CN110981967A

CN110981967A - α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体、合成方法及应用

Info

Publication number: CN110981967A
Application number: CN201911155874.3A
Authority: CN
Inventors: 于日磊; 梁家珍
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-11-22
Also published as: CN110981967B

Abstract

本发明属于二聚体合成及应用技术领域，公开了一种α‑芋螺毒素Mr1.1的二聚体、合成方法及应用，α‑芋螺毒素Mr1.1二聚体的α‑芋螺毒素Mr1.1为多肽类化合物，其包含有两对二硫键，为I–III、II–IV连接方式，且C端酰胺化；氨基酸结构均用氨基酸的简写表示，两个半胱氨酸之间的连接表示其侧链之间形成的二硫键。本发明采取二聚化的方式合成Mr1.1二聚体，以提高对α9α10 nAChR的活性。α9α10 nAChR是与疼痛相关靶点，得到的α‑芋螺毒素Mr1.1的二聚体，能够作用于人源α9α10 nAChR；与野生型Mr1.1相比，活性提高了约46倍，有望开发出新的用于治疗疼痛的多肽类药物。

Description

α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体、合成方法及应用

技术领域

本发明属于二聚体合成及应用技术领域，尤其涉及一种α-芋螺毒素Mr1.1 的二聚体、合成方法及应用。

背景技术

目前，最接近的现有技术：α9α10乙酰胆碱受体(nAChR)为近年来新发现的乙酰胆碱受体亚型之一，是治疗慢性疼痛的靶标，对外伤和化疗引起的疼痛具有明显作用。目前，特异性作用于α9α10nAChR的α-芋螺毒素为Vc1.1，RgIA 和PeIA等。但是由于人体和老鼠体内α9α10nAChR的差异性，这些毒素在人体 α9α10nAChR上的活性明显下降，不足以成药。Mr1.1是通过PCR对Conus marmoreus的毒液管的cDNA序列进行扩增而得到的新的α-4/7芋螺毒素。Can Peng et.al.的研究表明：Mr1.1能够特异性作用于老鼠α7nAChR，并在体内显示镇痛活性。Mr1.1是α9α10nAChR的特异性抑制剂，其靶向性远高于α7nAChR。 Mr1.1对α9α10nAChR的抑制活性要大于Vc1.1和RgIA，为102.6±6.7nM。但是为发展成为镇痛药物，其对α9α10nAChR的抑制抑制活性仍需提高。普遍的用于提高野生型芋螺毒素肽活性的方式是通过定点突变和筛选完成的，但是这种方式往往工作量大，且对于其活性很难有大的提升。也可以采取非天然氨基酸替代，侧链官能团修饰，环化等方式来提高其活性，但均不能十分合理的，指导性的提升其靶向性和活性，并且往往还伴随着合成困难，产率低等特点。根据α9α10nAChR多靶点，且其受体上存在有相邻结合位点的特性，可以设计合成Mr1.1多肽二聚体，同时作用于α9α10nAChR上的相邻靶点，并起协同作用，从而提高其对α9α10nAChR的抑制活性。

综上所述，现有技术存在的问题是：Mr1.1对α9α10nAChR的抑制活性低。普遍的用以提高芋螺毒素活性的方法，包括突变，侧链修饰等，不仅仅工作量大，且可能伴随着产率低，合成困难的弊端。

解决上述技术问题的难度：采用二聚体的方式合成Mr1.1二聚体主要涉及 Mr1.1的叠氮化修饰，以及Click反应的顺利实施和完成。

解决上述技术问题的意义：根据α9α10nAChR上多靶点的特性采用二聚化的方式合成Mr1.1二聚体，同时作用于α9α10nAChR两个相邻靶点，可以明显提升其活性。这为提升α-CTx对α9α10nAChR的活性提供了一个简单且有效的方法。为发展用于治疗疼痛的多肽类药物提供指导。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体、合成方法及应用。

本发明是这样实现的，一种α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体，所述α-芋螺毒素 Mr1.1的二聚体的结构式为：

α-芋螺毒素Mr1.1为多肽类化合物，其包含有两对二硫键，为I–III、II –IV连接方式，且C端酰胺化；氨基酸结构均用氨基酸的简写表示，两个半胱氨酸之间的连接表示其侧链之间形成的二硫键。

本发明的另一目的在于提供一种所述α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法，所述α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法包括以下步骤：

