażania się komórek rakowych związanych z układem tworzenia się szpiku t.zn. z białaczką szpikową.

W 1987 r. Laerum i wsp. donieśli, że produkt utleniania tego peptydu był dimerem /HP-5/ utworzonym za pomocą mostku dwusiarczkowego. Ten dimer ma przeciwne działanie niż monomer, ponieważ silnie stymuluje tworzenie kolonii hodowlanych zarówno ludzkiego jak i mysiego CFU-gm in vitro i w znacznym stopniu kontroluje mysie komórki szpikowe in vivo. Zastrzeżone to było w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 87 309 806.5.

Podano, że dimer jest użyteczny w stymulowaniu tworzenia się szpiku u pacjentów o zredukowanej aktywności wytwarzania szpiku, łącznie z uszkodzeniem szpiku kostnego, agranulocytozą i aplastyczną anemią w tym pacjentów o obniżonej funkcji szpiku kostnego z uwagi na immunosupresyjne leczenie mające na celu zdławienie reakcji tkanek np. w chirurgii przeszczepiania szpiku. Związki te mogą być również stosowane w celu promowania szybszej regeneracji szpiku kostnego po chemoterapii cytostatycznej i po terapii radiacyjnej w chorobach nowotworowych i wirusowych. Mogą one być szczególnie cenne dla pacjentów z poważnymi infekcjami spowodowanymi brakiem reakcji odpornościowej spowodowanej uszkodzeniem szpiku.

Obecność wiązania dwusiarczkowego w dimerze HP-5 sugeruje, że monomer jest ewentualnym metabolitem in vivo. Ponieważ monomer inhibituje tworzenie się krwinek, trwałość dimeru HP-5 jest istotna przy stosowaniu in vivo w celu stymulowania tworzenia się szpiku. Zidentyfikowanie trwałego dimeru wyeliminowałoby ten potencjalny problem.

Niniejszy wynalazek obejmuje peptydy przedstawione dalej wzorem 1, które mają działanie hemoregulacyjne i mogą być stosowane do stymulowania tworzenia się krwinek oraz do leczenia chorób bakteryjnych, wirusowych i grzybiczych. Białka te przydatne są do przywrócenia do stanu normalnego leukocytów u pacjentów o obniżonej liczbie komórek wynikającej z różnych sytuacji klinicznych takich jak wywołane chirurgicznie dławienie tworzenia się szpiku, AIDS, wrodzone zaburzenia rozwojowe rdzenia, przeszczepy szpiku kostnego i organów, ochrona pacjentów przed zmniejszeniem liczby krwinek białych we krwi na skutek infekcji, w leczeniu pacjentów z poważnymi poparzeniami i dla poprawy w przypadku obniżonego tworzenia się szpiku obserwowanego przy niektórych środkach antywirusowych specyficznych wobec cyklu komórkowego. Białka te są również przydatne w leczeniu chorób infekcyjnych wirusowych, grzybiczych i bakteryjnych, zwłaszcza Candida i Herpes zarówno u pacjentów, którym obniżano odporność jak i u normalnych.

Związki te mogą być również stosowane w połączeniu z monomerami opisanymi w amerykańskim opisie patentowym nr 4 499 081 dla zapewnienia zmiany szczytów wysokiej i niskiej aktywności w komórkach szpiku kostnego, wzmacniając tym sposobem naturalny dobowy rytm tworzenia się krwinek. Tym sposobem terapia cytostatyczna może być prowadzona

165 133 w okresach niskiej aktywności szpiku kostnego, redukując tym sposobem ryzyko uszkodzeń szpiku kostnego, podczas gdy regeneracja będzie promowana przez kolejny szczyt aktywności.

Sposób wytwarzania nowych peptydów o wzorze 1, w którym Y1 Y 2 niezależnie od siebie oznaczają grupę CH2 lub atom S, x oznacza liczbę 0, 1,2,3 lub 4, m oznacza liczbę 0, 1 lub 2, n oznacza liczbę 0, 1 lub 2, A oznacza kwas piroglutaminowy, prolinę, glutaminę, tyrozynę lub kwas glutaminowy, B oznacza kwas glutaminowy, tyrozynę lub kwas asparginowy, C oznacza kwas glutaminowy, tyrozynę lub kwas asparginowy, D oznacza lizynę, argininę, tyrozynę, N-metyloargininę, kwas dwuaminopentynokarboksylowy lub jego karbonamid lub pochodną hydroksymetylową, E oznacza kwas glutaminowy, kwas asparginowy, tyrozynę lub wiązanie peptydowe, pod warunkiem, że gdy Yti Y 2 oznacza atom S, to x oznacza liczbę 2,3 lub 4 i m i n oznaczają liczbę 1, albo gdy Y|i Y2 oznaczają grupę CH2, to x oznacza liczbę 0,1 lub 2 i m i n oznaczają liczbę 0, albo gdy Y1 oznacza atom S a Y2 oznacza grupę CH2, to x oznacza 0 a n oznacza liczbę 1, albo gdy Y 2 oznacza atom S a Y1 oznacza grupę CH2, to x oznacza liczbę 0, a m oznacza liczbę 1, lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, według wynalazku polega na tym, że:

(a) zabezpiecza się funkcyjną grupę łańcucha oraz grupę α-aminową aminokwasów oznaczonych symbolem D za pomocą F-moc lub t-Boc;

(b) kowalencyjnie przyłącza się C końcem aminokwas zabezpieczony grupami funkcyjnymi z etapu (a) do żywicy, takiej jak żywica benzhydrylowa, oznaczonej skrótem BHA, żywica metylobenzhydrylowa oznaczonej skrótem MBHA, żywica chlorometylowa oznaczonej skrótem CMR lub żywica fenyloacetamidometylowa oznaczonej skrótem PAM;

(c) usuwa grupę ochronną grupy α-aminowej działaniem słabego kwasu w rozpuszczalniku organicznym, a następnie zobojętnia trzeciorzędową zasadę aminową w rozpuszczalniku organicznym;

(d) związek o wzorze 2, w którym Y1 i/lub Y2 oznaczają S, a x ma wyżej podane znaczenie dla wzoru 1, zabezpiecza się F-moc albo związek o wzorze 2, w którym Y1 i/lub Y2 oznaczają grupę CH2 zamiast S, i x ma wyżej podane znaczenie dla wzoru 1, zabezpiecza się t-Boc;

(e) sprzęga się produkt otrzymany w etapie (d) z produktem reakcji z etapu (c) z użyciem N,N’ - dicykloheksylokarbodiimidu oznaczonego skrótem DCC oraz 1-hydroksybenzotriazolu oznaczonego skrótem HOBT, a następnie przemywa rozpuszczalnikami organicznymi w celu usunięcia nadmiaru reagentów;

(f) usuwa grupę ochronną działaniem słabego kwasu w rozpuszczalniku organicznym;

(g) poddaje zabezpieczeniu aminokwas oznaczony symbolem E, jeżeli jest obecny, albo C, jeżeli E jest nieobecny, postępując w sposób opisany w etapie (a) i poddaje sprzęganiu z produktem reakcji z etapu (f) z użyciem DCC i HOBT, usuwa grupę ochronną działaniem słabego kwasu w rozpuszczalniku organicznym, po czym zobojętnia trzeciorzędową zasadą aminową w rozpuszczalniku organicznym;

(h) poddaje zabezpieczeniu aminokwas oznaczony symbolem B i A w sposób opisany w etapie (a), po czym kolejno sprzęga się z produktem reakcji z etapu (g) z użyciem DCC i HoBt, usuwa grupę ochronną działaniem słabego kwasu w rozpuszczalniku organicznym, a następnie zobojętnia trzeciorzędową aminą w rozpuszczalniku organicznym;

(i) odszczepia peptyd od żywicy zadaje HF lub HBr/kwasem octowym w obecności odpowiedniej substancji usuwającej kation;

(j) ewentualnie peptyd poddaje się estryfikacji, działając alkoholem w obecności katalizatora kwasowego;

(k) oczyszcza peptyd za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej;

(l) ewentualnie wytwarza się farmaceutycznie dopuszczalną sól działając nadmiarem reagenta kwasowego lub alkalicznego w rozpuszczalniku.

