HUT67982A

HUT67982A - Process for proucing organo-protective peptides and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HUT67982A
Application number: HU9401952A
Authority: HU
Inventors: Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Predrag Sikiric; Ivan Udovicic; Boris Mildner; Ernest Suchanek; Stjepan Mise; Branko Turkovic; Marko Duvnjak; Ivo Rotkvic
Original assignee: Petek; Seiwerth; Grabarevic; Sikiric; Udovicic; Mildner; Suchanek; Mise; Turkovic; Duvnjak; Rotkvic
Priority date: 1992-11-16
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 1995-05-29
Also published as: SK279227B6; ATE163131T1; SK85794A3; DE69316974D1; EP0624164B1; CZ162294A3; CZ285155B6; CA2127553C; HUT66303A; HU211260A9; DE69316974T2; WO1994011394A3; RO115733B1; SI9300595A; AU5624994A; HU9401952D0; EP0624164A1; SI9300595B; JP2812803B2; JPH07507568A

Description

Szerves-védő aktivitással rendelkező proteinek, és eljárás előállításukra, és terápiás használatuk

Ez a találmány olyan új peptidekre vonatkozik, amelyek a természetes BPC csoportéval azonos típusú, magas biológiai aktivitással rendelkeznek, de aminosav-láncuk rövidebb.

A találmány háttere

Az EP 0 432 400 számú iratban bemutattak egy szerves-védő hatással rendelkező, biológiailag aktív porteint, amelyet emberi vagy állati testb 1 izoláltak, és BPC-nek neveztek el (Body protecting Compound - Test védő vegyület). Ezt publikálták a következő helyen is: P. Sikiric és mtsai, Exp. Clin. Gastroenterol:, 1, 15-26, 1991. E protein molekulatömege nagy, mintegy 40 000 + 5000 dalton, és szerkezetét csak részben határozták meg. E vegyületnek igen széles spektrumú biológiai aktivitása van, mint például: fekély ellen védő, májvédő, antivirális, ödéma ellenes, általános gyulladásgátló aktivitás, anti-malignus aktivitás és mások. A vegyületet a fenti betegségek és rendellenességek kezelésére használhatj ák, továbbá az idegrendszer rendellenességei és betegségei, a dopaminerg etiológiai, a sebészeti, sztomatológiai rendellenességek, és a fertilitás kezelésére, és az állatorvoslásban. De ez a széles aktivitásspektrum a meghatározatlan szerkezet, vagy

rs /2 az izolált BPC vegyület nem megfelelő tisztaságának vagy homogenitásának a következménye is lehet.

A találmány leírása

A találmány egy aspektusa szerint a szintetikus peptideknek van egy olyan osztálya, amely meglepően magas biológiai aktivitást mutat, különösen a test védelme tekintetében.

Ezeknek a jól definiált szerkezetű szintetikus vegyületeknek minden esetben van egy nagy előnyük a csak definiált nagy molekulájú BPC-vel szemben, bonyolult eljárással kapható meg bizonytalan részlegesen amely csak természetes forrásból.

Részletesebben, ez a találmány magas biológiai aktivitással rendelkező peptidek egy új osztályára vonatkozik, amelyek 8 - 15 aminosavat tartalmaznak, és amelyeket az alábbi alap szerkezeti képlet mutat be, ahol a három betűs aminosav kódokat használjuk, és ahol minden aminosav gyök alatti szám megfelel a gyök helyzetének a peptid láncban:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Alá Asp Zaa Alá Xaa Xaa 15 10

Xaa ι

‘T ahol egy vagy több aminosavmaradék helyettesítve van. Az alkalmas Xaa, Yaa és Zaa szubsztituenseket a következő I. táblázat mutatja be:

I. Táblázat gyök szubsztituens

Xaa egy semleges alifás aminosav:

Alá, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva

Yaa bázikus aminosav:

Lys, Arg, Orn, His

Zaa savas aminosav:

Glu, Asp, Aad, Apm

Előnyös peptidek a következők:

1. szekvencia:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Asp Alá Leu Gly

10

Val

• ·

2. szekvencia:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Asp Alá Gly Leu

10

Val

3. szekvencia:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp Asp Alá Leu Gly 15 10

Val

A találmány egy másik szempontja szerint vannak olyan analóg peptidek, amelyek C terminálisa amid vagy karboxi terminált formában van, amelyek a fent leírt szerkezeti képlettel rendelkeznek, és ahol legalább egy és legfeljebb 7 ami nosavmaradék az 1-15 régióban ki van hagyva, és legalább egy a megmaradó aminosavak közül helyettesíthető az I. táblázatban leírt szubsztituciós séma szerint.

G /5

Az előnyös peptidek a következők:

4. szekvencia:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys
1	5
Val 14 5. szekvencia:

Pro Alá Asp Alá Leu Gly

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys

5

Val

6. szekvencia:

Pro Alá Asp Alá Gly Leu

Glu Pro Pro Pro Leu Lys	Pro
1	5
7. szekvencia:
Asp Pro Pro Pro	Ile Arg	Pro
1	5

Alá

Alá Asp

8. szekvencia:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp

5

Egy másik megvalósítási mód szerint a fenti szerkezeti képletű peptidek, ahol legalább egy aminosavmaradék ki lehet hagyva, és legalább egy a maradék aminosavak közül helyettesítve lehet az I. táblázatban jelölt módon, ciklikus formába vannak átalakítva egy új CO-NH kötés kialakításával az első és az utolsó aminosavmaradék között a molekulában. Az előnyös peptidek a következők:

9. szekvencia:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp Alá Leu Gly Val

I 2 5 10 13 I

10. szekvencia:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Alá Asp | 2 5 9 |

A bejelentők úgy találták, hogy amikor a fent leírt peptideket alkalmazzák, ezek a peptidek a kiindulási BPC proteinnel azonos, vagy annál nagyobb biológiai aktivitást mutatnak.

1. ) Védő hatás a májra és a hasnyálmirigyre

Az újonnan szintetizált, 2., 3., 4., 6. szekvenciával jelölt peptidek védő hatását referencia standardokkal (bromoszkriptin, amantadin, szomatosztatin) hasonlítottuk össze patkányokban, máj és hasnyálmirigy károsodás különböző kísérleti modelljeiben: 24 óra epevezeték ligáció, 24 óra epevezeték + máj artéria ligáció, 48 óra bezártság, mint stressz, CC1₄ alkalmazása. A használt peptidek, 10/zg-10 ng/kg testtömeg közötti tartományban i.g. vagy i.p. alkalmazva, szignifikánsan megakadályozták a máj és hasnyálmirigy nekrózist, valamint az elzsírosodást olyan állatokban, amelyeket 24 órás epevezeték ligációnak, 24 órás epevezeték + máj artéria ligációnak, 48 óra bezártságnak, vagy CC1₄ alkalmazásának vetettek alá. A bilirubin, SGOT, SGPT biokémiai értékei teljesen összhangban vannak az említett makro/mikroszkópikus adatokkal.

2. ) A veselézióra gyakorolt hatás

a) Egyoldalú veseektomia

A kísérletekben 190-250 g-os hím és nőstény Wistar albínó patkányokat használtunk. Egyoldalú veseektomiát végeztünk, és eredményként a kontrolinál, valamint a 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidekkel kezelt (10 /zg/kg testtömeg, i.p.