第一步，叠氮化Mr1.1的合成是通过在Mr1.1的N端引入叠氮九聚乙二醇羧酸完成；

第二步，linker的合成通过多肽固相合成以Rink Amide-MBHA树脂为载体，将GRRRRG偶联到树脂载体上；再将双Fmoc保护的赖氨酸偶联到甘氨酸的N端，通过20％哌啶脱除赖氨酸上主链和侧链上的Fmoc保护基，并与5-己炔酸偶联，合成含有两个炔基的linker的树脂肽；通过TFA:Tips:H₂O＝90：5：5 为切割条件，将多肽从树脂上切割，并脱去所有氨基酸侧链的保护基；液相分离纯化，冻干，得到目标linker；

第三步，Mr1.1二聚体的合成是通过叠氮化Mr1.1上的叠氮官能团和linker 上的炔基发生click反应完成。

进一步，所述第一步叠氮化Mr1.1肽的合成具体包括：

(1)通过多肽固相合成技术，以Rink Amide-MBHA树脂为载体，将Mr1.1 的C端连接到树脂载体上；以四当量的Fmoc保护的氨基酸为原料，四当量的 HCTU和八当量的DIEA为缩合试剂，室温反应1h为缩合条件实现氨基酸的偶联；

(2)以20％的哌啶为Fmoc脱除条件脱去Fmoc保护基，进行下一个氨基酸的偶联，以此重复，实现野生型Mr1.1树脂肽的合成；

(3)在实现Mr1.1最后一个氨基酸的偶联，且脱除Fmoc保护基以后，加入两当量的叠氮九聚乙二醇羧酸，两当量的HATU和四当量的DIEA，室温反应过夜，完成缩合反应，将叠氮官能团引入到Mr1.1当中；

(4)通过TFA:Tips:H₂O＝90：5：5为切割条件，将多肽从树脂上切割下来，并脱去所有氨基酸侧链的保护基；通过二步氧化法，合成叠氮化的Mr1.1。

进一步，所述两步氧化法通过先将切割下来的多肽溶解在0.1M的碳酸氢铵溶液中，调节pH至8-10，室温反应48h后液相分离得到形成一对二硫键的中间物，再将分离后的一步氧化物用水溶解，加入五当量的碘，室温反应1小时，液相分离纯化冻干后得到。

进一步，所述第二步的与5-己炔酸偶联的条件：四当量的5-乙炔酸，四当量的HATU，八当量的DIEA，室温反应过夜。

进一步，所述第三步包括每一当量的linker，加入三当量的叠氮化Mr1.1，四当量的五水硫酸铜，四当量的TBTA和八当量的抗坏血酸钠。

进一步，以DMF:H₂O＝1:1为溶剂，加入氮气保护，室温反应12h；反应结束后，冻干除去DMF，后液相分离纯化并冻干，得到目标Mr1.1二聚体。

本发明的另一目的在于提供一种所述α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体在治疗慢性疼痛的靶标中的应用。Mr1.1是α9α10nAChR的特异性抑制剂，而α9α10 nAChR是被证明了的治疗疼痛的靶标。本发明合成的Mr1.1二聚体对α9α10 nAChR有强有力的抑制作用，其可以作为探针用于研究α9α10nAChR的结构与功能。

本发明的另一目的在于提供一种所述α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体在治疗外伤和化疗疼痛药物中的应用。Mr1.1对治疗疼痛的靶点--α9α10nAChR有很好的抑制作用，因此有发展成为用于治疗外伤的药物的可能性，或者用于减轻化疗所引起的疼痛。

本发明的另一目的在于提供一种所述α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体在治疗疼痛的多肽类药物的应用。野生型Mr1.1在体内显示良好的镇痛活性，其镇痛活性来源于其对乙酰胆碱受体的抑制作用。而本发明合成的Mr1.1二聚体与野生型相比，对镇痛的靶点α9α10nAChR的作用更强，其镇痛活性也应该更加显著。因此，在治疗疼痛方面，其有能发展成为药物的可能。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明采取二聚化的方式合成 Mr1.1二聚体，以提高其对α9α10nAChR的靶向性。得到α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体，能够作用于人体α9α10nAChR，与野生型Mr1.1相比，其活性提高了约46倍，有望开发出新的用于治疗疼痛的多肽类药物。

附图说明

图1是本发明实施例提供的α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法流程图。

图2是本发明实施例提供的Mr1.1和Mr1.1二聚体对人α9α10nAChR的活性示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体、合成方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的结构式为：

α-芋螺毒素Mr1.1为多肽类化合物，其包含有两对二硫键，为I–III、II –IV连接方式，且C端酰胺化。其氨基酸结构均用氨基酸的简写表示，两个半胱氨酸之间的连接表示其侧链之间形成的二硫键。