W zakres wynalazku wchodzą również farmaceutycznie dopuszczalne kompleksy soli związków otrzymanych sposobem według wynalazku. Należy zwrócić uwagę we wzorze 1, że A obejmuje terminalną grupę aminową reszty aminokwasowej odpowiadającą kwasowi piroglutaminowemu, prolinie, glutaminie, tyrozynie lub kwasowi glutaminowemu. Podobnie, D obejmuje terminalną grupę karboksylową reszty aminokwasowej odpowiadającą lizynie, argi6

165 133 ninie, tyrozynie, N-metyloargininie, kwasowi dwuaminopentynokarboksylowemu lub karboksyamidowi lub jego hydroksymetylowej pochodnej.

W niniejszym opisie stosowane są ogólnie przyjęte skróty i symbole do opisania białek, a mianowicie:

pGlu = kwas piroglutaminowy

Pro = prolina

Gln = glutamina

Glu = kwas glutaminowy

Asp = kwas asparaginowy

Lys = lizyna

Arg = arginina

Cys = cysteina

Tyr = tyrozyna

Sub = kwas dwuaminosuberynowy

Hna = kwas dwuaminopentynokarboksylowy

Pim = kwas dwuaminopimelinowy

Adp = kwas dwuaminoadypinowy

Zgodnie z tradycyjnym oznaczaniem zakończenie aminowe jest po lewej stronie, a zakończenie karboksylowe jest po prawej stronie. Wszystkie chiralne aminokwasy mogą być w absolutnej konfiguracji D lub L.

Końce aminowe mogą być ochraniane przez acylowanie. Przykładami takich grup ochronnych są t-butoksykarbonyl /t-Boc/, CHjCO i Ar- CO / Ar = benzyl/.

Zakończenia C mogą być w postaci grupy karboksylowej jak w przypadku naturalnych aminokwasów lub w postaci karboksyamidu /- C/=0/NH2/ lub hydroksymetylu /-CH2 -OH/.

Korzystne są te związki, w których Y i Y₂ oznaczają CH₂ a x jest równe 1 lub 2 lub w których A oznacza pGlu, B oznacza Glu, C oznacza Asp, D oznacza Lys i E oznacza wiązanie peptydowe a chiralne aminokwasy są w absolutnej konfiguracji L.

Szczególnie korzystne są związki o wzorach 3 i 4.

Związki otrzymywane według wynalazku różnią się od związków znanych z europejskiego zgłoszenia patentowego nr 873 098 065. Związki z wyżej wymienionego opisu patentowego mają wiązanie dwusiarczkowe między dwoma peptydami, tj. Yi i Y2 oznaczają S, zaś m, n ix oznaczają liczbę 0. Zaś związki wytwarzane sposobem według wynalazku, w których Yii Y2 występuje w postaci siarki mają wartość x oznaczającą liczbę 2, 3 lub 4, a m i n oznaczają liczbę 1. Wiązanie węgiel-węgiel nie ulega łatwo rozszczepieniu in vivo, a zatem związki są bardziej trwałe in vivo niż związki opisane w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 873 098 806.5.

W syntezie nowych peptydów wykorzystuje się technologię stałej fazy Merrifielda, J.Am.Chem.Soc., 85, 2149 (1964), można też z powodzeniem stosować znane technologie prowadzenia reakcji w roztworze. Technologie syntezy peptydów ogólnie podane są przez J.M.Stewarta i J.D.Younga w Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, II (1984) lub przez M.Bodansky’ego, Y.A.Klausera i M.P.Ondetti w Peptide Synthesis, John Wiley Sons, Inc., New York, N.Y. (1976) i ich ogólne zasady postępowania mogą być wykorzystane do wytwarzania nowych związków sposobem według wynalazku.

Każdy aminokwas lub peptyd jest odpowiednio zabezpieczony sposobem znanym w chemii peptydów. Na przykład do ochrony grupy aminowej, zwłaszcza w pozycji a korzystne są grupy fluorenylometoksykarbonylowa (F-moc) lub t-butoksykarbonylowa (t- Boc).Odpowiednio podstawiona grupa karbobenzyloksylowa może być stosowana do grupy ε-aminowej lizyny, a grupa benzylowa do grup α i β karboksylowych Asp i Glu odpowiednio. Odpowiednim podstawieniem karbobenzyloksylowej grupy ochronnej jest podstawienie orto i/lub para przez chlor, brom, nitro lub metyl i stosuje się je w celu modyfikowania reaktywności grupy ochronnej. Za wyjątkiem grupy t-Boc, grupy ochronne dobiera się tak, aby nie były usuwane w warunkach łagodnie kwasowych. Te grupy ochronne usuwa się metodami takimi jak katalityczne uwodornianie, sodem w ciekłym amoniaku lub przez tratowanie HF znanym sposobem.

165 133

Jeśli stosuje się metodę fazy stałej, peptyd buduje się kolejno wychodząc od zakończenia karboksylowego w kierunku ku końcowi aminowemu peptydu. Syntezę w fazie stałej zaczyna się od kawalencyjnego końca C amino kwasu z zabezpieczonymi grupami funkcyjnymi przez przyłączenie go do odpowiedniej żywicy, takiej jak żywica benzhydryloaminowa /BHA/, żywica metylobenzhydryloaminowa /MBHA/ lub żywica chlorometylowa /CMR/, jak ogólnie podano w amerykańskim opisie patentowym nr4 244 946, lub żywica fenyloacetamidometylowa /PAM/. Podkład z żywicy BHA lub MBHA stosuje się jeżeli końcem karboksylowym produktu peptydowego jest karbonamid. Żywicę CMR lub Pam na ogół stosuje się, jeżeli końcówką karboksylową produktu peptydowego jest grupa karboksylowa, chociaż można ją również stosować do produkcji karbonamidu lub estru.

Grupę ochronną grupy α-aminowej usuwa się przez zadanie łagodnym kwasem /np. kwasem trójfluorooctowym/. Przy związkach, w których Y1 i/lub Y2 oznacza CH2 zamiast S, di-Boc /kwas dwuaminodwukarboksylowy/ sprzęga się z dwoma aminokwasami na żywicy stosując odpowiedni środek sprzęgający. Wszystkie wolne grupy karboksylowe amiduje się odpowiednią zabezpieczoną pochodną D. Stosuje się odpowiednie znane cykle usuwania grup ochronnych zobojętniania i sprzęgania w celu kolejnego dodawania aminokwasów bez wyodrębniania produktu pośredniego, aż do utworzenia pożądanego peptydu. Skompletowany peptyd można następnie odblokować i/lub odszczepić od nośnika żywicowego w dowolnym porządku.

Zadanie peptydu na podłożu żywicy Hf lub HBr/kwasem octowym odszczepia białko od żywicy i wytwarza końcówkę karboksylową aminokwasu jako kwasu karboksylowego.

Jeśli pożądany jest ester, żywicę CMR lub Pam można zadać odpowiednim alkoholem, takim jak alkohol metylowy, etylowy, propylowy, butylowy lub benzylowy, w obecności trójetyloaminy dla odłączenia białka od żywicy i bezpośredniego wytworzenia estru.

Estry peptydu według wynalazku mogą również być wytwarzane metodami tradycyjnymi z prekursorem kwasu karboksylowego. Zwykle kwas karboksylowy zadaje się alkoholem w obecności katalizatora kwasowego. Alternatywnie, kwas karboksylowy można przekształcić do aktywowanego pośredniego acylu, takiego jak halogenek kwasowy i zadanie alkoholem, korzystnie w obecności zasady.

Korzystnym sposobem odłączenia peptydu od podłoża żywicowego jest zadanie peptydu na podłożu żywicowym bezwodnym HF w obecności odpowiedniej substancji usuwającej kation, takiej jak anizol lub dwumetoksybenzen. Tą metodą jednocześnie usuwa się wszystkie grupy ochronne, za wyjątkiem grupy tioalkilowej ochraniającej siarkę, i odszczepia się białko od żywicy. Hydrolizowane tym sposobem peptydy od żywic CMR i Pam są kwasami karboksylowymi, zaś odszczepiane od żywicy BHA otrzymuje się w postaci karbonamidów.

