HU206889B

HU206889B - Process for producing hemoregulating peptides and pharmaceutical compositions containing them as active components

Info

Publication number: HU206889B
Application number: HU904201A
Authority: HU
Inventors: Pradip Kumar Bhatnagar; William Francis Huffman; James Edward Talmadge
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1989-07-14
Filing date: 1990-07-13
Publication date: 1993-01-28
Also published as: PL166004B1; AU5901490A; EP0408371B1; PH30055A; IL95012A; ZA905505B; EP0408371A1; CN1054773A; CA2020838A1; PT94702A; MA21902A1; CA2020838C; PT94702B; ZW11290A1; IE902547A1; ES2064642T3; ATE112289T1; MY106352A; DE69012901D1; NO177713C

Description

A találmány tárgya eljárás hemoregulátor hatással rendelkező új peptidek, és hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására. A fenti gyógyászati készítmények a vérképzés (hematopoiesis) stimulálására és virális, fungális vagy bakteriális fertőzések kezelésére használhatók.

A csontvelőképződés (myelopoiesis) szabályozásában számos szabályozó messenger és módosító, mint például a telepképződést stimuláló faktor, interferonok és különféle típusú peptidek részt vesznek [Metcalf, Cell, 43, 5 (1985); Baserga R., Foa P., Metcalf D., Polli E. E. (szerkesztők), Biological Regulation of Cell Proliferation (1986); Nicola és munkatársai, J. Cell. Physiol. 128, 501 (1986); Zoumbos és munkatársai, Proyr. Hemat. /, 341 és 14, 201 (1986); Wernerés munkatársai, Experientia, 42, 521 (1986)]. 20 évvel ezelőtt Rytomaa és Kivieniemi [Cell Tissue Kínét. 1, 329-340 (1986); Rytomaa és munkatársai, Conlrol of Cellular Growth in Aduit Organisms 106-138. oldal (1967)] leírták, hogy az érett fehérvérsejtek (leukociták) extraktumai (leukocitás chalon) képesek specifikusan gátolni patkány csontveló'sejtek proliferációját (burjánzását) szövettenyészetekben. Később kimutatták, hogy az a faktor, amelynek móltömege 3000 D-nál kisebb, képes indukálni az átvihető patkány leukémia regresszióját, valamint a leukémiasejtek szaporodását lassítja emberi szervezetben . Paukovits és mások is extraháltak patkány csontvelősejtekből egy hasonló faktort, és kimutatták, hogy az gátolja a csontvelősejtek triciált timidin felvételét [Paukovits W. R., Cell Tissue Kinet. 4, 539-547 (1971); Naturforsch. 37, 1297 (1982)]. Boll és munkatársai 1979-ben kimutatták a patkány leukocita extraktumok gátló hatását emberi csontvelősejtekre, szövettenyészetben, és számos más kutató is bizonyította, hogy ez a nyers leukocita extraktum gátolta a rágcsáló csontvelősejtekből származó g-CFUC és/vagy gm-CFUC fejlődését in vitro.

A fenti biológiailag hatásos anyagot leukocita chalon-nak nevezték el, amely - elméletük szerint - a sejtburjánzásnak olyan endogén inhibitora, amely ugyanabban a szövetben fejti ki hatását, amely azt kiválasztja. A nyers extraktumokból nyert anyag nem mutatott faj-specificitást, viszont erősen szövet-specifikus volt. Azt is kimutatták, hogy nemtoxikus, és reverzibilis aktivitással rendelkezik.

Az (A) képletű szintetikus hemoregulátor pentapeptidről 1982-ben ismertették, hogy a csontvelőképző sejtekre mind in vivő szelektív gátlóhatást fejt ki, és a fő hatást láthatólag a csontvelőképző törzs-sejtekre (CFU-gm) fejti ki [Paukovits és munkatársai, Z. Naturforsch. 37, 1297 (1982) és 4 499081 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Feltételezik, hogy ez a peptid egy természetben előforduló, leukocitaképződést gátló faktor analógja, amelyet kis mennyiségekben csontvelő extraktumokban találtak. A peptid a vérképzés, és különösen a fehérvérsejtképzés gátlása révén hajlamos a nyugalomban lévő sejtek osztódási szakaszba lépését megakadályozni, és ezáltal a citotoxikus daganatellenes szerekkel szemben érzékennyé válást meggátolni. A citotoxikus szerekkel végzett gyógykezelésben játszott védő szerepe mellett a peptid a csontvelőképző rendszer rákos sejtjei (azaz csontvelő-leukémia) burjánzásának meggátlására is használható.

Learum és munkatársai 1987-ben leírták, hogy a fenti peptid oxidációs terméke egy dimer (HP—5), amely diszulfid-hidakkal jön létre. A dimemek a monomerrel ellentétes a hatása, mivel erősen stimulálja mind a humán, mind egér CFU-gm sejtek szaporodását in vitro, és in vivő serkentőleg szabályozza az egér csontvelőképző sejteket. A fenti vegyületet a 873098065 sz. európai szabadalmi leírásban ismertették.

A dímerről leírták, hogy csökkent csontvelőképződésben szenvedő betegek csontvelőképzésének stimulálására használható, így például csontvelő-károsodás, fehérvérsejthiány és apláziás anémia esetén, olyan betegeknél is, akiknél a csökkent csontvelő-funkció immunszupresszív kezelés következménye, amelyet a szöveti reakciók elfojtására például a csontvelőátültetéseknél alkalmaznak. A vegyületet a csontvelő gyors regenerálódásának elősegítésére is lehet alkalmazni, tumoros vagy vírusos betegségek citosztatikus vagy besugárzásos kezelését követően. Különösen értékesek lehetnek olyan esetekben, amikor a betegek a csontvelőelégtelenséget követő immunválasz hiánya miatt komoly fertőzéseket kapnak.

A diszulfid-kötés jelenléte a HP-5 dimerben arra enged következtetni, hogy a monomer egy lehetséges metabolit in vivő. Mivel a monomer gátolja a vérképződést, a HP-5 dimer stabilitása kritikus, ha in vivő a vérképződés stimulálására használják. Stabilis dimer felfedezése megoldaná ezt a potenciális problémát.

A találmány szerinti eljárás olyan peptidek - továbbiakban (I) általános képletű peptidek - előállítására vonatkozik, amelyek hemoregulátor aktivitással rendelkeznek, és vérképződés serkentésére, valamint bakteriális, virális vagy fungális fertőzések kezelésére használhatók. A fenti peptidek különféle klinikai állapotok, például sebészetileg indukált csontvelőszupresszió, AIDS, veleszületett csontvelőrendellenesség, csontvelő- és szerv-átültetések miatt alacsonyabb sejtszámú betegben a leukociták számának helyreállítására; a betegek fertőzésekből eredő leukopénia elleni védelmére; súlyos égési sérültek kezelésére; és bizonyos sejtciklus-specifikus antivirális szer adagolásánál észlelt csontvelőszupresszió gyógyítására használhatók. A találmány szerinti eljárással előállított peptidek virális, fungális és bakteriális fertőzések, különösen Candida és Herpes okozta fertőzések kezelésére is használhatók, mind normális, mind csökkent immunrendszeri működésű betegeknél.

A fenti vegyületeket a 4499 081 sz. amerikai szabadalmi leírásban ismertetett monomerrel kombinálva is használhatjuk, ezzel a csontvelősejtekben váltakozva magas és alacsony aktivitásokat biztosítunk, így fokozzuk a vérképződés természetes napi ritmusát. Ily módon a citosztatikus terápiát az alacsony csontvelő-aktivitási periódusban alkalmazhatjuk, ezáltal csökkenthetjük a csontvelő-károsodás rizikóját; míg a regenerálódást a következő aktivitás-csúcs segíti elő.

HU 206 889 B

A találmány szerinti eljárás hatóanyagként (I) általános képletű vegyületet és gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására is vonatkozik.

A találmány értelmében állatok (beleértve az embert is) csontvelőképző rendszerét úgy serkenthetjük, hogy a kezelendő alanynak hatásos mennyiségben egy találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületet adunk.

A találmány értelmében normális vagy csökkent immunműködésű állatok (beleértve az embert is) virális, fungális és bakteriális fertőzéseit úgy kezelhetjük, hogy a kezelendő alanynak hatásos mennyiségben adagoljuk a találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületet.

A találmány szerinti eljárás az (I) általános képletű peptidek - a képletben

Y, és Y₂ jelentése egymástól függetlenül -CH₂- vagy

-S-, x értéke 0,1,2,3 vagy 4, m értéke 0,1 vagy 2, n értéke 0,1 vagy 2,

A jelentése piroglutaminsav-, prolin-, glutamin-, tirozin- vagy glutamin-maradék,

B jelentése glutaminsav-, tirozin- vagy aszparaginsav-maradék,

C jelentése glutaminsav-, tirozin- vagy aszparaginsav-maradék,

D jelentése lizin-, arginin-, Ν-metil-arginin-, diaminohexinsav-maradék, vagy ezek hidroxi-metil-származéka,

E jelentése glutaminsav, aszparaginsav-, tirozin-maradék, vagy peptid-kötés, azzal a megkötéssel, hogy ha Y, és Y₂ jelentése -S-, akkor x értéke 2,3 vagy 4, és m és n értéke 1; vagy ha Y, és Y₂ jelentése -CH₂-, akkor x értéke 0,1 vagy 2 és m és n értéke 0; vagy ha Y | jelentése -S- és Y₂ jelentése -CH₂-> akkor x értéke 0 és n értéke 1; vagy ha Y₂ jelentése -S- és Y ₍jelentése -CH₂-, akkor x értéke 0 és m értéke 1 és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására vonatkozik.

A találmány szerinti eljárással előállíthatok a gyógyászatilag elfogadható komplex sók is. Megjegyezzük, hogy az (I) általános képletben A hordozza a piroglutaminsavból, prolinból, glutaminból, tirozinból vagy glutaminsavból származó aminosav-maradék terminális aminocsoportját. Hasonlóképpen, D tartalmazza a lizinből, argininből, tirozinból, N-metil-argininből, diamino-hexinsavból vagy azok karboxamido- vagy hidroxi-metil-származékából származó maradék terminális karboxilcsoportját.

