FI79860C - Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin des-pheb1-humaninsulin eller derivat daerav ur svininsulin, des-pheb1-svininsulin eller derivat daerav. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin des-pheb1-humaninsulin eller derivat daerav ur svininsulin, des-pheb1-svininsulin eller derivat daerav. Download PDFInfo
- Publication number
- FI79860C FI79860C FI820117A FI820117A FI79860C FI 79860 C FI79860 C FI 79860C FI 820117 A FI820117 A FI 820117A FI 820117 A FI820117 A FI 820117A FI 79860 C FI79860 C FI 79860C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- insulin
- des
- human insulin
- porcine
- human
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
1 79860
Menetelmä ihmisen insuliinin, ihmisen Des-PheB 1 -insuliinin tai niiden johdannaisten valmistamiseksi sian insuliinista, sian Des-PheB 1-insuliinista tai niiden johdannaisista 5 Keksinnön kohteena on menetelmä ihmisen insuliinin, ihmisen Des-PheB 1-insuliinin tai niiden johdannaisten valmistamiseksi, jotka sisältävät suojaryhmiä vapaissa funktionaalisissa ryhmissä, sian insuliinista, sian Des-Phe®1-insuliinista tai niiden johdannaisista, jotka sisältävät 10 suojaryhmiä vapaissa funktionaalisissa ryhmissä.
Ihmisen insuliini ja siasta saatu insuliini eroavat toisistaan karboksyyliasemassa olevan aminohapon suhteen asemassa B30 insuliinin B-ketjussa. Ihmisen insuliinissa seuraa lysyyliryhmää kohdassa B29 treoniini, sian 15 insuliinissa alaniini.
Ihmisen insuliinin kokonaissynteesin (1) Märkii et ai., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360 (1979), ss. 1699 - 1632 lisäksi mahdollistavat eri puolisynteettiset menetelmät alaniinin vaihtamisen treoniiniin käyttäen sian in-20 suliinia lähtöaineena.
Suurehkojen ihmisen insuliinimäärien valmistamiseksi on kokonaissynteesi liian kallis.
Puolisynteettisissä menetelmissä, joita ovat esittäneet Ruttenberg (2) US-patenttijulkaisu 3 903 068 sekä 25 Obermeier ja Geiger (3) R. Obermeier et ai., Hoppe-Sey-ler's Z. Physiol. Chem. 357 (1976), ss. 759 - 767, trypti-sellä digestoinnilla valmistettu sian desoktapeptidi-B23-30-insuliini sidotaan peptidikemiallisten menetelmien avulla ihmisen insuliinijakson B23-30 suojatun synteet-30 tisen oktapeptidin kanssa. Kaikkien suojaryhmien poistamisen jälkeen suoritetaan monimutkaiset puhdistusvaiheet. Ihmisen insuliinin saanto on pieni.
Muutettaessa luonnollista sian insuliinia ihmisen insuliiniksi suurempia saantoja voidaan saada entsymaat-35 tisten menetelmien avulla.
2 79860
Inoye et ai., J. Am. Chem. Soc. 101 (1979), ss. 751 - 752 (4) ovat kehittäneet menetelmän, jossa sian desoktapeptidi-B23-30-insuliinin annetaan reagoida synteettisen oktapeptidi-B23-30:n (ihmisen) kanssa tryptistä 5 katalyysiä käyttäen ihmisen insuliiniksi. Epäkohtana tässä reaktiossa on synteettisen oktapeptidin käyttö, joka, kuten Ruttenberg'in ja Obermeier'in menetelmissä, täytyy valmistaa verrattain monimutkaisesti.
Taloudellisempi on sellainen muuttaminen, jossa 10 vain sian insuliinin viimeinen aminohappo B30 vaihdetaan. US-patenttijulkaisussa 3 276 961 Bodanszky et ai. esittävät menetelmän, jonka mukaan eläinten insuliinista valmistetaan entsyymien, kuten trypsiinin ja karboksipepti-daasin A avulla treoniinin läsnäollessa ihmisen insulii-15 nia. Menetelmä ei kuitenkaan ole käyttökelpoinen, koska siinä mainituissa olosuhteissa ei yksinomaan Lys-Ala-(B29-30), vaan myös muut insuliinin peptidisidokset ha-j aantuvat.