Modyfikację terminalnej grupy aminowej peptydu przeprowadza się przez alkilowanie lub acylowanie ogólnie znanym sposobem. Modyfikacje te można prowadzić na aminokwasie przed wprowadzeniem do białka lub na białku po zsyntezowaniu go i uwalnia się terminalną grupę aminową, ale przed usunięciem grup ochronnych.

Zwykle acylowanie prowadzi się na wolnej grupie aminowej przy użyciu halogenku acylu, bezwodnika lub aktywowanego estru, odpowiadającego alkilo lub arylo kwasu w obecności aminy trzeciorzędowej. Mono-alkilowanie prowadzi się najdogodniej przez redukujące alkilowanie grupy aminowej z odpowiednim alifatycznym aldehydem lub ketonem w obecności łagodnego środka redukującego, takiego jak cyjanoborowodorek litu lub sodu. Dwualkilowanie można prowadzić przez zadanie grupy aminowej nadmiarem halogenku alkilu w obecności zasady.

Syntezę białek w roztworze można prowadzić sposobami tradycyjnymi stosowanymi do tworzenia wiązań amidowych. Zwykle, chroniony za pomocą t-Boc aminokwas, który ma wolną grupę karboksylową sprzęga się z chronionym aminokwasem, który ma wolną grupę aminową przy użyciu odpowiedniego środka sprzęgającego, takiego jak N,N‘- dwucykloheksylokarbodiimid /DCC/, ewentualnie w obecności katalizatorów takich jak 1-hydroksybenzotriazol /HOBT/ lub dwumetyloaminopirydyna /DMAP/. Odpowiednie są również inne metody, takie jak tworzenie aktywowanych estrów, bezwodników lub halogenków kwasowych, wolnej grupy karboksylowej aminokwasu zabezpieczonego przez t-Boc, i następna reakcja z wolną aminą ochronionego aminokwasu, ewentualnie w obecności zasady. Na przykład, chroniony grupami

165 133

BOC aminokwas lub białko zadaje się w rozpuszczalniku bezwodnym, takim jak chlorek metylenu lub tetrahydrofuran /THF/ w obecności zasady, takiej jak N- metylomorfolina, DMAP /dwumetyloaminopirydyna/ lub trójakiloamina, chloromrówczanem izobutylu tworząc aktywowany bezwodnik, który jest następnie poddany reakcji z wolną aminą innego chronionego aminokwasu lub białka. Utworzone za pomocą tych metod białko może być następnie selektywnie pozbawione grup ochronnych, za pomocą znanych sposobów przy końcówce aminowej lub karboksylowej i sprzężone z innymi białkami lub aminokwasami przy użyciu podobnych technik. Po skompletowaniu peptydu, grupy ochronne można usunąć tak jak opisano powyżej, na przykład przez uwodornienie w obecności palladu lub platyny jako katalizatora, zadanie sodem w ciekłym amoniaku, kwasem fluorowodorowym lub alkaliami.

Jeśli końcowy peptyt, po usunięciu grup ochronnych zawiera grupę zasadową, można sporządzić sól addycyjną z kwasem. Sole addycyjne z kwasami białek sporządza się sposobem standardowym w odpowiednim rozpuszczalniku ze związku macierzystego i nadmiaru kwasu takiego jak chlorowodór, bromowodór, kwas siarkowy fosforowy, octowy, jabłkowy, bursztynowy lub metanosulfonowy. Szczególnie przydatne jest tworzenie octanu. Jeśli końcowe białko zawiera grupę kwasową, można sporządzić sole kationowe .Zwykle związek macierzysty zadaje się nadmiarem reagenta alkalicznego takiego jak wodorotlenek, węglan lub alkoholan zawierający odpowiedni kation. Kationy takie jak Na+, K+, Ca⁺⁺ i NHą+są kationami obecnymi w farmaceutycznie dopuszczalnych solach. Szczególnie korzystne są Na+ i NH4+.

Na ogół w celu wywarcia działania stymulującego, peptydy otrzymane sposobem według wynalazku można podawać ludziom przez iniekcje lub doustnie w dawce 0,1 -10 mg, na przykład 1-5 mg na 70 kg wagi ciała na dzień, przy podawaniu drogą infuzji lub podobnymi technikami, dawka może wynosić 30-300 mg na 70 kg wagi ciała, na przykład około 100 mg w przeciągu 6 dni. Zasadniczo pożądane jest wytwarzanie stężenia peptydu około 10'¹³ do 10'⁵ w płynie zewnątrzkomórkowym pacjenta.

Związek o wzorze 1 i/lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól stosuje się jako składnik aktywny kompozycji farmaceutycznych w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką. Kompozycjom tym można nadać postać na przykład odpowiednią do podawania doustnego, donosowego, pozajelitowego lub doodbytniczego.

W określeniu farmaceutyczne włączone są zastosowania weterynaryjne.

Białka te mogą być kapsułkowane, tabletkowane lub sporządzone w postaci emulsji lub syropów do podawania doustnego. Można dodawać farmaceutycznie dopuszczalne stałe lub ciekłe nośniki w celu wzmocnienia lub stabilizowania kompozycji lub dla ułatwienia sporządzenia kompozycji. Ciekłe nośniki obejmują syrop,olej arachidowy, olej z oliwek, glicerynę, solankę i wodę. Stałe nośniki obejmują skrobię, laktozę, dwuwodzian siarczanu wapnia, białą ziemię, stearynian magnezu lub kwas stearynowy, talk, pektynę, gumę arabską, agar lub żelatynę. Nośnik może również obejmować materiał podtrzymujący uwalnianie,taki jak monostearynian glicerylu lub dwustearynian glicerylu, sam lub z woskiem. Ilość stałego nośnika może być różna, ale korzystnie będzie zawarta w zakresie pomiędzy około 20 mg do około 1g na poszczególną dawkę. Preparaty farmaceutyczne sporządza się zgodnie z tradycyjną techniką farmaceutyczną obejmującą mielenie, mieszanie, granulowanie i prasowanie tam, gdzie jest to konieczne w celu sporządzenia tabletek; lub mielenie, mieszanie i napełnianie dla uzyskania postaci twardej kapsułki żelatynowej. Gdy stosuje się ciekły nośnik, preparat może mieć postać syropu, eliksiru, emulsji lub zawiesiny wodnej lub niewodnej. Takie preparaty ciekłe mogą być podawane bezpośrednio doustnie · lub mogą nimi być napełnione miękkie kapsułki żelatynowe. Można stosować również nośniki specyficzne dla danego organu.

Alternatywnie, kompozycje farmaceutyczne z białek otrzymanych według wynalazku lub ich pochodnych mogą być sporządzone w postaci roztworów lub proszków liofilizowanych do podawania pozajelitowego. Proszek można przekształcić w ciecz przez dodanie odpowiedniego rozcieńczalnika lub innego farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika, przed użyciem. Preparaty ciekłe na ogół stanowią buforowane, izotoniczne roztwory wodne. Przykładami odpowiednich rozcieńczalników są normalne izotoniczne roztwory solanki, standardowa 5% dekstroza w wodzie lub zbuforowany roztwór octanu sodu lub amonu. Takie preparaty są szczególnie odpowiednie do podawania pozajelitowego, ale mogą one być stosowane do podawania doust165 133 nego lub zawarte w inhalatorze o dozowanych dawkach lub rozpylaczu do nadmuchiwania. Może być pożądane dodawanie zaróbek takich jak poliwinylopirolidon, żelatyna, hydroksyceluloza, guma arabska, glikol polietylenowy, mannit, chlorek sodu lub cytrynian sodu.

Do podawania doodbytniczego, sproszkowane białka otrzymane według wynalazku mogą być łączone z wypełniaczami - zarobkami takimi jak masło kakaowe, gliceryna, żelatyna lub glikole polietylenowe i odlewane do form na czopki. Proszki mogą również być łączone z preparatami olejowymi, żelami, kremami lub emulsjami, buforowane lub niebuforowane i podawane poprzez smarowanie i wcieranie przez skórę.

