FI77876C - Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. Download PDFInfo
- Publication number
- FI77876C FI77876C FI810385A FI810385A FI77876C FI 77876 C FI77876 C FI 77876C FI 810385 A FI810385 A FI 810385A FI 810385 A FI810385 A FI 810385A FI 77876 C FI77876 C FI 77876C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- insulin
- thr
- porcine
- ome
- trypsin
- Prior art date
Links
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 title claims description 56
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 title claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 title claims description 32
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 title claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title description 9
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Substances N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 176
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 73
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 71
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 71
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 67
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 62
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 62
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 62
- -1 insulin compound Chemical class 0.000 claims description 51
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 claims description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 34
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 31
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Natural products C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 21
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 13
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 12
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 10
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 8
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N insulin rabbit Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N 0.000 claims description 5
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 2
- 101100189913 Caenorhabditis elegans pept-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 102
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 34
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 26
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 17
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 17
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 17
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 8
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- 150000008551 L-threonines Chemical class 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 5
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 4
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000590035 Achromobacter lyticus Species 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012442 analytical experiment Methods 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1,3-oxazole-4-carbaldehyde Chemical compound FC1=CC=CC(C=2OC=C(C=O)N=2)=C1 BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005982 diphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 2
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940087562 sodium acetate trihydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- YZYKBQUWMPUVEN-UHFFFAOYSA-N zafuleptine Chemical compound OC(=O)CCCCCC(C(C)C)NCC1=CC=C(F)C=C1 YZYKBQUWMPUVEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWADEBCIPVNACR-ZDUSSCGKSA-N (2s)-2-(n-(4-methylphenyl)sulfonylanilino)propanoic acid Chemical group C=1C=C(C)C=CC=1S(=O)(=O)N([C@@H](C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 TWADEBCIPVNACR-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N (r)-(6-ethoxyquinolin-4-yl)-[(2s,4s,5r)-5-ethyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl]methanol;hydrochloride Chemical group Cl.C([C@H]([C@H](C1)CC)C2)CN1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OCC)C=C21 QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100005280 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cat-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000004648 butanoic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N chloroacetone Chemical compound CC(=O)CCl BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229950004152 insulin human Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N methyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 108010066090 neutral insulin Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- IWOKCMBOJXYDEE-UHFFFAOYSA-N sulfinylmethane Chemical compound C=S=O IWOKCMBOJXYDEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XASPGLPXANLVTJ-RITPCOANSA-N tert-butyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)OC(C)(C)C XASPGLPXANLVTJ-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Forklifts And Lifting Vehicles (AREA)
Description
! 77876 B30
Menetelmä lhmisinsuliinin tai ihmisinsuliinin treoniini esterin tai sen suolan ta-i kompleksin valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu menetelmään ihmisinsuliinin tai ihmi- B30 sinsuliinin treoniini -esterin tai sen suolan tai kompleksin valmistamiseksi.
Hoidettaessa diabetes mellitus -sairautta käytetään tavallisesti insuliinipreparaatteja, jotka sisältävät sian- ja naudan insuliinia. Naudan-, sian- ja ihmisinsuliinin välillä on pieniä eroja niiden aminohappokoostumuksen suhteen, jolloin ero ihmis- ja sianinsuliinin kohdalla rajoittuu yksinkertaiseen aminohappoon, ihmisinsuliinissa B30-aminohappo on treoniini, kun se taas sianinsuliinissa on alaniini. Kuitenkin voidaan sanoa, että ideaalinen insuliini ihmisten hoitoon on insuliinipreparaatti, jolla on tarkkaan sama rakenne kuin ih-misinsuliinilla.
Luonnollisen ihmisinsuliinin valmistamiseksi ei ole saatavilla tarpeeksi ihmisen haimarauhasia.
Synteettistä ihmisinsuliinia on valmistettu pienessä mittakaavassa suurin kustannuksin, Helv. Chim. Acta 57^ 2617, ja 60, 27. Sianinsuliinista on valmistettu semisynteettistä ihmisinsuliinia monimutkaisella menetelmällä, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 357, 759.
US-patenttijulkaisun 3 276 961 väitetään koskevan menetelmää semisynteettisen ihmisinsuliinin valmistamiseksi, jossa menetelmässä muita, animaalisia insuliineja saatetaan reagoimaan treoniinin kanssa entsyymin, kuten trypsiinin tai karboksipep-tidaasi A:n läsnäollessa. Ihmisinsuliinin saanto on kuitenkin hyvin pieni (jos ylipäätänsäkään saadaan ihmisinsuliinia), sillä menetelmä suoritetaan vedessä, joissa olosuhteissa 2 77876 B22 B23 trypsiini johtaa Arg -Gly -sidoksen lohkeamiseen, J. Biol. Chem. 236, 743.
Toinen tunnettu semisynteettinen menetelmä ihmisinsuliinin valmistamiseksi käsittää seuraavat kolme vaihetta: Ensimmäi- B30 sessä vaiheessa sianinsuliini lohkaistaan sian-des-(Ala )- insuliiniksi käsittelemällä karboksipeptidaasi A:11a, Hoppe-
Seyler's Z. Physiol. Chem. 359, 799. Toisessa vaiheessa Β3Ό— suoritetaan sian-des-(Ala )-insuliinille trypsiinin katalysoima kytkentä Thr-OBut:n kanssa, jolloin saadan ihmisinsu-B30 liinin Thr -tert.butyyliesteri. Kolmannessa vaiheessa mainittua esteriä käsitellään trifluorietikkahapolla, jolloin saadaan ihmisinsuliinia, Nature 280, 412. Ensimmäisessä a2 1 vaiheessa tapahtuu kuitenkin Asn :n osittaista poistumis- , B30 A21 ta, jolloin saadaan des-(Ala , Asn )-insuliinia. Tämä johdannainen antaa kahden seuraavan reaktiovaiheen aikana valmistettavaan semisynteettiseen ihmisinsuliiniin epäpuhtau-Δ 21 den des(Asn )-insuliini, joka epäpuhtaus on vaikeasti poistettavissa tunnetuin preparatiivisin menetelmin. Des-A21 (Asn )-insuliinilla on pieni biologinen aktiivisuus (n.
5 %), Amer. J. Med. 40, 70.