• · · · • « ίι '3 beadva 1 órával a műtét előtt ) csoportoknál a megmaradt vese tömegének növekedését figyeltük meg. A peptidekkel kezelt csoportoknál következetesen a megmaradt vese tömegnövekedésének csökkenését figyeltük meg.

A két csoportban összehasonlítottuk a biokémiai paramétereket, úgy látszik, hogy minden használt peptid javítja a megmaradó vese funkcióit.

b) Gentamicin alkalmazása

A kísérletekben nőstény Wistar albínó patkányokat használtunk. Gentamicin használatával indukáltuk a vesecsatornák károsodását, 40 mg/kg dózisban használva naponta, egy 30 napos periódusban. Minden állatot leöltünk 5 nappal az utolsó gyógyszeradagolás után. A kontroll csoportban a tubulusok szignifikáns elváltozását figyeltük meg, míg következetsen kisebb elváltozást találtunk minden, a fent említett peptidekkel kezelt csoportnál.

c) Higany-klorid

A kísérletben Wistar albínó patkányokat használtunk. A higany-kloridot 2 mg/kg testtömeg dózisban, i.v. alkalmaztuk, a 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptideket 20 Mg/kg dózisban, 1 órával a higany-klorid alkalmazása előtt adtuk • « « · « « ·»· be. Eltérően a kontroll adatoktól, a fent említett peptidekkel kezelt csoportoknál a biokémiai és mikroszkópos eredmények védő hatást mutattak.

3. ) A tesztiszlézióra gyakorolt hatás

A 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidek hatását a tesztiszlézióra ketokonazol alkalmazásával (24 mg/kg i.g.), tesztoszteronnal (30 mg/kg i.p.) vagy 6 Gy besugárzással vizsgáltuk. A 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptideket 1 órával a kezelés előtt adtuk be. A 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidek védő hatást mutattak.

4. ) Fertilitás/Kereskedelmi tenyésztés

a) A 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidek és a fertilitás. A hatás az oligoasztenospermiszre.

A kutatást 10 olyan 30-40 éves emberen végezték el, akiknél oligoasztenospermiszt diagnosztizáltak. Ezektől az emberektől 3-4 nap önmegtartóztatás után ejakulátumot gyűjtöttek. Cseppfolyósítás (30 perc) után az ejakulátum 0,5 ml-éhez 0,5 ml oldószert adagoltak rétegesen. A kontroll közeg HAM-F 10-böl állt, 10% hatástalanított kordális szérummal. A kísérleti közeg ezen felül 2 ^g/ml vagy 4 /zg/ml

BPC-t tartalmazott. 90 perces terjedési idő után, 37°C-nál, t, π ίο

5% CO₂-t tartalmazó atmoszférában, Horwell tenyésztő kamrában, a haladó mozgású, a helyben mozgó és a nem mozgó spermatozoák számát meghatároztuk 1 ml ejakulátumban. Az elsődleges eredmények azt mutatták, hogy a fent említett peptideknek kis koncentrációban nincs hatásuk a spermatozoák mozgékonyságára. Mindamellett magasabb koncentrációban (4 μg) a kontrolihoz %-ban viszonyítva a mozgékonyság szignifikánsan változott.

b) A 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidek és a reprodukciós folyamatok

Az említett peptideket előzőleg három terhességen átesett egerekben vizsgálták. 20 nappal a tejtermelés elmaradása után az állatokat pároztatták. A használt peptideket 10 M9/kg testtömeg dózisban i. p. adták be naponta egyszer az egész terhességi (19-21 nap), és laktációs (a következő három hét) periódus alatt. A kontroll csoport párhuzamosan egy azonos térfogatú sóoldatot kapott. A n stényenkénti utódszámot, és az ivadékok tömegét regisztrálták.

Gondos statisztikai analízissel a nőstényenként! utódszám következetes, szignifikáns növekedését mutatták ki, de meglepően, egy vizsgált időpontban sem volt különbség a testtömegben. Minden nőstényt a laktáció elmaradása utáni 25

t

A?.

>1 napig hagytak regenerálódni. Majd újból pároztatták azokat, hogy az ötödik terhességre gyakorolt hatást vizsgálják.

A kontrollcsoporttal összehasonlítva magasabb termékenységi rátát és magasabb laktációs képességet regisztráltak minden, a fent említett peptidekkel kezelt csoportnál.

Meg kell jegyezni, hogy az említett peptidek javíthatják a termékenységet egészen öreg egereknél is. Következésképpen ezek az eredmények összhangban vannak az általánosan előnyös hatású peptidek képességeivel és a humán spermát használó in vitro eljárásban kapott adatokkal.

c) Kereskedelmi tenyésztés

1419 egészséges sertés (összesen 4306 sertésből) közvetlenül a születés után 10 gg 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidet kapott. Másik 1440-et a 13. életnapon, 1 órával a kasztráció előtt kezeltek, míg a maradék 1477 csak a szokásos vasterápiát kapta. 4 hét múlva megállapítottuk a cullingot, a zúzódások számát, a mortalitást, a testtömeget és a táplálékfogyasztást. A használt, egyszer alkalmazott peptidek szignifikánsan csökkentették a culling rátát (abban a csoportban, melyet közvetlenül születés után kezeltek) és a zúzódási gyakoriságot (minden, a peptidekkel kezelt csoportban). A kezelt állatoknál azonos testtömeget • · · ·

IS _z12 figyeltünk meg, de jelentősen alacsonyabb táplálékfogyasztással.

A fertőzésekre gyakorolt hatás: 40 E. coli enterocolitisszel fertőzött, 28 napos elválasztott sertést vizsgáltunk. A használt peptideket 20 állatnál alkalmaztuk (10 jug/kg testtömeg i.m.). Egy hónappal később a peptidekkel kezelt állatoknál a mortalitási ráta szignifikánsan csökkent.

Egy másik kísérletben 1200 egészséges sertésnél vizsgálták az első hét után a halálozási arányt. 400 állat a szokásos vasterápián kívül közvetlenül a születés után kapta az említett peptideket. Az említett peptidekkel kezelt (10 Mg/kg testtömeg i.m.) csoportoknál a halálozási arány szignifikánsan alacsonyabb volt.

5.) Az amfetamin viselkedésre gyakorolt hatás

A 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidek hatását 10 ^g/kg vagy 10 ng/kg testtömeg i.p. dózisban, 5 perccel az amfetamin alkalmazása előtt, vagy azzal egyidőben adagolva vizsgálták. Az említett peptidekkel kezelt csoportoknál az amfetamin okozta viselkedési rendellenességek szignifikánsan csökkentek.

¹ > ’ι

I

A³

6. ) Vérzési idő

A 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidek hatását a szokásos vérzési tesztekkel (farok megvágása) vizsgáltuk egereken és patkányokon, heparin alkalmazásával (1000 Ul/kg s.c. 3 órával a sebzés előtt), vagy anélkül. A vizsgált peptideket a sebzés indukálásával egyidőben alkalmaztuk (10 gg/kg vagy 10 ng/kg i.p.). Minden, a vizsgált peptidekkel kezelt állatnál a vérzési idő szignifikáns csökkenése volt megfigyelhető.