H. G. Gattner et ai. teoksessa Insulin, toimittanut 20 D. Brandenburg, A. Wollmer 1980 Proc. 2nd Intern. Insulin
Symposium 1979, ss. 118 - 125 (5) ja K. Morihara et ai. julkaisussa Nature 280 (1979), ss. 412 - 413 (6) ja EP Al-0017938 (6a) lähtevät kaksivaiheisessa menetelmässä (sian) Des-Ala-B30-insuliinista ja sitovat sen trypsiinin 25 avulla treoniinimetyyliesterin tai treoniini-tert-butyyli- esterin kanssa vastaavaksi ihmisen insuliiniesteriksi. Natronlipeällä tai trifluorietikkahapolla suoritetun este-riryhmän poistamisen jälkeen saadaan ihmisen insuliinia hyvällä saannolla.
30 Molemmissa viimeksi mainituissa tunnetuissa mene telmissä käytetään lähtöaineena sian Des-Ala-B30-insulii-nia. Tätä saadaan karboksipeptidaasin A (CPA) avulla sian insuliinista. CPA pilkkoo asteittain peptidien ja proteiinien karboksyyliasemassa olevia neutraaleja ja happamia 35 L-aminohappoja. Aminohapot lohkeavat erilaisen lohkeamis-
II
3 79860 kinetiikan mukaan. Entsymaattinen hajoaminen pysähtyy emäksisillä aminohapoilla esimerkiksi lysiini-B29:ään tai arginiini-B22reen insuliinin-B-ketjussa. Täten alaniini-ryhmä voidaan poistaa insuliini-B-ketjun asemassa B30 5 ilman etenevää ketjun hajoamista.
CPA-digestoinnin epäkohtana on kuitenkin entsyymien samanaikainen vaikutus C-päätteiseen aminohappoon aspara-giiniin insuliinin A-ketjun asemassa A21. Tavanomaisissa digestointiolosuhteissa CPA:lla poistuu erilaisten loh-10 keamisnopeuksien vuoksi noin 10 - 20 % asparagiinia ja samanaikaisesti 80 - 90 % alaniinia sian insuliinista. Tämäntapainen hajoamistuote sisältää siten reagoimattoman insuliinin lisäksi seoksen, joka muodostuu Des-Ala-B30-Des-Asn-A21-, Des-Ala-B30- ja Des-Asn-A21-insuliinista.
15 E. W. Schmitt et ai., Hoppe-Seyler's Z. Physiol.
Chem. 359 (1978), ss. 799 - 802 (8) ovat onnistuneet vähentämään Des-Ala-B30-Des-Asn-A21-insuliinin muodostumisen pienemmäksi kuin 5 - 10 % käyttämällä NH4 + -pitoista puskuria. Huolimatta pylväskromatograafisesta puhdistuksesta 20 ei kuitenkaan ole voitu estää sitä, että siten valmistettu ihmisen insuliini aiheuttaa vielä selviä immunologisia reaktioita.
Nyt on löydetty puolisynteettinen menetelmä, jonka mukaan välttäen CPA-digestointi trypsiinin avulla sian 25 insuliinin muuttaminen ihmisen insuliiniesteriksi onnistuu yhdessä ainoassa vaiheessa. Esteristä voidaan valmistaa tavanomaisella tavalla ihmisen insuliinia. Kokonaissaanto yksivaiheisessa reaktiossa on 50 - 65 %. Oleellisesti yksinkertaisemman reaktionkulun ohella tämän menetelmän etu 30 on ihmisen insuliinin talteenotossa, joka ei enää voi sisältää edellä mainittuja epäpuhtauksia ja soveltuu siten käytettäväksi myös immunologisesti vaikeissa tapauksissa.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että sian insuliinin tai sian Des-PheB 1-insuliinin tai 35 niiden johdannaisten, jotka sisältävät suojaryhmiä vapais-
___ - I
4 79860 sa funktionaalisissa ryhmissä, annetaan reagoida isoelekt-risen pisteensä alapuolella olevassa pH-arvossa trypsiinin tai trypsiinin tapaisen entsyymin läsnäollessa vesipitoisessa väliaineessa ilman neutraalin, inertin, veden kanssa 5 sekoittuvan liuottimen läsnäoloa, reaktiolämpötilan ollessa alle 40°C, ylimäärän kanssa treoniiniesteriä tai treo-niiniesteri-eetteriä, minkä jälkeen haluttaessa poistetaan mahdollisesti läsnäolevat suojaryhmät.