Spraye do nosa można sporządzać podobnie w postaci wodnego roztworu i pakować w pojemniki rozpylaczy zarówno z propelentem aerozolowym lub zaopatrzone w środki do ręcznego sprężania. Można produkować kapsułki zawierające jeden lub kilka składników aktywnych, na przykład, przez mieszanie składników aktywnych z obojętnymi nośnikami, takimi jak laktoza lub sorbit i napełniać tą mieszaniną kapsułki żelatynowe.

Pojedyncze dawki zawierające związki według wynalazku, korzystnie zawierają 0,1-10 mg, na przykład, 1-5 mg białka o wzorze 1 lub jego soli.

Związki wytworzone sposobem według wynalazku mogą być stosowane do stymulowania tworzenia się szpiku, który polega na podawaniu skutecznej ilości powyżej kompozycji pacjentowi, oraz do leczenia infekcji wirusowych, grzybiczych i bakteryjnych u zwierząt normalnych i o obniżonej odporności, polegający na podawaniu zwierzęciu w razie potrzeby skutecznej ilości kompozycji farmaceutycznej zdefiniowanej powyżej.

Działanie biologiczne związków o wzorze 1 wykazano w następujących próbach.

Wzbudzanie działania stymulującego kolonie przez komórki zrębowe.

Ludzkie komórki zrębowe szpiku kostnego linii Ce hodowano do zlania w plastikowych szalkach do hodowli tkankowej w pożywce RPMI-1640 i 5% FBS. Dzień przed próbą pożywkę tę zmieniono na DMEM bez dodawania surowicy. Do tych hodowli, dodano na przeciąg 1 godziny związki, po czym przemyto od hodowli. Pożywkę zastąpiono świeżym DMEM i komórki inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C, 5% CO2. Po 24 godzinach supernatant hodowli komórkowej C6 odebrano, poddano sterylizacji przez filtrację i wymrożono, aż można go było oznaczyć na obecność aktywności stymulującej kolonie krwiotwórcze /CSAJ jak podano poniżej.

Miękka próba agarowa.

Komórki szpiku kostnego otrzymano ze szczurów Lewisa. Nastawiono je na 10⁶ komórek/ml w DMEM bez surowicy. Zastosowano układ agarowy z pojedynczą warstwą wykorzystujący następujące: DMEM wzbogacony substancjami odżywczymi /NaHCO3, pirogronian, aminokwasy, witaminy i bufor HEPES/; 0,3% agar Bacto i 20% surowicę szczurów Lewisa. Do tego dodano rozcieńczenia supernatantu linii komórkowej C6 /10-2,5%/ z powyższego wraz z komórkami szpiku kostnego szczura /końcowe stężenie = 10⁵ komórek/ml/. Płytki agarowe inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 7-8 dni. Kolonie rozmnażające komórki szpiku kostnego /CFU-C/ policzono za pomocą mikroskopu. Liczba policzonych kolonii agarowych była proporcjonalna do ilości CSA obecnego w supernatancie zrębowych komórek szpiku kostnego linii C6.

16^ 133

Tabela 1

Aktywność stymulująca kolonię krwiotwórczą przy użyciu 5% supernatantu

Dawka ng/ml	% w stosunku do próby kontrolnej /pGlu-Glu-Asp/2-Sub-/Lys/2 /przykład 2/
1000	192
100	241
10	207
1	188
0,1	154
0,01	97
0,001	-

Model Herpes Simplex myszy

Siedem dni przed infekcją myszom Balb/c wstrzyknięto dootrzewnowo raz dziennie 0,2 objętość o dawce 10 i 1 ng/kg związku. Myszy kontrolne otrzymały iniekcje 0,2 ml mieszaniny buforu rozcieńczającego, DPBS i 0,5% normalnej surowicy mysiej dezaktywowanej przez ogrzewanie.

Myszy zakażono wirusem Herpes Simplex /szczep MS/ przez wstrzyknięcie 5,0 x 10⁵/pfu zawieszonego w 0,05 ml PBS do każdej poduszeczki tylnej łapy. Kontynuowano podawanie myszom iniekcji związku lub kontrolnej, aż do agonii /zaprzestanie przyjmowania pożywienia i wody/. Zwykle paraliż pojawił się w tylnej łapie w osiem dni po zakażeniu. Paraliż postępował aż do wystąpienia zapalenia mózgu;

Alternatywnie, wirus wszczepiano drogą dopochwową. Tampon z waty zawierający 5,0 x 105/pfu szczepu MS-NAP umieszczano w pochwie myszy.

Stosowano test Wilcoxina do oznaczenia czy stwierdzono znaczny wzrost przeżycia w grupie traktowanej w stosunku do grupy · kontrolnej.

Test prowokacji Candida

Stosowano szczep B311a Candida albicans. Szczep ten przeprowadzono przez mysz a następnie zamrożono do temperatury - 70°C. B311a jest zjadliwy wobec myszy o obniżonej odporności w zakresie 5,0 - 8,0 x 10’ cfu/mysz i dla myszy normalnych w zakresie 1,0 - 2,0 x 10’ cfu/mysz. Próbkę z zamrożonego zapasu Candida hodowano na skosie dekstrozowym Sobourauda a następnie przeniesiono do 50 ml wytrząsanej hodowli bulionu Sabourauda na 18 godzin. Komórki przemyto trzykrotnie, następnie policzono na hemocytometrze i żywotność potwierdzono przez wyeliminowanie barwnika metylowego. Obliczenie żywotności przeprowadzono na inokulum w celu potwierdzenia obliczeń.

Wszystkie myszy /Balb/c/ zainfekowane Candida były zainfekowane i.v. komórkami zawieszonymi w 0,2 ml solanki. Niektórym myszom subletalnie zmniejszono ilość szpiku przez napromienienie 300 radami. W 2 godziny po napromienieniu zwierzętom wstrzyknięto związek CSF jako pozytywną próbę kontrolną lub zaróbkę, dziennie. Siedem dni po napromienieniu i rozpoczęciu leczenia, myszy narażono na Candida albicans przez podanie dożylne. Należy zauważyć, że stanowiło to w przybliżeniu ^D-75 dla normalnych myszy. W innych badaniach myszom nie zmniejszano odporności. W tych badaniach myszy były traktowane począwszy od siódmego dnia po zainfekowaniu w taki sam sposób jak myszy napromienione. W obu modelach myszy traktowano aż do agonii i zmiany w przeżyciu porównano stosując test Wilcoxina.

Poniższe przykłady służą do zilustrowania wynalazku. Przykłady w żaden sposób nie ograniczają zakresu wynalazku, ale mają za zadanie pokazać jak wykorzystać związki otrzymane sposobem według wynalazku.

W przykładach wszystkie temperatury podano w stopniach Celsjusza. Analizę aminokwasu przeprowadzono na Dionex Autoion 1θ0. Analiza na zawartość białka bazowała na analizie

165 133 aminokwasu. Widma masowe FAB oznaczano na spektrometrze masowym VG ZAB przy użyciu bombardowania szybkimi atomami. Stosowano następujące skróty:

Arg = arginina

Asp = kwas asparaginowy t-Boc = trzeciorzędowy butoksykarbonyl

BI} = ^benzyl

Cl-Z = p-chlorokarbobenzyloksykarbonyl /Z=karbobenzyloksykarbonyl/

DCC = dwucykloheksylokarbodwuimid

DEEA = dwuizopropyloetyloamina

EDC = /N-etylo-N’-/3-dwumetyloaminopropylo/karbodiimid

Glu = kwas glutaminowy p-Glu = kwas piroglutaminowy

Tyr = tyrozyna

Hna = kwas dwuaminopentynokarboksylowy

HOBT = hydroksybenzotriazol

Lys = lizyna

NMP = N-metylo-2-pirolidynon

Pro = prolina

OBz = benzyl, w którym atom O jest w miejsce atomu H/gr. benzyloksylowa/

GLn = glutamina

Cys = cysteina

Pim = kwas dwuaminopimelowy o wzorze 5a

Sub = kwas dwuaminosuberynowy o wzorze 5b

Adp = kwas dwuaminoadypinowy o wzorze 5c

N-MeArg = N-metyloarginina

Prc = bis BOC-S,S’-1,3-propanodiylocysteina

Etc = bis BOC-S,S’-1,2-etanodiylocysteina

Buc = bis BOC-S,S’-1,4-butanodiylocysteina

Przykład I. Wytwarzanie /p-Glu-Glu-Asp/2 -Pim-/Lys/₂ o wzorze 6.

