JPS62116598A - インシユリン誘導体の製造方法 - Google Patents
インシユリン誘導体の製造方法Info
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- JPS62116598A JPS62116598A JP61266447A JP26644786A JPS62116598A JP S62116598 A JPS62116598 A JP S62116598A JP 61266447 A JP61266447 A JP 61266447A JP 26644786 A JP26644786 A JP 26644786A JP S62116598 A JPS62116598 A JP S62116598A
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- insulin
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- compound
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は大インシュリンの製造方法に関するものである
。本発明者らはトリプシンまたはカルボニル側塩基性ア
ミノ酸残基に特異性を示すトリプシン様酵素の作用によ
りデス−８３０−インシュリンに１〜１００倍モル量の
スレオニン誘導体を反応させて、ついで得られる縮合物
から保護基を除去してインシュリンを得る方法を発見し
た。
。本発明者らはトリプシンまたはカルボニル側塩基性ア
ミノ酸残基に特異性を示すトリプシン様酵素の作用によ
りデス−８３０−インシュリンに１〜１００倍モル量の
スレオニン誘導体を反応させて、ついで得られる縮合物
から保護基を除去してインシュリンを得る方法を発見し
た。
インシュリンは糖尿病の治療薬として代替品のない貴重
な薬物であり、現在主として牛インシュリンおよび豚イ
ンシュリンが治療に用いられている。しかし、これらの
インシュリンは構成アミノ酸の一部が人インシュリンと
異なっているため、体内で抗体が産生されることがあり
、抗体が産生されるとそれ以後のインシュリンの治療効
果が著しく低下するなどの問題を生じる。したがって、
工業的規模で行ないうる人インシュリンの合成方法の確
立が強く望まれている。
な薬物であり、現在主として牛インシュリンおよび豚イ
ンシュリンが治療に用いられている。しかし、これらの
インシュリンは構成アミノ酸の一部が人インシュリンと
異なっているため、体内で抗体が産生されることがあり
、抗体が産生されるとそれ以後のインシュリンの治療効
果が著しく低下するなどの問題を生じる。したがって、
工業的規模で行ないうる人インシュリンの合成方法の確
立が強く望まれている。
本発明者らの方法によれば、人インシュリンとＢ鎖３０
位のアミノ酸のみが異なる豚インシュリンを原料に用い
て人インシュリンを容易に合成することができる。この
ようにして得られる人インシュリンが理想的な治療用イ
ンシュリンであることは論を俟たない。
位のアミノ酸のみが異なる豚インシュリンを原料に用い
て人インシュリンを容易に合成することができる。この
ようにして得られる人インシュリンが理想的な治療用イ
ンシュリンであることは論を俟たない。
豚デスオクタペプチドインシュリンと人インシュリンオ
クタペプチドから大インシュリンを得る試ミハ、エム・
ニー・ルツテンベルク（Ｍ、Ａ。
クタペプチドから大インシュリンを得る試ミハ、エム・
ニー・ルツテンベルク（Ｍ、Ａ。
Ｒｕｔｔｅｎｂｅｒｇ ）がサイエンス（５ｃｉｅｎｃ
ｅ） １７７巻６２３頁（１９７２年）に、およびアー
ル・オーベルマイヤー（Ｒ８Ｑｂａｒｍｅｉａｒ ）ら
がサイツシュリフト・シュア・ヒジオロジツシエ・ヘミ
−（Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｉｉｒ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌｏｇｉｓｃｈａ Ｃｈｅｍｉｅ） ３５７巻７５９頁
（１９７６年）に発表しているように既になされている
が、何れも化学的手段によるものであり、前者において
は工程の最後にアルカリ処理を含み、これに伴う副反応
がさけられない。また後者の場合は反応が非特異的で多
くの副反応を生じるため、精製が複雑かつ困難となり収
率も著しく低い。従って、工業的規模では到底行ない得
ない。
ｅ） １７７巻６２３頁（１９７２年）に、およびアー
ル・オーベルマイヤー（Ｒ８Ｑｂａｒｍｅｉａｒ ）ら
がサイツシュリフト・シュア・ヒジオロジツシエ・ヘミ
−（Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｉｉｒ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌｏｇｉｓｃｈａ Ｃｈｅｍｉｅ） ３５７巻７５９頁