Nyt on yllättäen osoittautunut, että insuliiniyhdisteitä, jotka ovat erilaisia kuin ihmisinsuliini, kuten sianinsuliini ja sen sisältämät tietyt epäpuhtaudet, voidaan muuttaa ihmis- insuliiniksi menetelmällä, jossa insuliiniyhdisteet yhdessä B30 vaiheessa muutetaan suoraan ihmisinsuliinin treoniini esteriksi. Tällä menelmällä saadaan ihmisinsuliinia olennaisesti paremmalla saannolla kuin tunnetuilla menetelmillä ja ilman vaikeasti poistettavissa olevia sivutuotteita.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle ihmisinsuliinin tai ihmis- B30
insuliinin treoniini -esterin tai sen suolan tai kompleksin valmistamiseksi on tunnusomaista, että insuliiniyhdis-te, jolla on kaava I
i 3 , 77876 R -(1---A—21) I I 2 (1---B---29 )-R (I) jossa -(1---A---21) (1—-B---29)- , B30 A1 on ihmis-des(Thr )-insuliiniosa, jossa Glv on sitou- 1 B29 tunut substituenttiin R ja Lys on sitoutunut substi-2 2
tuenttim R , R on aminohappo tai peptidiket ju, joka sisältää korkeintaan 36 aminohappoa, ja R on vety tai ryhmä, jolla on yleinen kaava R -X-, jossa X on arginiini tai ly-siini ja R on peptidiketju, ^oka sisältää korkeintaan 35 aminohappoa, tai R yhdessä R :n kanssa on peptidiketju, joka sisältää korkeintaan 35 aminohappoa, sillä ehdolla, että R :ssä ja R :ssa olevien aminohappojen lukumäärä on pienempi kuin 37, tai sen suola tai kompleksi, joka voidaan muuttaa kaavan I mukaiseksi insuliiniyhdisteeksi, transpepti-doidaan L-treoniiniesterin kanssa, jolla on kaava II
, 5 4
Thr(R )-0R (II) ... 4 5 jossa R on karboksyylisuojaryhmä ja R on vety tai hyd- roksyylisuojaryhmä, tai sen suolan kanssa seoksessa, joka sisältää vettä, veteen sekoittuvaa orgaanista liuotinta ja trypsiiniä, jolloin vesipitoisuus reaktioseoksessa on alle 50 % (tilavuus/tilavuus) ja reaktiolämpötila on alle 50 C, ja mahdollisesti hapon läsnäollessa, jonka jälkeen saatu ih-.... .B30 misinsuliinin treoniini -esteri haluttaessa lohkaistaan.
Esillä oleva keksintö perustuu sille havainnolle^ että aminohappo tai peptidiketju, joka on sitoutunut Lys -karbon-yyliryhmään kaavan I mukaisessa insuliiniyhdisteessä, voidaan yhdessä vaiheessa vaihtaa treoniiniesteriin. Mainittua vaihtoa merkitään tässä transpeptidoinniksi.
4 77876
Kaavan I mukaiset insuliiniyhdisteet ovat insuliineja ja in- suliininkaltaisia yhdisteitä, jotka sisältävät ihmis-des-B30 (Thr )-insuliiniosan, jossa B30-aminohappo insuliinissa on alaniini (esimerkiksi sian, koiran ja evävalaan ja kaskelo-tin insuliini) tai seriini (kaniini). Tässä käytetty merkintä "insuliinin kaltaiset yhdisteet" käsittää myös proinsuliinin, joka saadaan jostakin yllä mainitusta lajista ja apinoista sekä välituotteita muutettaessa proinsuliinia insuliiniksi. Esimerkkeinä tällaisista välituotteista voidaan antaa lohkaistu proinsuliini, desdipeptidiproinsuliinit, desnonapepti-diproinsuliini ja diarginiini-insuliinit, R. Chance: In Proceedings of the Seventh Congress of IDF, Buenos Aires 1970, 292-305, R.R. Rodriques & J.V.-Owen, Excerpta Medica, Amsterdam.
Vaikkakin trypsiini tunnetaan parhaiten proteolyyttisten omi- naisuuksiensa puolesta, ovat asiantuntijat havainneet, että B304 trypsiini voi katalysoida des-(Ala )-insuliinm ja treo-niini-tert-butyyliesterin kytkemisen, Nature 280, 412. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään trypsiiniä katalysoimaan transpeptidointi.
Edellä esitetyn mukaisesti julkaisu Nature 280, 412 koskee menetelmää peptidien kytkemiseksi, kun taas esillä oleva keksintö koskee menetelmää peptidien transpeptidoimiseksi. Jos se vaihe, jossa ihmisinsuliiniesteri hydrolysoidaan, jätetään huomioimatta, on julkaisun Nature 280, 412 mukaan käytettävä kaksi vaihetta ihmisinsuliiniesterin valmistamiseksi, nimittäin peptidin lohkaisuvaihe ja peptidin kytkemisvaihe. Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan ihmisinsuliiniesteri suoraan yhdessä vaiheessa, joka on transpep-tidointivaihe.
Julkaisussa Nature 280, 412 esitetään, että on yllättävää, - B22 B23 ettei tuotteessa tapahdu Arg -Gly -sidoksen lohkea-mista. On tunnettua, että trypsiini vesipitoisessa väliai- i s 77876 B22 B23 neessa lohkaisee sekä kohdassa Arg -Glv että kohdas-B29 B30 sa Lys -Ala ja niinpä julkaisun Nature 280, 412 perusteella on odotettavissa, että trypsiini orgaanisessa vä- B29 B30 liaineessa ei myöskään lohkaise Lys -Ala -sidosta.
Julkaisussa Nature 280, 412 ei ole mitään mainintaa siitä, B29 —B30 tapahtuuko Lys -Ala -sidoksen lohkaisua orgaanisessa väliaineessa. Näin ollen on keksinnön mukaisesti erityisen yllättävää, että sianinsuliinille voidaan suoraan suorittaa transpeptidointi.
Julkaisussa Biochem. Biophys. Res. Corn. 9^, 396, on kuvattu menetelmä ihmisinsuliinin valmistamiseksi, joka menetelmä on olennaisesti identtinen julkaisussa Nature 280, 412, kuvatun menetelmän kanssa, jolloin siinä kuitenkin entsyyminä käytetään Achromobacter lyticus -proteaasia. Edellä esitetty tarkastelu koskien julkaisua Nature 280, 412, pätee näin ollen myös julkaisulle Biochem. Biophys. Res. Com. 92, 396.