Lähtömateriaaliksi keksinnön mukaista reaktiota 10 varten soveltuvat alkuperäisen sian insuliinin lisäksi sen johdannaiset, joita voidaan saada muodostamalla suo-jaryhmiä vapaisiin funktionaalisiin kohtiin tai lohkaisemalla tai vaihtamalla yksittäisiä aminohappoja. Menetelmätuotteena saadaan käytettäessä tämäntapaisia sian insulii-15 nin johdannaisia ihmisen insuliinia, joka sisältää vastaavat suojaryhmät tai peräkkäisryhmät. Edullinen sian insuliinin johdannainen, jota voidaan käyttää keksinnön mukaisessa reaktiossa, on Des-PheB 1-sianinsuliini, joka keksinnön mukaisessa reaktiossa antaa vastaavan ihmisen 20 Des-Phe® 1 -insuliinin.
Edelleen sian insuliinin edullisia johdannaisia ovat ne, joiden asemassa N°B1 on suojaryhmä. Edullisin suojaryhmä tässä asemassa on tert-butyylioksikarbonyyli-(Boc)-ryhmä. Muita suojaryhmiä on esittänyt E. Wiinsch, 25 Mewthoden der organischen Chemie (Hoyben-Weyl) Band XV/1, Stuttgart 1974.
Reaktio suoritetaan keksinnön mukaisesti käytetyn lähtöinsuliinin tai sen johdannaisen isoelektrisen pisteen alapuolella olevassa pH-arvossa. Sian insuliinin tapauk-30 sessa on isoelektrinen piste pH-arvossa 5,4. Siten on suositeltavaa työskennellä sian insuliinia lähtömateriaalina käytettäessä arvon 5,4 alapuolella olevassa pH:ssa. Työskentelylle matalissa pH-arvoissa asettaa rajansa insuliinin pysyvyys ja entsyymin aktiivisuus happamessa ympäris-35 tössä.
5 79860
On osoittautunut tarkoituksenmukaiseksi sijoittaa insuliini tai insuliinijohdannainen treoniiniesteriasetaa-tin kanssa vesipitoiseen väliaineeseen, joka heikolla orgaanisella hapolla, edullisesti etikkahapolla, on säädetty 5 hieman happamaan pH-arvoon = pH noin 5. Tämän erikoisen menetelmämuunnoksen etuna on ensisijassa suuremmat saannot työskentelyyn vesipitoisissa orgaanisissa liuottimissa verrattuna. Muita etuja ovat orgaanisten liuottimien säästö ja reaktioseoksen helpompi käsittely, koska orgaanisen 10 liuottimen erottamista ei vaadita.
Reaktio voidaan suorittaa huoneen lämpötilassa. Reaktion nopeuttamiseksi soveltuu heikko lämmittäminen, kuitenkaan ei pitäisi ylittää noin 40°C:n lämpötilaa. Työskentely jäähdyttäen ei anna mitään etuja.
15 Trypsiinin lisäksi soveltuvat keksinnön mukaiseen menetelmään myös sellaiset entsyymit, jotka kirjallisuudesta tunnetaan trypsiinin tapaisina, so. sellaiset, jotka hajottavat määrätyt peptidisidokset emäksisten aminohappojen karboksyylipäätteissä. Käytettävän entsyymin määräl-20 lä on vain vähäinen merkitys. Se voi olla välillä 1:1-100:1, jolloin luvut tarkoittavat painosuhdetta sianin-suliini:entsyymi. Edullisesti työskennellään painosuhteessa noin 10:1.
Treoniiniesterinä voidaan käyttää kaikkia tunnet-25 tuja L-treoniiniestereitä. Esimerkkejä sopivista L-treo-niiniestereistä ovat L-treoniini-tert-butyyliesteri, L-treoniini-O-tert-butyyli-tert-butyyliesteri ja L-treonii-niroetyyliesteri. Treoniiniesterien johdannaisilla keksinnön mielessä tarkoitetaan niitä, joissa treoniinin 0H-30 funktiota varten on suojaryhmä, erikoisesti eetterisuoja-ryhmä.
Treoniiniesteriä käytetään insuliiniin nähden ylimäärin. Ylimäärän tulisi olla noin 10...100-kertainen mo-laarinen määrä insuliinin suhteen.