（１９７６年）に発表しているように既になされている
が、何れも化学的手段によるものであり、前者において
は工程の最後にアルカリ処理を含み、これに伴う副反応
がさけられない。また後者の場合は反応が非特異的で多
くの副反応を生じるため、精製が複雑かつ困難となり収
率も著しく低い。従って、工業的規模では到底行ない得
ない。
一方、本発明者らの方法はデスーＢ３０−インシュリン
とＬ−スレオニン誘導体とを酵素反応により縮合させて
インシュリンを得る方法で、公知の化学的手段による方
法とは異なり、反応が特異的で副反応も生ぜず、ラセミ
化も起きず、未反応原料を損なわずに回収できる、等の
利点を有する。
とＬ−スレオニン誘導体とを酵素反応により縮合させて
インシュリンを得る方法で、公知の化学的手段による方
法とは異なり、反応が特異的で副反応も生ぜず、ラセミ
化も起きず、未反応原料を損なわずに回収できる、等の
利点を有する。
さらに同方法では、１〜１００倍モル量のし一スレオニ
ン誘導体を用いることにより、通常の酵素反応では当然
起きるＢ鎖２２位のアルギニンのカルボニル側切断が防
止され、したがって通常の酵素反応では必須であるアル
ギニン側鎖への保護基導入が不必要である。
ン誘導体を用いることにより、通常の酵素反応では当然
起きるＢ鎖２２位のアルギニンのカルボニル側切断が防
止され、したがって通常の酵素反応では必須であるアル
ギニン側鎖への保護基導入が不必要である。
同方法は、トリプシンまたはカルボニル偵ｊ塩基性アミ
ノ酸残基に特異性を示すトリプシン様酵素の存在下に、
Ｂ鎖３０位のアミノ酸が欠けたデスーＢ３０−インシュ
リン（以下化合物■と記す）に１〜１００倍モル量のＬ
−スレオニン誘導体（以下化合物■と記す）を反応させ
、ついで得られる縮合物から保護基を除去することより
なる。
ノ酸残基に特異性を示すトリプシン様酵素の存在下に、
Ｂ鎖３０位のアミノ酸が欠けたデスーＢ３０−インシュ
リン（以下化合物■と記す）に１〜１００倍モル量のＬ
−スレオニン誘導体（以下化合物■と記す）を反応させ
、ついで得られる縮合物から保護基を除去することより
なる。
化合物Ｉは下記の一般式で表わされる。
ＣＨ。
ＣＨ−ＯＲ’
Ｉ
ＨｆｆｉＮ−ＣＨ−ＣＯＯＲ”
（式中 Ｒ１は水素またはヒドロキシ基の保護基、Ｒ″
はカルボキシル基の保護基をそれぞれ表わす。） 上記の化合物■は豚起源のインシュリンにカルボキシペ
プチダーゼＡを作用させることにより得られ、例えば、
イ・ダブりニー・シュミット（Ｅ。
はカルボキシル基の保護基をそれぞれ表わす。） 上記の化合物■は豚起源のインシュリンにカルボキシペ
プチダーゼＡを作用させることにより得られ、例えば、
イ・ダブりニー・シュミット（Ｅ。
Ｗ、 Ｓｃｈｍｉｔｔ）らがホツペーセイラーズ・サイ
トシュリフト・フユア・ヒジオロジツシエ・ヘミ−（）
！ｏｐｐｅ−５ａｙｌｅｒ’ｓ Ｚａｉｔｓｃｈｒｔｆ
ｔ ｆｉｉｒ ＰｈｙｓｃｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅＣｈｅ
ｍｉｅ） ３５９巻７９９頁（１９７８年）に記載して
いる方法により製造できる。またアクロモバクタ−・リ
ティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔａｒ １ｙｔｉｃｕ
ｓ）が産生するリジンに特異性を有し、リシ′ンのカル
ボニル側を切断する酵素を用いても容易に製造すること
ができる。同酵素の分離および性状については、正本ら
がアグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ４２巻１４４
３頁（１９７８年）に発表しており、同論文においては
上記性状を有する酵素をプロテアーゼＩと称している。
トシュリフト・フユア・ヒジオロジツシエ・ヘミ−（）
！ｏｐｐｅ−５ａｙｌｅｒ’ｓ Ｚａｉｔｓｃｈｒｔｆ
ｔ ｆｉｉｒ ＰｈｙｓｃｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅＣｈｅ
ｍｉｅ） ３５９巻７９９頁（１９７８年）に記載して
いる方法により製造できる。またアクロモバクタ−・リ
ティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔａｒ １ｙｔｉｃｕ
ｓ）が産生するリジンに特異性を有し、リシ′ンのカル
ボニル側を切断する酵素を用いても容易に製造すること
ができる。同酵素の分離および性状については、正本ら
がアグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ４２巻１４４
３頁（１９７８年）に発表しており、同論文においては
上記性状を有する酵素をプロテアーゼＩと称している。
化合物Ｉは、その側鎖官能基であるヒドロキシ基が保護