7. ) A kasztráció következményeire gyakorolt hatás

Allen-Doisy módszere szerinti módosított eljárást végeztünk. Különböző dózisokat alkalmaztunk (10 μ<3 vagy 10 ng/kg i.p.) elő vagy utókezelésként, egyszeri alkalmazásban, vagy naponta egyszeri alkalmazással rendszeresen. A vizsgált peptidekkel kezelt csoportoknál a különböző kasztrációs következmények teljes megszűnése vagy visszafejlődése volt megfigyelhető.

8. ) Magas vérnyomás

Magas vérnyomást indukáltunk egyoldali veseartéria elzárással. 10 nap múlva az állatokat a 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidekkel ( 10 μg vagy 10 ng/kg testtömeg • · • · • · ·

fs

i.p.) vagy sóoldattal kezeltük, különböző eljárást alkalmazva (egyszeri vagy folyamatos alkalmazás). A vizsgált peptidekkel kezelt csoportoknál megemelkedett vérnyomásértékek szignifikáns csökkenését figyelhettük meg.

9.) A kísérleti diabetes mellitusra gyakorolt hatás him Wistar albínó patkányokban sztreptozotocinnal vagy alloxánnal indukáltuk a diabetes mellitust. A 2.,3.,4.,6.

szekvenciájú peptidek, vagy 100 /zg/kg dózisban alkalmazva, szignifikánsan késleltették a diabetes kialakulását. Azonkívül szignifikánsan megnövelték

Wistar patkányok pajzsmirigyét és mellékpajzsmirigyét teljesen eltávolitóttűk. Azután a 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptideket testtömeg (10 ng/kg testtömeg i.p.) vagy sóoldatot (5 ml/kg

i.p.) alkalmaztunk, különböző eljárások szerint vagy ismételt kezelés). A vizsgált peptidekkel kezelt csoportokban mirigyek eltávolításának következményei szignifikánsan csökkentek.

|G

11. ) A nyaki verőér elkötése

Az állatokat 3 órával a két nyaki verő ér lekötése után leöltük. Egy órával azelőtt az összes állatot a 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidekkel (10 ng/kg testtömeg i.p.) vagy sóoldattal (5 ml/kg testtömeg i.p.) kezeltük. A vizsgált peptidekkel kezelt csoportokban szignifikánsan kisebb agyödémát találtunk.

12. ) Mellékvesék

A mellékvese károsodásának előidézésére az állatok anilint kaptak (300 mg/kg s.c. 7 napon át). Minden állatot egyszerre kezeltünk a 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidekkel (10 Mg/kg testtömeg, 10 ng/kg testtömeg i.p.) vagy sóoldattal (5 ml/kg testtömeg i.p.). A mellékvesék tömegét és a mikroszkopikus változásokat regisztráltuk. Az anilin kontroll csoporthoz viszonyítva a vizsgált peptidek szignifikánsan csökkentették a mellékvesék tömegének anilin-indukált csökkenését mindkét dózisban. Mivel azt általában elfogadják, hogy az anilin által indukált zavar az ACTH hiperszekrécióval kapcsolatos, egy ok-okozati viszonyt mutathatunk ki a vizsgált peptidek és az ACTH között. Ezt az is alátámasztja, hogy az említett peptidekkel kezelt és a nem kezelt kontroll csoportokban azonos tömeget találtunk.

Továbbá, az állatokat 48 órás bezártsági stressznek vetettük alá, előzőleg a vizsgált peptidekkel kezelve (10 μ$ vagy 10 ng/kg i.p./i.g.). A mellékvesék megemelkedett tömegének csökkenése a vizsgált peptidekkel kezelt állatoknál összhangban volt a megfelelő mikroszkópos megfigyelésekkel.

13. ) Hőmérsékleti zavarás

Élesztő oldatot (4000 mg/kg s.c.) alkalmazva a testhőmérséklet növekedését, és hideg vízbe való merítéssel, 40°C hőmérséklettel vagy reserpin használatával (5 mg/kg i.p.) a hőmérséklet csökkenését idéztük elő. A 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidek különböző alkalmazása (10 ng/kg testtömeg i.p.) mind a megnövelt, mind a csökkentett hőmérsékletnél következetesen normalizálta mindkét hőmérsékleti eltérést.

14. ) A hematopoézisre gyakorolt hatás

Albínó egerekbe citosztatikumokat (Endoxan, Vincristin, Adriablastin, Cytozinarabinosid) injektáltunk LD₅q dózisban. Egy órával a citosztatikum alkalmazása előtt az állatokat a 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidekkel kezeltük 10 μg dózisban, míg a kontrollok azonos térfogatban sóoldatot kaptak. Az állatokat a 3.,5.,7. és 11. kísérleti napokon leöltük. A vér paramétereit (E, Hb, Htc, L, Tb, absz.

IS neutrofil szám) , a csontvelőt, a máj és a lép citológiáját és szövettanát vizsgáltuk.

A harmadik kísérleti napon nem volt eltérés az L, E, Tb és neutrofil értékekben a csoportok között, eltérően attól, hogy a peptidekkel kezelt állatok csontvelejében intakt hematopoetikus sejtek voltak megfigyelhetők, ellentétben a kontrolioknál megfigyelhető aplasiaval.

A neutrofilek és a leukociták száma szignifikánsan növekedett a peptidekkel kezelt állatokban az ötödik napig, a hetedik napig elérve a normál értéket, ellentétben a kontroliokkal, ahol a 11. nap előtt nem figyeltek meg normalizálódást.

15.) A fájdalom csökkentése

A fájdalmat 2% MgS0₄ vagy alkalmazásával indukáltuk, peptidek a dózis illetve az

0,6% ecetsav intraperitoneális

A 2.,3.,4.,6. szekvenciájú alkalmazás ideje alapján eltérő metódusok szerinti alkalmazása (10 Mg vagy 10 ng/kg i.p., egyidöben vagy 30 perccel előbb) szignifikánsan csökkentette a fájdalomérzet időtartamát a kontroll csoportokkal összehasonlítva.

·»·· » <» * »·»« ······· * • > »·· · · • · · V « · · !u

16. ) Rickettsiák által indukált infekció

Megfelelő tojásokba 0,2 ml Coxielle Burnetti szuszpenziót injektáltunk. Szintén injektáltuk a tojásokba a 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptideket (1 pg, 10 pg, 100 pg és 1 ng) . A túlélési idő szignifikánsan hosszabb volt a kezelt csoportokban, mint a kontrolioknál.