6 79860
Keksinnön mukainen reaktio antaa ensin ihmisen insuliinin B30-estereitä, jotka haluttaessa voidaan muuttaa sinänsä tunnettujen menettelyjen avulla poistamalla esteriryhmä vapaaksi ihmisen insuliiniksi.
5 On suositeltavaa suorittaa insuliinille ennen sen muuttamista vapaaksi insuliiniksi vaadittavat puhdistustoimenpiteet esimerkiksi tunnettujen pylväskromatograafis-ten menetelmien avulla.
Saadusta insuliinista voidaan valmistaa tavanomai-10 siä annostusmuotoja käytettäviksi lääkeaineina hoidettaessa Diabetes mellitus'ta.
Esimerkki 1 120 mg siasta saatua insuliinia ja 231 mg ThriOBu*JBu* suspendoidaan 2 ml:aan 0,1 molaarista pyri-15 diiniasetaattipuskuria, jonka pH-arvo on 4,0, ja liuotetaan lisäämällä 3 ml dimetyyliformamidia. Liuoksen pH-arvo mitataan ja tarvittaessa säädetään uudestaan etikkahapolla tai pyridiinillä arvoon 4,0. Kirkkaaseen liuokseen lisätään 30°C:ssa 5 mg TPCK-trypsiiniä. 4 tunnin kuluttua 20 lisätään vielä 2 x 5 mg:n osuutta TPCK-trypsiiniä. Reak-tioseosta sekoitetaan sitten vielä 16 tuntia 35°C:n lämpötilassa. Liuos tehdään sitten happamaksi pH-arvoon 2-3 IN suolahapolla ja saostetaan lisäämällä etanolia (1 ml) ja eetteriä (5 ml). Sakka eristetään sentrifugoimalla ja 25 sitä hierretään eetterin kanssa. Jauhemainen jäännös puhdistetaan jakokromatografiän avulla SephadexR LH20-pyl-väässä, kuten Obermeier et ai. ovat esittäneet. Erotuksessa ihmisen insuliiniesteriä sisältävät jakeet väkevöidään tyhjössä huoneen lämpötilassa ja saostetaan asetoni/eet-30 teri-seoksella. Jäännökseksi jäänyttä, reagoimatonta sian insuliinia voidaan käyttää uudestaan puolisynteesissä. Muodostunut sakka erotetaan sentrifugoimalla ja kuivataan. Saanto: 81 mg. Tämä tuote liuotetaan suojaryhmien poistamiseksi 3 ml:aan 6N anisolilla kyllästettyä suolahappoa
II
7 79860 mittäen lyhyeksi ajaksi 40°C:seen. Tämän jälkeen jäähdytetään ja 0°C:n lämpötilassa säädetään pH arvoon 2-3 10-%:isella natronlipeällä.
Ihmisen insuliini saostetaan lisäämällä 30 ml ase-5 töniä. Sakka erotetaan sentrifugoimalla ja kuivataan tyhjössä. Saanto on 77 mg ihmisen insuliinia.
Täten saatu ihmisen insuliini osoittaa kaniineilla verensokerin laskutestissä täyden biologisen tehokkuuden, joka on 26 I.E./mg sian insuliinista laskettuna.
10 Aminohappoanalyysi vastaa ihmisen insuliinin teo reettisia arvoja:
Teoreettinen Havaittu Glu 7 7,00
Ala 1 1,04 15 Thr 3 2,88
Lys 1 1,01
Esimerkki 2 120 mg siasta saatua insuliinia ja 133 mg treonii-20 nimetyyliesteriä annetaan reagoida esimerkissä 1 esitetyllä tavalla ihmisen insuliinimetyyliesteriksi ja tämä puhdistetaan. Siten saatua tuotetta (73 mg) sekoitetaan 0,1 ml:n kanssa 0,1N natriumhydroksidiliuosta 15 minuuttia 0°C:ssa. Sitten neutraloidaan 0,1 N suolahapolla (0,5 ml), 25 dialysoidaan ja jäähdytyskuivataan. Saatu ihmisen insuliini (68 mg) on biologisesti täysin aktiivinen ja sen aminohappoanalyysi vastaa teoreettisia arvoja.