されていなくとも反応に供しうるが、保護基を導入する
ならは、ペプチド合成反応で通常利用される保護基、例
えば、ｔ−ブチル、ペンシル、アセチルなどを用いると
よい。また、化合物■のカルボキシル基は保護きれてい
ることが必要で、通常用いられるカルボキシル基の保護
基を使用すればよい。例えば、ｔ−ブチル、ペンシルな
どのアルキルおよびアラルキルエステルの形で修飾する
。
されていなくとも反応に供しうるが、保護基を導入する
ならは、ペプチド合成反応で通常利用される保護基、例
えば、ｔ−ブチル、ペンシル、アセチルなどを用いると
よい。また、化合物■のカルボキシル基は保護きれてい
ることが必要で、通常用いられるカルボキシル基の保護
基を使用すればよい。例えば、ｔ−ブチル、ペンシルな
どのアルキルおよびアラルキルエステルの形で修飾する
。
上記の保護基の選択においては、それらの保護基の導入
または除去処理において、インシュリンを変性したり失
活したりしないものを選択するよう考慮すべきである。
または除去処理において、インシュリンを変性したり失
活したりしないものを選択するよう考慮すべきである。
ペプチド合成に用いる保護基については、エム・ポダン
スツキー（Ｍ、 Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）らがペプチド・
シンセンス（Ｐｅｐｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉＳ）第
２版（１９７６年）（ジョン・ウィリー・アンド・サン
ス（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ））に詳しく
記載している。
スツキー（Ｍ、 Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）らがペプチド・
シンセンス（Ｐｅｐｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉＳ）第
２版（１９７６年）（ジョン・ウィリー・アンド・サン
ス（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ））に詳しく
記載している。
なお、保護基の選択においては、−回の保護基脱離操作
により同時に除去できものを選ぶのが好ましいことは論
を俟たない。
により同時に除去できものを選ぶのが好ましいことは論
を俟たない。
同方法で使用する酵素は、トリプシンまたは各種動植物
および微生物起源のカルボキンル側塩基性アミノ酸に特
異性を示すトリプシン様酵素などを含む。トリブレン様
酵素としては、例えば、ストレプトマイ゛セス属菌から
抽出分離された酵素がある。同酵素については電属らが
アーキパス・才ブ・バイオケミストリー・アンド・バイ
オフイジクス（Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 ＞ １２６巻９７１頁（１９６８年）に、
吉田らがエフイービーニス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔ、 ） １５巻１２９頁（１９７１年）に記載して
いる。使用する酵素は混在するキモトリプシンまたはキ
モトリプシン様の活性を除去する目的でトンルーし一フ
ェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）などで
処理するとよい。
および微生物起源のカルボキンル側塩基性アミノ酸に特
異性を示すトリプシン様酵素などを含む。トリブレン様
酵素としては、例えば、ストレプトマイ゛セス属菌から
抽出分離された酵素がある。同酵素については電属らが
アーキパス・才ブ・バイオケミストリー・アンド・バイ
オフイジクス（Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 ＞ １２６巻９７１頁（１９６８年）に、
吉田らがエフイービーニス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔ、 ） １５巻１２９頁（１９７１年）に記載して
いる。使用する酵素は混在するキモトリプシンまたはキ
モトリプシン様の活性を除去する目的でトンルーし一フ
ェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）などで
処理するとよい。
化合物Ｉと化合物■の縮合反応は上記の酵素のペプチド
結合形成反応に適した条件で行なわれる。ｐＨは５〜８
、特に６〜７付近が好ましく、反応温度は０〜５０℃、
とくに２０〜４０℃がよい。化合物Ｉと化合物■の濃度
は可能なかぎり高いことがのぞましい。さらに化合物工
と化合物■は１：１〜１００：１のモル比で反応させる
のがよく、とくに２０：１〜１〜１００：１付近がよい
。反応液には水と混合しろる適当な有機溶媒を加える。