Pół grama żywicy t-BOC-Lys/Cl--Z-O CH₂-Pam /0,63 m mola/g/ załadowano do naczynia reakcyjnego syntezatora Beckmana 990 B. W etapie usuwania grup ochronnych grupę t-Boc usunięto przy użyciu 40% kwasu triój^^oroi^i^^i^-wego /TFA/ w chlorku metylenu /C^Ch/. Trójfluorooctan zobojętniono przy użyciu 10% DIEA/CH2Cl2. Dwa mM /780 mg/ kwasu dwu-BOC-2,6-dwuaminopimelowego sprzężono przy użyciu 2 mM DCC i HOBT. Sprzęganie przeprowadzono w mieszaninie 15 ml CH2CI2 i 10 ml DMF w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Do śledzenia sprzęgania stosowano test Kaisera. Jakiekolwiek pozostałe wolne grupy karboksylowe dwukrotnie amidowano przy użyciu 2 mM /1,65g/ H-Lys/Z/-OBz.HCl i 3 mM DCC i 3 mM HOBT w 25 ml CH2CI2/DMF/15/10/.

Po dwóch godzinach sprzęgania żywicę dwukrotnie przemyto 15 ml CH2Cl2, dwukrotnie 15 ml DMF, dwukrotnie 15 ml MeOH/C^Ch /1:1/ i w końcu dwukrotnie 15 ml CH2Cl2. Po usunięciu grup ochronnych t-Boc przy użyciu 40% TFA/CH2Cl₂ zobojętniono za pomocą 10% DIEa/cH₂C1₂, 2 mM /0,646g/ Boc-Asp/Bz1/ i 2 mM DCC i 2 mM HOBT dodano i sprzęgano przez 2 godziny w 25 ml CH2CI2/ DMF/15/10/. Żywicę poddano następnie etapowi przemywania tak jak opisano wcześniej. Etap usuwania grup ochronnych i zobojętniania powtórzono przed sprzęganiem 2 mM/(^,6'^^g/ Boc-Glu /Bz1/, 2 mM DCC i 2 mM HOBT w 25 ml CH2CI2/DMF /15/10/. Po przemyciu, usuwaniu grup ochronnych i zobojętnianiu sprzężono 2 mM /0,258g/ pHlu, 2 mM DCC i 2 mM HOBT w 25 ml CH₂Cl;>/DMF /15/10/ w przeciągu 2 godzin zanim żywicę poddano etapowi przemywania. Kompletność sprzęgania śledzono za pomocą testu Kaisera i w każdym etapie potrzebne było tylko jedno sprzęganie. Po zakończeniu syntezy żywicę suszono i ważono. Wydajność: 1,2g.

Żywicę z peptydem /1,2g/ załadowano do aparatu do rozszczepiania i rozszczepianie prowadzono stosując 10 ml kwasu fluorowodorowego /HF/ i 1 ml anizolu w temperaturze -15°C przez 2 godziny. Po usunięciu HF pod próżnią mieszaninę żywicy i białka kilkakrotnie przemyto

165 133 eterem i białko wyekstrahowano lodowatym kwasem octowym /30 ml/. Większość kwasu usunięto z ekstraktów na wyparce obrotowej i pozostałość rozcieńczono wodą i liofilizowano. Ekstrakt w kwasie octowym miał 810 mg surowego białka.

Surowy peptyd /80 mg/ otrzymany z ekstrakcji kwasem octowym oczyszczano dalej przy użyciu preparatywnej kolumny C-18. Peptyd przepuszczano przez uprzednio zrównoważoną kolumnę /w 0,1% TFA/H2O/. Białko eluowano przy użyciu liniowego gradientu 80% acetonitrylu, 20% wody i 0,1% TFA.

Współeluowały trzy izomery /8,52 min./. Rozdzielono je na kolumnie C-18 stosując gradient 30% /0,1% TFA w CH3CN/, 70% /0,1% TFA w H2O/ do 80% /0,1% TFA w CH3CN/, 20% /0,1% TFA w H2O/ w przeciągu 35 minut przy szybkości przepływu 1,5 ml/min. Wyeluowano następujące frakcje:

frakcja 1 : 18,69 min frakcja 2 : 19,68 min frakcja 3 : 22,95 min

Analiza aminokwasów dała następujące wyniki:

Analiza aminokwasu zaobserwowano

Glu 1,99

Asp 1,0

Lys 1,05 kwas bis aminopimelowy brak danych widmo masowe = 1157,5 /M+H/+

Przykład II.

Synteza w fazie stałej

[p-Glu-Glu(OBz)-Asp(Obz)]2-Sub-[Lys(2-Cl-Z]2-O-żywica o wzorze 7

Do reaktora wprowadza się 20g (8,8 mmola) Boc-Lys(C-Z)-O-żywicy i rozcieńcza ją CH2O2 aż do uzyskania spęcznienia żywicy. W przykładzie tym stosuje się żywicę MBHA.

Grupę Boc zabezpieczającą aminokwas usuwa się przez przemywanie 40 ml 50% TFA w CH2O2 w czasie 5 minut, a następnie 40 ml 50% TFA w czasie 30 minut. Żywicę przemywa się jeszcze trzy (3) krotnie 40 ml CH2Cl2.

Wytworzoną sól TFA zadaje się dwukrotnie (2x) 40 ml 10% DIEA w CH2O2 w czasie 1 minuty, przemywa się 40 ml CH2Cl2 i następnie jeszcze raz 40 ml 10% DIEA w CH2Cl2. Żywicę przemywa się dokładnie (6x40 ml) CH2Cl2. W tym czasie test ninhydrynowy daje wynik pozytywny (podłoże barwy niebieskiej w roztworze barwy niebieskiej).

W celu sprzęgania kwasu di-Boc-suberynowego z NH2-Lys(2-Cl-Z) żywicą, w 5 ml m-pirolu i 20 ml CH2G2 rozpuszcza się 1,78g (4,4 mmola) kwasu di-Boc-suberynowego i 1,20g (8,8 mmola) HOBt. Roztwór chłodzi się do temperatury 0°C za pomocą łaźni lodowej. Do roztworu dodaje się 1,81g (8,8 mmola) DCC i mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze 0°C w czasie 15 minut. Uzyskaną DCU odsącza się i do żywicy dodaje się uprzednio aktywowany ester. Przebieg reakcji śledzi się za pomocą testu Kaisera (ninhydrynowy).

Po upływie 96 godzin dipeptyd z żywicą przemywa się CH2G2 (3x40 ml), m-pirolem (3x40 ml) i CH2G2 (6x40 ml).

Po procesie, test ninhydrynowy daje roztwór o barwie jasnoniebieskiej w porównaniu do negatywnej próby kontrolnej.

Następnie żywicę przemywasię 10% bezwodnikiem octowym w CH2Cl2 w czasie 10 minut i na zakończenie CH2G2 (6x40 ml).

Grupę ochronną usuwa się TFA i etapy zobojętniania powtarza się, otrzymując żywicę dipeptydową. W celu sprzęgania aminokwasu stosuje się 6,25g (19,36 mmola) Boc-Asp(OBz), 2,62g (19,36 mmola) HoBt i 4,0g (19,36 mmola) DCC. Reakcję kończy się po 24 godzinach sprzęgania, co potwierdza negatywny test ninhydrynowy. Tripeptyd z żywicą przemywa się CH2Cl2 (3x40 ml), m-pirolem (3x40 ml) i CHCh (6x40 ml).