A leírásban a peptidkémiában szokásos rövidítéseket és jelöléseket használjuk, az alábbiaknak megfelelően:

pGlu piroglutaminsav

Pro prolin

Gin glutamin

Glu	glutaminsav
Asp	aszparaginsav
Lys	lizin
Arg	arginin
Cys	cisztein
Tyr	tirozin
Sub	diamino-szuberinsav
Hna	diamino-hex insav
Pim	diamino-pimelinsav
Adp	diamino-adipinsav

A szokásos jelöléssel összhangban, az amino-terminális a peptidlánc bal, a karboxil-terminális a jobb végén van feltüntetve. Mindegyik optikailag aktív aminosav D vagy L abszolút konfigurációban lehet.

Az amino-terminálist acilezéssel védhetjük. Védőcsoportra példaként említjük a terc-butoxi-karbonilcsoportot (t-BOC), acetilcsoportot és Ar-CO-csoportot (Ar=benzil).

A C-terminális karboxilesöpört lehet (mint a természetes aminosavakban), vagy hidroxi-metil-csoport (CH₂OH).

Előnyösek azok az (I) általános képletű vegyületek, amelyek képletében Y, és Y₂ jelentése -CH₂- és x értéke 1 vagy 2, vagy amelyekben A jelentése pGlu, B jelentése Glu, C jelentése Asp, D jelentése Lys és E jelentése peptid-kötés, és az optikailag aktív aminosavak L abszolút konfigurációban vannak.

Különösen előnyösek az (1) és (2) képletű vegyületek.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek annyiban különböznek az ismert vegyöletektől, hogy a dimer nem egy diszulfid-híddal, hanem egy szén-szénkötést tartalmazó híddal van összekapcsolva. A szénszén-kötés in vivő nem hasítható könnyen, ezért a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek in vivő stabilabbak, mint a 873098065 számú európai szabadalmi leírásból ismert vegyületek.

Az (I) általános képletű vegyületeket szilárd fázisú eljárással [Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1964)] vagy oldatban állíthatjuk elő, ismert módon. A peptidek szintézisét a szakirodalomban ismertetett módszerekkel végezhetjük [például J. M. Stewart és J. D. Young, „Solid Phase Peptide Synthesis”, Pierce Chemical Company, Rockford, II. (1984); és M. Bodansky, Y. A. Klauser és M. A. Ondetti, „Peptide Synthesis”, John Wiley & Sons, Inc., New York, N, Y. (1976)].

Az aminosavakat vagy peptideket szokásos módon megfelelő védőcsoportokkal védjük. Az aminocsoport védésére, különösen az α-helyzetben például előnyösen fluorenil-metoxi-karbonil-csoportot (Fmoc) vagy terc-butoxi-karbonil-csoportot (t-BOC) használunk. A lizin ε-amino-csoportjának védésére megfelelően szubsztituált benzil-oxi-karbonil-csoportot, az Asp és Glu β-, illetve γ-karboxil-csoportjának védésére benzilcsoportot használhatunk. A benzil-oxi-karbonil-védőcsoport szubsztituense például klór-, brómatom, nitrovagy metilcsoport lehet orto- és/vagy para-helyzetben, és ezzel a védőcsoport reaktivitását módosíthatjuk. A t-BOC-csoport kivételével célszerűen olyan védócso3

HU 206 889 B portokat használunk, amelyek enyhe savas kezeléssel nem távolíthatók el. Ezeket a védőcsoportokat egyéb módszerekkel, például katalitikus hidrogénezéssel, cseppfolyós ammóniában nátriummal kezelve, vagy hidrogén-fluoridos kezeléssel távolítjuk el, ismert módon.

Abban az esetben, ha szilárd fázisú peptidszintézist alkalmazunk, a peptidet a karboxi-terminálistól kiindulva fokozatosan építjük fel az amino-terminálisig. A szilárd fázisú peptidszintézis első lépéseként egy védett aminosav C-terminálisát kovalensen kötjük egy megfelelő' gyantához, például benzhidril-amin-gyantához (BHA), metil-benzhidril-amin-gyantához (MBHA) vagy klór-metil-gyantához (CMR), ahogy azt a 4244946 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban általánosan ismertetik, vagy fenil-acetamido-metil-gyantához (PAM). Ha a kívánt pepiid Cterminálisa karboxamidocsoport, hordozógyantaként BHA-t vagy MBHA-t használunk. Ha a kívánt termék C-terminálisa karboxilcsoport, általában CMR vagy PAM gyantát használunk, de ezeket karboxamid vagy észter csoportot tartalmazó C-tenninális esetén is használhatjuk.

Az ct-amino-csoport védőcsoportját enyhe savas kezeléssel - például trifluor-ecetsavval - távolíthatjuk el. Olyan (I) általános képletű vegyületek esetén, amelyek képletében Yj és/vagy Y₂ jelentése -CH₂- kénatom helyett, diBOC-diamino-dikarbonsavat kapcsolunk megfelelő kapcsolószerrel a gyantán lévő aminosavak közül kettőhöz. A szabad karboxilcsoportokat a D megfelelően védett származékával amidáljuk. A további aminosavak egymást követő hozzákapcsolására a köztitennék izolálása nélkül, megfelelő, ismert védőcsoport-eltávolítás semlegesítés - kapcsolás ciklusokat használunk, a kívánt (I) általános képletű pepiid kialakításáig. A kész peptidet ezután kívánt sorrendben védőcsoport-mentesítjük és/vagy lehasítjuk a gyantáról.

A gyantához kötött peptidet hidrogén-fluoriddal vagy hidrogén-bromid/ecetsavval kezelve a peptidet a gyantáról lehasítjuk, és olyan peptidet kapunk, amelynek C-terminálisa karboxilcsoport tonnában van.

Ha észterszármazékot kívánunk előállítani, a CMR vagy PAM gyantát megfelelő alkohollal, például metil-, propil-, butil- vagy benzil-alkohollal kezelhetjük, trietil-amin jelenlétében, ezzel a peptidet a gyantáról lehasítjuk és közvetlenül észter formában kapjuk a C-terminális aminosavat.

A találmány szerinti eljárással előállított peptidek észtereit karbonsav-prekurzorokból szokásos módon is előállíthatjuk. Általában úgy járunk el, hogy a karbonsavat alkohollal kezeljük, savkatalizátor jelenlétében. Ügy is eljárhatunk, hogy a karbonsavat reakcióképes karbonsavszármazékká - például savhalogeniddé alakítjuk, és ezt a közti terméket kezeljük alkohollal, bázis jelenlétében.

A peptidet előnyösen úgy hasítjuk le a hordozógyantáról, hogy vízmentes hidrogén-fluoriddal kezeljük, megfelelő kation-befogó, például anizol vagy dimetoxi-benzol jelenlétében. Ezzel a módszerrel egyidejűleg az összes védőcsoportot is eltávolítjuk, kivéve a kénatomot védő tioalkilcsoportot, és a peptidet is lehasítjuk a hordozógyantáról. A CMR vagy PAM gyantáról ily módon hidrolizált peptidek C-terminálisként karboxilcsoportot, míg a BHA gyantáról lehasított peptidek C-terminálisként karboxamidocsoportot tartalmaznak.

A peptidek terminális aminocsoportját ismert módon végzett alkilezéssel vagy acilezéssel módosíthatjuk. A fenti módosításokat végrehajthatjuk az aminosavon, a pepiidbe való beépítést megelőzően, vagy a kész pepiiden, miután azt előállítottuk és a terminális aminocsoportot szabaddá tettük, de a védőcsoportokat még nem távolítottuk el.

A szabad aminocsoport acilezését rendszerint a megfelelő alkil- vagy aril-sav savhalogenidjével, savanhidridjével vagy aktív észterével végezzük, tercier amin jelenlétében. A monoalkil-származékokat legelőnyösebben úgy állítjuk elő, hogy az aminocsoportot megfelelő alifás aldehiddel vagy ketonnal reduktívan alkilezzük, enyhe redukálószer - például lítium- vagy nátrium-ciano-bórhidrid - jelenlétében. A dialkilezést úgy végezhetjük, hogy az aminocsoportot egy bázis jelenlétében feleslegben lévő alkil-halogeniddel kezeljük.

Az oldatban végzett peptidszintézist amidkötések kialakítására szokásosan használt eljárással végezzük. Rendszerint úgy járunk el, hogy a szabad karboxilcsoportot tartalmazó, aminocsoportján t-BOC-csoporttal védett aminosavat megfelelő kapcsolószerrel egy szabad aminocsoportot tartalmazó védett aminosavval kapcsoljuk. Kapcsolószerként például N,N’-diciklohexil-karbodiimidet (DCC) használunk, adott esetben katalizátor - például 1-hidroxi-benzotriazol (HOBT) vagy dimetil-amino-piridin (DMAP) jelenlétében. Úgy is eljárhatunk, hogy egy t-BOC-védett aminosav szabad karboxilcsoportját aktív észterré, anhidriddé vagy savhalogeniddé alakítjuk, majd egy védett aminosav szabad aminocsoporljával reagáltatjuk, adott esetben bázis jelenlétében. így például egy védett BOC-aminosavat vagy peptidet vízmentes oldószerben, például metilén-kloridban vagy tetrahidrofuránban (THF), bázis - például N-metil-morfoiin, DAMP vagy trialkilamin - jelenlétében izobutil-klór-formiáttal kezelve aktív anhidriddé alakítunk, amelyet azután egy másik védett aminosav vagy peptid szabad aminocsoportjávál reagáltatunk. A fenti eljárásokkal előállított peptidek amino- vagy karboxil-védőcsoportját szelektíven eltávolíthatjuk, szokásos eljárásokat alkalmazva, és hasonló módszerekkel más peptidekhez vagy aminosavakhoz kapcsoljuk. A kívánt peptid felépítése után a védőcsoportokat a fent ismertetett eljárásokkal - például palládium- vagy platinakatalizátor jelenlétében hidrogénezéssel, cseppfolyós ammóniában nátriumos kezeléssel, hidrogén-fluoridos vagy lúgos kezeléssel - eltávolítjuk.