Esimerkki 3 120 mg siasta saatua insuliinia ja 175 mg treonii-30 ni-tert-butyyliesteriä annetaan reagoida esimerkissä 1 esitetyllä tavalla ja puhdistetaan. Saanto on 76 mg ihmisen insuliinin tert-butyyliesteriä. Tuote liuotetaan 1 ml:aan trifluorietikkahappoa ja 0,05 ml:aan anisolia ja sitä sekoitetaan huoneen lämpötilassa 60 minuuttia. Siten 35 muodostunut suojaamaton ihmisen insuliini saostetaan li- 8 79860 säämällä 8 ml eetteriä ja erotetaan linkoamalla. Jäännös liuotetaan veteen, dialysoidaan ja jäähdytyskuivataan. Saanto on 71 mg ihmisen insuliinia, jolla on täysi biologinen aktiivisuus ja oikea aminohappokoostumus.
5 Esimerkki 4 115 g sian Des-PheB 1-insuliinia ja 231 mg ThriBu* )ΟΒυ*:a annetaan reagoida esimerkissä 1 esitetyllä tavalla ja tuote puhdistetaan. Saanto on 75 mg Des-PheB1 -ihmisinsuliinin B30-di-tert-butyyliesteriä. Tertiääristen 10 butyyliryhmien poistamisen ja esimerkin 1 mukaisen eristämisen jälkeen saadaan 70 mg vapaata Des-PheB1-ihmisinsu-liinia.
Biologinen aktiviteetti: 26 I.E./mg.
Aminohappoanalyysi: 15 Teoreettinen Havaittu
Glu 7 7,00
Ala 1 0,98
Thr 3 2,90
Phe 2 2,10 20 Lys 1 1,04
Esimerkki 5 120 mg sian insuliinia ja 231 mg ThriBu* )0But :an annetaan reagoida esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Tryp-25 siinin asemesta käytetään 0,50 ml agaroosigeeliin sidottua trypsiiniä. Trypsiiniagaroosin poistamisen jälkeen suodattamalla liuosta käsitellään esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Ihmisen insuliinin saanto on 61 mg.
Esimerkki 6 30 5g sian insuliinia ja 30 g Thr(Bu*JOBu*-asetaattia liuotetaan 20 ml:aan vettä ja pH säädetään etikkahapolla arvoon 5,0 - 5,2. Reaktiokomponenttien liuokseen liuotetaan 400 mg trypsiiniä liuotettuna 2 ml:aan vettä. Reaktion kulkua valvotaan asetaattikalvoelektroforeesin avul-35 la. Käytetyn sian insuliinin reaktion ollessa maksimaali-
II
9 79860 nen (noin 90 %) seostetaan raaka reaktiotuote lisäämällä 200 ml metanolia ja 50 ml di-isopropyylieetteriä. Sentri-fugoinnin ja kuivauksen jälkeen saanto on 5,1 g raakamate-riaalia, joka HPLC-analyyttisen tutkimuksen mukaan sisäl-5 tää 90 % ihmisinsuliini-B30-But2 :a.
Esimerkki 7 30 ml:aan 37,5-%:ista etikkahapon vesiliuosta liuotetaan peräkkäin 5 g N°B1-Boc-sianinsuliinia ja 24 g ThrfBu* )0Bu*:a ja lisätään esimerkin 6 mukaisesti 400 mg 10 trypsiiniä 2 ml:ssa vettä. Reaktio etenee esimerkin 6 mukaisesti ja keskeytetään maksimaalisen reaktion jälkeen seostamalla metanoli/di-isopropyylieetteriseoksella. Eristämisen ja kuivaamisen jälkeen on saanto 5,0 g raakamate-riaalia, joka HPLC-analyysin mukaan sisältää 87 % NaBl-15 Boc-ihmisinsuliini-B30-But2:a.
Esimerkki 8 10 g sian insuliinia liuotetaan 45 ml:aan vettä lisäämällä 5 ml etikkahappoa. Lisätään 33 g ThriBu* JOBu*-asetaattia ja tähän kirkkaaseen liuokseen lisätään sekoit-20 taen 0,8 g trypsiiniä 5 ml:aan vettä liuotettuna. 16 tunnin jälkeen huoneen lämpötilassa reaktio keskeytetään seostamalla 500 ml:11a metanolin ja di-isopropyylieetterin seosta (tilavuussuhde 4:1) ja käsitellään esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Ihmisen insuliiniesterin saanto on 25 4 g.