17. ) Tumorsejtekre gyakorolt hatás

a) Két sejtvonalat, L-924-et és a B-16 melanoma sejtvonalat in vitro tenyésztettünk standard körülmények között. In vitro megfigyeltük a 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidek hatását a fent említett sejtkultúrák növekedésére. Két nappal a sejtkultúrák elindítása után 3%-os koncentrációban (0,1 ml) adagoltuk az említett peptideket. Három nappal később sejtszámlálóval meghatároztuk a sejtek számát tenyészetenként. Az eredmények azt mutatják, hogy az említett peptideknek gátló hatásuk van a B-16 melanoma sej tekre.

b) Az Erlich's aszcitesz tumor (EAT) egy olyan tumor, amely minden egérfajtában képes növekedni, mind aszcitesztumorként, mind szilárd tumorként, a tumorsejtek bevezetésének módjától függően. Egereket injektáltunk EAT sejtekkel szubkután vagy intraperitoneálisan, és

2ο megfigyeltük az ΕΑΤ sejtek és a 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidek együtt inkubálásának hatását az egerek túlélési idejére. Az állatokat egy 45 napos periódus alatt vizsgáltuk. A 15 hím NMRI kontroll egér 0,4 x 10⁶ EAT sejtet kapott. Az injektálás előtt a tumorsejteket egy órán át sóoldatban inkubáltuk. Az injekciós térfogat 0,2 ml volt. Az átlagos túlélési idő ebben a csoportban 36 nap volt, és csak 3/15 élte túl a 45 napot.

A másik 15 hím NMRI egér a tumorsejtek ugyanakkora dózisát kapta, ugyanakkora térfogatban, de ezeket a sejteket előzőleg az említett peptidek oldatában inkubáltuk (2 ^g/ml). Csak 2/15 egér pusztult el a megfigyelési periódus alatt (45 nap), az összes többi több, mint 45 napot túlélt. A kontroll és a kísérleti csoport közötti különbség szignifikáns volt (P<0,01) . Ugyanezt az eredményt kaptuk, ha azonosan jártunk el, de az EAT sejteket i.p. injektáltuk (s.c. helyett).

c) Egereket használtunk annak a vizsgálatára, hogy hogyan hatnak a 2.,3.,4.,6. szekvenciájú peptidek (10 /zg/kg testtömeg i.p. dózisban adva) a melanoma vagy az aplasztikus mamas karcinoma sejtek injektálásával indukált tüdő áttételekre. A peptidekkel kezelt csoportokban a tüdő áttételek számának szignifikáns csökkenését figyeltük meg.

A fenti adatokra alapozva kijelenthetjük, hogy az említett peptidek meghosszabbították a tumoros állatok túlélési idejét, így antitumor aktivitást mutattak.

18.) Depresszióellenes aktivitás

A depresszióellenes aktivitás vizsgálatához az erőltetett úszás tesztet használtuk Porsolt és munkatársai szerint (Eur. J. Pharmacol., 47, 379-391, 1978).

Hím Wistar patkányokat (180-240 g testtömeg) használtunk ehhez a kísérlethez. A vizsgált peptideket a leírt előírások szerint alkalmaztuk. Röviden, a kontroll állatok sóoldatot kaptak, a felvétel 5 percig tartott, és az immobilitás idejét számoltuk. Az immobilitás ideje a kontrolinál 150 másodperc volt, míg a peptidekkel kezelt állatoknál csak 6070 másodperces értéket figyeltünk meg. Egy hatás válasz görbét számoltunk a következők szerint: 10 μg - 10 ng/kg teljes hatás, 10 pg/kg testtömeg az aktivitás még jelen van, 1 pg/kg nincs hatás.

Ezen peptidek farmakológiai vizsgálatának következő eredményei megmutatják, hogy a peptideknek a szervezetet a stressz és a betegségek ellen védő, általánosan a szervezet funkcióit normalizáló aktivitása van.

Használatuk szintén hatásos lehet néhány humán vagy állati betegség és zavar megelőzésében és kezelésében. Részletesebben, ezeket a vegyületeket a következők kezelésére használhatjuk:

- stressz által indukált zavarok és betegségek

- máj és hasnyálmirigy zavarok és léziók

- tesztisz sorvadás és sperma mobilitási zavarok

- termékenységi zavarok

- kereskedelmi tenyésztés fejlesztése

- rickettsia betegségek

- pajzsmirigy-, mellékpajzsmirigyektomia

- diabetes mellitus

- mellékvese zavarok

- a hematopoetikus rendszer zavarai

- koagulációs zavarok

- vérzési zavarok

- poszt-kasztrációs/menopauzális zavarok

- ischémiás vagy toxikus léziók

- pszichiátriai zavarok

- magas vérnyomás

- a testhőmérséklet zavarai

- fájdalom

- tumor

- depresszió

S

A leírt peptideket általában gyógyszerkészítmények széles választékában alkalmazhatjuk, egy nem toxikus gyógyszerészeti hordozó- vagy vivőanyaggal, valamint egy töltőanyaggal, nem toxikus pufferrel vagy fiziológiás sóoldattal kombinálva. Ez a gyógyszerkészítmény alkalmazható helyileg vagy szisztémásán, és bármely megfelelő formában lehet, mint folyékony, szilárd, szemiszolid, injektálható oldat, tabletta, kenőcs, lotion, kapszula, lingvalett vagy hasonlók.

A peptideket szisztémás alkalmazás esetén általában 10“⁵ 10^-2 mg/kg testtömeg dózisban adhatjuk be. Helyi kezelés esetén magasabb koncentrációban, 0,l%-0,5% között alkalmazhatók.

A szájon át való adagolás (intra gastric) esetén szintén jó aktivitásúak a vegyületek, és előnyösen semmilyen toxicitásra utaló jel nincs jelen 50 mg/kg testtömeg dózisig.

Az itt leírt peptideket szintetizálhatjuk lépésről lépésre, a védett aminosavak kondenzálásával homogén folyadékba rendszerben, vagy előnyösen szilárd fázisú eljárást alkalmazva. A ciklikus peptidek előállítására kívánt hosszúságú részlegesen védett lineáris peptideket állítunk elő , alkil észter csoporttal a C-terminálison, amit aziddá », ······· ······· • · ··· · · ··· ·· ζ

konvertálunk, majd összekapcsoljuk és eltávolítjuk a védőcsoportot. Alternatív módon a részlegesen védett, szabad végcsoporttal rendelkező lineáris peptideket ciklizálhatjuk difenilfoszforil aziddal, nagyon híg oldatban.

A találmányt a következő példákon át írjuk le, amelyek azonban nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

1. Példa

Peptidszintézis a Boc stratégiát alkalmazva:

A peptidszintézist 100 mg Boc-Val-PAM gyantával kezdtük, hogy C-terminálisan karboxillel rendelkező peptideket állítsunk elő (a PAM-ot az Applied Biosystemstől vásároltuk, a 0,56 meq/g helyettesítés az aminopolisztirén egy aminoacil-4-(oximetil)-fenilecetsav származéka). A Boc aminosavakat (Boc = tért.-butoxikarbonil-) egymás után a polimer hordozóra kondenzáltuk, kondenzációs reagensként diizopropilkarbodiimidet (DIPC) használva. A Boc csoportot minden lépésben trifluorecetsav (TFA) 50 %-os diklorometános oldatával távolítottuk el. Ezután az aminocsoportot deprotonáltuk diizopropiletilaminnal.

A konverziónak minden lépésben nagyobbnak kellett lennie

99,5%-nál. Ha nem így volt, a kondenzációt megismételtük. A : i

X teljes szintézis után a hasítást alacsony HF eljárással (2 óra 0°C) végeztük. A karboniumion eltávolítására anizolt használtunk. A HF-ot nitrogénárammal párologtattuk el. A tiszta nyers peptidet azután az olajos csapadék száraz éterbe öntésével kaptuk meg.