Ha a kívánt peptid a védőcsoport eltávolítása után bázikus csoportot tartalmaz, savaddíciós sóvá alakíthatjuk. A peptidek savaddíciós sóit szokásos módon állíthatjuk elő, az alapvegyület megfelelő oldószerrel készült oldatát megfelelő sav - például hidrogén-klorid, hidrogén-bromid, kénsav, foszforsav, ecetsav, ma4

HU 206 889 B leinsav, borostyánkősav vagy metánszulfonsav - feleslegével kezelve. Különösen előnyösek az ecetsavas sók. Ha a kész peptid savas csoportokat tartalmaz, kationos sókká alakíthatjuk. Az alapvegyületet rendszerint lúgos reaktáns - például a megfelelő kation hidroxidja, karbonátja vagy alkoxidja - feleslegével kezeljük. A gyógyászatilag elfogadható sók kationként például nátriumot, káliumot, kalciumot vagy ammóniumot tartalmazhatnak. Különösen előnyösek a nátriumés ammóniumsók.

Serkentő hatás elérésére a találmány szerinti eljárással előállított peptideket általában injekció formájában vagy orálisan adhatjuk humán pácienseknek, 0, ΙΙΟ mg, például 1-5 mg/70 kg testtömeg/nap dózisban. Ha infúzióval vagy hasonló módon adagoljuk, a dózis 30-300 mg/70 kg testtömeg/nap, például 100 mg lehet, 6 napon keresztül. Elvileg a pepiidből mintegy 10¹³10~⁵ mól/1 koncentrációt kell biztosítani a beteg extracelluláris folyadékaiban.

A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítmények hatóanyagként egy vagy több (I) általános képletű vegyületet, vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazzák gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve. A gyógyászati készítmény formája például orális, nazális, parenterális vagy rektális adagolásra alkalmas forma lehet.

A gyógyászati kifejezés az állatgyógyászati alkalmazást is magában foglalja, nemcsak a humán gyógyászati alkalmazást.

Orális adagolás céljára a találmány szerinti eljárással előállított peptideket kapszulává, tablettává, emulzióvá vagy sziruppá alakíthatjuk. Gyógyászatilag elfogadható szilárd vagy cseppfolyós hordozóanyagok hozzáadásával fokozhatjuk a készítmény stabilitását, vagy megkönnyíthetjük a készítmény előállítását. Cseppfolyós hordozóanyagként például szirupot, földimogyoróolajat, olívaolajat, glicerint, sóoldatot vagy vizet használhatunk. A szilárd hordozóanyag például keményítő, laktóz, kalcium-szulfát-dihidrát, terra alba, magnézium-sztearát vagy sztearinsav, talkum, pektin, akácmézga, agar vagy zselatin lehet. A hordozóanyag tartalmazhat egy nyújtott hatást biztosító anyagot, például gliceril-monosztearátot vagy gliceril-disztearátot adott esetben viasszal együtt. A szilárd hordozóanyag mennyisége változó, előnyösen mintegy 20 mg-1 g lehet dózisegységenként. A gyógyászati készítményeket ismert módszerekkel állíthatjuk elő, például őrléssel, keveréssel, granulálással, és kívánt esetben tablettává préseléssel; vagy őrléssel, keveréssel és kapszulába töltéssel, kemény zselatin kapszulák előállítására. Ha cseppfolyós hordozóanyagot használunk, a készítmény formája szirup, elixír, emulzió, vagy vizes vagy nemvizes szuszpenzió lehet. A fenti cseppfolyós készítményeket vagy közvetlenül orálisan adagoljuk, vagy lágy zselatin kapszulába töltjük. Szerv-specifikus hordozórendszereket is használhatunk.

A találmány szerinti eljárással előállított peptidekből vagy származékaikból parenterális alkalmazásra oldatokat vagy Iiofilizált porokat is előállíthatunk. A porokat megfelelő hígítószer vagy egyéb gyógyászatilag elfogadható hordozóanyag hozzáadásával rekonstituálhatjuk felhasználás előtt. A cseppfolyós készítmények általában pufferolt, izotóniás vizes oldatok. Hígítószerként például fiziológiás izotóniás sóoldatot, standard 5%-os vizes dextrózoldatot vagy pufferolt nátrium- vagy ammónium-acetát-oldatot használhatunk. A fenti készítmények különösen parenterális alkalmazásra előnyösek, de orálisan is adagolhatok, vagy belélegeztetésre is alkalmasak, ha mért dózisokat kibocsátó inhalátorral vagy aeroszol-készülékkel adagoljuk. Bizonyos esetekben egyéb segédanyagokat, így poli( vinil-pirrolidon)-t, zselatint, hidroxi-cellulózt, akácmézgát, polietilénglikolt, mannitot, nátrium-kloridot vagy nátrium-citrátot is tartalmazhatnak a készítmények.

Rektális alkalmazásra a találmány szerinti eljárással előállított, porított peptideket megfelelő hordozóanyaggal, például kakaóvajjal, glicerinnel, zselatinnal vagy polietilénglikolokkal elegyítjük, és kúppá formáljuk. A porított hatóanyagot olajos készítménnyé, géllé, krémmé vagy emulzióvá is formálhatjuk, pufferral, vagy anélkül, és transzdermálisan adagolhatjuk a kezelendő betegnek.

A nazális spray-készítményeket a vizes oldatokhoz hasonlóan formálhatjuk, és aeroszol hajtóanyaggal működő tartókba vagy kézi kompresszióval működtetett eszközbe tölthetjük. Az egy vagy több hatóanyagot tartalmazó kapszulákat úgy állíthatjuk elő, hogy a hatóanyagokat inért hordozóanyagokkal, például laktózzal vagy szorbitollal összekeverjük, és a keveréket zselatin kapszulákba töltjük.

A dózisegység-készítmények előnyösen 0,1—10 mg, például 1-5 mg (I) általános képletű pepiidet vagy annak sóját tartalmazzák.

A találmány értelmében a csontvelőképződést úgy stimulálhatjuk, hogy a kezelendő alanynak a találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítmények hatásos mennyiségét adagoljuk.

A találmány értelmében normális vagy csökkent immunműködésű állatok virális, gombás és bakteriális fertőzéseit is kezelhetjük oly módon, hogy a kezelendő alanynak hatásos mennyiségben adunk egy fent ismertetett, találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítményt.

Az (1) általános képletű vegyületek biológiai aktivitását az alábbi vizsgálatokkal bizonyítjuk.

1. Telepképződést stimuláló aktivitás indukálása vázsejtekkel

A C6 humán csontvelő stroma-sejtvonalból műanyag szövettenyésztő csészékben 5% FBS-t tartalmazó RPMI-1640 tápközegben összefüggő tenyészeteket állítunk elő. A vizsgálatot megelőző napon a fenti tápközeget szérum nélküli DMEM-tápközegre cseréljük. Az így kapott tenyészetekhez hozzáadjuk a vizsgálandó vegyületeket, majd 1 óra múlva kimossuk a tenyészetből. A tápközeget friss DMEM tápközegre cseréljük, és a sejteket 5% CO₂-ot tartalmazó atmoszférában 37 °C-on 24 órán keresztül inkubáljuk. Ezután a C6sejttenyészet felülúszóját összegyűjtjük, sterilre szűr5

HU 206 889 Β jíik és a vérképző sejtek szaporodását stimuláló aktivitás (CSA) meghatározásáig lefagyasztjuk.

CSA meghatározása lágy agar módszerrel A csontvelősejteket Lewís-patkányokból preparáljuk. A sejtkoncentrációt szérum nélküli DMEM tápközeggel 10⁶ sejt/ml-re állítjuk. Az alábbi komponensekből egyrétegű agar-rendszert készítünk: NaHCO3-tal, piruváttal, aminosavakkal, vitaminokkal és HEPESpufferrel kiegészített DMEM; 0,3% Bacto agar, és 20% Lewis-patkány szérum. Ehhez adjuk a fenti C⁶ sejtvonal felülúszók különböző hígításait (10-2,5%) a patkány csontvelősejtekkel együtt (végkoncentráció = 10⁵sejt/ml). Az agarlemezeket 5% CO2 mellett 37 °C-on 7-8 napon keresztül inkubáljuk. Az osztódó csontvelősejt-telepeket (CFU-C) mikroszkóp segítségével megszámláljuk. Az agar-lemezen lévő telepek száma arányos a C⁶ csontvelő stroma-sejtek felülúszójában jelen lévő CSA mennyiségével.

/. táblázat

Vérképző telepképződést stimuláló aktivitás 5% felülúszó jelenlétében

Dózis (ng/ml)	Kontrol 1 %-a
(pGlu-Gki-Asp)₂-Sub-(Lys)₂(2. példa)
1000	192
100	241
10	207
1	188
0,1	154
0,01	97
0,001	-

2. Herpes Simplex elleni, hatás egéren

A fertőzés előtt 7 nappal Balb/c egereknek intraperitoneálisan, naponta egy alkalommal 0,2 ml dózistérfogatban 10, illetve 1 ng/kg vizsgálandó vegyületet injektálunk. A kontroll állatoknak 0,2 ml térfogatban a hígításra használt puffért (0,5% hővel inaktivált normál egér szérumot tartalmazó DPBS) injektáljuk.

Az egereket Herpes Simplex vírussal (MS törzs) fertőzzük oly módon, hogy mindkét hátsó mancsukba 0,05 ml PBS-ben szuszpendálva 5,0x10⁵ plakk-képző egység vírust injektálunk. Az egereknek folyamatosan továbbadjuk a vizsgálandó vegyületet, illetve a kontroli-injekciókat addig, amíg haldokolni nem kezdenek (képtelenek ennivalót és vizet felvenni). A hátsó lábak bénulása rendszerint az injektálást követő 8. napon jelentkezik. A paralízis továbbfejlődik, végül enkefalitis jelentkezik.

A vírussal való fertőzést a vaginán keresztül is végrehajthatjuk, az egér vaginájába 5,0xl0⁵ plakk-képző egység MS-NAP vírustörzset tartalmazó vattacsomót illesztve.