Powtarza się opisane powyżej etapy usuwania TFA i zobojętnia DEEA. Przeprowadza się sprzęganie, stosując Boc-Glu(OBz) (6,52g, 19,36 mmola), HOBt [2,62g, 19,36 mmola] i DCC

165 133

[4,0g 19,36 mmola). Po 24 godzinach sprzęgania, reakcja jest zakończona. Tripeptyd z żywicą przemywa się C^Ck (3x40 ml), m-pirolem (3x40 ml) i CH2Ck (6x40 ml).

Powtarza się opisane powyżej etapy usuwania grup ochronnych i zobojętniania DIEA. Do sprzęgania stosuje się pGlu (2,5g, 19,36 mmola), HOB (2,62g, 19,36 mmola) i DCC (4,0g, 19,36 mmola). Po 24 godzinach sprzęgania, reakcja jest zakończona. Pentapeptyd z żywicą przemywa się CH2CI2 (3x40ml)m-pirolem (3x40 ml) i CH₂Ck (6x40 ml). Otrzymany produkt suszy się w eksykatorze próżniowym w czasie 24 godzin.

Do pojemnika reaktora reakcji z HF o dużej pojemności wprowadza się 21g otraymanego produktu, dodaje 12 ml anizolu i pojemnik wprowadza do reaktora reakcji i z HF. Pojemnik chłodzi się do temperatury -78°C za pomocą łaźni izopropanol/suchy lód w czasie 30 minut. Następnie pojemnik napełnia się 60 ml bezwodnego HF i zawartość miesza się w temperaturze O°C z użyciem łaźni lodowej w czasie 1 godziny. Następnie HF usuwa się z reakcji przez powolne otwarcie pojemnika reaktora po połączeniu do przewodu z aspiratorem wody. Żywicę suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem (próżnia) w czasie 1 godziny.

Osuszoną żywicę wprowadza się na lejek ze spiekanego szkła i przemywa 600 ml bezwodnego eteru. Surowy peptyd ekstrahuje się z żywicy za pomocą 1000 ml H2O zawierającej 0,1 % TFA. Wodny przesącz poddaje się liofilizacji (w ciągu nocy). Otrzymuje się 3,3g surowego peptydu. Surowy peptyd oczyszcza się za pomocą chromatografii rzutowej z odwróconą fazą i HPLC.

Uzyskuje się 1,6g czystego produktu.

Widmo masowe = 1170 (M+H/C48H74N12O22.

Przykład III. Synteza analogów zawierających tyrozynę /Tyr-Głu-Aspk-Sub/LysĄ /pGlu-Tyr-Glu-Asp/2-Śub-/Lys/2 /pGlu-Glu-T yr-AspĄ-Sub-ZLysĄ /pGlu-Glu-Asp-Tyr/2-Sub-/Lys/2

2g BOC-Lys/Cl-Z/-O-żywicy/ Peninsula LabsR podstawienie 0,49 mM/g/ umieszczono w wytrząsanym ręcznie naczynu. Po etapie usuwania grup ochronnych i zobojętniania, 2mM /808 mg/ kwasu dwu- BOC-dwuaminosuberynowego spraężono z żywicą stosując 4 mM /824 mg/ dwucykloheksylokarbodiimidu /DCC/ i 4 mM /612 mg/1 - hydroksybenzotriazolu w postaci hydratu /HoBT/ w 25 ml 50% N- metylo-2-pirolidonu /NMP/ i dwuchlorometanu /DCM/. Pozostawiono, aby reakcja zachodziła przez noc a następnie dodano 10 mM /4,06g/. H-Lys /27-OBz.HCl, 10mM/1,29g/dwuizopropyloetyloaminy /DIEA/, 10mM /2,06g/ DCCi 10 mM /1,53g/ HOBT. Po 2 godzinach nieprzereagowane grupy aminowe zostały pokryte za pomocą 10% bezwodnika octowego w NMP/DCM /1:1/. Około jedną trzecią uzyskanej BOC-Sub-Lysżywicy przeniesiono do innego naczynia reakcyjnego. Większa frakcja żywicy została nazwana frakcja I a mniejsza frakcja została nazwana frakcja II. Stosowano standardowe cykle usuwania grup ochronnych, zobojętniania i sprzęgania w celu sprzężenia BOC-Tyr /Br-Z/, BOCAsp/OBz/, BOC- Glu/OBz/ i P-glu z żywicą we frakcji II. Stosowano 5 mM aminokwasu, DCC i HoBT. Sprzęganie prowadzono w 25 ml NMP/DCM /1:1/ i monitorowane było na kompletność za pomocą testu Kaisera. Z żywicą frakcji I sprzężono 5 mM BOC-Asp/OBz/. Jedną czwartą otrzymanej żywicy BOC-Asp-Sub-Lys przeniesiono do innego naczynia /frakcja III/. Pozostałą żywicę nazwano frakcją IV. Stosowano standardowe cykle usuwania grup ochronnych, neutralizacji i sprzęgania w celu sprzężenia BOC-Tyr/Br-Z/, BOC- Glu/OBz/ i pGLU do żywicy we frakcji III. Stosowano 5 mM aminokwasu, DCC i HOBT. Sprzęganie prowadzono w 25 ml NMP/DCM /1:1/ i kompletność spraęgania śledzono za pomocą testu Kaisera. 5 mM BOC-Glu/OBz/ sprzężono z żywicą większej frakcji /frakcja IV/. Jedną trzecią tej żywicy przeniesiono do innego naczynia i 5 mM p-Glu sprzężono z tą frakcją /frakcja VI/ otrzymując w wyniku syntezy p-Glu-Glu-Asp-Sub-Lys-żywicę. 5 mM Tyr-/Br-Z/ spraężono z większą frakcją /frakcja V/ i żywicę dalej rozdzielono na połowę. Jedną połowę żywicy zachowano a drugą połowę żywicy /frakcja VII/ sprzężono z 5 mM p-Glu otrzymując w rezultacie syntezy p-Glu-Tyr- Glu-Asp-Sub-Lys-żywicę. Postępowanie to zilustrowano na załączonym schemacie. W przykładzie tym używano żywicę PAM.

165 133

Z powyższych peptydów na żywicy usunięto grupy ochronne i rozszczepiono je stosując HF/anizol w temperaturze 0°C w przeciągu 1 godziny. Surowe peptydy /około 100 mg/ oczyszczano na preparatywnej kolumnie C-18 /Vydac 2,5x30 cm stosując układ woda/ 0,1% kwas trójfluorooctowy /TFA/ i acetonitry10,01% bufor TFA.

	Analiza aminokwasowa
FAB/MS /M+H/	Asp	Glu	Sub	Lys
/Tyr-Glu-Asp/2- Sub-/Lys/2	1274	2,08/2/	2,8/2/	1,08/1/	2/2/
/pGlu-Tyr-Glu-Asp/2-Sub-/Lys/2	1497	2,1/2/	3,9/4/	1,01/1/	2/2/
/pGlu-Glu-Tyr-Asp/2-Sub-/Lys/2	1497	2,2/2/	3,86/4/	0,98/1/	2Ι2Ι
/pGlu-Glu-Asp-Tyr/2-Sub-/Lys/2	1497	2,2/2/	4,06/4/	1,0/2/	2/2/

Liczby w nawiasach wskazują stosunki teoretyczne. Stosunki doświadczalne podano w odniesieniu do Lys.

Przykład IV. Wytwarzanie /pGlu-Glu-Asp/2-Prc-/Lys/2 a/ Synteza bis BOC-S,S’-1,3-propanodiylocysteiny: 3 ml metanolu nasycono suchym amoniakiem i dodano 0,5g BOC-cysteiny w 0,5 ml metanolu, a następnie dodano 0,35 ml 1,3-dwubromopropanu. 10 minut później dodano dodatkowe 0,5g BOC-cysteiny w 0,5 ml metanolu. Po 4,5 godzinach rozpuszczalnik odparowano i oleistą pozostałość rozpuszczono w wodzie. pH roztworu doprowadzono do 9 i roztwór wyekstrahowano eterem. Warstwę wodną zakwaszono do pH 2 i wyekstrahowano octanem etylu. Warstwę organiczną osuszono i odparowano 1,12g bis-BOC-S,S’-1,3-propanodiylocysteiny. Aminokwas ten stosowano dalej bez oczyszczania, FAB/MS M+H = 469.