Esimerkki 9 10 g sian insuliinia liuotetaan 40 ml:aan vettä lisäämällä 5 ml etikkahappoa yhdessä 6 g:n kanssa Thr(Bufc)0But)-asetaattia. Reaktiokomponenttien seokseen 30 lisätään 0,8 g trypsiiniä liuotettuna 2 ml:aan vettä. 16 tunnin jälkeen huoneen lämpötilassa menetellään esimerkissä 8 esitetyllä tavalla ja puhdistetaan seos. Saanto puhdistuksen jälkeen on 4,1 g ihmisen insuliiniesteriä.
10 79860
Esimerkki 10 120 mg sian insuliinia liuotetaan 0,5 ml:aan vettä ja 0,04 ml:aan etikkahappoa yhdessä 380 mg: n kanssa ThriBu* )0Bu*)-asetaattia. Liuokseen lisätään 10 yksikköä 5 lysyleenidipeptidaasi-Lys-cl (5 mg proteiinia). 16 tunnin jälkeen huoneen lämpötilassa menetellään esimerkissä 8 esitetyllä tavalla ja seos puhdistetaan. Ihmisen insuliinin saanto 61 mg.
Esimerkki 11 10 1,35 kg ThriBu*)0Βυ*:a liuotetaan 1 litraan petro- lieetteriä ja jäähdytetään jäillä. Liuokseen lisätään 340 ml etikkahappoa ja liuos jäähdytetään kiteytyksen loppuun asti 0°C:seen. Kide jäännös Thr(But JOBu*1-asetaatti suodatetaan, pestään 0°C:n lämpöisellä petrolieetterillä ja kui-15 vataan tyhjössä. Thr(Bufc JOBu* -asetaatin saanto 1,44 kg (sulamispiste 58 - 60°C).
Il
Claims (11)
1. Menetelmä ihmisen insuliinin, ihmisen Des-Phe insuliinin tai niiden johdannaisten valmistamiseksi, jot- 5 ka sisältävät suojaryhmiä vapaissa funktionaalisissa ryh- B1 missä, sian insuliinista, sian Des-Phe -insuliinista tai niiden johdannaisista, jotka sisältävät suojaryhmiä vapaissa funktionaalisissa ryhmissä, tunnettu sii- B1 tä, että sian insuliinin tai sian Des-Phe -insuliinin 10 tai niiden johdannaisten, jotka sisältävät suojaryhmiä vapaissa funktionaalisissa ryhmissä, annetaan reagoida iso-elektrisen pisteensä alapuolella olevassa pH-arvossa tryp-siinin tai trypsiinin tapaisen entsyymin läsnäollessa vesipitoisessa väliaineessa ilman neutraalin, inertin, veden 15 kanssa sekoittuvan liuottimen läsnäoloa, reaktiolämpötilan ollessa alle 40°C, ylimäärän kanssa treoniiniesteriä tai treoniiniesteri-eetteriä, minkä jälkeen haluttaessa poistetaan mahdollisesti läsnäolevat suojaryhmät.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, B1 20 tunnettu siitä, että valmistetaan Des-Phe B1 ihmisinsuliinia Des-Phe -sian insuliinista.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan pHrssa, : joka vaihtelee arvosta 4 lähtöaineena käytetyn sian insu- 25 liinin isoelektriseen pisteeseen.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sian insuliinin johdannainen ...... .... OtBl on sian insuliini, ]ossa on suojaryhma N -asemassa.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että suojaryhmä on Boc.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan ihmisinsuliini-ThrB30(But)OBut.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, B1 35 tunnettu siitä, että valmistetaan Des-Phe -ihmis-insuliini-ThrB30(But)OBut. 12 79860
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan ihmisinsuliini-530 t t Q/gi Thr (Bu ) OBu , joka N -asemassa on suojattu Ni^-suo-jaryhmällä.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, Cy B1 tunnettu siitä, että valmistetaan N -BOC-ihmis-insuliini-ThrB3° (Bu1") OBut.