A kontroll csoporthoz képest szignifikáns növekedést a túlélésben Wilcoxin-teszttel mutatjuk ki.

3. Candida albicans fertőzés elleni hatás egéren

A vizsgálatra Candida albicans B311a törzset használunk. A törzset egérben passzáljuk, majd -70 °C-on lefagyasztjuk. A B31 la törzs immunszupresszált egérben 5,0-8,0xl0⁴ telepképzó' egység/egér dózisban, egészséges egérben l,0-2,0xl0-⁵ telepképző egység/egér dózisban fertőzőképes. A lefagyasztott Candidából vett mintát Sabouraud-dextróz ferde agaron tenyésztjük, majd 50 ml cseppfolyós Sabouraud tápközegben 18 órán keresztül rázatjuk. A sejteket háromszor mossuk, majd hemocitométerrel sejtszámlálást végzünk, és az élő sejtszámot metilénkék festék kizárással határozzuk meg.

A Balb/c egereket iv. fertőzzük a Candida albicansszal, 0,2 ml sóoldatban szuszpendált sejtekkel. Néhány egérben 300 rád besugárzással nem-letális csontvelődepressziót idézünk elő. A besugárzást követő 2 órától kezdve az állatoknak pozitív kontrollként CSF vegyületet vagy hordozóanyagot injektálunk, naponta. A besugárzás és kezelés elkezdése után 7 nappal az egereket intravénásán adott Candida albicans-szal provokáljuk. A C. albicans dózisa a normál LD₇₅ dózisnak felel meg.

Más vizsgálatsorozatban az állatokat nem immunszupresszáljuk. Ekkor az egereket a fertőzést követő 7. napon kezdjük kezelni, ugyanazzal a módszerrel, mint a besugárzott egereket.

Mindkét kísérletsorozatban az állatokat addig tartjuk megfigyelés alatt, míg haldokolni nem kezdenek, és az élettartamok változását Wilcoxin-teszttel értékeljük ki.

A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni, a korlátozás szándéka nélkül.

A példákban minden hőmérsékleti értéket °C-ban adunk meg. Az aminosav-analizist Dionex Autoion 100-zal végezzük. A peptid-tartalom meghatározását az aminsav-analízis alapján végezzük. A FAB tömegspektrumokat VG ZAB tömegspektrométerrel hatátozzuk meg, gyors atomokkal való bombázást alkalmazva. A példákban használt rövidítések jelentése:

Arg	arginin
Asp	aszparaginsav
Lan	S[CH₂CH(NH₂)COOH]₂ (lantionin)
t-BOC	terc-butoxi-karbonil
Bz	benzil
Cl-Z	p-klór-benzil-oxi-karbonil (Z = benzil-oxikarbonil)
DCC	diciklohexil-karbodiiimid
D1EA	diizopropil-etil-amin
EDC	N-etil-N’-[3-(dimetil-amino)-propil]-karbo- diimid
GIu	glutaminsav
pGlu	piroglutaminsav
Tyr	tirozin
Hna	diamino-hexinsav
HOBT	hidroxi-benzotriazol
Lys	lizin
NMP	N-metil-2-pirroIidinon
Pro	prolin
Gin	glutamin
Cys	cisztein
Pim	(3) képlet (diám ino-pimel insav)

HU 206 889 B

Sub (4) képlet (diamino-szuberinsav)

Adp (5) képlet

N-MeArg N-metil-arginin

Prc bisz Boc-S,S’-l,3-propándiil-cisztein

Etc bisz Boc-S,S’-l,2-etándiil-cisztein

Buc bisz Boc-S,S’-l,4-butándiil-cisztein

1. példa (pGlu-Glu-Asp)2-Pim-(Lys)21(1) képletű vegyület] előállítása

0,5 g (0,63 mmól/g) t-BOC-Lys(Cl-Z)-OCH₂-PAM gyantát helyezünk Beckman 990 B szintetizátor reakcióedényébe. A védőcsoport eltávolítási lépésben a tBOC csoportot 40% trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmazó metilén-kloridot használva távolítjuk el. A trifluoracetát-sót 10% DIEA/metilén-kloriddal semlegesítjük. 2 mmól (780 mg) diBOC-2,6-diamino-pimelinsavat mmól DCC-t és HOBT-t használva kapcsolunk. A kapcsolást 15 ml metilén-klorid és 10 ml DMF elegyében, szobahőmérsékleten, 2 órán keresztül végezzük. A kapcsolás kimutatására Kaiser-tesztet használunk. A megmaradt szabad karboxilcsoportokat 3 mmól (1,65 g) H-Lys(Z)-OBzxHCl-t, 3 mmól DCC-t és mmól HOBT-t használva, 25 ml 15:10 arányú metilén-klorid-DMF elegyben kétszer amidáljuk.

Két órán keresztüli kapcsolás után a gyantát kétszer 15 ml metilén-kloriddal, kétszer 15 ml DMF-dal, kétszer 15 ml metanol/metilén-kloriddal (1:1), és végül kétszer 15 ml metilén-kloriddal mossuk. A t-BOC-csoport 40% TFA/metilén-kloriddal végzett eltávolítása és 10% DIEA/metilén-kloriddal végzett semlegesítés után 2 mmól (0,646 g) BOC-Asp(Bzl)-t, 2 mmól DCC-t és 2 mmól HOBT-t adunk hozzá, és 25 ml metilén-klorid/DMF-ban (15:10) 2 órán keresztül kapcsoljuk. A gyantát ezután a fent ismertetett műveletsorozattal mossuk. Megismételjük a védőcsoport eltávolítására és a semlegesítésre szolgáló lépéseket, majd hozzáadunk 2 mmól (0,674 g) BOC-Glu(Bzl)t, 2 mmól DCC-t és 2 mmól HOBT-t, és 25 ml metilén-klorid/DMF-ban (15 :10) elvégezzük a kapcsolást. Mosás, védőcsoport eltávolítás és semlegesítési lépés után hozzáadunk 2 mmól (0,258 g) pGlu-t, 2 mmól DCC-t és 2 mmól HOBT-t, és 25 ml metilén-klorid/DMF-ban (15:10) 2 órán keresztül elvégezzük a kapcsolást, majd a gyantát mossuk. A kapcsolási reakció lejátszódását Kaiserteszttel követjük, minden egyes kapcsolást csak egyszer kellett elvégezni. A szintézis befejezése után a gyantát szárítjuk és lemérjük. A hozam 1,2 g.

Az 1,2 g peptid-gyantát hasító készülékbe helyezzük, és 10 ml hidrogén-fluoriddal (HF) és 1 ml anizollal -15 °C-on 2 órán keresztül elvégezzük a hasítást. A HF-ot vákuumban eltávolítjuk és a peptid és gyanta elegyét dietil-éterrel alaposan mossuk, majd a pepiidet 30 ml jégecettel extraháljuk. A sav fő tömegét rotációs vákuumbepárló készülék segítségével eltávolítjuk és a maradékot vízzel hígítjuk, majd liofilizáljuk. Az ecetsavas extraktumból 810 mg nyers pepiidet kapunk.

Az ecetsavas extrahálással kapott nyers pepiidből 80 mg-ot preparatív C-18 oszlopon továbbtisztítunk. A pepiidet 0,1% TFA/H₂O-zel előzetesen ekvilibrált oszlopon folyatjuk keresztül. A pepiidet 80% acetonitril, 20% víz és 0,1% TFA lineáris gradiensével eluáljuk.

Három izomer eluálódik együtt (8,52 perc). Ezeket C-18 oszlopon választjuk szét, 35 perc alatt,

1,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett, 30%, 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitril + 70%, 0,1% TEA-t tartalmazó víz -) 80%, 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitril + 20%, 0,1% TFA-t tartalmazó víz gradienssel. A következő frakciók eluálódnak:

1. frakció: 18,69 perc

2. frakció: 19,68 perc

3. frakció: 22,95 perc.

Az aminosav-analízis eredményei az alábbiak:

Aminosav neve	Mért érték
Glu	1,99
Asp	1,0
Lys	1,05
diamino-pimelinsav	nem vizsgáltuk

Tömegspektrum: 1157,5 (M+H)⁺

2. példa (pGlu-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys)₂ [(2) képletű vegyület] előállítása

A) BOC-Sub-Lys(z-Z)-COOBz előállítása

A biszBOC-(l,l)-diamino-szuberinsavat (Sub) R. Nutt eljárása szerint szintetizáljuk [J. Org. Chem. 45, 3078 (1980)].

mmól (808 mg) BOC-Sub-at, 4 mmól (1,56 g) Lys(e-Z)-COOBzxHCl-t és 4 mmól (0,613 g) HOBT-t 10 ml metilén-kloridban oldunk, és az oldatot jég/aceton fürdő segítségével -15 °C-ra lehűtjük. Hozzáadunk 4 mmól (0,692 ml) diizopropil-etil-amint (DIEA), majd 0,T12 g (4 mmól) vízoldható karbodiimidet (EDC). Az elegyet 1 órán keresztül keverjük, majd hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. 3 óra elteltével a metilén-kloridot elpárologtatjuk és a maradékot 200 ml etil-acetátban oldjuk. Az oldatot először 1 n sósavoldattal, majd 1 n nátrium-hidroxid-oldattal, telített nátrium-klorid-oldattal és vízzel mossuk. A mosásokat háromszor megismételjük, minden egyes mosást mintegy 100 ml oldattal végzünk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk és bepároljuk.

1,86 g (79%) BOC-Sub-Lys(e-Z)-COOBz-t kapunk, amelyet további tisztítás nélkül felhasználunk.