結合形成反応に適した条件で行なわれる。ｐＨは５〜８
、特に６〜７付近が好ましく、反応温度は０〜５０℃、
とくに２０〜４０℃がよい。化合物Ｉと化合物■の濃度
は可能なかぎり高いことがのぞましい。さらに化合物工
と化合物■は１：１〜１００：１のモル比で反応させる
のがよく、とくに２０：１〜１〜１００：１付近がよい
。反応液には水と混合しろる適当な有機溶媒を加える。
有機溶媒の添加は、反応液中の水の濃度を下げて、逆反
応である加水分解反応を抑えるだけでなく、化合物Ｉお
よび化合物■の溶解性を著しく高める点で効果がある。
応である加水分解反応を抑えるだけでなく、化合物Ｉお
よび化合物■の溶解性を著しく高める点で効果がある。
有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、グリセ
リンなどを単独で°または組合せて用いる。とくに０〜
６５％、とくに４０〜６０％の濃度で用いるとよい。一
般に、有機溶媒を用いる場合は、原料の溶解度、酵素の
変性や加水分解反応などを考慮して水に対する割合を決
定する０反応液の緩衝剤としては、トリスヒドロキシメ
チルアミノメタン（トリス）や炭酸塩などが用いられる
。
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、グリセ
リンなどを単独で°または組合せて用いる。とくに０〜
６５％、とくに４０〜６０％の濃度で用いるとよい。一
般に、有機溶媒を用いる場合は、原料の溶解度、酵素の
変性や加水分解反応などを考慮して水に対する割合を決
定する０反応液の緩衝剤としては、トリスヒドロキシメ
チルアミノメタン（トリス）や炭酸塩などが用いられる
。
反応液の酵素濃度は基質濃度や酵素の活性で異なってく
るが、市販結晶トリプシンを用いる場合は１ｍｇ／ｍ１
〜１０ ｍｇ／ ｍｌ付近がよい。酵素はそのまま用い
てもよいし、適当な不溶性担体に結合又は包含させた固
定化酵素として用いてもよい。
るが、市販結晶トリプシンを用いる場合は１ｍｇ／ｍ１
〜１０ ｍｇ／ ｍｌ付近がよい。酵素はそのまま用い
てもよいし、適当な不溶性担体に結合又は包含させた固
定化酵素として用いてもよい。
反応時間は、反応条件により異なるが、通常は酵素反応
が平衝に達するに要する時間をとればよく、通常３〜７
２時間、多くの場合６〜２４時間程度である。
が平衝に達するに要する時間をとればよく、通常３〜７
２時間、多くの場合６〜２４時間程度である。
反応終了後はペプチドの分離法として通常用いられる方
法を組合せて利用し、Ｂ鎖３０位スレオニンがカルボキ
シル基に保護基を省しかつヒドロキシ基に保護基を有し
ていてもよい人インシュリンを得、ついで目的とする人
インシュリンを得る。
法を組合せて利用し、Ｂ鎖３０位スレオニンがカルボキ
シル基に保護基を省しかつヒドロキシ基に保護基を有し
ていてもよい人インシュリンを得、ついで目的とする人
インシュリンを得る。
例えば、反応終了後反応液をゲル濾過にかけ、未反応の
化合物Ｉおよび酵素を単離回収する。回収した化合物■
および酵素はそのまま再使用が可能である。残部を適当
なりロマトグラフイーに付し、生成したＢ鎖３０位スレ
オニンがカルボキシル基に保護基を有しかつヒドロキシ
基に保護基を有シテいてもよい大インシュリンと未反応
デス−Ｂ２Ｏ−インシュリンを分離する。後者は化合物
■として再使用できる。前者は更に保護基脱離反応に付
し、人インシュリンとする。
化合物Ｉおよび酵素を単離回収する。回収した化合物■
および酵素はそのまま再使用が可能である。残部を適当
なりロマトグラフイーに付し、生成したＢ鎖３０位スレ
オニンがカルボキシル基に保護基を有しかつヒドロキシ
基に保護基を有シテいてもよい大インシュリンと未反応
デス−Ｂ２Ｏ−インシュリンを分離する。後者は化合物
■として再使用できる。前者は更に保護基脱離反応に付
し、人インシュリンとする。
保護基の脱離方法は用いる保護基によって異なるが、通
常の脱離方法に準じて行えばよく、例えば、ヒドロキシ
基やカルボキシル基の保護基として使用されるｔ−ブチ
ル基は、カチオン捕捉剤（例えばアニソール）の存在下
トリフルオロ酢酸で処理すると脱離する。前者のように
単一の脱離処理で除去できる保護基をスレオニンの側鎖
官能基およびカルボキシル基の保護に用いると、脱離処
理が簡単で収率も向上する。カルボキシル末端がその他
のエステルになっている場合も適当な加水分解処理によ
り保護基を除去できる。
常の脱離方法に準じて行えばよく、例えば、ヒドロキシ
基やカルボキシル基の保護基として使用されるｔ−ブチ
ル基は、カチオン捕捉剤（例えばアニソール）の存在下
トリフルオロ酢酸で処理すると脱離する。前者のように
単一の脱離処理で除去できる保護基をスレオニンの側鎖
官能基およびカルボキシル基の保護に用いると、脱離処
理が簡単で収率も向上する。カルボキシル末端がその他