Keksinnön mukaisesti transpeptidointi voidaan suorittaa liuottamalla insuliiniyhdiste, L-treoniiniesteri ja trypsiini seokseen, joka sisältää vettä ja vähintään yhtä veteen sekoittuvaa orgaanista liuotinta, mahdollisesti hapon läsnäollessa.
Edullisia veteen sekoittuvia orgaanisia liuottimia ovat polaariset liuottimet. Esimerkkeinä tällaisista liuottimista voidaan antaa metanoli, etanoli, 2-propanoli, 1,2-etaanidio-li, asetoni, dioksaani, tetrahydrofuraani, N,N-dimetyyliform-amidi, formamidi, Ν,Ν-dimetyyliasetamidi, N-metyylipyrrolido-ni, heksametyylifosforitriamidi ja asetonitriili.
Veden määrä reaktioseoksessa riippuu käytettävästä veteen sekoittuvasta orgaanisesta liuottimesta, reaktiolämpötilasta, ja siitä, onko happoa läsnä reaktioseoksessa, ja sen tulee olla pienempi kuin noin 50 % (tilavuus/tilavuus), ja edullisesti pienempi kuin noin 40 % (tilavuus/tilavuus), ja suurempi kuin noin 10 % (tilavuus/tilavuus).
6 77876
Eräs etu veden määrän vähentämisellä reaktioseoksessa on, että sivutuotteiden synty tällöin pienenee. Hapon määrän lisäämisellä reaktioseoksessa on mahdollista vastaavasti pienentää sivutuotteiden syntyä. Saannon lisääntyminen korreloituu orgaanisen liuottimen korkeaan pitoisuuteen.
Käytetty trypsiinilaji ei tämän keksinnön suorittamisessa ole oleellinen. Trypsiini on hyvin karakterisoitu entsyymi, joka on kaupallisesti saatavissa hyvin puhtaana, erityisesti naudasta ja siasta. Voidaan vielä käyttää mikrobiologisesti saatua trypsiiniä. Tämän keksinnön suorittamisessa ei trypsiinin muoto, esim. kiteinen trypsiini (liukoinen muoto), immobili-soitu trypsiini tai jopa trypsiinijohdannaiset (kunhan trypsiinin aktiivisuus säilyy) ole oleellinen. Tässä käytetty trypsiini käsittää kaikista lähteistä saadun trypsiinin ja kaikki trypsiinimuodot, joilla on transpeptidoiva aktiivisuus, käsittäen myös proteaasit, joilla on trypsiinin tapainen spesifisyys, Achromobacter lyticus -proteaasi, Agric. Biol. Chem. 42, 1443.
Esimerkkeinä aktiivisista trypsiinijohdannaisista voidaan antaa asetyloitu trypsiini, sukkiniloitu trypsiini, glutaralde-hydillä käsitelty trypsiini ja immobilisoidut trypsiinijohdannaiset.
Mikäli käytetään immobilisoitua trypsiiniä, tämä suspendoi-daan väliaineeseen.
Sopivan puskurisysteemin aikaansaamiseksi voidaan lisätä orgaanisia tai epäorgaanisia happoja, kuten suolahappoa, muurahaishappoa, etikkahappoa, propionihappoa tai voihappoa tai emäksiä, kuten pyridiiniä, TRIS'iä, N-metyylimorfoliinia tai N-etyylimorfoliinia. Orgaaniset hapot ovat edullisia. Reaktio voidaan kuitenkin suorittaa ilman tällaisia lisäyksiä. Lisätty happomäärä on tavallisesti pienempi kuin noin 10 ekvivalenttia yhtä ekvivalenttia L-treoniiniesteriä kohden. Hapon 7 77876 määrä on edullisesti välillä 0,5-5 ekvivalenttia yhtä ekvivalenttia L-treoniiniesteriä kohden. Voidaan myös lisätä ioneja, jotka stabilisoivat trypsiinin, kuten esimerkiksi kalsiumio-nit.
Riittävä reaktionopeuden saavuttamiseksi entsymaattiset reaktiot trypsiiniä käyttäen suoritetaan tavallisesti noin o 37 C:ssa. Trypsiinin inaktivoitumisen välttämiseksi suoritetaan esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä edullisesti lämpötilassa, joka on alle ympäristön lämpötilan. Käytän- o nossa reaktiolämpötilat, ]otka ovat yli noin 0 C ovat edullisia .
Riippuen reaktiolämpötilasta, lisätystä trypsiinin määrästä ja muista reaktio-olosuhteista reaktioaika on tavallisesti välillä useita tunteja - useita päiviä.
Trypsiinin ja insuliiniyhdisteen painosuhde on tavallisesti suurempi kuin noin 1:200, edullisesti suurempi kuin noin 1:50, ja pienempi kuin noin 1:1.
B30
Transpeptidoinnissa saadut ihmisinsuliinin treoniini -esterit voidaan kuvata yleisellä kaavalla III: 5 4 B30 (Thr(R )—OR ) -h-In (III) B30 4 jossa h-In on ihmis-des-(Thr )-insuliiniosa, ja R ja 5 R merkitsevät samaa kuin yllä.
Kaavan II mukaisia käyttökelpoisia L-treoniiniestereitä ovat sellaiset, joissa R on karboksyylisuojaryhmä, joka voidaan B30 poistaa ihmisinsuliinin treoniini -esteristä (kaava III) sellaisissa olosuhteissa, joissa insuliinimolekyylissä ei tapahdu oleellisesti palautumattomia muutoksia. Esimerkkeinä tällaisista karboksyylisuojaryhmistä voidaan antaa alemmat al-kyylit, esim. metyyli, etyyli ja tert.butyyli, substituoidut 8 77876 bentsyylit, kuten p-metoksibentsyyli ja 2,4,6-trimetyylibent- syyli ja difenyylimet^yli, ja ryhmiä, joilla on yleinen kaava -CH CH SO R , jossa R on alempi alkyyli, kuten metyyli, 2 2 2 etyyli, propyyli ja n-butyyli. Sopivia hydroksyylisuojaryhmiä 5 R ovat sellaiset, jotka voidaan poistaa ihmisinsuliinin B30 treoniini -esteristä (kaava III) sellaisissa olosuhteissa, joissa insuliinimolekyylissä ei tapahdu oleellisesti palautu- 5 mattomia muutoksia. Esimerkkinä tällaisesta ryhmästä R voidaan antaa tert.-butyyli.