Ezután a nyers peptidet reverz fázisú HPLC-vel, 5 x 150 mm, RP-18 szilika géllel töltött oszlopot használva gradiens elucióval tisztítottuk, a következő oldószerrendszerrel: 0,1% TFA víz/acetonitrilben. Detekció: ultraibolya abszorbció 225 nm-nél. A 4. szekvenciájú peptid szintézisét a 4. ábrán mutatjuk be.

2. Példa

Peptidszintézis Fmoc stratégiát használva

A szintézishez standard Fmoc-kal védett aminosavakat használtunk (Fmoc

9-fluorenilmetilhiloxi-karbonil-). A lánc oldalsó funkciós csoportjait 0-tetra butilészterként (Asp,

Apm, Glu, Aad) és

Boc származékként (Lys) védtük. Az aminosavat (Val) polimerizált BHA hordozó (BHA benzhidrilamino gyanta) gyantára kötöttük, kötő reagensként diizopropil-karbodiimidet használva. A Fmoc védőcsoportot minden lépésben piperidinnel távolítottuk el. Azután a második és minden következő aminosavat azonos módon adtunk hozzá, amíg a szintézis teljes nem lett. A lehasítást

TFA/TFMSA/anizol = 2:17:52 (térf/térf) keverékkel végeztük.

A peptidet ezután az 1. példában leírt HPLC eljárással tisztítottuk. A 2. szekvenciájú peptid szintézisét a 2. ábra mutatja be.

3. Példa

Peptidszintézis Ddz stratégiát használva:

Minden aminosavat az alfa amino funkciónál Ddz-vel (= alfa, alfa-dimetil-3, 5 dimetoxibenziloxikarbonil-) védve alkalmaztunk. Az oldalsó funkciós csoportokat Z csoporttal (= benziloxikarbonil-) védtük a lizin esetében, és O-t-Bu csoporttal (t-butilészter) az aszparaginsav és a glutaminsav esetében.

Az első Ddz-aminosav kötésére 1,4 mmol/g kapacitású Merrifield hordozót (keresztkötött klorometilált polisztirén gél) használtunk, cézium só formájában. A diciklohexilkarbodiimiddel végzett kondenzáció után a Ddz védőcsoportot minden lépésben 5% TFA diklormetános oldatával távolítottuk el, amit 10% trietilamin diklorometános mosás és deprotonálás követett. A deprotonálás után lépést azonos

2^

S'' eljárással végeztük. Ezeket a lépéseket addig ismételtük, amig a peptidszekvencia teljes nem lett.

Végül a peptidet a polimer hordozóról HBr/TFA/anizol keverékével hasítottuk le. Az illó rész elpárologtatása után az így lehasított peptidet száraz éterből kicsaptuk és szárítottuk. A nyers peptidet azután az 1. példában leírt módon HPLC-vel tisztítottuk.

A 6. szekvenciájú peptid szintézisét a 3. ábrán mutatjuk be.

4. Példa

A ciklikus peptidek szintézise:

A következő részlegesen védett formában levő peptidet állítottuk elő az 1. vagy 2. példában leírt módszer szerint:

OBzl N0₂ OBzl

Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Arg-Pro-Ala-Asp-OH

A fenti peptid 0,0005 mólos dimetilformamidos oldatát ciklizáltuk difenilfoszforilazid és trietilamin hozzáadása után 20 °C-on, 12 órán át.

Azután ezt a keveréket hidrogéneztük hidrogén/palládium faszén katalizátorral 25°C-on 8 órán át.

Az oldószert gondosan elpárologtattuk és a nyers terméket az 1. példában leírt módon HPLC-vel tisztítottuk.

A 10. szekvenciájú ciklikus peptidet 10%-os kitermeléssel kaptuk meg:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Alá Asp

10

Lineáris és ciklikus peptidek szintézise a Ddz stratégiát használva:

Ugyanazt a Ddz védőcsoportokat alkalmazó stratégiát használtuk lineáris vagy ciklikus peptidek előállítására. Az oldalcsoportokat Z csoporttal (lizin) és O-benzilészter csoportokkal - OBzl - (glutaminsav és aszparaginsav) védtük. A polimer hordozó HICRAM^R gyanta volt (ORPEGEN védjegy, Heidelberg, Germany), ami 4-bromokrotonil-bétaalanilamidometil-polisztirén. Az első aminosavat (Ddz-valin) cézium sója formájában kötöttük a polimer hordozóhoz.

Ezután a Ddz csoportot trifluorecetsav (5%) diklorometános oldatával eltávolítottuk, és az aminocsoprotot deprotonáltuk diizopropiletilaminnal. A következőő lépésben a polimer mátrixon levő valin maradékhoz Ddz-glicint kapcsoltunk diizopropilkarbodiimidet (DIPC) használva, 1hidroxibenzotriazol j elenlétében.

Ezeket a lépéseket ismételtük, amíg a peptidlánc teljes lett. A védett formában levő szintetizált peptidet azután gondosan lehasítottuk a HYCRAM^R hordozóról tetrakisz (trifenil-foszfino)-palládiummal (0), majd vízmentes tetrahidrofuránban feloldottuk, oxigén jelenléte nélkül. Egy adalékanyagot, mint a morfolin, használtunk akceptor molekulaként az allilcsoporthoz.

A polimer hordozót kiszűrtük, és tetrahidrofuránnal mostuk. A peptidoldatot azután egy rövid szilikagél oszlopon szűrtük át, hogy eltávolítsuk a palládium katalizátort.

Az eluátumot, amely a részlegesen védett 4a. peptidet tartalmazza, az oldószer vákuumban történő elpárologtatása után szárítottuk.

£9

A 4. szekvenciájú lineáris peptid szintézise:

A részlegesen védett 4a. peptidet 2,2,2 trifluoroetanolban oldottuk, és hidrogén gázzal 30°C-on hidrogéneztük faszénen (10%), palládium jelenlétében. A katalizátort kiszűrtük, és az oldószert vákuumban elpárologtattuk. A nyers maradékot azután az 1. példában leírt módon HPLC-vel tisztítottuk. Tisztítás után a 4. szekvenciájú peptidet kaptuk. A termék azonos volt az 1. példában kapott vegyülettel.

A 9. szekvenciájú ciklikus peptid szintézise:

A 4a. részlegesen védett peptidet dimetilformamid/diklorometánban (1:1) feloldottuk úgy, hogy 0,001 mólos oldatot kapjunk. A ciklizációhoz DIPC-t és HOBtt adtunk hozzá, és 20°C-on 10 órán át állni hagytuk. Azután az oldatot kis térfogatra koncentráltuk, 2,2,2 trifluororetanollal hígítottuk, és Sephadex LH-20-val töltött oszlopon átengedve tisztítottuk. A részlegesen védett ciklikus 9a peptidet tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és hidrogén buborékoltatásával és intenzív rázással hidrogéneztük faszénen (10%), palládium katalizátorral 30°C-on 8 órán át.

Azután a katalizátort szűréssel eltávolítottuk, és az oldatot az oldószer vákuumban történő elpárologtatásával szárítottuk. A nyers peptidet az 1. példába leírt módon

HPLC-vel tisztítottuk. A kapott tiszta ciklikus peptidet a

9. szekvenciájú peptidként azonosítottuk.