/ Wytwarzani e /pGluGluAsp/2Proc/Lys22

BOC-Lys żywicę /0,53g, podstawienie 0,63 mM/g/ załadowano do wytrząsarki ręcznej i po cyklach usuwania grup ochronnych i zobojętniania, bis BOC-S,S’-1,3-propanodiylocysteinę /290 mg, 0,6 mM/ sprzężono stosując 1 mM /206 mg/ DCC i 1 mM /153 mg/ HOBT w 10 ml NMP/DCM / 1:1/. Po dwóch godzinach żywicę przemyto NMP i DCM i dodano 2 mM /765 mg/ H-Lys IZJ-OBz a następnie dodano 1,5 mM /300 mg/ DCC i 1,5 mM /230 mg/ HOBT w 4 ml NMP/DCM /1: 1/. Po 18 godzinach żywicę przemyto stosując 20 NMP i DCM. Normalne cykle usuwania grup ochronnych i zobojętniania oraz sprzęgania powtórzono przy sprzęganiu BOCAsp/OBz/, BOC-Glu/OBz/ i p-Glu. Stosowano 1 mM aminokwasu, DCC i HOBT. Sprzęganie prowadzono w 5 ml NMP/DCM /1:1/. Kompletność sprzęgania śledzono za pomocą testu Kaisera. Z uzyskanego peptydu na żywicy /416 mg/ usunięto grupy ochronne i odszczepiono je przy użyciu 0,5 ml anizolu i 8 ml HF w temperaturze O°C przez 2 godziny. HF odparowano i mieszaninę żywicy i białka przemyto eterem i wyekstrahowano lodowatym kwasem octowym. Po liofilizacji otrzymano 130 mg surowego białka. Surowe białko /61,5 mg/ oczyszczano na kolumnie C 18 Vydac do chromatografii preparatywnej stosując układ buforowy acetonitrylwoda /0,1% TFA/. Otreymano 16,5 mg czystego białka.

FAB/MS: M+H 1249,3 Analiza aminokwasowa Asp 2,0/2/

Glu 4,28/4/

Dpe 1,14

Lys 1,96/2/

W przykładzie tym użyto żywicy PAM.

Przykład V. Synteza /pGlu-Glu-AspĄSub/HnaĄ

Hydroksymetylo żywicę 0,5g /0,45 równoważ./g/ zawieszono w DCM /5 ml/ i poddano reakcji z 126 mg /0,335 mM/ kwasu 2,N,-BOC-6,N-Z- 2,6-dwuamino-4-pentynokarboksylowego /Hna/, 40 mg /0,335/ dwumetyloaminopirydyny /DMAP/, 69 mg /0,335/ DCC i 50 mg /0,335/ HOBT. Acylowaną żywicę przemyto DCM /3x/, NMP/3x/ i DCM /4x/. Nieprzereagowane grupy

161> 133 hydroksylowe pokryto 0,5 ml izocyjanianu fenylo w 20 ml DCM. Żywicę starannie przemyto DCM i NMP. Grupę BOC usunięto przy użyciu 40% TFA/DCM. Po zobojętnieniu 10% DIEA w DCM, sprzężono BOC-Sub 44 mg /0,11 mM/ przy użyciu 50 mg /0,22 mM/ DCC i 33,6 mg /0,11 mM/HOBT. Po 16 godzinach żywicę przemyto przy użyciu NMP i DCM. Normalne cykle usuwania grup ochronnych i zobojętniania oraz sj^rr^^ęgia^i^ powtórzono do sprzężenia z BOC Asp/OBz/, bOc-GIu/OBz/ i pGlu. Stosowano 1 nM4 aminokwasu, DCC i HOBT. Spnz?ganie wykonano w 5 ml NMP/DCM /1:1/. Zakończenie sprzęgania śledzono za pomocą testu Kaisera. Z uzyskanej żywicy z białkiem usunięto grupy ochronne i rozszczepiono stosując 0,6 ml anizolu i 10 ml HF w temperaturze O⁰C przez 2 godziny, HF odparowano a mieszaninę żywicy z białkiem przemyto eterem i wyekstrahowano lodowatym kwasem octowym. Po liofilizacji otrzymano 93,7 mg surowego peptydu. Surowy peptyd 20,6 mg oczyszczono na preparatywnej kolumnie C-18 Vydac stosując układ buforowy acetonitryl-woda /0,1 % TFA/. Otrzymano 7,5 mg czystego białka. Analiza aminokwasu i FAB/MS potwierdziły budowę.

FAB/MS: M+H 1163 Analiza aminokwasowa Asp 2,0/2/

Glu 4,01/4/

Sub 2,01/1/

Hna 1,44/2/.

A-B-C-E-NH CO-D \z

CH (CH₂) ‘ęn₂>n

CH z\

A-B-C-E-NH CO-D

WZ0R 1

165 133

- Y₂-(C H₂l_n-C /

Nn CO

WZÓR 2 pGlu-Glu-Asp-NH CO-Lys (C

Ho)

2'3 pGlu-Glu-Asp-NH CO-Lys

Pim= NH-CH- CO {C^h2)₃

NH-CH-CO

WZÓR 5a

WZÓR 3 pGlu - Glu-Asp - NH^^^pO-Lys ICH₂)₄

A pGlu-Glu-Asp-NH CO-Lys

Sub = NH-CH - CO (CH₂)₄

NH-CH- CO

WZÓR 5b

Adp= NH-CH-CO (CH₂)2

NH-CH-CO

WZÓR 4

WZÓR 5c

165 133

pGlu -Glu-Asp - NH - CH - CO-Lys ięH2)₄ pGlu-Glu-Asp-NH-CH -CO-Lys

WZÓR 7

BOC-Sub- Lys-Zywica

1/3 żywica (Fr.II)

2/3 żywica (Fr.l)

5mM(2.47g)BOC-Tyr(Br-Z)

5mM(1.03)DCC

5mM(726mg)H0Bt

BOC-Ty r -Sub -Lys -Żywica

BOC - Asp- Su b- Lys-Zywica 3/4 żywica (Fr IV) 11/4 żywica (Fr.III)

BOC-Asp -Tyr-Sub-Lys-Zywica

BOC-Glu-Asp - Tyr-Sub-LysZy wica

5mM (1.65g)BOC-Glu(OBz) 5mM (1.03) DCC 5mM (726mg)HOBt

5mM (2.47g)BOC-Tyr(Br-Z) 5mM (1.03) DCC 5mM (726mg)HOBt BOC-T/r-Asp -Sub-Lys-Żywica

5mM(1.65g)BOC-Glu(OBz) 5mM (1.03) DCC 5mM(726mg)HOBt

SCHEMAT (1

165 133 p-Glu-Glu-Asp-Tyr-Sub-Lys-Zywica PKB-11624-27-c/563 mg

BOC- Glu-Tyr-Asp-Sub-Lys-Zywica

5mM(1.65g)B0C-GLu(CBz) 5mM(1.03 )DCC 5mM(726 mgJHOBt

5mM (0.65g)p-Glu

5mM{1.03)DCC

5mM(726mg)HOBt p-Glu-Glu -Tyr-Asp-Sub-Lys- Żywica PKB-11624-27-d/903 mg

BOC-Glu-Asp-Sub- Lys- Żywica

2/3 żywica (Fr.V)

1/3 żywica (Fr.VI)

SCHEMAT (2)

5mM(2.47g)BOC-Tyr(Br-Z) 5mM(1.03 )DCC 5mM (726mg)HOBt

BOC-Tyr-Glu-Asp- Sub-Lys-Żywica

1/2 żywica (Fr.VII)

BOC-Tyr-Glu-Asp-Sub-Lys-Żywica PKB-11624-27- d /301 mg

5mM (0.65g)p- Glu 5mM( 1.03) DCC 5mM(726mg)H0Bt p-Glu-Glu-Asp-Sub-Lys-Zywica

PKB-11624-27-d/903mg

5mM(0.65g)p-Glu 5mM(1.03)DCC 5mM (726mg)HOBt pGlu - Tyr -Glu-Asp- Sub- Lys-Żywica PKB-11624- 27e/860 mg