10 Thr (Bu ) OBu , josta on poistettu suojaryhmät. R1
10. Menetelmä ihmisen insuliinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan ihmisinsuliini-B 3 O t*
11. Menetelmä Des-Phe -ihmisinsuliinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan n 1 η O Λ f- t . Des-Phe -ihmisinsuliini-Thr (Bu )OBu , josta on poistettu suojaryhmät. 13 7 9 8 60
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3101382 | 1981-01-17 | ||
| DE19813101382 DE3101382A1 (de) | 1981-01-17 | 1981-01-17 | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI820117L FI820117L (fi) | 1982-07-18 |
| FI79860B FI79860B (fi) | 1989-11-30 |
| FI79860C true FI79860C (fi) | 1990-03-12 |
Family
ID=6122819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI820117A FI79860C (fi) | 1981-01-17 | 1982-01-14 | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin des-pheb1-humaninsulin eller derivat daerav ur svininsulin, des-pheb1-svininsulin eller derivat daerav. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4601852A (fi) |
| EP (1) | EP0056951B1 (fi) |
| JP (1) | JPS57138396A (fi) |
| KR (1) | KR880001107B1 (fi) |
| AT (1) | ATE13893T1 (fi) |
| AU (1) | AU559235B2 (fi) |
| CA (1) | CA1190496A (fi) |
| DE (2) | DE3101382A1 (fi) |
| DK (1) | DK149615B (fi) |
| ES (1) | ES508657A0 (fi) |
| FI (1) | FI79860C (fi) |
| GR (1) | GR74758B (fi) |
| IL (1) | IL64789A (fi) |
| ZA (1) | ZA82261B (fi) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK147437A (en) * | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| AU551174B2 (en) * | 1981-09-15 | 1986-04-17 | Nordisk Insulinlaboratorium | Enzymatic preparation of human insulin or b-30 esters thereof |
| EP0087238A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-31 | Biogen N.V. | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| EP0092829B1 (en) * | 1982-04-23 | 1990-11-07 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for semi-synthesis of human insulin and alkaline protease for use therein |
| DE3333640A1 (de) * | 1983-09-17 | 1985-04-25 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten, deren b-kette c-terminal verlaengert ist, neue basisch modifizierte insulin-derivate diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| DE3334407A1 (de) * | 1983-09-23 | 1985-04-04 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | In position b 30 modifizierte insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| NZ232375A (en) * | 1989-02-09 | 1992-04-28 | Lilly Co Eli | Insulin analogues modified at b29 |
| DE4028120C2 (de) | 1990-09-05 | 1996-09-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten |
| US5106510A (en) * | 1991-03-08 | 1992-04-21 | Enviroguard, Inc. | Combined filtration and fixation of heavy metals |
| DK0547544T3 (da) * | 1991-12-18 | 1997-09-08 | Hoechst Ag | Fremgangsmåde til fremstilling af insulinholdige opløsninger. |
| US5534488A (en) * | 1993-08-13 | 1996-07-09 | Eli Lilly And Company | Insulin formulation |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| RU2120299C1 (ru) * | 1995-06-08 | 1998-10-20 | Акционерное курганское общество "Синтез" | Способ получения высокоочищенного монокомпонентного инсулина |
| RU2126690C1 (ru) * | 1996-11-06 | 1999-02-27 | Анистратенко Николай Юрьевич | Способ очистки инсулина-сырца, получаемого из поджелудочной железы свиней |
| BR9813111A (pt) | 1997-10-24 | 2000-08-15 | Lilly Co Eli | Composições de insulina insolúveis |
| CO4970787A1 (es) * | 1997-12-23 | 2000-11-07 | Lilly Co Eli | Composiciones insolubles de insulina y derivados de insulina que controlan la glucosa sanguinea |
| UA46668C2 (en) * | 2001-12-29 | 2006-01-16 | Omakooe Ltd Liability Company | Method for preparing combined dosage form of human insulin |
| UA46666C2 (en) * | 2001-12-29 | 2006-01-16 | Omakooe Ltd Liability Company | Method for preparing dosage form of short-term acting insulin |
| UA46669C2 (uk) * | 2001-12-29 | 2005-12-15 | Товариство З Обмеженою Відповідальністю "Мако" | Спосіб приготування готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії |
| UA46667C2 (en) * | 2001-12-29 | 2006-01-16 | Omakooe Ltd Liability Company | Method for preparing semisynthetic human insulin |
| US6964561B2 (en) * | 2002-04-23 | 2005-11-15 | V System Composites, Inc. | High-performance infusion system for VARTM fabrication |