Alemmat alkyyliryhmät sisältävät vähemmän kuin 7 hiiliatomia, edullisesti vähemmän kuin 5 hiiliatomia.
Tavallisesti käytettyjä suojaryhmiä kuvataan teoksessa Metho-den der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Voi. XV/1, Eugen Muller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.
Jotkin kaavan II mukaiset L-treoniiniesterit ovat tunnettuja yhdisteitä, ja muut L-treoniiniesterit (kaava II) voidaan valmistaa analogisesti tunnettujen yhdisteiden valmistusmenetelmin .
Kaavan II mukaiset L-treoniiniesterit voivat olla vapaina emäksinä tai sopivina orgaanisina tai epäorgaanisina suoloina, edullisesti asetaatteina, propionaatteina, butyraatteina ja hydrohalogenideina, kuten hydroklorideina.
On suositeltavaa käyttää reagoivien ainesosien, eli insulii-niyhdisteen ja L-treoniiniesterin (kaava II) korkeita pitoisuuksia. L-treoniiniesterin ja insuliiniyhdisteen moolisuhde on edullisesti suurempi kuin noin 5:1.
On toivottavaa, että L-treoniiniesterin (kaava II) pitoisuus reaktioseoksessa on suurempi kuin 0,1 M.
i 9 77876 B30
Ihmisinsuliinia saadaan ihmisinsuliinin treoniini -este- 4 ristä (kaava III) poistamalla suojaryhmä R ja mahdollisesti läsnä oleva suojaryhmä^R tunnetulla tavalla tai sinänsä tunnetulla tavalla. Kun R on metyyli, etyyli tai ryhmä, 6 6 jolla on kaava -CH CH SO R , jossa R merkitsee samaa kuin 2 2 2 yllä, voidaan mainittu suojaryhmä poistaa lievissä, emäksisissä olosuhteissa vesiväliaineessa, edullisesti pH-arvossa noin 8 - noin 12, esimerkiksi noin 9,5. Emäksenä voidaan käyttää ammoniakkia, etyyliamiinia tai alkalimetallien hyd- 4 roksidejä, kuten natriumhydroksidia. Kun R on tert.butyyli, substituoitu bentsyyli, kuten p-metoksibentsyyli tai 2,4,6-trimetyylibentsyyli tai difenyylimetyyli, voidaan mainittu ryhmä poistaa asidolyysillä, edullisesti käyttäen trifluori-etikkahappoa. Trifluorietikkahappo voi olla vedetön ja se voi sisältää vettä, tai se voidaan laimentaa orgaanisella liuottimena, kuten dikloorimetaanilla. Kun R on tert.butyyli, voidaan mainittu ryhmä poistaa asidolyysillä, kuten yllä on mainittu.
B30
Ihmisinsuliinin kaavan III mukaisia edullisia treoniini - 5 estereitä ovat yhdisteet, joissa R on vety, ja näitä yhdisteitä voidaan valmistaa kaavan II mukaisista L-treoniini- 5 estereistä, joissa R on vety.
Keksinnön mukaisessa transpeptidoinnissa muutetaan mikä tahansa edellä mainituista insuliiniyhdisteistä siten ihmisin- B30 suliinin treoniini -esteriksi (kaava III), joka tämän jälkeen voidaan lohkaista ihmisinsuliinin saamiseksi.
Tämän keksinnön vielä eräs etu on se, että kaavan I mukaiset insuliinin tapaiset yhdisteet, joita on läsnä raakainsulii- nissa ja joissakin kaupallisissa insuliinipreparaateissa, voidaan tämän keksinnön mukaisella transpeptidoinnilla muut- B30 taa ihmisinsuliinin treoniini -esteriksi, jotka yhdisteet tämän jälkeen voidaan lohkaista ihmisinsuliinin saamiseksi.
10 77876
Esimerkkejä kaavan I mukaisista insuliinin tapaisista yhdisteistä on esitettty seuraavassa: ,1 .2
Sian diarginiini-insuliini (R on vety ja R on -Ala-Arg- 3 2
Arg), sian proinsuliini (R on yhdessä R :n kanssa -Ala-
Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Glu-
Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Gly-Gl^-Pro-Pro-
Gln-Lys-, jossa pääte-alanyyli on sitoutunut Lys tään), 3 2 koiran proinsuliini (R on yhdessä R :n kanssa -Ala-Arg-
Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-
Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-, jossa pääte-alanyyli B29 % . . . ,.. .
on sitoutunut Lys tään), lohkaistu sian proinsuliini (R on Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-, ja R on -Ala-
Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-
Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu), sian despeptidiproinsu-1 2 liini (R on vety ja R on -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-
Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-
Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln), ihmisproinsuliini 3 2 (R on yhdessä R :n kanssa -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-
Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-
Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gl^-Ser-Leu-Gln-Lys-, jossa pääte-treonyyli on sitoutunut Lys tään) ja apinaproinsu-, 3 2 liini (R on yhdessä R tn kanssa -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-
Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-
Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, ^3 2 ^3 jossa pääte-treonyyli on sitoutunut Lys tään).
Kaavassa I vaihdetaan R -substituentti, joka on merkitty 3 R -X- siten vetyyn.
Esillä olevan keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto käsittää sian raakainsuliinin sisältämien insuliinin kaltaisten yhdisteiden tai näiden suolan tai kompleksin reaktion L-treonii- niesterin (kaava II) tai tämän suolan kanssa yllä mainituissa 4 olosuhteissa, jonka jälkeen suojaryhma R ja mahdollisesti 5 läsnäoleva suojaryhmä R poistetaan. Tällöin tällä menetel- 11 77876 mällä muutetaan sianinsuliini, sekä sen sisältämät insuliinin kaltaiset yhdisteet ihmisinsuliiniksi.
Esimerkkeinä insuliiniyhdisteiden (kaava I) kompleksista tai suolasta voidaan antaa sinkkikompleksi tai sinkkisuola.