A HYCRAM^R polimer hordozón való szintézist Ddz stratégiával, és a ciklizációt a 4. és 5. ábrán mutatjuk be. Minden szintetizált peptid tisztaságát HPLC eljárással ellenőriztük, RP-18 szilikagél oszlopot (Oktadecilszilanizált) használva, víz/acetonitril/trifluorecetsav oldószerkeverék gradiensével eluálva a szokásos módon. A tisztaság minden esetben nagyobb volt, mint 95%.

A peptideket aminosav analízissel (az értékek +-10%-on belül voltak az elméletileg várthoz képest), szekvencia analízissel, a molekulatömeg tömeg-FAB spektrometriás meghatározásával, ultraibolya és infravörös spektrummal jellemztük (6. és 7. ábra).

Bár részleteiben találmányunknak csak bizonyos megvalósítási módjait írtuk le, nyilvánvaló azoknak, akik a szakterületen jártasak, hogy számos más forma megvalósítható és számos változtatás tehető, amelyek a találmány gondolatán, és a csatolt igénypontok oltalmi körén belül maradnak.

♦ · · ·

Szekvencia lista

1) Általános információk:

(i) Bejelentő:

(A) NÉV: Predrag Sikiric (B) UTCA: Jurisiceva 5 (C) VÁROS: Zagreb (E) ORSZÁG:Horvátország (F) POSTA KÖD (ZIP): 41000 (A) NÉV: Mariján Petek (B) UTCA:Visnjica 29 (C) VÁROS:Zagreb (E) ORSZÁG:Horvátország (F) POSTA KÖD (ZIP): 41000 (A) NÉV: Sven Seiwerth (B) UTCA:Palmoticeva 17 (C) VÁRÓS:Zagreb (E) ORSZÁG:Horvátország (F) POSTA KÖD (ZIP) :41000 (A) NÉV: Zeljko Grabarevic (B) UTCA:Lermanova 12a (C) VÁROS:Zagreb

(E) ORSZ./G: Horvátország (F) POSTA KÖD (ZIP):41000 (A) NÉV: Branko Turkovic (B) UTCA:Bauerova 19 (C) VÁROS-.Zagreb (E) ORSZÁ.G: Horvátország (F) POSTA KÖD (ZIP):41000 (A) NÉV: Boris Mildner (B) UTCA:Kopernikova 34 (C) VÁROS: Zagreb (E) ORSZÁG:Horvátország (F) POSTA KÖD (ZIP):41000 (A) NÉV: Ernest Suchanek (B) UTCA:Aleja V. Popovica 125 (C) VÁROS: Zagreb (E) ORSZÁG:Horvátország (F) POSTA KÖD (ZIP):41000 (A) NÉV: Ivó Rotkvic (B) UTCA:Cvijetno naselje 1/21 (C) VÁROS: Zagreb (E) ORSZÁG:Horvátország (F) POSTA KÖD (ZIP):41000 ί

(A) NÉV: Marko Duvnjak (B) UTCA:Roze Luksemburg 4 (C) VÁROS:Zagreb (E) ORSZÁG:Horvátország (F) POSTA KÖD (ZIP):41000 (A) NÉV: Stjepan Mise (B) UTCA:Ruzveitova 37 (C) VÁROS:Split (E) ORSZÁG:Horvátország (F) POSTA KÖD (ZIP) :58000 (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Szerves-védő aktivitással rendelkezi proteinek, és eljárás előállításukra, és terápiás használatuk (iii) SZEKVENCIÁK SZÁMA: 11 (iv) SZÁMÍTÓGÉP ÁLTAL OLVASHATÓ FORMA:

(A) MÉDIUM TÍPUSA: floppy diszk (B) SZÁMÍTÓGÉP:IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER:PC-DOS/MS-DOS (D) SZOFTVER:PatentIn Release #1.0, #1.25 verzió (EPO) (v) AKTUÁLIS BEJELENTÉSI ADATOK:

A BEJELENTÉS SZÁMA: WO PCT/EP 93/01352 • · · • · · ···:

ί

2) A 1. SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG:15 aminosav (B) TÍPUS:aminosav (C) SZÁLTIPUS:egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA:peptid (v) A FRAGMENTUM TÍPUSA:N-terminális (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS:peptid (B) ELHELYEZKEDÉS:1... 15 (C) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/cimke=l.

(x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(A) SZERZŐK:Sikiric, Predrag

Petek, Mariján

Rucman, Rudolf

Rotkvic, Ivó

Seiwerth, Sven

Grabarevic, Zeljko

Suchanek, Ernest

Jagic, V.

Krnjevic, Hrvoje szkevencia

AG

Mise, Stjepan

Duvnjak, Marko

Danilovic, Z.

Turkovic, Branko

Udovicic, Iván (B) CiM:Hypothesis: Stomach stress response, diagnostic and therapeutical value - a new approach in organoprotection (C) FOLYÓIRAT:Exp, Clin. Gastroenterol.

(D) KÖTET:1 (E) KIADÁS:1 (F) OLDALAK:15-25 (G) DÁTUM:1991. jan-mar.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 1. SZEKVENCIÁBAN:2 -12 (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(H) DOKUMENTUM SZÁM:EP 0 432 400 A2 (I) BEJELENTÉSI DÁTUM :1990. szept. 11.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A . SZEKVENCIÁBAN:2 -12 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1. SZEKVENCIA:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Asp Alá Leu Gly

10

Val

2) A 2. SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG:15 aminosav (B) TÍPUS:aminosav (C) SZÁLTIPUS:egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA:peptid (v) A FRAGMENTUM TIPUSA:N-terminális (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS:peptid (B) ELHELYEZKEDÉS :1...15 (C) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/cimke=2.

(x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(A) SZERZŐK:Sikiric, Predrag

Petek, Mariján

Rucman, Rudolf

Rotkvic, Ivó

Seiwerth, Sven

Grabarevic, Zeljko

Suchanek, Ernest

Jagic, v.

Krnj évi c, Hrvoj e

Mise, Stjepan

Duvnj ak, Marko szekvencia

Danilovic, Z.

Turkovic, Branko

(D) KÖTET:1 (E) KIADÁS:1 (F) OLDALAK:15-26 (G) DÁTUM:1991. jan-mar.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 2. SZEKVENCIÁBAN:1-15 (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(H) DOKUMENTUM SZÁM:EP 0 432 400 A2 (I) BEJELENTÉSI DÁTUM:1990. szept. 11.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 2. SZEKVENCIÁBAN:1-15 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 3. SZEKVENCIA

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Asp Alá Gly Leu

10

Val

2) A 3. SZEKVENCIA ADATAI:

a (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG:15 aminosav (B) TÍPUS:aminosav (C) SZÁLTIPUS:egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA:péptid (v) A FRAGMENTUM TÍPUSA:N-terminális (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS:peptid (B) ELHELYEZKEDÉS :1...15 (C) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/cimke=3. szekvencia (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(A) SZERZŐK:Sikiric, Predrag

Petek, Mariján

Rucman, Rudolf

Rotkvic, Ivó

Seiwerth, Sven

Grabarevic, Zeljko

Suchanek, Ernest

Jagic, V.