のエステルになっている場合も適当な加水分解処理によ
り保護基を除去できる。
本発明のＢ鎖３０位スレオニンがカルボキシル基に保護
基を有しかつヒドロキシ基に保護基を有していてもよい
人インシュリンから得られるインツユリンは先に記載し
たように血糖降下作用を有する糖尿病治療薬としてまた
は試薬として有用である。本発明者らの方法で豚インシ
ュリンより合成した人インシュリンはマウスに対する血
糖降下作用試験において牛インシュリンと同等の効果を
示した。
基を有しかつヒドロキシ基に保護基を有していてもよい
人インシュリンから得られるインツユリンは先に記載し
たように血糖降下作用を有する糖尿病治療薬としてまた
は試薬として有用である。本発明者らの方法で豚インシ
ュリンより合成した人インシュリンはマウスに対する血
糖降下作用試験において牛インシュリンと同等の効果を
示した。
本発明化合物より合成した人インシュリンは、市販の豚
インシュリンや牛インシュリンと同様に製剤化し、人に
投与される。すなわち、塩化亜鉛などを加えて亜鉛複合
体にしたり、リン酸水素ナトリウムや酢酸ナトリウム等
の緩衝剤を加えたり等張剤とするため塩化ナトリウムを
加えるなど、さらに、クレゾール、フェノール、パラオ
キシ安息香酸アルキルエステル（例えば、メチル、エチ
ル、プロピノ呟 ブチルエステルなど）などの防腐剤を
加えるなどの市販インシュリン製剤に用いられる調製法
を利用し、注射剤を製造する。かかる注射剤の投与量は
患者の症状に応じて異なるが、市販のインシュリン製剤
の投与と同様に行なえばよく、成人１日約１〜１００単
位を投与するようにするとよい。
インシュリンや牛インシュリンと同様に製剤化し、人に
投与される。すなわち、塩化亜鉛などを加えて亜鉛複合
体にしたり、リン酸水素ナトリウムや酢酸ナトリウム等
の緩衝剤を加えたり等張剤とするため塩化ナトリウムを
加えるなど、さらに、クレゾール、フェノール、パラオ
キシ安息香酸アルキルエステル（例えば、メチル、エチ
ル、プロピノ呟 ブチルエステルなど）などの防腐剤を
加えるなどの市販インシュリン製剤に用いられる調製法
を利用し、注射剤を製造する。かかる注射剤の投与量は
患者の症状に応じて異なるが、市販のインシュリン製剤
の投与と同様に行なえばよく、成人１日約１〜１００単
位を投与するようにするとよい。
以下に実施例において、本発明化合物の製造例を示すが
、実施例は本発明を何ら限定するものでない。
、実施例は本発明を何ら限定するものでない。
なお、実施例で用いる略号は下記の意味を表わす
Ａｌａ アラニン ＩｌａイソロイシンＡｒｇ
アルギニン ＬｅｕロイシンＡｓｎ アス
パラギン ＬｙｓリジンＡＳり アスパラギン酸Ｐ
ｈｅフェニルアラニンＣｙＳＯｓ Ｈシスティン酸 Ｐ
ｒｏプロリンＧｌｕ グルタミン酸 Ｓｅｒセリン
Ｇｌｎ グルタミン Ｔｈｒスレオニンｃ１ｙ
グリシン ＴｙｒチロシンＨｉｓ ヒスチ
ジン ＶａｌバリンＯＢｕ’ ｔ−ブチルエステル
残基 また、デスーＢ３０−インシュリンとはインシュリンＢ
鎖の３０位アミノ酸が欠損しているインシュリン、例え
ば、豚インシュリンではアラニンが欠損しているインシ
ュリンをいう。
アルギニン ＬｅｕロイシンＡｓｎ アス
パラギン ＬｙｓリジンＡＳり アスパラギン酸Ｐ
ｈｅフェニルアラニンＣｙＳＯｓ Ｈシスティン酸 Ｐ
ｒｏプロリンＧｌｕ グルタミン酸 Ｓｅｒセリン
Ｇｌｎ グルタミン Ｔｈｒスレオニンｃ１ｙ
グリシン ＴｙｒチロシンＨｉｓ ヒスチ
ジン ＶａｌバリンＯＢｕ’ ｔ−ブチルエステル
残基 また、デスーＢ３０−インシュリンとはインシュリンＢ
鎖の３０位アミノ酸が欠損しているインシュリン、例え
ば、豚インシュリンではアラニンが欠損しているインシ
ュリンをいう。
実施例１
（１）デスーＢ３０−インシュリン（豚型）豚インシュ
リン５００ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ
８，３）１００ｍｌに溶解し、結晶カルボキシペプチダ
ーゼＡ（ワーシングトン社製、ジイソブロピルフルオロ
ホスヘート処理、４９ ｕ／ｍｇ） ５ ｍｇを添加し
て室温で８時間反応させる。アラニンの生成量が０．７
７Ｍ／ＬＭインシュリンのときに反応を止め、反応物を
凍結乾燥後、０．５Ｍ酢酸に溶解し超微細粒のセファデ
ックスＧ５００カラム（３，５Ｘ９５ｃｍ）に吸着させ
、０．５Ｍ酢酸で１フラクシヨンあたり１１゜５ｍｌで
溶出する。フラクションの４０〜６０番を集め凍結乾燥
し標記化合物４６０ｍｇを得る。収率９２％。
リン５００ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ
８，３）１００ｍｌに溶解し、結晶カルボキシペプチダ
ーゼＡ（ワーシングトン社製、ジイソブロピルフルオロ
ホスヘート処理、４９ ｕ／ｍｇ） ５ ｍｇを添加し
て室温で８時間反応させる。アラニンの生成量が０．７