B) BOC-Asp($-OBz)-Sub-Lys(z-Z)-COOBz előállítása

1,8 g BOC-Sub-Lys(e-Z)-COÓBz-t 4 n dioxános hidrogén-klorid-oldatban oldunk, majd az oldatot 0,5 óra múlva szárazra pároljuk. A maradékot dietil-éterrel mossuk és egy éjszakán keresztül szárítjuk. A hidrogén-klorid-sót 30 ml metilén-kloridban oldjuk és hozzáadunk 1,292 g BOC-Asp(P-OBz)-t Az oldatot-15 °C-ra hűtjük, és hozzáadunk 0,613 g HOBT-t, 0,554 ml DIEA-t és 0,772 g EDC-t. Az elegyet 2 órán keresztül keverjük, majd hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. A reakcióelegyet 18 óra múlva (egy éjszaka) feldolgozzuk. A meti7

HU 206 889 B lén-kloridot elpárologtatjuk és a maradékot 200 ml etilacetátban oldjuk. Az oldatot 1 n sósavoldattal, 1 n nátrium-hidroxid-oldattal, telített nátrium-klorid-oldattal és vízzel mossuk, a mosásokat háromszor megismételjük, minden egyes alkalommal 100 ml mosófolyadékot használunk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk és bepároljuk.

1,9 g (73%) BOC-Asp(p-OBz)-Sub-Lys(e-Z)COOBz-t kapunk. A pepiidet további tisztítás nélkül felhasználjuk.

C) BOC-Glu(y-OBz)-Asp($-OBz)-Sub-Lys(e.-Z)COOBz előállítása

1,8 g BOC-Asp(3-OBz)-Sub-Lys(e-Z)-COOBz-t 15 ml 4 n dioxános hidrogén-klorid-oldatban oldunk. 15 perc múlva az oldószert eltávolítjuk, a maradékot dietil-éterrel mossuk és szárítjuk. A hidrogén-klorid-sót 15 ml N-metil-pirrolidonban (NMP) oldjuk. Az oldatot -15 °C-ra hűtjük, és hozzáadunk 4 mmól (1,338 g) BOCGlu(yOBz)-t, 0,204 ml DIEA-t, 0,772 g EDC-t és 0,612 g HOBT-t. Az elegyet egy éjszakán keresztül keverjük, miközben fokozatosan szobahőmérsékletre melegedik. A reakcióelegyet 1 liter lehűtött, 10% nátrium-karbonátot tartalmazó telített nátrium-klorid-oldatba öntjük. A csapadékot szűrjük, vízzel mossuk és vákuumban szárítjuk.

1,3 g BOC-Glu(y-OBz)-Asp(p-OBz)-Sub-Lys(eZ)-COOBz-t kapunk, a hozam 68%. A terméket további tisztítás nélkül felhasználjuk.

D) pGlu-Glu(y-OBz)-Asp($-OBz)-Sub-Lys(e-Z)COOBz előállítása

1,2 g BOC-Glu(y-OBz)-Asp(p-OBz)-Sub-Lys(eZ)-COOBz-t 15 ml 4 n dioxános sósavoldatban oldunk. 15 perc múlva az oldószert eltávolítjuk és a maradékot dietil-éterrel mossuk és szárítjuk. A hidrogénklorid-sót 15 ml NMP-ben oldjuk. Az oldatot -15 °Cra hűtjük, és hozzáadunk 4 mmól (0,516 g) piroglutamint (pGlu), 0,106 ml DIEA-t, 0,772 g EDC-t és 0,612 g HOBT-t. Az elegyet egy éjszakán keresztül keverjük, és közben hagyjuk fokozatosan szobahőmérsékletre melegedni. A reakcióelegyet 1 liter lehűtött, 10% nátrium-karbonátot tartalmazó telített nátriumklorid-oldathoz adjuk. A csapadékot szűrjük, vízzel mossuk és vákuumban szárítjuk.

0,830 g (69%) pGlu-Glu(y-OBz)-Asp(P-OBz)-SubLys-(e-Z)-COOBz-t kapunk, amelyet további tisztítás nélkül felhasználunk.

E) pGlu-Glu-Asp-Sub-Lys-COOH előállítása

0,200 g pGIu-Glu(y-OBz)-Asp(P-OBz)-Sub-Lys(eZ)-COOBz-ből a védőcsoportokat 5 ml HF és 1,5 ml anizol elegyével 0 °C-on végzett kezeléssel lehasítjuk. A hidrogén-fluoridot eltávolítjuk és a pepiidet dietiléter és 0,1 n ecetsav között megosztjuk. A vizes fázist mossuk és liofilizáljuk.

0,089 g pGlu-Glu-Asp-Sub-Lys-COOH-t kapunk. A fenti pepiid 20 mg-ját C18 prep Vyadec oszlopon tisztítjuk, izokratikus feltételek között (10% acetonitril, 90% víz és 0,1% trifluor-ecetsav, átfolyási sebesség:

5,6 ml/perc).

FAB-tömegspektrum (M+H) =1171

Aminosav-analízis: Asp(l,0), Glu(2,19), Lys(l,01), Sub(n.v.)

HPLC: retenciós idő C18 Vyadec 0,23x25 mm-es analitikai oszlopon: 7,01 perc (átfolyási sebesség: 1,5 ml, gradiens: 0%—->80% B, A=0,l% TFA-t tartalmazó H₂O, B = 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitril).

3. példa (pGlu-Glu-Asp)₂-Lan-(Lys)₂ előállítása

0,5 g (0,63 mmól/g) t-BOC-Lys(Cl-Z)-CH₂-PAM-ot helyezünk Beckman 990 szintetizátor reakcióedényébe. A t-BOC-csoportot 40% TFA-t tartalmazó metilén-kloriddal eltávolítjuk. A trifluor-ecetsavas sót 10% DIEA/metilén-kloriddal semlegesítjük. 2 mmól biszBOC-lantionint (Lan) kapcsolunk 4 mmól DCC és HOBT segítségével 15 ml metilén-klorid és 10 ml DMF elegyében, szobahőmérsékleten. A kapcsolási reakció lejátszódását Kaiser-teszttel követjük nyomon. A szabadon maradt karboxilcsoportokat 3 mmól H-Lys-OBzxHCldal amidáljuk, 3 mmól DCC és HOBT jelenlétében, 25 ml metilén-klorid/DMF (15:10) elegyben. A gyantát metilén-kloriddal, 30% metanolt tartalmazó metilén-kloriddal és tiszta metilén-kloriddal alaposan mossuk (25 mlx3), majd a védőcsoport eltávolításából, semlegesítésből és kapcsolásból álló ciklust a többi aminosavval (Asp, Glu és pGlu) megismételjük. Az egyes kapcsolásokban az aminosavat, DCC-t és HOBT-t 4 mmól mennyiségben használjuk. Az egyes kapcsolási reakciók lejátszódását Kaiser-teszttel követjük. A szintézis befejeztével a gyantát szárítjuk és lemérjük.

A peptid-gyantát hasító készülékbe helyezzük, és ml hidrogén-fluoriddal (HF) hasítjuk, 1 ml anizolban, -15 °C-on 2 órán keresztül. A HF eltávolítása után a gyantát dietil-éterrel alaposan kimossuk, és 30 ml jégecettel extraháljuk. Az ecetsav fő tömegét rotációs vákuumbepárló berendezéssel eltávolítjuk és a maradékot vízzel hígítjuk és liofilizáljuk. A cím szerinti pepiidet HPLC eljárással végzett tisztítás után kapjuk.

4. példa (Pro-Asp-Asp)₂-Sub-(Lys)₂ előállítása

0,5 g (0,63 mmól/g) t-BOC-Lys(Cl-Z)-CH₂-PAMot Beckman 990 szintetizátor reakcióedényébe helyezünk. A t-BOC-csoportot 40% TFA-t tartalmazó metilén-kloriddal eltávolítjuk. A trifluor-ecetsavas sót 10% DIEA/metilén-kloriddal semlegesítjük. 2 mmól biszBOC-diamino-szuberinsavat kapcsolunk, 4 mmól DCC és HOBT jelenlétében, 15 ml metilén-klorid és 10 ml DMF elegyében, szobahőmérsékleten. A kapcsolási reakció lejátszódását Kaiser-teszttel követjük. A szabadon maradt karboxilcsoportokat 3 mmól H-LysOBzxHCl-dal amidáljuk, 3 mmól DCC és HOBT jelenlétében, 25 ml metilén-klorid/DMF (15:10) elegyben. A gyantát metilén-kloriddal, 30% metanolt tartalmazó metilén-kloriddal és metilén-kloriddal alaposan átmossuk (25 mlx3), majd a védőcsoport eltávolításából, semlegesítésből és kapcsolásból álló ciklust a többi aminosavval (Asp, Asp és Pro) megismételjük. Az egyes kapcsolási reakciókban 4 mmól aminosavat, DCC-t és HOBT-t használunk. A kapcsolási reakciók lejátszódását Kaiser-teszttel követjük. A szintézis befejeztével a gyantát szárítjuk és lemérjük.

HU 206 889 B

A peptid-gyantát hasító készülékbe helyezzük, és 10 ml hidrogén-fluoriddal (HF) hasítjuk, 1 ml anizolban, -15 °C-on 2 órán keresztül. A HF eltávolítása után a gyantát dietil-éterrel alaposan kimossuk, és 30 ml jégecettel extraháljuk. Az ecetsav fő tömegét rotációs 5 vákuumbepárló berendezéssel eltávolítjuk és a maradékot vízzel hígítjuk és liofilizáljuk. A cím szerinti pepiidet HPLC eljárással végzett tisztítás után kapjuk.

5. példa (Pro-Asp-Asp)₂-Pim-(Lys)₂ eltávolítása

0,5 g (0,63 mmól/g) t-BOC-Lys(Cl-Z)-CH₂-PAMot Beckman 990 szintetizátor reakcióedényébe helyezünk. A t-BOC-csoportot 40% TFA-t tartalmazó metilén-kloriddal eltávolítjuk. A trifluor-ecetsavas sót 10% 15 DIEA/metilén-kloriddal semlegesítjük. 2 mmól biszBOC-pimelinsavval kapcsolunk, 4 mmól DCC és HOBT jelenlétében, 15 ml metilén-klorid és 10 ml DMF elegyében, szobahőmérsékleten. A kapcsolási reakció lejátszódását Kaiser-teszttel követjük. A szaba- 20 dón maradt karboxilcsoportokat 3 mmól H-LysOBzxHCl-dal amidáljuk, 3 mmól DCC és HOBT jelenlétében, 25 ml metilén-klorid/DMF (15:10) elegyben. A gyantát metilén-kloriddal, 30% metanolt tartalmazó metilén-kloriddal és metilén-kloriddal alaposan 25 átmossuk (25 mlx3), majd a védőcsoport eltávolításából, semlegesítésből és kapcsolásból álló ciklust a többi aminosavval (Asp, Asp és Pro) megismételjük. Az egyes kapcsolási reakciókban 4 mmól aminosavat, DCC-t és HOBT-t haszálunk. A kapcsolási reakciók 30 lejátszódását Kaiser-teszttel követjük. A szintézis befejeztével a gyantát szárítjuk és lemérjük.