Krnj évi c, Hrvoj e

Mise, Stjepan

Duvnj ak, Marko «

• ··*< ·« I : .

• ν· ··

Danilovic, Z.

Turkovic, Branko

(D) KÖTET:1 (E) KIAEÁS : 1 (F) OLDALAK:15-26 (G) DÁTUM :1991. jan-mar.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 3. SZEKVENCIÁBA: 7 -12 (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(H) DOKUMENTUM SZÁM:EP 0 432 400 A2 (I) BEJELENTÉSI DÁTUM:1990. szept. 11.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 3. SZEKVENCIÁBA:7-12 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 3. SZEKVENCIA

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp Asp Alá Leu Gly

10

Val

2) A 4. SZEKVENCIA AATAI :

···· · ·· · ··*· «·!···· · • · *·· « · • · e · · · · (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG:14 aminosav (B) TÍPUS:aminosav (C) SZÁLTIPUS:egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA:péptid (v) A FRAGMENTUM TIPUSA:N-terminális (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS:peptid (B) ELHELYEZKEDÉS :1...14 (C) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/cimke=4. szekvencia (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(A) SZERZŐK:Sikiric, Predrag

Petek, Mariján

Rucman, Rudolf

Rotkvic, Ivó

Seiwerth, Sven

Grabarevic, Zeljko

Suchanek, Ernest

Jagic, V.

Krnjevic, Hrvoje

Mise, Stjepan

Duvnj ak, Marko

Danilovic, Ζ.

Turkovic, Branko

(D) KÖTET:1 (E) KIADÁS:1 (F) OLDALAK:15-26 (G) DÁTUM:1991. jan-mar.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 4. SZEKVENCIÁBAN:7-10 (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(H) DOKUMENTUM SZÁM:EP 0 432 400 A2 (I) BEJELENTÉSI DÁTUM:1990. szept. 11.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 4. SZEKVENCIÁBAN:7-10 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 4. SZEKVENCIA

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp Alá Leu Gly

10

Val

2) A 5. SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG:14 aminosav (B) TÍPUS:aminosav (C) SZÁLTIPUS:egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA:peptid (v) A FRAGMENTUM TIPUSA:N-terminális (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS:peptid (B) ELHELYEZKEDÉS :1...14 (C) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/cimke=5. szekvencia (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(A) SZERZŐK:Sikiric, Predrag

Petek, Mariján

Rucman, Rudolf

Rotkvic, Ivó

Seiwerth, Sven

Grabarevic, Zeljko

Suchanek, Ernest

Jagic, V.

Krnj évi c, Hrvoj e

Mise, Stjepan

Duvnj ak, Marko ···«

Danilovic, Z.

Turkovic, Branko

(D) KÖTET:1 (E) KIADÁS:1 (F) OLDALAK:15-26 (G) DÁTUM:1991. jan-mar.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 5. SZEKVENCIÁBAN:1-10 (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(H) DOKUMENTUM SZÁM:EP 0 432 400 A2 (I) BEJELENTÉSI DÁTUM:1990. Szept. 11.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 5. SZEKVENCIÁBAN:1-10 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 5. SZEKVENCIA

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Alá Gly Leu

10

Val

2) A 6. SZEKVENCIA ADATAI:

• · · ·

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG:8 aminosav (B) TÍPUS:aminosav (C) SZÁLTIPUS:egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA:peptid (v) A FRAGMENTUM TÍPUSA:N-terminális (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS:peptid (B) ELHELYEZKEDÉS :1...8 (C) EGYÉB INFORIVÁCIö:/cimke=6 .

(x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(A) SZERZŐK:Sikiric, Predrag

Petek, Mariján _λ Rucman, Rudolf

Rotkvic, Ivó

Seiwerth, Sven

Grabarevic, Zeljko

Suchanek, Ernest

Jagic, V.

Krnjevic, Hrvoje

Mise, Stjepan

Duvnjak, Marko szekvencia

Danilovic, Z.

Turkovic, Branko

Udovicic, Iván (B) CiM:Hypothesis: Stomach stress response, diagnostic and therapeutical value - a new approach in o rganopro t e c t i on (C) FOLYÓIRAT:Exp, Clin. Gastroenterol.

(D) KÖTET:1 (E) KIADÁS : 1 (F) OLDALAK:15-26 (G) DÁTUM:1991. jan-mar.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 6. SZEKVENCIÁBAN: 1-4 (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(H) DOKUMENTUM SZÁM:EP 0 432 400 A2 (I) BEJELENTÉSI DÁTUM:1990. szept. 11.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 6. SZEKVENCIÁBAN:1-4 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 6. SZEKVENCIA

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá

5

2) A 7. SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG:9 aminosav (B) TÍPUS:aminosav

• · · ·

(C) SZ.ÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA:peptid (v) A FRAGMENTUM TIPUSA:N-terminális (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS:peptid (B) ELHELYEZKEDÉS :1...9 (C) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/cimke=7. szekvencia (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(A) SZERZŐK:Sikiric, Predrag

Petek, Mariján

Rucman, Rudolf

Rotkvic, Ivó

Seiwerth, Sven

Grabarevic, Zeljko

Suchanek, Ernest

Jagic, V.

Krnj evi c, Hrvoj e

Mise, Stjepan

Duvnjak, Marko

Danilovic, Z.

Turkovic, Branko

Udovicic, Iván • · ·

··· (B) CiM:Hypothesis: Stomach stress response, diagnostic and therapeutical value - a new approach in organoprotection (C) FOLYÓIRAT:Exp, Clin. Gastroenterol.

(D) KÖTET:1 (E) KIADÁS:1 (F) OLDALAK:15-26 (G) DÁTUM:1991. jan-mar.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 7. SZEKVENCIÁBAN:2-4 (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(H) DOKUMENTUM SZÁM:EP 0 432 400 A2 (I) BEJELENTÉSI DÁTUM:1990. szept. 11.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 7. SZEKVENCIÁBAN: 2-4 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 7. SZEKVENCIA

Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Alá Asp

5

2) A 8. SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG:9 aminosav (B) TÍPUS:aminosav (C) SZÁLTIPUS:egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris *>

Ul (ii) A MOLEKULA TÍPUSA:peptid (v) A FRAGMENTUM TIPUSA:N-terminális (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS:peptid (B) ELHELYEZKEDÉS :1...9 (C) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/cimke=8.

(x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(A) SZERZŐK:Sikiric, Predrag

Petek, Mariján

Rucman, Rudolf

Rotkvic, Ivó

Seiwerth, Sven

Grabarevic, Zeljko

Suchanek, Ernest

Jagic, V.

Krnj évi c, Hrvoj e

Mise, Stjepan

Duvnj ak, Marko

Danilovic, Z.

Turkovic, Branko

Udovicic, Iván szekvencia (B) CiM:Hypothesis: Stomach stress response, diagnostic and therapeutical value - a new approach in bű ··: ι organoprotection (C) FOLYÓIRAT:Exp, Clin. Gastroenterol.