SCHEMAT (3)

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowych peptydów o wzorze 1, w którym Yi i Y2 niezależnie od siebie oznaczają grupę CH2 lub atom S, x oznacza liczbę 0, 1, 2, 3 lub 4, m oznacza liczbę 0, 1 lub 2, n oznacza liczbę 0,1 lub 2, A oznacza kwas piroglutaminowy, prolinę, glutaminę, tyrozynę lub kwas glutaminowy, B oznacza kwas glutaminowy, tyrozynę lub kwas asparaginowy, C oznacza kwas glutaminowy, tyrozynę lub kwas asparaginowy, D oznacza lizynę, argininę, tyrozynę, N-metyloargininę, kwas dwuaminopentynokarboksylowy lub jego karbonamid lub pochodną hydroksymetylową, E oznacza kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, tyrozynę lub wiązanie peptydowe, pod warunkiem, że gdy Y ii Y2 oznacza atom S, to x oznacza liczbę 2, 3 lub 4 i m i n oznaczają liczbę 1, albo gdy Yii Y 2 oznaczajągiupę CH2, to x oznacza liczbę 0,1 lub 2 i m i n oznaczają liczbę 0, albo gdy, Yi oznacza atom S a Y2 oznacza grupę CH2, to x oznacza 0 a n oznacza liczbę 1, albo gdy Y2 oznacza atom S a Yi oznacza grupę CH2, to x oznacza liczbę 0, a m oznacza liczbę 1, lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, że (a) zabezpiecza się funkcyjną grupę łańcucha bocznego oraz grupę α - aminową aminokwasów oznaczonych symbolem D za pomocą F-moc lub t-Boc;

   (b) kowalencyjnie przyłącza się C końcem aminokwas z zabezpieczonymi grupami funkcyjnymi z etapu (a) do żywicy, takiej jak żywica benzhydrylowa, oznaczonej skrótem BHA, żywica metylobenzhydrylowa oznaczonej skrótem MBHA, żywica chlorometylowa oznaczonej skrótem cMr lub żywica fenyloacetamidometylowa oznaczonej skrótem PaM;

   (c) usuwa grupę ochronną grupy a- aminowej działaniem słabego kwasu w rozpuszczalniku organicznym, a następnie zobojętnia trzeciorzędową zasadę aminową w rozpuszczalniku organicznym;

   (d) związek o wzorze 2, w którym Y1 i/lub Y2 oznaczają S, a x ma wyżej podane znaczenie dla wzoru 1, zabezpiecza się F-moc albo związek o wzorze 2, w którym Y1 i/lub Y2 oznaczają grupę CH2 zamiast S, i x ma wyżej podane znaczenie dla wzoru 1, zabezpiecza się t-Boc;

   (e) sprzęga się produkt otrzymany w etapie (d) z produktem reakcji z etapu (c) z użyciem N,N’ -dicykloheksj^^ok^irbodiimidu oznaczonego skrótem DCC oraz 1-hydroksybenzotriazolu oznaczonego skrótem HOBT, a następnie przemywa rozpuszczalnikami organicznymi w celu usunięcia nadmiaru reagentów;

   (f) usuwa grupę ochronną działaniem słabego kwasu w rozpuszczalniku organicznym;

   (g) poddaje zabezpieczeniu aminokwas oznaczony symbolem E, jeżeli jest obecny, albo C, jeżeli E jest nieobecny, postępując w sposób opisany w etapie (a) i poddaje sprzęganiu z produktem reakcji z etapu (f) z użyciem DCC i HOBT, usuwa grupę ochronną działaniem słabego kwasu w rozpuszczalniku organicznym, po czym zobojętnia trzeciorzędową zasadą aminową w rozpuszczalniku organicznym;

   (h) poddaje zabezpieczeniu aminokwas oznaczony symbolem B i A w sposób opisany w etapie (a), po czym kolejno sprzęga się z produktem reakcji z etapu (g) z użyciem DCC i HoBt, usuwa grupę ochronną działaniem słabego kwasu w rozpuszczalniku organicznym, a następnie zobojętnia trzeciorzędową aminą w rozpuszczalniku organicznym;

   (i) odszczepia peptyd od żywicy zadaje HF lub HBr/kwasem octowym w obecności odpowiedniej substancji usuwającej kation;

   (j) ewentualnie peptyd poddaje się estryfikacji, działając alkoholem w obecności katalizatora kwasowego;

   (k) oczyszcza peptyd za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej;

   (l) ewentualnie wytwarza się farmaceutycznie dopuszczalną sól działając nadmiarem reagenta kwasowego lub alkalicznego w rozpuszczalniku.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku (p-Glu-Glu-Asp)2 -Pim-(Lys)2, w którym p-Glu oznacza kwas piroglutaminowy, Glu oznacza

   165 133 kwas glutaminowy, Asp oznacza kwas asparginowy, Pim oznacza kwas dwuaminopimelowy, a Lys oznacza lizynę, poddaje się sprzęganiu związek t-BOC-Lys(Cl- Z)-0 CH2 -PAM, w którym PAM oznacza żywicę fenyloacetamidometylową; Cl-Z oznacza p- chlorokarbobenzyloksykarbonyl, z kwasem di-BOC-2,6- dwuaminopimelowym, reakcji z H-Liz/Z/OBz.HCl, sprzęganiu z Boc- Asp(Bz), a następnie sprzęganiu z Boc-Glu (Bz) i spreęganiu z p- Glu.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku [pGlu-Glu Asp ]2 -Sub-[Lys]2 ,w którym Sub oznacza kwas dwuaminosube^nowy, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie, NH2 -Lys/2-Cl-Z/ -żywicę poddaje się sprzęganiu z kwasem di-Boc-suberynowym, a następnie odpowiednio Boc-Asp(OBz), Boc-Glu(OBz) i p-Glu, przy czym żywica ma znaczenie podane w zastrz. 1.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związków (Tyr-Glu-Asp/2-Sub/Lys/2, /p-Glu-Tyr-Glu- Asp/2 -Sub-/Lys/2, /p-Glu-Glu-Tyr-AspĄ -Sub/Lys/2 i /p-Glu- Glu-Asp-Tyr/2 -Sub-/Lys/2, w których Tyr oznacza tyrozynę, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie, poddaje się sprzęganiu BOC-Lys/Cl-ZZ-O-żywicę z kwasem dwu-BOC- dwuaminosuberynowym, a następnie o odpowiednio z H-Lys/Z/- OBz.HCl, BOC-Tyr/Br-Z/, Boc-Asp/OBz/, BOC-Glu/OBz,BOC-Glu/OBz i p-Glu, przy czym żywica ma znaczenie podane w zastrz. 1.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku /p-Glu-Glu-Asp/2 -Prc-ZLysĄ, w którym Prc oznacza bis BOC-S,S’ -1,3-propylideno-cysteinę, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie, poddaje się sprzęganiu BOC- Lys żywicę z bis BOC-S,S’-1,3-propyliden-ocysteiną, po czym z H-Lys/Z/-OBz, przy czym Z oznacza karbobenzyloksykarbonyl, Bz oznacza benzyl, a następnie kolejno z BOC-Asp/OBz/, BOC-Glu/OBz/ i p-Glu, przy czym żywica ma znaczenie podane w zastrz. 1.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku /p-Glu-Glu-Asp/2 Sub/Hna/2, w którym Hna oznacza kwas dwuaminopentynokarboksylowy, a pozostałe symbole mają wyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji hydroksymetylo- żywicę z kwasem 2,N-BOC-6, N-Z-2,6-dwuamino-4-pentynokarboksylowym i acylowaną żywicę, po usunięciu grupy BOC, poddaje się sprzęganiu z BOC-Sub i kolejno z BOC-Asp/OBz/, BOCGlu/OBz i p-Glu, przy czym żywica ma znaczenie podane w zastrz. 1.