Kun reaktio-olosuhteet valitaan yllä olevan mukaan ottaen huomioon ne tulokset, jotka saavutetaan seuraavissa esimer-, . .. . B30 keissa, on mahdollista saada ihmisinsuliinin treoniini esteriä saannolla, joka ylittää 60 % ja jopa 80 % ja joissakin edullisissa olosuhteissa saanto on yli 90 %.
Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä on siten tunnettuun tekniikan tasoon seuraavat edut: . B30 a) Entsymaattinen hydrolyysi Ala :n poistamiseksi, esimerkiksi karboksipeptidaasi A:11a, vältetään.
X . , B30 V
b) Välituotteen eristäminen kuten sian-des-(Ala )-insu-liini on tarpeeton.
x A21 c) Vältetään epäpuhtautena esiintyvät des(Asn )-insulii- nijohdannaiset.
d) Proinsuliini ja muut insuliinin kaltaiset epäpuhtaudet, jotka ovat läsnä raakainsuliinissa, muutetaan keksinnön mu- B30 kaisella menetelmällä - ihmisinsuliinin treoniini -esterin kautta - ihmisinsuliiniksi, jolloin saanto suurenee.
e) Antigeeniset insuliinin kaltaiset yhdisteet, GB-patentti-julkaisu 1 285 023, muutetaan ihmisinsuliiniksi.
Eräs edullinen menetelmä ihmisinsuliinin valmistamiseksi esitetään seuraavassa: 1) Transpeptidointiin käytetään raaka-aineena raakaa sianin-suliinia, esim. kiteistä insuliinia, joka valmistetaan sit-raattipuskuria käyttäen, US-patenttijulkaisu 2 626 228.
i2 7 7 8 7 6 2) Transpeptidoinnin jälkeen mahdollisesti jäljellä oleva trypsiinin aktiivisuus poistetaan edullisesti, esimerkiksi olosuhteissa, joissa trypsiini on inaktivoitu, esimerkiksi happamassa väliaineessa, jonka pH-arvo on alle 3. Trypsiini voidaan poistaa erottamalla molekyylipainon mukaan, esim. geelisuodatuksella "Sephadex G-50":llä tai "Bio-gel P-30":llä 1 M etikkahapossa. Nature 280, 412.
3) Muut epäpuhtaudet, kuten reagoimaton sianinsuliini voidaan poistaa käyttäen anionin- ja/tai kationinvaihtokromato-grafiaa, katso esimerkit 1 ja 2.
, B30 4) Tämän jälkeen lohkaistaan ihmisinsuliinin treoniini esteri, ja ihmisinsuliini eristetään, esimerkiksi kiteytetään sinänsä tunnetulla tavalla.
Tällä tavoin saadaan ihmisinsuliinia, jolla on farmaseuttisesti hyväksyttävä puhtausaste, ja haluttaessa voidaan ihmisinsuliini vielä puhdistaa.
Seuraavassa käytetyt lyhenteet ovat IUPAC-IUB Commissionin (1974) hyväksymien ohjeiden mukaisia biokemialliselle sanastolle, Collected Tentative Rules Se Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2nd ed., Maryland 1975.
Analyyttiset kokeet:
Sianinsuliinin ja sianproinsuliinin muuttaminen ihmisinsulii-niesteriksi voidaan havainnollistaa DISC-PAGE-elektroforeesil-la 7,5-%:sessa polyakryyliamidigeelissä puskurissa, jossa on 0,375 M TRIS, 0,06 M HC1 ja 8 M ureaa. Puskurin pH-arvo on 8,7. Kaavan III mukaiset esterit migroituvat nopeudella, joka on 75 % sianinsuliinin nopeudesta. Sianproinsuliini, joka mig-roituu 55 %:n nopeudella verrattuna sianinsuliinin nopeuteen, 13 77876 muutetaan keksinnön mukaisella menetelmällä viimeksi mainituksi tuotteeksi. Reaktiotuotteet tunnistettiin kaavan III mukaisiksi yhdisteiksi seuraavien kriteerien perusteella: a) Kaavan III mukaisten ihmisinsuliiniestereiden elektroforeettinen migraatio vastaa verrattuna sianin-suliiniin yhden negatiivisen varauksen menettämisen.
b) Geelissä olevien värjättyjen proteiinijuovien, jotka vastaavat kaavan III mukaisia yhdisteitä, aminohappokoostumus on identtinen ihmisinsuliinin aminohappo-koostumuksen kanssa, eli siinä on 3 moolia treoniinia ja 1 mooli alaniinia 1 moolia insuliinia kohti, ja sianinsuliinin koostumus on 2 moolia treoniinia ja 2 moolia alaniinia 1 moolia insuliinia kohti. Menetelmiä aminohappokoostumuksien analysoimiseksi polyakryy-liamidigeeleissä olevissa proteiinijuovissa on kuvattu julkaisussa Eur. J. Biochem. 2J5, 147.
c) Todiste siitä, että lisätty treoniini sijoittuu C-terminaalisen aminohapon B-ketjuun, saadaan insuliinin S-S-siltojen hapettavalla sulfitolyysillä 6 M gua-nidiinihydrokloridissa, jota seuraa A- ja B-ketjujen erottaminen ioninvaihtokromatografoinnilla "SP Sepha-dex":illa. Kun B-ketju-S-sulfonaatti pilkotaan karboksi-peptidaasi A:11a vapautuu C-terminaalinen aminohappo.
Tätä menettelyä on kuvattu julkaisussa Markussen, Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima, 12-14 juli, 1978 (julkaisu:
Baba, Kaneko ja Yanihara) Int. Congress Series n:o 468, Excerpta Medica, Amsterdam-Oxford. Analyysi suoritetaan sen jälkeen kun esteriryhmä on lohkaisut kaavan III mukaisista yhdisteistä.
Yllä mainitut kolme analyysiä osoittavat selvästi, että on tapahtunut muuttumista ihmisinsuliiniksi.