７Ｍ／ＬＭインシュリンのときに反応を止め、反応物を
凍結乾燥後、０．５Ｍ酢酸に溶解し超微細粒のセファデ
ックスＧ５００カラム（３，５Ｘ９５ｃｍ）に吸着させ
、０．５Ｍ酢酸で１フラクシヨンあたり１１゜５ｍｌで
溶出する。フラクションの４０〜６０番を集め凍結乾燥
し標記化合物４６０ｍｇを得る。収率９２％。
生成物を酸加水分解（６Ｍ塩酸、１１０℃、２４時間）
に付して得たアミノ酸分析値は下記のとおりである。括
弧内の数値は理論値を示す。以下においても同様。
に付して得たアミノ酸分析値は下記のとおりである。括
弧内の数値は理論値を示す。以下においても同様。
Ｌｙｓ １ 、 ＯＯ（１）、Ｈｉｓ １．９１（
２）、Ａｒｇ Ｏ，９５（１）、Ａｓｐ ３．２１
（３）、Ｔｈｒ ２ 、０９ （２）、Ｓ＠ｒ ２
．９７（３）、Ｇｌｕ ７．３５（７）、ｃ１７ ４
、２９ （４）、Ａｌａ １．２６（１）、ＣｙＳ
ＯｓＨ５、９４（６）、Ｖａｌ ３．８６（４）、Ｉ
ｌｅ １ 、５５ （２）、Ｌｅｕ ６．５３（６
）、ｒｙｒ ４．０８（４）、Ｐｂｏ２ 、２２ （
３）、Ｐｒｏ １．２（１）。
２）、Ａｒｇ Ｏ，９５（１）、Ａｓｐ ３．２１
（３）、Ｔｈｒ ２ 、０９ （２）、Ｓ＠ｒ ２
．９７（３）、Ｇｌｕ ７．３５（７）、ｃ１７ ４
、２９ （４）、Ａｌａ １．２６（１）、ＣｙＳ
ＯｓＨ５、９４（６）、Ｖａｌ ３．８６（４）、Ｉ
ｌｅ １ 、５５ （２）、Ｌｅｕ ６．５３（６
）、ｒｙｒ ４．０８（４）、Ｐｂｏ２ 、２２ （
３）、Ｐｒｏ １．２（１）。
（２） ［Ｂ ３０− Ｔｈｒ −ＯＢｕ’ ］−イン
シュリン（豚型） （１）の生成物１００ｍｇ（１０ｍＭ）とＬ−スレオニ
ン−ｔ−ブチルエステル１５４ｍｇ（５００ｍＭ） ｘ
タノール／ジメチルホルムアミド混液（１：１）１．０
５ｍ１に溶解し、結晶トリプシン（ワーシングトン社製
、３回再結晶）４ｍｇを含有する０、５Ｍ硼酸塩緩衝液
（ｐＨ６，５）０．７５ｍ１と混合する。なお、この混
合液にはトシル−し−フェニルアラニンクロロメチルケ
トン（以下ＴＰＣＫと記ス）が最終濃度０．０１ｍＭで
含有されるようにしておく。同混合液を３７°Ｃで１晩
保つ。高速液体クロマトグラフィーにより目的化合物の
生成を確認し収率を求めると７５％であった。混合液を
氷酢酸で酸性としたのち超微細粒のセファデックスＧ５
０のカラム（４，２ｘ１３０ｃｍ）でゲル濾過を行ない
、トリブンン含有分画、標記インシュリン誘導体を含有
する分画、Ｌ−スレオニン−ｔ−ブチルエステル含有分
画に分ける。酵素活性およびニンヒドリン反応を測定し
、トリプシンおよびスレオニンｔ−ブチルエステルは各
々５０％回収されることか確認された。インシュリン誘
導体を含有する分画を凍結乾燥し、標記化合物の粗粉末
８９ＬＩ１ｇを得る。
シュリン（豚型） （１）の生成物１００ｍｇ（１０ｍＭ）とＬ−スレオニ
ン−ｔ−ブチルエステル１５４ｍｇ（５００ｍＭ） ｘ
タノール／ジメチルホルムアミド混液（１：１）１．０
５ｍ１に溶解し、結晶トリプシン（ワーシングトン社製
、３回再結晶）４ｍｇを含有する０、５Ｍ硼酸塩緩衝液
（ｐＨ６，５）０．７５ｍ１と混合する。なお、この混
合液にはトシル−し−フェニルアラニンクロロメチルケ
トン（以下ＴＰＣＫと記ス）が最終濃度０．０１ｍＭで
含有されるようにしておく。同混合液を３７°Ｃで１晩
保つ。高速液体クロマトグラフィーにより目的化合物の
生成を確認し収率を求めると７５％であった。混合液を
氷酢酸で酸性としたのち超微細粒のセファデックスＧ５
０のカラム（４，２ｘ１３０ｃｍ）でゲル濾過を行ない
、トリブンン含有分画、標記インシュリン誘導体を含有
する分画、Ｌ−スレオニン−ｔ−ブチルエステル含有分
画に分ける。酵素活性およびニンヒドリン反応を測定し
、トリプシンおよびスレオニンｔ−ブチルエステルは各
々５０％回収されることか確認された。インシュリン誘
導体を含有する分画を凍結乾燥し、標記化合物の粗粉末
８９ＬＩ１ｇを得る。
次いで、０．０１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，６）と７Ｍ
ｆｔ素で緩衝化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５の
カラム（１，９Ｘ２４．５ｃｍ）に上記生成物を４°Ｃ
でかけ、上記緩衝液を８００ｍ１流したのち食塩濃度０
．３Ｍまで直線的に濃度勾配をつけた溶出を行ない、０
．０８〜０．０９Ｍ濃度付近の分画Ａと０．１３〜０．
１４Ｍ濃度付近の分画Ｂを順次得る。各分画を直ちに３
〜４日間冷所で０．０１Ｍ酢酸アンモニウム溶液に対し
て透析した後凍結乾燥し、分画Ａより粉末３５ｍｇを、
分画Ｂより２７ｍｇを得る。高速液体クロマトグラフィ
ーおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動により、前者
が標記化合物であり後者がデスーＢ３０−インシュリン