A peptid-gyantát hasító készülékbe helyezzük, és 10 ml hidrogén-fluoriddal (HF) hasítjuk, 1 ml anizolban, -15 °C-on 2 órán keresztül. A HF eltávolítása után 35 a gyantát dietil-éterrel alaposan kimossuk, és 30 ml jégecettel extraháljuk. Az ecetsav fő tömegét rotációs vákuumbepárló berendezéssel eltávolítjuk és a maradékot vízzel hígítjuk és liofilizáljuk. A cím szerinti pepiidet HPLC eljárással végzett tisztítás után kapjuk.

6. példa (Tyr-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys)₂, (pGlu-Tyr-Glu-Asp)₂Sub-(Lys)₂, (pGíu-Glu-Tyr-Asp)₂-Sub-(Lys)₂ és (pGlu-Glu-Asp-Tyr)₂-Sub-(Lys)₂ tirozin-tartalmú analógok előállítása g (0,49 mmól/g) BOC-Lys(Cl-Z)-O-gyantát (Peninsula Labs^R) helyezünk kézi rázóedénybe. A védőcsoport eltávolítás! és semlegesítési lépés után a gyantához mmól (808 mg) diBOC-diamino-szuberinsavat kap- 50

	FAB/MS	Aminosav-analízis*
(M+H)	Asp	Űlu	Sub	Lys
(Try-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys)₂	1274	2,08 (2)	2,4(2)	1,08 (1)	2(2)
(pGlu-Tyr-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys)₂	1497	2,1 (2)	3,9(4)	1,01(1)	2(2)
(pGlu-GIu-Tyr-Asp)₂-Sub-(Lys)₂	1497	2,2 (2)	3,86(4)	0,98(1)	2(2)
(pGlu-Glu-Asp-Tyr)₂-Sub-(Lys)₂	1497	2,2 (2)	4,06 (4)	LO(l)	2(2)

* a zárójelbe lelt számok az elméleti arányokat jelentik, a kísérleti arányokat a Lys-hez viszonyítottuk csolunk, 4 mmól (824 mg) DCC-t és 4 mmól (612 mg) 1 hidroxi-benzotriazol-hidrátot (HOBT) használva, 25 ml 50% N-metil-2-pirrolidinont (NMP) tartalmazó metilénkloridban (DCM). A reakciót egy éjszakán keresztül játszatjuk le, majd az elegyhez 10 mmól (4,06 g) H-Lys(Z)OBz-HCl-t, 10 mmól (1,29 g) diizopropil-etil-amint (DIEA), 10 mmól (2,06 g) DCC-t és 10 mmól (1,53 g) HOBT-t adunk. Két óra múlva a reagálatlan aminocsoportokat 10% ecetsavanhidridet tartalmazó NMP/DCM 10 (1:1) eleggyel lefedjük.

A kapott BOC-Sub-Lys-gyanta mintegy 1/3-át másik reakcióedénybe visszük át. A gyanta fő tömegét I. frakciónak, kisebb részét II. frakciónak nevezzük.

A II. frakcióban a gyantához a szokásos védőcsoport-eltávolítási, semlegesítési és kapcsolási lépésből álló ciklusokkal BOG-Tyr(Br-Z)-t, BOC-Asp(OBz)-t, BOC-Glu(OBz)-t és pGlu-t kapcsolunk. 5 mmól aminosavat, DCC-t és HOBT-t használunk. A kapcsolást 25 ml NMP/DCM (1:1) elegyben végezzük, és a reakció lejátszódását Kaiser-teszttel követjük.

Az I. frakcióban a gyantához 5 mmól BOCAsp(OBz)-t kapcsolunk. A kapott BOC-Asp-Sub-Lysgyanta 1/4-ét másik reakcióedénybe visszük át (III. frakció). A maradékot IV. frakciónak nevezzük.

A III. frakcióban a gyantához a szokásos védőcsoport-eltávolítási, semlegesítési és kapcsolási lépésből álló ciklusokkal BOC-Tyr(Br-Z)-t, BOC-Glu(OBz)-t és pGlu-t kapcsolunk. 5 mmól aminosavat, DCC-t és HOBT-t használunk. A kapcsolást 25 ml NMP/DCM (1:1) elegyben végezzük, és a reakció lejátszódását Kaiser-teszttel követjük.

A IV. frakcióban a gyantához 5 mmól BOCGlu(OBz)-t kapcsolunk. A kapott gyanta 1/3-át másik reakcióedénybe visszük át (VI frakció), és 5 mmól pGlu-t kapcsolunk hozzá, így pGlu-Glu-Asp-Sub-Lysgyantát kapunk.

Az V. frakcióhoz 5 mmól Boc-Tyr(Br-Z)-t kapcsolunk, majd a gyantát két részre osztjuk.

A gyanta egyik felét megőrizzük, a másik feléhez 40 (VII. frakció) 5 mmól pGlu-t kapcsolunk, így pGluTyr-Glu-Asp-Sub-Lys-gyantát kapunk. A reakciósort az 1. reakcióvázlattal szemléltetjük.

A kapott peptid-gyantákból a védőcsoport-eltávolítást és a peptid lehasítását HF/anizollal 0 °C-on 1 óra 45 alatt végezzük. A mintegy 100 mg nyers peptideket C-18 Vydac 2,5x30 cm-es preparatív oszlopon tisztítjuk, víz/0,1% triluor-ecetsav (TFA) és acetonitril/0,1% TFA puffer-rendszert használva.

A kapott peptidek fizikai állandói az alábbiak

HU 206 889 B

7. példa (pGlu-Glu-Asp)₂-Prc-(Lys)₂ előállítása

A) BOC-S.S'-/,3-propándiil-cisztein előállítása ml metanolt vízmentes ammóniával telítünk, és hozzáadunk 0,5 g BOC-ciszteint 0,5 ml metanolban, majd 0,35 ml 1,3-dibróm-propánt. 10 perc múlva újabb 0,5 g BOC-ciszteint adunk az elegyhez 0,5 ml metanolban. 4,5 óra múlva az oldószert elpárologtatjuk és az olajos maradékot vízben oldjuk. Az oldat pH-ját 9-re állítjuk és az oldatot dietil-éterrel extraháljuk. A vizes fázist pH 2-re savanyítjuk, és etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist szárítjuk és bepároljuk. 1,12 g biszBOC-S,S’-l,3-propándiil-ciszteint kapunk. Az aminosavat további tisztítás nélkül felhasználjuk. FAB/MS (M+H)=469.

B) (pGlu-Glu-Asp)₂-Prc-(Lys)₂ előállítása

0,53 g BOC-Lys-gyantát (szubsztitúció: 063 mmól/g) kézi rázóedénybe helyezünk, és a védőcsoport eltávolítási és semlegesítési lépések után hozzákapcsolunk 290 mg (0,6 mmól) biszBOC-S,S’-l,3propándiil-ciszteint, 1 mmól (206 mg) DCC és 1 mmól (153 mg) HOBT alkalmazásával 10 ml NMP/DCM (1:1) elegyben. Két óra múlva a gyantát NMP-vel és DCM-mel mossuk, és hozzáadunk 2 mmól (765 mg) H-Lys(Z)-OBz-t, majd 1,5 mmól (390 mg) DCC-t és

1,5 mmól (230 mg) HOBT-t 4 ml NMP/DCM (1:1) elegyben. 18 óra elteltével a gyantát 20 ml NMP-mel és DCM-mel mossuk.

A szokásos védőcsoport-eltávolítási, semlegesítési és kapcsolási lépésekből álló ciklus ismétlésével elvégezzük a kapcsolást BOC-Asp(OBz)-vel, BOCGlu(OBz)-vel és pGlu-val is. A kapcsolási reakcióban 1 mmól aminosavat, DCC-t és HOBT-t használunk, a kapcsolást 5 ml NMP/DCM (1:1) elegyben végezzük. A kapcsolási reakció lejátszódását Kaiser-teszttel követjük.

A kapott 416 mg peptid-gyantáról a védőcsoportokat és a pepiidet 0,5 ml anizol és 8 ml HF elegyével 0 °C-on 2 óra alatt lehasítjuk. A HF-ot elpárologtatjuk és a peptid és gyanta elegyét dietil-étenel mossuk, majd jégecettel extraháljuk. Liofilizálás után 130 mg nyers pepiidet kapunk.

61,5 mg nyers pepiidet C—18 Vydac preparatív oszlopon tisztítunk, acetonitril-víz (0,1% TFA) pufferrendszert használva. 16,5 mg tiszta cím szerinti pepiidet kapunk. FAB/MS (M+H)= 1249,3

Aminosav-analízis: Asp 2,0(2), Glu 4,28(4), Prc 1,14, Lys 1,96 (2)

8. és 9. példa (pGlu-Glu-Asp)₂-Etc-(Lys)₂ és (pGlu-Glu-Asp)₂Buc-(Lys)₂ előállítása

A biszBOC-S,S’-l,2-etándiil-ciszteint (Etc) és a biszBOC-S,S’-l,4-butándiil-ciszteint (Buc) a biszBOC-S,S’-propáldii!-ciszteinre ismertetett eljárással állítjuk elő.

A (pGIu-Glu-Asp)₂-Prc-(Lys)₂ előállítására ismertetett eljárással 30 mg (pGlu-Glu-Asp)₂-Etc-(Lys)₂-t és 17 mg (pGlu-G]u-Asp)₂-Buc-(Lys)₂-t kapunk.