14 77876
Sianinsuliinin ja sianproinsuliinin muuttaminen ihmis-insuliiniesteriksi voidaan seurata kvantitatiivisesti käyttämällä HPLC:tä (high pressure liquid chromatography) käänteisfaasissa. Käytetään 4 x 300 mm: n "^,uBonda-pak C-^g-kolonnia" (Waters Ass.) / ja eluointi suoritetaan puskurilla sisältäen 0,2 M ammoniumsulfaattia, (jonka pH-arvo on säädetty 3,5:een rikkihapolla) ja sisältäen 2'6-50 % asetonitriiliä. Optimaalinen asetonitriilipitoi-suus riippuu siitä, mikä kaavan III mukainen esteri ha- 4 lutaan erottaa sianinsuliinista. Kun R on metyyli, ja R on vety, erottuminen saavutetaan 26 %:sessa (tila- vuus/tilavuus) asetonitriilissä . Sianinsuliini ja B 3 0 (Thr-OMe) -h-In (Me on metyyli) eluoituu 4,5:n ja 5,9:n kolonnitilavuuden jälkeen selvästi erottuvina symmetrisinä huippuina. Ennen HPLC-kolonniin viemistä proteiinit saostetaan reaktioseoksesta lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. Sakka kerätään sentrifugoimalla, kuivataan tyhjössä ja liuotetaan 0,02 M rikkihappoon.
Menetelmää ihmisinsuliiniestereiden ja ihmisinsuliinin valmistamiseksi kuvataan lähemmin seuraavilla esimerkeillä, jotka kuvaavat eräitä keksinnön mukaisen menetelmän edullisia suoritusmuotoja.
Esimerkki 1 200 mg kerran kiteytettyä sian raakainsuliinia liuotettiin 1,8 mliaan 3,33 M etikkahappoa. Lisättiin 2 ml 2 M liuosta, jossa oli Thr-OMe (Me on metyyli) N,N-dimetyyliasetamidissa, ja 20 mg trypsiiniä liuotettuna 0,2 ml:aan vettä. Proteiinit saostettiin seoksen seistyä 18 h 37°C:ssa lisäämällä 40 ml asetonia, ja sakka eristettiin sentrifugoimalla. Liuosfaasi heitettiin pois. Sakan analyysi HPLCrllä käyttäen 26 % asetonitriiliä (katso analyyttiset kokeet) osoittaa, että 60 % sianin- B30 suliinista on muuttunut (Thr-OMe) -h-In:ksi. Sakka liuotettiin 8 ml:aan juuri deionisoitua 8 M ureaa, 15 77876 pH-arvo säädettiin 8,Oraan käyttäen 1 M ammoniakkia, ja liuos lisättiin 2,5 x 25 cm:n kolonniin, joka oli täytetty "QAE A-25 Sephadex":illa, ja joka oli tasapainotettu 0,1 M ammoniumkloridipuskurilla sisältäen 60 % (tilavuus/tilavuus) etanolia, ja tämän pH-arvo säädettiin 8,Oraan ammoniakilla. Eluointi suoritettiin samalla puskurilla ja kerättiin 15 ml:n fraktioita. (Thr-OMe) B 3 0 -h-In:ää löydettiin fraktioissa 26-46, reagoimatonta sianinsuliinia fraktioissa 90-120. Fraktiot 26-46 yhdis- B3 0 tettiin, etanoli haihdutettiin tyhjössä, ja (Thr-OMe) -h-In kiteytettiin sitraattipuskurissa kuten julkaisussa Schlichtkull et ai., Handbuch der inneren Medizin, 7/2A, 96, Berlin, Heidelberg, New York 1975 kuvataan. Saantona saatiin 95 mg kiteitä, joilla oli sama rombinen muoto kuin analogisella tavalla kiteytetty sianinsuliini. Aminohappokoostumus osoittautui identtiseksi ihmisinsu-liinin aminohappokoostumuksen kanssa. Tämän lisäksi suoritetut analyyttiset kokeet, joita on kuvattu edellä, B 3 0 osoittivat, että saatu tuote oli (Thr-OMe) -h-In. Esimerkki 2 100 mg sianinsuliinia, joka täyttää GB-patenttijulkaisussa 1 285 023 kuvatut puhtauskriteerit, liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M etikkahappoon, johon tämän jälkeen lisättiin 1 ml 2 M liuosta, joka sisälsi treoniinimetyy-liesteriä Ν,Ν-dimetyyliformamidissa ja 12 mg TPCK-kä-siteltyä (TPCK on tosyylifenyylialaniinikloorimetyyli-ketoni)-trypsiiniä liuotettuna 0,1 mlraan vettä. Reaktio pysäytettiin kun reaktioseosta oli inkuboitu 24 h 37°C:ssa lisäämällä 4 ml 1 M fosforihappoa. Saatu B3 0 (Thr-OMe) -h-In erotettiin reagoimattomasta sianinsu- liinista ioninvaihtokromatografoinnilla käyttäen 2,5 x 25 cm "SP Sephadex"-kolonnia ja eluenttia sisältäen 0,09 M natriumkloridia ja 0,02 M natriumdivetyfosfaattia (puskurin pH-arvo on 5,5) 60 %:sessa etanolissa. Frak- B30 tiot, jotka sisälsivät (Thr-IMe) -h-In kerättiin, 16 77876 etanoli poistettiin vakuumissa, ja tuote kiteytettiin kuten esimerkissä 1 on esitetty. Saanto oli 50 mg (Thr-OMe)B3^-h-In.
Esimerkki 3
100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M
Β3Π etikkahappoa ja muutettiin (Thr-OMe) -h-In:ksi ja puhdistettiin kuten sianinsuliinille on kuvattu esimer- R 3 0 kissä 1. Proinsuliinin konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 73 % HPLC-analyysin mukaan määritettynä asetonisa- B 3 0 kasta. Kiteisen (Thr-OMe) -h-In:n saanto oli 54 mg. Esimerkki 4 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 2,77 M etikkahappoa vedessä ja annettiin reagoida kuten esimerkissä 2 on kuvattu. Reaktion päätyttyä proteiinit saos- tettiin lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. DISC-PAGE- B 3 0 analyysi osoitti 70 %:n konversiota (Thr-OMe) -h-In: ksi.
Esimerkki 5
100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M
etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N-metyy- lipyrrolidonissa. Reaktio suoritettiin kuten esimerkissä B 3 0 4 on kuvattu, ja konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 20 %.
Esimerkki 6 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 2,77 M etikkahappoa vedessä, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä HMPA:ssa (heksametyylifosforitriamidi). Reaktio suoritettiin kuten esimerkissä 4 on kuvattu. Konversio
Dlf| (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 80 %.
Esimerkki 7
100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M
17 77876 etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N- dimetyyliasetamidissa. Reaktio suoritettiin kuten esi- E 3 0 merkissä 4 on kuvattu. Konversio (Thr-OMe) h-In:ksi oli 80 %.