（豚型）と標記化合物の混合物であることが確認された
。
ｆｔ素で緩衝化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５の
カラム（１，９Ｘ２４．５ｃｍ）に上記生成物を４°Ｃ
でかけ、上記緩衝液を８００ｍ１流したのち食塩濃度０
．３Ｍまで直線的に濃度勾配をつけた溶出を行ない、０
．０８〜０．０９Ｍ濃度付近の分画Ａと０．１３〜０．
１４Ｍ濃度付近の分画Ｂを順次得る。各分画を直ちに３
〜４日間冷所で０．０１Ｍ酢酸アンモニウム溶液に対し
て透析した後凍結乾燥し、分画Ａより粉末３５ｍｇを、
分画Ｂより２７ｍｇを得る。高速液体クロマトグラフィ
ーおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動により、前者
が標記化合物であり後者がデスーＢ３０−インシュリン
（豚型）と標記化合物の混合物であることが確認された
。
標記化合物の高速液体クロマトグラフィーおよびポリア
クリルアミドゲル電気泳動による測定値を以下に示す。
クリルアミドゲル電気泳動による測定値を以下に示す。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐＨ８；１０％ゲル
； １８ 、１ ｍＡ／ｃｍ’ ；泳動時間１００分）
：移動距＄４．３ｃｍ。
； １８ 、１ ｍＡ／ｃｍ’ ；泳動時間１００分）
：移動距＄４．３ｃｍ。
高速液体クロマトグラフィー［ヌクレオシル（Ｎｕｃｌ
ｅｏｓｉｌ ） ７ ＣＩａ （Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎ
ａｇｅ１社製） ； ４ｍｍＸ５０ｍｍ（プレカラム）
および４ｍｍＸ２５０ｒｒＩｎ（メインカラム）；３２
％アセトニトリル−パン７７ ｔＩ液（５ｍＭリン酸
、５ｍｔｉ・ｎ−ブチルスルホン酸ナトリウム、５０ｍ
Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ３、Ｏ）；流速：毎分２ｍｌコ
ニ保持時間１３．２分。
ｅｏｓｉｌ ） ７ ＣＩａ （Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎ
ａｇｅ１社製） ； ４ｍｍＸ５０ｍｍ（プレカラム）
および４ｍｍＸ２５０ｒｒＩｎ（メインカラム）；３２
％アセトニトリル−パン７７ ｔＩ液（５ｍＭリン酸
、５ｍｔｉ・ｎ−ブチルスルホン酸ナトリウム、５０ｍ
Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ３、Ｏ）；流速：毎分２ｍｌコ
ニ保持時間１３．２分。
（３）大インシュリン
７二”） −ルｏ 、２ｎ＋１を含むトリフルオロ酢酸
２ｍｌを上記■で得た化合物３０ｍｇに加え、室温で３
０分保つ、窒素気流中でトリフルオロ酢酸を除き、ＩＮ
酢酸２ｍｌの存在下、エーテル１５ｍ１でアニソールを
抽出した後、酢酸部を凍結乾燥し標記化合物２８ｍｇを
得る。原料の純度を７７％とすると収率４３％である。
２ｍｌを上記■で得た化合物３０ｍｇに加え、室温で３
０分保つ、窒素気流中でトリフルオロ酢酸を除き、ＩＮ
酢酸２ｍｌの存在下、エーテル１５ｍ１でアニソールを
抽出した後、酢酸部を凍結乾燥し標記化合物２８ｍｇを
得る。原料の純度を７７％とすると収率４３％である。
氷晶はアミノ酸分析値、スラブゲル電気泳動、高速液体
クロマトグラムにより標記化合物と同定した。
クロマトグラムにより標記化合物と同定した。
（１）と同様の条件で行なったアミノ酸分析の結果は下
記のとおりである。
記のとおりである。
Ｌｙｓ １．００（１）、）Ｉｉｓ １ 、８９
（２）、Ａｒｇ ０．８７（１）、Ａｓｐ ３ 、
３２ （３）、Ｉｈｒ ３ 、１６ （３）、Ｓｅｒ
２ 、９９ （３）、Ｇｌｕ ７ 、３５ （７
）、Ｐｒｏ １．２９（１）、Ｇｌｙ ４．３９（
４）、Ａｌａ １ 、２６ （１）、ＣｙＳＯｓＨ４
，６（６）、Ｖａｌ ３ 、９３ （４）、１１ｅ
１．６１（２）、Ｌｅｕ ６．５１（６）、Ｔｙｒ
３．６８（４）、Ｐｈｅ ３ 、１９ （３）。
（２）、Ａｒｇ ０．８７（１）、Ａｓｐ ３ 、
３２ （３）、Ｉｈｒ ３ 、１６ （３）、Ｓｅｒ
２ 、９９ （３）、Ｇｌｕ ７ 、３５ （７
）、Ｐｒｏ １．２９（１）、Ｇｌｙ ４．３９（
４）、Ａｌａ １ 、２６ （１）、ＣｙＳＯｓＨ４
，６（６）、Ｖａｌ ３ 、９３ （４）、１１ｅ
１．６１（２）、Ｌｅｕ ６．５１（６）、Ｔｙｒ
３．６８（４）、Ｐｈｅ ３ 、１９ （３）。
スラブゲル電気泳動（ｐＨ８；１０％ゲル；１８ 、１
ｍＡ／ｃｍ” ；泳動時間１００分）：移動距離６．
０ｃｍ、高速液体クロマトグラフィ−ロヌクレオシル（
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ） ７ Ｃ＋ ｓ （Ｍａｃｈｅ