10. példa (pGlu-Glu-Asp)₂-Sub-(N-MeArg)₂ előállítása 0,5 g hidroxi-metil-gyantát (0,45 mekvivalens/g) ml DCM-ben szuszpendálunk, és 0,5 mmól (221 mg) BOC-N-MeArg-nal, 0,5 mmól (61 mg) dimetil-aminopiridinnel és 0,5 mmól (103 mg) DCC-vel reagáltatjuk. Az acilezett gyantát DCM-mel háromszor, NMP-vel háromszor és DCM-mel négyszer mossuk. A reagálatlan hidroxilcsoportokat 0,5 ml fenil-izocianáttal 20 ml DCM-ben reagáltatva lefedjük. A gyantát alaposan mossuk DCM-mel és NMP-vel. A BOC-csoportot 40% TFA/DCM eleggyel eltávolítjuk. 10% DIEA/DCMmel való semlegesítés után 0,05 mmól (20,2 mg) BOCSub-ot kapcsolunk, 0,125 mmól (25,7 mg) DCC-t és 0,125 mmól (19,1 mg) HOBT-t használva. 72 óra elteltével a gyantát NMP-vel és DCM-mel mossuk. A szokásos védőcsoport-eltávolítási, semlegesítési és kapcsolási lépésekből álló ciklus ismétlésével elvégezzük a kapcsolást BOC-Asp(OBz)-vel, BOC-Glu(OBz)-vel és pGlu-val. 1 mmól aminosavat, DCC-t és HOBT-t használunk a kapcsolási reakciókban, és a kapcsolást ml NMP/DCM (1:1) elegyben végezzük. A kapcsolási reakció lejátszódását Kaiser-teszttel követjük. A kapott peptid-gyanta (484 mg) védőcsoportjainak eltávolítását és a hasítást 0,5 ml anizollal és 10 ml HF-dal 0 °C-on 2 óra alatt hajtjuk végre. A HF-ot elpárologtatjuk és a peptid és gyanta elegyét dietil-éterrel mossuk és jégecettel extraháljuk.

Liofilizálás után 12,5 mg nyers peptidet kapunk.

mg nyers peptidet C—18 Vydac preparatív oszlopon tisztítjuk, acetonitril-víz (0,1% TFA) puffer-rendszert használva. 2 mg tiszta cím szerinti peptidet kapunk.

M+H= 1255,4 Aminosav-analízis: Asp 2,00(2), Glu 4,35(4).

M+H=1163 Aminosav-analízis: Asp 2,00(2), Glu 4,01(4).

//. példa (pGlu-Glu-Asp)₂-Sub-(Hna)₂ előállítása

0,5 g (0,45 mekvivalens/g) hidroxi-metil-gyantát ml DCM-ben szuszpendálunk, és 126 mg (0,335 mmól) N²-BOC -N⁶-Z-2,6-diamino-4-hexinsavval (Hna), 40 mg, (0,335 mmól) dimetil-amino-piridinnel (DMAP), 69 mg (0,335 mmól) DCC-vel és 50 mg (0,335 mmól) HOBT-vel reagáltatjuk. Az acilezett gyantát DCM-mel háromszor, NMP-vel háromszor, és DCM-mel négyszer mossuk. A reagálatlan hidroxilcsoportokat 0,5 ml fenil-izocianáttal 20 ml DCMben lefedjük. A gyantát DCM-mel és NMP-vel alaposan átmossuk. A BOC-csoportot 40% TFA/DCM-mel eltávolítjuk. 10% DIEA/DCM eleggyel semlegesítjük, majd 44 mg (0,11 mmól) BOC-Sub-val kapcsolunk, 50 mg (0,22 mmól) DCC-t és 33,6 mg (0,11 mmól) HOBT-t használva. 16 óra múlva a gyantát NMP-vel és DCM-mel mossuk. A szokásos védőcsoport eltávolítási, semlegesítési és kapcsolási reakcióból álló ciklust megismételve hozzákapcsoljuk a BOC-Asp(OBz)-t, BOC-Glu(OBz)-t és pGlu-t. 1 mmól aminosavat, DCC-t és HOBT-t használunk. A kapcsolást 5 ml NMP/DCM (1:1) elegyben végezzük, A reakció leját1

HU 206 889 Β szódását Kaiser-teszttel követjük. A kapott 608 mg peptid-gyantából 0,6 ml anizollal és 10 ml HF-dal 0 °C-on 2 óra alatt eltávolítjuk a védőcsoportokat és elvégezzük a hasítást. A HF-ot elpárologtatjuk és a peptid és gyanta elegyét dietil-éterrel mossuk, majd jégecettel extraháljuk. Liofilizálás után 93,7 mg nyers pepiidet kapunk.

20,6 g nyers pepiidet C-18 Vydac preparatív oszlopon tisztítunk, acetonitril-víz (0,1% TFA) puffer-rendszert használva. 7,5 mg cím szerinti tiszta pepiidet kapunk.

FAB/MS (M+H) = 1163

Aminosav-analízis: Asp 2,0 (2), Glu 4,01 (4), Sub 2,01 (1), Hna 1,44 (2).

72, példa (pGlu-Glu-Asp)₂-Adp-(Lys)₂ előállítása A) BiszBOC-2(S),5(S)-di.aminO-adipinsav előállítása

A cím szerinti vegyületet R. Nutt módszere szerint szintetizáljuk [J. Org. Chem. 45,3078 (1980)].

240 ml metanol és 80 ml piridin elegyéhez 192 mg nátrium-metoxidot és 57,56 g BOC-Asp(OBz)-t adunk. A kapott homogén elegyet 0 °C-ra hűtjük. A reakcióelegyen mintegy 1,5 amperes áramot (100 V) vezetünk keresztül, platina-elektródok segítségével. Az oldat hőmérsékletét 15 °C és 25 °C közötti értéken tartjuk. A kiindulási anyag fogyását vékonyréteg-kromatográfiásan követjük (futtatás: klorofonn-metanol-ecetsav 95:4:1 arányú elegyével). 5 óra elteltével a reakciót leállítjuk. Az oldószert rotációs vákuumbepárlóval eltávolítjuk. A barna, olajos maradékot 150 ml etil-acetátban oldjuk. Az oldatot szobahőmérsékleten 18 órán keresztül állni hagyjuk. A csapadékot szűréssel eltávolítjuk és a szűrletet bepároljuk. 61,7 g nyers biszBOC2,5-diamino-Szuberinsav-dibenzil-észtert kapunk.

g fenti nyersterméket hexánban töltött szilikagél-oszlopra viszünk. Az oszlopot egymást követően 10, 20, 25 és 30% etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluáljuk. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiás eljárással analizáljuk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és az oldószert rotációs vákuumbepárlóval eltávolítjuk. A kapott 3,78 g tisztított terméket vákuumban szárítjuk.

g fenti'dibenzil-észtert 120 ml metanolban oldunk, és Parr-készülékben, 378 mg 10% fémet tartalmazó szénhordozós palládiumkatalizátor jelenlétében hidrogénezünk. A hidrogénezés 5 óra alatt végbemegy. Az oldatot szűrjük és a szűrletet rotációs vákuumbepárlóval koncentráljuk. A kapott nyers biszBOC-2,5-diamino-adipinsavat szilikagélen, gyorskromatográfiás eljárással tisztítjuk, kloroformban töltött oszlopot használva. Az oszlopot egymást követően kloroform, metanol és ecetsav 98:2:0,1; 98:2:0,5; 95:4:1; 90:8:2; 85:10:5 és 70:20: 10 arányú elegyeivel végezzük. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és rotációs vákuumbepárlóval koncentráljuk, majd a maradékot vákuumban szárítjuk.

1, 07 g cím szerinti vegyületet kapunk, amelynek szerkezetét NMR és tömegspektrometriás adataik alátámasztják.

B) (pGlu-Glu-Asp)₂-Adp-(Lys)₂ előállítása

0,5 g (0,63 mmól) BOC-Lys(Cl-Z)-PAM gyantát kézi rázóedénybe helyezünk. A BOC-csoportot 40% TFA/metilén-kloriddal eltávolítjuk. A trifluor-ecetsavas sót 10% DIEA/DCM eleggyel semlegesítjük. 2 mmól biszBOC2,5-diamino-adipinsavat (Adp) kapcsolunk, 4 mmól DCC-t és HOBT-t használva 15 ml DCM és 15 ml NMP elegyében. A szabad karboxilcsoportokat 3 mmól HLys(Z)-OBz-vel amidáljuk, 3 mmól DCC és HOBT jelenlétében, 30 ml DCM/NMP (1:1) elegyben. A kapcsolás után a gyantát DCM-mel és NMP-vel alaposan átmossuk. A védőcsoport-eltávolítási, semlegesítési és kapcsolási lépésből álló ciklust megismételve hozzákapcsoljuk a kívánt peptid többi aminosavját (Asp, Glu és pGlu) is. 4 mmól aminosavat, DCC-t és HOBT-t használunk minden egyes kapcsolásban. A kapcsolási reakciók lejátszódását Kaiser-teszttel követjük.

A szintézis befejeztével a peptid-gyantát hasító készülékbe helyezzük, és 10 ml HF és 1 ml anizol elegyével -15 °C-on 2 óra alatt hasítjuk. A HF eltávolítása után a gyantát dietil-éterrel alaposan átmossuk és a peptidet jégecettel extraháljuk. Az ecetsav fő tömegét rotációs vákuumbepárlóval eltávolítjuk és a maradékot vízzel hígítjuk, majd liofilizáljuk. A cím szerinti terméket HPLC eljárással végzett tisztítás után kapjuk.