Esimerkki 8 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N-dimetyyliasetamidissa. Tämän jälkeen lisättiin 200 U (units) trypsiiniaktiivisuutta (määritettynä substraatilla BAEE) immobilisoituna 1 g:aan lasihelmiä, ja kun oli inkuboitu 24 h ajan 37°C:ssa lasiin sidottu trypsiini suodatettiin pois. Reaktion loputtua seostettiin proteiinit lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. DISC-PAGE-analyysi osoitti 40 %:n konversiota (Thr-OMe)B30-h-In:ksi.
Esimerkki 9 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N-dimetyyliasetamidissa. Tämän jälkeen lisättiin 300 U trypsiiniaktiivisuutta (mitattuna substraatille BAEE), joka oli immobilisoitu 200 ^ugraan CNBr-aktivoitua "Sephadex G-150". Kun oli inkuboitu 24 h ajan 37°C:ssa suodatettiin "Sephadex":iin sidottu trypsiini pois. Reaktion loputtua proteiinit saostettiin lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. DISC-PAGE-analyysi osoitti 70 %:n konversiota (Thr-OMe)B30-h-In:ksi.
Esimerkki 10
Esimerkissä 7 kuvattu menetelmä toistettiin käyttäen esterinä 2 M Thr-OBut (But on tert.butyyli) N,N-dimetyy-liasetamidissa. Konversio (Thr-OBut)B30-h-In:ksi oli 80%.
Esimerkki 11
Esimerkissä 8 kuvattu menetelmä toistettiin käyttäen 18 77876 esterinä 2 M Thr-OBut:tä N,N-dimetyyliasetamidissa. Konversio (Thr-OBut)B30-h-In:ksi oli 30 %.
Esimerkki 12
Esimerkissä 9 kuvattu menetelmä toistettiin käyttäen esterinä 2 M Thr-OBu^itä N,N-dimetyyliasetamidissa. Konversio (Thr-OBu^)B3<"*-h-In: ksi oli 70 %.
Esimerkki 13
100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M
etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N- dimetyyliasetamidissa. Reaktio suoritettiin kuten esi- B 3 0 merkissä 4 on kuvattu. Konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 80 %.
Esimerkki 14
100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M
etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N- dimetyyliasetamidissa. Seosta käsiteltiin immobilisoi- dulla trypsiinillä vastaavalla tavalla kuin esimerkissä B 3 0 8 on kuvattu. Konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 40 %. Esimerkki 15
100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M
etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N-di- metyyliasetamidissa. Seosta käsiteltiin immobilisoidulla trypsiinillä vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 9 on B3 0 kuvattu. Konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 70 %. Esimerkki 16 100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OBut:tä N,N-dimetyyliasetamidissa. Reaktio suoritettiin vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 4 on kuvattu. Konversio (Thr-OBu*·) B3B-h-In:ksi oli 80 %.
19 77876
Esimerkki 17 100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OBut:tä N,N-dimetyyliasetamidissa. Seosta käsiteltiin trypsiinillä, joka oli immobilisoitu lasihelmille vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 8 on kuvattu. Konversio (Thr-OBut)B3^-h-In:ksi oli 40 %.
Esimerkki 18
100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M
etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OBut:tä N,N- dimetyyliasetamidissa. Seosta käsiteltiin trypsiinillä, joka oli immobilisoitu CNBr-aktivoidulle "Sephadex- G-150":lle, vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 9 +* B 3 0 on kuvattu. Konversio (Thr-OBu ) -h-In:ksi oli 70 %. Esimerkki 19 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,5 ml:aan 6 M etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 1 M Thr-OTmb:ta (Tmb on 2,4,6-trimetyylibentsyyliä) N,N-dimetyyliasetamidissa. Edelleen lisättiin 0,5 ml Ν,Ν-dimetyyliasetamidia ja 5 mg TPCK-käsiteltyä trypsiiniä 0,1 ml:ssa vettä. Reak-tioseosta säilytettiin 32°C:ssa 44 h. Reaktion päätyttyä saostettiin proteiinit lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. DISC-PAGE-analyysi osoitti 50 %:n konversiota (Thr-OTmb)B30-h-In:ksi.
Esimerkki 20 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3 M etikka- happoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä dioksaanissa.
Reaktio suoritettiin vastaavalla tavalla kuin esimerkis- B 3 Π sä 4, ja konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 10 %. Esimerkki 21 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3 M etikka-happoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä asetonitrii- 20 77876
Iissä. Reaktio suoritettiin vastaavalla tavalla kuin B3 0 esimerkissä 4, ja konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 10 S.
Esimerkki 22 B30 250 mg kiteistä (Thr-OMe) -h-In dispergoitiin 25 mlraan vettä ja liuotettiin lisäämällä 1 N natriumhydroksidi-liuosta pH-arvoon 10,0. pH-arvo pidettiin vakiona 10,0: ssa 24 h:n ajan 25°C:ssa. Muodostunut ihmisinsuliini kiteytettiin lisäämällä 2 g natriumkloridia, 350 mg natriumasetaattitrihydraattia ja 2,5 mg sinkkiasetaatti-dihydraattia jonka jälkeen lisättiin 1 N suolahappoa pH-arvon 5,52 saamiseksi. Romboedriset kiteet eristettiin sentrifugoimalla, sen jälkeen kun niitä oli pidetty 24 h 4°C:ssa, pestiin 3 ml:11a vettä, eristettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. Saanto: 220 mg ihmisinsuliinia.