ｒｅｙ−Ｎａｇｅ１社製） ； ４ｍｍＸ ５０ｍｍ（
プレカラム）および４ｍＸ２５０ｍｍ（メインカラム）
；３２％アセトニトリル−バッファー溶液（５ｍＭリン
酸、５ｍＭ・ｎ−プチルスルホン酸ナトリウム、５０ｍ
Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ３，０）；流速：毎分２ｍｌコ
ニ保持時間４．９７分。
ｍＡ／ｃｍ” ；泳動時間１００分）：移動距離６．
０ｃｍ、高速液体クロマトグラフィ−ロヌクレオシル（
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ） ７ Ｃ＋ ｓ （Ｍａｃｈｅ
ｒｅｙ−Ｎａｇｅ１社製） ； ４ｍｍＸ ５０ｍｍ（
プレカラム）および４ｍＸ２５０ｍｍ（メインカラム）
；３２％アセトニトリル−バッファー溶液（５ｍＭリン
酸、５ｍＭ・ｎ−プチルスルホン酸ナトリウム、５０ｍ
Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ３，０）；流速：毎分２ｍｌコ
ニ保持時間４．９７分。
特許出願人 塩野義製薬株式会社
代 理 人 弁理士 潮１）雄−
−ユ□□、劇Ｊ
Claims (1)
- （１）Ｂ鎖３０位スレオニンがカルボキシル基に保護基
を有しかつヒドロキシ基に保護基を有していてもよい人
インシュリンを保護基の脱離処理に付して人インシュリ
ンを得ることを特徴とする人インシュリンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61266447A JPS62116598A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | インシユリン誘導体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56175030A JPS57155997A (en) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | Insulin derivative |
| JP61266447A JPS62116598A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | インシユリン誘導体の製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56175030A Division JPS57155997A (en) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | Insulin derivative |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62116598A true JPS62116598A (ja) | 1987-05-28 |
| JPH0150719B2 JPH0150719B2 (ja) | 1989-10-31 |
Family
ID=26496421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61266447A Granted JPS62116598A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | インシユリン誘導体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62116598A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5191288A (ja) * | 1974-12-21 | 1976-08-10 | ||
| JPS54135789A (en) * | 1978-04-13 | 1979-10-22 | Nippon Soda Co Ltd | Preparation of human insulin |
-
1986
- 1986-11-07 JP JP61266447A patent/JPS62116598A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5191288A (ja) * | 1974-12-21 | 1976-08-10 | ||
| JPS54135789A (en) * | 1978-04-13 | 1979-10-22 | Nippon Soda Co Ltd | Preparation of human insulin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0150719B2 (ja) | 1989-10-31 |
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