如图1所示，本发明实施例提供的α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法包括以下步骤：

S101：叠氮化Mr1.1合成通过在Mr1.1的N端引入叠氮九聚乙二醇羧酸完成的。

S102：Linker的合成：linker的合成是通过多肽固相合成技术，以Rink Amide-MBHA树脂为载体，将GRRRRG偶联到树脂载体上；再将双Fmoc保护的赖氨酸偶联到甘氨酸的N端，继而通过20％哌啶脱除赖氨酸上主链和侧链上的Fmoc保护基，并与5-己炔酸偶联，合成含有两个炔基的linker的树脂肽；通过TFA:Tips:H₂O＝90：5：5为切割条件，将多肽从树脂上切割下来，并脱去所有氨基酸侧链的保护基，液相分离纯化，冻干，得到目标linker。

S103：Mr1.1二聚体的合成是通过叠氮化Mr1.1上的叠氮官能团和linker上的炔基发生click反应完成的。条件：每一当量的linker，加入三当量的叠氮化 Mr1.1，四当量的五水硫酸铜，四当量的TBTA(CAS：510758-28-8)和八当量的抗坏血酸钠。以DMF:H₂O＝1:1为溶剂，加入氮气保护，室温反应12h。反应结束后，冻干除去DMF，后液相分离纯化并冻干，得到目标Mr1.1二聚体。

本发明实施例提供的α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法具体包括以下步骤：

第一步，叠氮化Mr1.1肽的合成：叠氮化Mr1.1的合成是通过在Mr1.1的N 端引入叠氮九聚乙二醇羧酸完成的。首先，通过多肽固相合成技术，以Rink Amide-MBHA树脂为载体，将Mr1.1的C端连接到树脂载体上。以四当量的Fmoc 保护的氨基酸为原料，四当量的HCTU和八当量的DIEA为缩合试剂，室温反应1h为缩合条件实现氨基酸的偶联；再以20％的哌啶为Fmoc脱除条件脱去 Fmoc保护基，接着进行下一个氨基酸的偶联，以此重复，实现野生型Mr1.1树脂肽的合成。最后，在实现Mr1.1最后一个氨基酸的偶联，且脱除Fmoc保护基以后，加入两当量的叠氮九聚乙二醇羧酸，两当量的HATU和四当量的DIEA，室温反应过夜，完成缩合反应，从而将叠氮官能团引入到Mr1.1当中。后续，再通过TFA:Tips:H₂O＝90：5：5为切割条件，将多肽从树脂上切割下来，并脱去所有氨基酸侧链的保护基。最后，通过二步氧化法，从而合成叠氮化的Mr1.1 (两步氧化法是通过先将切割下来的多肽溶解在0.1M的碳酸氢铵溶液中，调节 pH至8-10，室温反应48h后液相分离得到形成一对二硫键的中间物，再将分离后的一步氧化物用水溶解，加入五当量的碘，室温反应1小时，液相分离纯化冻干后得到)。

第二步，Linker的合成：linker的合成是通过多肽固相合成技术，以Rink Amide-MBHA树脂为载体，将GRRRRG(每个字母代表一个氨基酸简写)偶联到树脂载体上。再将双Fmoc保护的赖氨酸(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)偶联到甘氨酸的N端，继而通过20％哌啶脱除赖氨酸上主链和侧链上的Fmoc保护基，并与5-己炔酸偶联(条件：四当量的5-乙炔酸，四当量的HATU，八当量的DIEA，室温反应过夜)，合成含有两个炔基的linker的树脂肽。后续，再通过 TFA:Tips:H₂O＝90：5：5为切割条件，将多肽从树脂上切割下来，并脱去所有氨基酸侧链的保护基。液相分离纯化，冻干，得到目标linker。

第三步，Mr1.1二聚体的合成：Mr1.1二聚体的合成是通过叠氮化Mr1.1上的叠氮官能团和linker上的炔基发生click反应完成的。条件：每一当量的linker，加入三当量的叠氮化Mr1.1，四当量的五水硫酸铜，四当量的TBTA(CAS： 510758-28-8)和八当量的抗坏血酸钠。以DMF:H₂O＝1:1为溶剂，加入氮气保护，室温反应12h。反应结束后，冻干除去DMF，后液相分离纯化并冻干，得到目标Mr1.1二聚体。