(D) KÖTET:1 (E) KIADÁS:1 (F) OLDALAK:15-26 (G) DÁTUM:1991. jan-mar.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 8. SZEKVENCIÁBAN:1-4 (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(H) DOKUMENTUM SZÁM:EP 0 432 400 A2 (I) BEJELENTÉSI DÁTUM :1990. szept. 11.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 8. SZEKVENCIÁBAN:1-4 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 8. SZEKVENCIA

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp

5

2) A 9. SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG:14 aminosav (B) TÍPUS:aminosav (C) SZÁLTIPUS:egyszálú (D) TOPOLÓGIA:cirkuláris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA:peptid (ν) A FRAGMENTUM TIPUSA:N-terminális (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS:peptid (B) ELHELYEZKEDÉS :1...14 (C) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/cimke=9. szekvencia (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(A) SZERZŐK:Sikiric, Predrag

Petek, Mariján

Rucman, Rudolf

Rotkvic, Ivó

Seiwerth, Sven

Grabarevic, Zeljko

Suchanek, Ernest

Jagic, V.

Krnj évi c, Hrvoj e

Mise, Stjepan

Duvnj ak, Marko

Danilovic, Z.

Tu rkovi c, Branko

(D) KÖTET:1 (E) KIADÁS : 1 (F) OLDALAK:15-26 (G) DÁTUM:1991. jan-mar.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 9. SZEKVENCIÁBAN:2-5 (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(H) DOKUMENTUM SZÁM:EP 0 432 400 A2 (I) BEJELENTÉSI DÁTUM:1990. szept. 11.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 9. SZEKVENCIA BÁN: 2 - 5 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 9. SZEKVENCIA

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp Alá Leu Gly

10

Val

2) A 10. SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG:10 aminosav (B) TÍPUS:aminosav (C) SZÁLTIPUS:egyszálú (D) TOPOLÓGIA:cirkuláris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA:peptid (v) A FRAGMENTUM TIPUSA:N-terminális

• · : . · ··· ·· (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS:péptid (B) ELHELYEZKEDÉS :1...10 (C) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/cimke=10. szekvencia (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(A) SZERZŐK:Sikiric, Predrag

Petek, Mariján

Rucman, Rudolf

Rotkvic, Ivó

Seiwerth, Sven

Grabarevic, Zeljko

Suchanek, Ernest

Jagic, V.

Krnjevic, Hrvoje

Mise, Stjepan

Duvnj ak, Marko

Danilovic, Z.

Turkovic, Branko

(D) KÖTET:1 (E) KIADÁS :1 (F) OLDALAK:15-26

A (G) DÁTUM:1991. jan-mar.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 10. SZEKVENCIÁBAN:1-6 (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(H) DOKUMENTUM SZÁM:EP 0 432 400 A2 (I) BEJELENTÉSI DÁTUM:1990. szept. 11.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 10. SZEKVENCIÁBAN:1-6 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 10. SZEKVENCIA

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Alá Asp

10

2) A 11. SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG:9 aminosav (B) TÍPUS:aminosav (C) SZÁLTIPUS:egyszálú (D) TOPOLÓGIA:lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA.-peptid (v) A FRAGMENTUM TÍPUSA:N-terminális (ix) JELLEMZÉS:

(A) NÉV/KULCS:peptid ····

(B) ELHELYEZKEDÉS :1...9 (C) EGYÉB INFORMÁCIÓ:/cimke=ll. szekvencia (x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(A) SZERZŐK:Sikiric, Predrag

Petek, Mariján

Rucman, Rudolf

Rotkvic, Ivó

Seiwerth, Sven

Grabarevic, Zeljko

Suchanek, Ernest

Jagic, V.

Krnj evi c, Hrvoj e

Mise, Stjepan

Duvnj ak, Marko

Danilovic, Z.

Turkovic, Branko

Udovi c i c, Iván (B) CiM:Hypothesis: Stomach stress response, diagnostic and therapeutical value - a new approach in organoprotection (C) FOLYÓIRAT:Exp, Clin. Gastroenterol.

(D) KÖTET:1 (E) KIADÁS :1 (F) OLDALAK:15-26 (G) DÁTUM:1991. jan-mar.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 11. SZEKVENCIÁBAN:1-4

(x) PUBLIKÁCIÓS INFORMÁCIÓK:

(H) DOKUMENTUM SZÁM:EP 0 432 400 A2 (I) BEJELENTÉSI DÁTUM:1990. szept. 11.

(K) RELEVÁNS GYÖKÖK A 11. SZEKVENCIÁBA:1-4 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 11. SZEKVENCIA

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asn

Claims

1. Magas biológiai aktivitással rendelkező peptidek egy új osztálya azzal jellemezve, hogy 8-15 aminosavat tartalmaznak, és hogy a következő általános képlettel írhatók le:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Alá Asp Zaa Alá Xaa Xaa

15 10

Xaa ahol:

Xaa jelentése egy semleges alifás aminosav, mint:

Alá, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva

Yaa jelentése egy bázikus aminosav, mint:

Lys, Arg, Orn, His

Zaa jelentése egy savas aminosav, mint:

Glu, Asp, Aad vagy Apm;

ahol legalább egy az Xaa vagy Zaa gyökök közül elhagyható.

2. Az 1. igénypont szerinti peptidek, ahol a molekula az első és az utolsó aminosav közötti peptidkötés által ciklizált.

ς~χ

3. Az 1. szekvenciájú peptid, amelynek képlete:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Asp Alá Leu Gly

15 10

Val

4. Az 2. szekvenciájú peptid, amelynek képlete:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Asp Alá Gly Leu

1 Val 15 5 10 5. Az 3. szekvenciájú peptid, amelynek képlete:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp Asp Alá Leu Gly 15 10

Val

6. Az 4. szekvenciájú peptid, amelynek képlete:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp Alá Leu Gly

15 10

Val

I

7. Az 5. szekvenciájú peptid, amelynek képlete:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Alá Asp Alá Gly Leu

15 10

Val

8. Az 6. szekvenciájú peptid, amelynek képlete:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá

9. Az 9. szekvenciájú peptid, amelynek képlete:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asp Alá Leu Gly Val 25 1013

10. Az 10. szekvenciájú peptid, amelynek képlete:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Alá Asp

I 2 5 9I

11. Az 11. szekvenciájú peptid, amelynek képlete:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Alá Asn

159

12. Terápiás készítmény, amely egy vagy több az l.-ll. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet tartalmaz egy ·· ··· ··* ··· *··*

Go

Gyogyszsrészetileg elfogadható szilárd vagy folyékony hordozóval összekeverve.

13. Az l.-ll. igénypontok szerinti új peptidek használata a következők kezelésére: stressz által indukált zavarok és betegségek, máj és hasnyálmirigy zavarok és léziók, tesztisz sorvadás és spermamobilitási zavarok, termékenységi zavarok, kereskedelmi tenyésztés fejlesztése, rickettsia betegségek, pajzsmirigy-, mellékpajzsmirigyektomia, diabetes mellitus, mellékvese zavarok, a vérképző rendszer zavarai, koagulációs zavarok, vérzési zavarok, posztkasztrációs/menopauzális zavarok, ishemiás és toxikus léziók, pszichiátriai zavarok, magas vérnyomás, a testhőmérséklet zavarai, fájdalom, tumor, depresszió.