| US20070108646A1 (en) * | 2005-11-15 | 2007-05-17 | Louderback Michael J | Method of fabricating a composite structure with details |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3276961A (en) * | 1963-04-08 | 1966-10-04 | Squibb & Sons Inc | Process for preparing human insulin |
| US3903068A (en) * | 1972-12-26 | 1975-09-02 | Us Health Education & Welfare | Facile synthesis of human insulin by modification of porcine insulin |
| DE2460753A1 (de) * | 1974-12-21 | 1976-06-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von humaninsulin |
| EP0017938B1 (en) * | 1979-04-13 | 1983-08-03 | Shionogi & Co., Ltd. | Process for preparing a b30-threonine insulin |
| DK147437A (en) * | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
-
1981
- 1981-01-17 DE DE19813101382 patent/DE3101382A1/de not_active Withdrawn
-
1982
- 1982-01-12 ES ES508657A patent/ES508657A0/es active Granted
- 1982-01-14 JP JP57003544A patent/JPS57138396A/ja active Granted
- 1982-01-14 AT AT82100217T patent/ATE13893T1/de active
- 1982-01-14 EP EP82100217A patent/EP0056951B1/de not_active Expired
- 1982-01-14 DE DE8282100217T patent/DE3264149D1/de not_active Expired
- 1982-01-14 FI FI820117A patent/FI79860C/fi not_active IP Right Cessation
- 1982-01-15 CA CA000394297A patent/CA1190496A/en not_active Expired
- 1982-01-15 DK DK16682A patent/DK149615B/da not_active Application Discontinuation
- 1982-01-15 GR GR67018A patent/GR74758B/el unknown
- 1982-01-15 IL IL64789A patent/IL64789A/xx active IP Right Grant
- 1982-01-15 AU AU79554/82A patent/AU559235B2/en not_active Expired
- 1982-01-15 ZA ZA82261A patent/ZA82261B/xx unknown
- 1982-01-18 KR KR8200188A patent/KR880001107B1/ko not_active Expired
-
1984
- 1984-08-15 US US06/641,357 patent/US4601852A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK149615B (da) | 1986-08-11 |
| AU559235B2 (en) | 1987-03-05 |
| ES8301206A1 (es) | 1982-11-16 |
| US4601852A (en) | 1986-07-22 |
| AU7955482A (en) | 1982-07-29 |
| ZA82261B (en) | 1982-12-29 |
| DE3101382A1 (de) | 1982-09-02 |
| DE3264149D1 (en) | 1985-07-25 |
| IL64789A (en) | 1985-09-29 |
| EP0056951A1 (de) | 1982-08-04 |
| KR880001107B1 (ko) | 1988-06-29 |
| JPH0141317B2 (fi) | 1989-09-05 |
| FI820117L (fi) | 1982-07-18 |
| KR830008995A (ko) | 1983-12-16 |
| JPS57138396A (en) | 1982-08-26 |
| CA1190496A (en) | 1985-07-16 |
| ES508657A0 (es) | 1982-11-16 |
| GR74758B (fi) | 1984-07-11 |
| IL64789A0 (en) | 1982-03-31 |
| DK16682A (da) | 1982-07-18 |
| ATE13893T1 (de) | 1985-07-15 |
| FI79860B (fi) | 1989-11-30 |
| EP0056951B1 (de) | 1985-06-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI79860C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin des-pheb1-humaninsulin eller derivat daerav ur svininsulin, des-pheb1-svininsulin eller derivat daerav. | |
| US6908897B2 (en) | Covalently bridged insulin dimers | |
| RU2205836C2 (ru) | Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками | |
| US5015728A (en) | Process for the preparation of insulin derivatives, the B chain of which is lengthened c-terminally | |
| FI77876C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. | |
| FI79853C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. | |
| FI78119C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenskligt insulin eller b-30-estrar daerav. | |
| US4639333A (en) | Process for converting preproinsulin analogs into insulins | |
| EP0051205A1 (de) | Neues Tridekapeptid, Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung | |
| FI73239B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett insulinderivat. | |
| EP0087238A1 (en) | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin | |
| EP0277561B1 (en) | New arginine derivative, process for the preparation thereof and its use in peptide synthesis | |
| JPS5811428B2 (ja) | インシユリンケイカゴウブツノセイホウ | |
| Brandenburg et al. | Crosslinked insulins: preparation, properties, and applications | |
| CZ280690B6 (cs) | Nové analogy karboxyterminálního oktapeptidu (B23-B30) B-řetězce lidského insulinu | |
| JPH0150719B2 (fi) | ||
| DE2810860A1 (de) | Verfahren zum aufbau von peptidketten | |
| JPS6312480B2 (fi) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |
Owner name: AVENTIS PHARMA DEUTSCHLAND GMBH |