13. példa (pGlu-Glu-Asp)₂-Sub-(Arg)₂ előállítása

0,6 g (0,6 mekvivalens/g) BOC-Arg(Tos)-PAM-ot 5 ml DCM-ben szuszpendálunk és DCM-mel és NMPvel alaposan átmossuk. A BOC-csoportot 40% TFA-t tartalmazó DCM-mel eltávolítjuk. 10% DIEA-t tartalmazó DCM-mel végzett semlegesítés után 72,7 mg (0,18 mmól) BOC-Sub-bal elvégezzük a kapcsolást, 74,1 mg (0,36 mmól) DCC-t és 56,5 mg (0,36 mmól) HOBT-t alkalmazva. A kapcsolást 5 ml 1:1 térfogatarányú NMP/DCM-ben végezzük. 16 óra elteltével a gyantát NMP-vel és DCM-mel mossuk. A szokásos védőcsoport eltávolítási, semlegesítési és kapcsolási ciklusokat BOC-Asp(OBz)-vel, BOC-Glu(OBz)-vel és p-Gluval megismételjük. 2,5 mmól aminosavat, DCC-t és HOBT-t alkalmazunk. A kapcsolást 5 ml 1:1 térfogatarányú NMP/DCM elegyben végezzük. A kapcsolási reakció lejátszódását Kaiser-teszttel követjük. A kapott 300 mg peptid-gyantáról a védőcsoportot eltávolítjuk és 1,0 ml anizol és 10 ml hidrogén-fluorid alkalmazásával 0 °C-on 2 órán keresztül hasítjuk. A HF-et elpárologtatjuk és a peptid és gyanta elegyét dietil-éterrel mossuk, és jégecettel extraháljuk. Liofilezés után 67 mg nyers peptidet kapunk. 30 mg nyers peptidet C-18 Vydac preparatív oszlopon tisztítunk, acetonitril-víz (0,1% TFA) puffer rendszert alkalmazva. 9 mg tiszta peptidet kapunk.

M+H=1227

Aminosav-analízis: Asp 2,00 (2), Glu 3,91 (4), Atg2,07 (2)

14. példa (Pro-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys)₂ előállítása

0,5 g (0,6 mekvivalens/g) BOC-Lys(Z)-PAM-ot 5 ml DCM-ben szuszpendálunk, és DCM-mel és NMP-vel alaposan átmossuk. A BOC-csoportot 40%

HU 206 889 B

TFA-t tartalmazó DCM-mel eltávolítjuk. 10% DIEA-t tartalmazó DCM-mel végzett semlegesítés után

60,6 mg (0,15 mmól) BOC-Sub-ot kapcsolunk hozzá, 61,8 mg (0,3 mmól) DCC-t és 47,1 mg (0,3 mmól) HOBT-t alkalmazva. A kapcsolást 5 ml 1 : 1 térfogatarányú NMP/DCM elegyben végezzük. 72 óra elteltével a gyantát NMP-vel és DCM-mel mossuk. A szokásos védőcsoport eltávolítási, semlegesítési és kapcsolási reakcióból álló ciklust megismételve hozzákapcsoljuk a BOC-Asp(OBz)-t, BOC-Glu(OBz)-t és BOCPro-t. 2,5 mmól aminosavat, DCC-t és HOBT-t alkalmazunk. A kapcsolást 5 ml NMP/DCM (,l: 1) elegyben végezzük. A reakció lejátszódását Kaiser-teszttel követjük. A kapott 350 ml peptid-gyantából a védőcsoportot eltávolítjuk és 0,35 ml anizol, valamint 10 ml HF alkalmazásával 0 °C-on 2 órán keresztül hasítjuk. A HF-et elpárologtatjuk, és a peptid és gyanta elegyét dietil-éterrel mossuk, és jégecettel extraháljuk. Liofilizálás után 95 mg nyers pepiidet kapunk. 50 mg nyers pepiidet C-18 Vydac preparatív oszlopon tisztítunk, acetonitril-víz (0,1% TFA) puffer rendszert használva.

11,5 mg tiszta pepiidet kapunk.

M+H= 1143,5

75, példa (pGlu-Glu-Asp)₂-Sub-(lizinol)₂ előállítása

58,5 mg (159,7 μπιόΐ) Boc-lizinolt 5 mi 4 n HCl/dioxánban oldunk, és szobahőmérsékleten 30 percen keresztül keverjük, miközben a gázfejlődést ásványolajon átbuborékoltatva figyeljük. A reakcióelegyet vákuumban óvatosan szárazra pároljuk és 30 percen keresztül nagyvákuumban tartjuk. A sót 5 ml DMF-ben oldjuk, és állandó keverés közben jég/aceton fürdőn lehűtjük. A kapott oldathoz egymás után 28μ1 (160,7μηιό1) DIEA-t, 26,3 mmg (194,7gmól) HOBT-t, 102,3 mmg (79,2μιτιό1) védett dimer tetrapeptidet (JS—15 980—223) és 36,2 mg (189,0μηιό1) EDC-t adunk. Az elegyet 1 éjszakán keresztül (körülbelül 18 óra) keverjük, miközben fokozatosan szobahőmérsékletre melegítjük, majd lassan 100 ml 1: 1 arányú jég/5% Na₂CO₃-ot tartalmazó telített NaCl elegybe pipettázzuk. A hideg szuszpenziót háromszor 50 ml etil-acetáttal extraháljuk, az egyesített extraktumokat egyszer 50 ml vízzel mossuk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfát felett szárítjuk, és vákuumban koncentráljuk. 126,8 mg (89% nyers hozam) viszkózus olajat kapunk.

63,7 mg fenti termékei körülbelül 5 ml vízmentes HF-dal és 0,5 ml anizollal kezelünk 0 °C-on, 1 órán keresztül. A HF-ot vákuumban óvatosan elpárologtatjuk, és a maradékot 15 ml tiszta TFA-ban okijuk. A kapott oldatot vákuumban szárazra pároljuk; H₂O-ban újra oldjuk és lioifilizáljuk. A kapott, nehezen kezelhető olajat 50 ml, 0,1% TFA-t tartalmazó vízben oldjuk, és 20 ml-es Bond Elüt oszlopra (Analytichem International) visszük. Az oszlopot újabb 50 ml pufferrel mossuk (a teljes mintát egyetlen frakcióként szedjük), majd egymást követően 100 ml 15:85 térfogatarányú acetonitril/víz (0,1 % TFA) eleggyel és 40:60 térfogatarányú acetonitrií^O (0,1% TFA) eleggyel eluáljuk. HPLC analízis szerint a fő komponens a második frakcióban eluálódik, ez a frakció 44 mg terméket tartalmaz. 22 mmx25 cm-es C-18 Vydac preparatív HPLC oszlopon tovább tisztítva 20,1 mg tisztított pepiidet kapunk, a tisztaság 86%-os. A tiszta tennék hozama 49%.

ESI+MS eredmények: (M+2H)²⁺ = m/z 572,2; (M+H+Na)²⁺=583,2 (Móltömeg = 1143)

Aminosav-analízis eredmények: (a mintát 6 n sósavval, 110 °C-on, 114 órán keresztül hidrolizáljuk):

Asx = 2,00 (2)

Glx = 4,15 (4)

Sub - nem határoztuk meg és lizinol - nem határoztuk meg Peptid tartalom = 109,72%, Asp-ra számítva.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Eljárás az (I) általános képletű peptidek - a képletben

Yi és Y₂ jelentése egymástól függetlenül -CH₂- vagy

-S-, x értéke 0, 1,2,3 vagy 4, m értéke 0, 1 vagy 2, n értéke 0, 1 vagy 2,

A jelentése piroglutaminsav-, prolin-, glutamin-, tirozin- vagy glutaminsav-maradék,

B jelentése glutaminsav-, tirozin- vagy aszparaginsav-maradék,

C jelentése glutaminsav-, tirozin- vagy aszparaginsav-maradék,

D jelentése lizin-, arginin-, Ν-metiI-arginin-, diaminohexinsav-maradék, vagy ezek hidroxi-metil-származéka,

E jelentése glutaminsav-, aszparaginsav-, tirozin-maradék vagy peptid-kötés, azzal a megkötéssel, hogy ha Y, és Y₂ jelentése -S-, akkor x értéke 2, 3 vagy 4, és m és n értéke 1, vagy ha Y j és Y₂ jelentése -CH₂-, akkor x értéke 0, 1 vagy 2 és m és n értéke 0, vagy ha Y| jelentése -S- és Y₂ jelentése -CH₂-, akkor x értéke 0 és n értéke 1, vagy ha Y, jelentése -CH₂- és Y₂ jelentése -S-, akkor x értéke 0 és m értéke 1 és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy védett aminosavak kapcsolásával előállítunk egy (II) általános képletű, megfelelően védett vegyületet a képletben A, B, C, E, Y₍, Y₂, m, x és n jelentése a tárgyi körben megadott és [D’j jelentése klór-metil-, metil-benzhidril-amin-, benzhidril-amin- vagy fénil-acetamido-metil-gyanta, vagy a tárgyi körben definiált D a védőcsoporto(ka)t eltávolítjuk és adott esetben a peptidet a gyantáról lehasítjuk, és a kapott vegyületet kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében

HU 206 889 B

Y i és Y Jelentése -CH₂-, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.

Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében x értéke 1 vagy 2, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében

Y j jelentése -S-, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében

Y( és Y₂ jelentése -S-, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében

A jelentése piroglutanűnsav-maradék,

B jelentése glutaminsav-maradék,

C jelentése aszparaginsav-maradék,

D jelentése lizin-maradék és

E jelentése peptid-kötés, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás (pGlu-GluAsp)₂-Pim-(Lys)₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás (pGlu-GluAsp)₂-Sub-(Lys)₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás (Tyr-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys)₂, (pGlu-Tyr-Glu-Asp)₂-Sub-(Lys)₂, (pGlu-Glu-Tyr-Asp)₂-Sub-(Lys)₂, (pGlu-Glu-Asp-Tyr)₂-Sub-(Lys)₂, (pGlu-Glu-Asp)₂-Sub-(N-MeArg)₂, (pGlu-Glu-Asp)₂-Sub-(Hna)₂, (pGlu-Glu-Asp)₂-Prc-(Lys)₂, (pGlu-Glu-Asp)₂-Etc-(Lys)₂ vagy (pGlu-Glu-Asp)₂-Buc-(Lys)₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket használjuk.
10. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületet - a képletben A, B, C, D, E, Y_b Y₂, x, m és n jelentése az 1. igénypontban megadott - vagy annak egy gyógyászatilag elfogadható sóját a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé alakítjuk.