本发明实施例提供的α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法的合成路线如图3所示。

下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。

本发明实验证明，α9α10乙酰胆碱受体(nAChR)为近年来新发现的乙酰胆碱受体亚型之一，是治疗慢性疼痛的靶标，对外伤和化疗引起的疼痛具有明显作用。α-芋螺毒素Vc1.1，RgIA在老鼠α9α10nAChR上表现出很强活性，但是在人体α9α10nAChR上实验时，活性却明显下降，分别降低100倍和300倍左右，影响其成药有效性。本发明所设计合成的α-芋螺毒素Mr1.1二聚体，表现出对人体α9α10nAChR明显的活性，与野生型Mr1.1相比，其活性提高了约46 倍，因此有望开发成为新的用于治疗疼痛的多肽类药物。

二聚体Mr1.1为多肽类化合物(GCCSHPACSVNNPDIC(nh2))。通过设计一个含有两个炔基官能团的linker，并对野生型的多肽进行修饰，引入叠氮官能团，继而通过click反应合成Mr1.1二聚体。此方法最先由Jingjing Wan等将铜催化的叠氮-炔环加成(CuAAc)反应应用到肽的合成当中完成，并成功地合成了二聚体和四聚体α-芋螺毒素ImI，显著提高了Im1其对α7nAChR的选择性与活性(DOI:10.1021/jacs.5b00244)。后期，通过本发明对实验条件摸索和优化，分别成功合成了Vc1.1，RgIA，PeIA的二聚体多肽化合物，并不同程度地提高了其对α9α10nAChR的抑制活性。通过电生理学技术对Mr1.1二聚体对人源α9α10nAChR的活性测定，可以发现其活性远高于野生型Mr1.1，活性提高了约46倍，有望开发出新的用于治疗疼痛的多肽类药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体，其特征在于，所述α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的结构式为：

α-芋螺毒素Mr1.1为多肽类化合物，其包含有两对二硫键，为I–III、II–IV连接方式，且C端酰胺化；氨基酸结构均用氨基酸的简写表示，两个半胱氨酸之间的连接表示其侧链之间形成的二硫键。

2.一种如权利要求1所述α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法，其特征在于，所述α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法包括以下步骤：

第二步，linker的合成通过多肽固相合成以Rink Amide-MBHA树脂为载体，将GRRRRG偶联到树脂载体上；再将双Fmoc保护的赖氨酸偶联到甘氨酸的N端，通过20％哌啶脱除赖氨酸上主链和侧链上的Fmoc保护基，并与5-己炔酸偶联，合成含有两个炔基的linker的树脂肽；通过TFA:Tips：H₂O＝90：5：5为切割条件，将多肽从树脂上切割，并脱去所有氨基酸侧链的保护基；液相分离纯化，冻干，得到目标linker；

第三步，Mr1.1二聚体的合成是通过叠氮化Mr1.1上的叠氮官能团和linker上的炔基发生click反应完成。

3.如权利要求2所述的α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法，其特征在于，所述第一步叠氮化Mr1.1肽的合成具体包括：

(1)通过多肽固相合成技术，以Rink Amide-MBHA树脂为载体，将Mr1.1的C端连接到树脂载体上；以四当量的Fmoc保护的氨基酸为原料，四当量的HCTU和八当量的DIEA为缩合试剂，室温反应1h为缩合条件实现氨基酸的偶联；

4.如权利要求3所述的α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法，其特征在于，所述两步氧化法通过先将切割下来的多肽溶解在0.1M的碳酸氢铵溶液中，调节pH至8-10，室温反应48h后液相分离得到形成一对二硫键的中间物，再将分离后的一步氧化物用水溶解，加入五当量的碘，室温反应1小时，液相分离纯化冻干后得到。

5.如权利要求2所述的α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法，其特征在于，所述第二步的与5-己炔酸偶联的条件：四当量的5-乙炔酸，四当量的HATU，八当量的DIEA，室温反应过夜。

6.如权利要求2所述的α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法，其特征在于，所述第三步包括每一当量的linker，加入三当量的叠氮化Mr1.1，四当量的五水硫酸铜，四当量的TBTA和八当量的抗坏血酸钠。

7.如权利要求6所述的α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体的合成方法，其特征在于，以DMF:H₂O＝1:1为溶剂，加入氮气保护，室温反应12h；反应结束后，冻干除去DMF，后液相分离纯化并冻干，得到目标Mr1.1二聚体。

8.一种如权利要求1所述α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体在治疗慢性疼痛的靶标中的应用。

9.一种如权利要求1所述α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体在治疗外伤和化疗疼痛药物中的应用。

10.一种如权利要求1所述α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体在治疗疼痛的多肽类药物的应用。