Esimerkki 23 B 3 0 100 mg (Thr-OTmb) -h-In:ää liuotettiin 1 ml:aan jääkylmää trifluorietikkahappoa, ja liuosta säilytettiin 2 h 0°C:ssa. Muodostunut ihmisinsuliini erotettiin lisäämällä 10 ml tetrahydrofuraania ja 0,97 ml 1,03 M suolahappoa tetrahydrofuraanissa. Muodostunut sakka eristettiin sentrifugoimalla, pestiin 10 ml:11a tetrahydrofuraania, eristettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. Sakka liuotettiin 10 ml:aan vettä, ja liuoksen pH-arvo säädettiin 2,5:een 1 N:llä natriumhydroksidiliuosta. Ihmisinsuliini erotettiin lisäämällä 1,5 g natriumkloridia ja eristettiin sentrifugoimalla. Sakka liuotettiin 10 ml:aan vettä, ja ihmisinsuliini erotettiin lisäämällä 0,8 g natriumkloridia, 3,7 mg sinkkiasetaattidihydraattia ja 0,14 g natriumasetaattitrihydraattia, jonka jälkeen lisättiin 1 N natriumhydroksidiliuosta pH-arvon 5,52 saavuttamiseksi. Sakka eristettiin sentrifugoimalla 24 h:n seisotuksen 21 77876 jälkeen 4°C:ssa, pestiin 0,9 mlrlla vettä, eristettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. Saanto: 90 mg ihmisinsuliinia.
Esimerkki 24 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,5 ml:aan 10 M etik- kahappoa, ja lisättiin 1,3 ml 1,54 M Thr-0Me:tä N,N- dimetyyliasetaatissa. Seos jäähdytettiin 12°C:een.
10 mg trypsiiniä liuotettuna 0,2 ml:aan 0,05 M kalsium- asetaattia lisättiin. Seoksen seistyä 48 tuntia 12°C:ssa saostettiin proteiinit lisäämällä 20 ml asetonia. Sian- B 3 0 insuliinin konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi on 97 % HPLC:llä.
Esimerkki 25 20 mg sianinsuliinia liuotettiin seokseen, jossa oli 0,08 ml 10 M etikkahappoa ja 0,14 ml vettä. Lisättiin 0,2 ml 2 M Thr-OMe:ta N,N-dimetyyliasetamidissa, ja seos jäähdytettiin -10°C:een. 2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,025 ml:aan 0,05 M kalsiumasetaattia lisättiin. Seoksen oltua 72 h-10°C:ssa saostettiin proteiinit lisäämällä B30 5 ml asetonia. Sianinsuliinin konversio (Thr-OMe) --h-In:ksi oli 64 % HPLC:llä.
Esimerkki 26 20 mg sianinsuliinia dispergoitiin 0,1 ml:aan vettä. Lisäämällä 0,6 ml 2 M Thr-OMe:tä H,Ν-dimetyyliasetami-dissa insuliini hajosi. Seos jäähdytettiin 7°C:een.
2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,025 ml:aan 0,05 M kalsiumasetaattia lisättiin. Seoksen oltua 24 h 7°C:ssa saostettiin proteiinit lisäämällä 5 ml asetonia. Sian- B 3 0 insuliinin konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 62 % HPLC:llä.
Esimerkki 27
20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,135 ml:aan 4,45 M
77876 propionihappoa. 0,24 ml 1,67 M Thr-OMe N,N-dimetyyli-asetamidissa lisättiin. 2 mg trypsiiniä 0,025 ml 0,05 M kalsiumasetaatissa lisättiin, ja seosta säilytettiin 37°C:ssa 24 tuntia. Proteiinit saostettiin lisäämällä 10 tilavuutta 2-propanolia. Sianinsuliinin konversio (Thr-OMe) B3^-h-I:n: ksi oli 75 % HPLCrllä.
Esimerkki 28 20 mg sianinsuliinia dispergoitiin 0,1 ml:aan vettä. Lisättiin 0,4 ml 2 M Thr-OMe:ta N,N-dimetyyliasetamidis-sa, jonka jälkeen lisättiin 0,04 ml 10 N suolahappoa, jolloin insuliini hajosi. 2 ml trypsiiniä liuotettuna 0,025 ml:aan 0,05 M kalsiumasetaattia lisättiin, ja seosta säilytettiin 37°C:ssa 4 tuntia. HPLC-analyysi B 3 0 osoittaa 46 %:n sianinsuliinin konversiota (Thr-OMe) --h-In:ksi.
Esimerkki 29 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,175 ml:aan 0,57 M etikkahappoa. Lisättiin 0,2 ml 2 M Thr-OMe:ta N,N-dimetyyliasetamidissa, jonka jälkeen lisättiin 0,025 ml 0,05 M kalsiumasetaattia. 10 mg Achromobacter lyticus-proteaasin raakapreparaattia lisättiin ja seosta säilytettiin 22 h 37°C:ssa. Proteiinit saostettiin lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. Sianinsuliinin konversio (Thr-OMe)B30-h-In:ksi oli 12 % HPLC:llä.
Esimerkki 30 20 mg sianinsuliinia dispergoitiin 0,1 ml:an 0,5 M etikkahappoa. Lisäämällä 0,2 ml 0,1 M Thr-OMe:tä N,N-dimetyyliasetamidissa insuliini hajosi. Seos jäähdytettiin 12°C:een, ja lisättiin 2 mg trypsiiniä 0,025 ml:ssa 0,05 M kalsiumasetaattia. Seoksen oltua 24 h 12°C:ssa osoittaa HPLC-analyysi 42 %:n sianinsuliinin B30 konversiota (Thr-OMe) -h-In:ksi.
23 77876
Esimerkki 31 2 mg kaniinin insuliinia liuotettiin 0,135 ml:aan 4,45 M etikkahappoa. Lisättiin 0,24 ml 1,67 M Thr-©Me:ta Ν,Ν-dimetyyliasetamidissa, jonka jälkeen lisättiin 1,25 mg trypsiiniä 0,025 ml:ssa 0,05 M kalsiumase-taattia. Seosta säilytettiin 37°C:ssa 4 h. HPLC-ana- lyysi osoitti 88 %:n kaniini-insuliinin konversiota B 3 0 (Thr-OMe) -h-In:ksi. Kaniini-insuliini eluoi sian- insuliinin HPLC-kolonnista, jolloin kaniini-insuliinin B 3 0 eluointitilavuuden ja (Thr-OMe) -h-In:n välinen suhde on 0,72.
Esimerkki 32 B 31 B 3 2 2 mg siandiargiini-insuliinia (Arg -Arg -insuliini) liuotettiin 0,135 ml:aan 4,45 M etikkahappoa. Lisättiin 0,24 ml 1,67 M Thr-0Me:tä Ν,Ν-dimetyyliasetamidissa, jonka jälkeen lisättiin 1,25 mg trypsiiniä 0,025 mlrssa 0,05 M kalsiumasetaattia. Seosta säilytettiin 37°C:ssa 4 h.HPLC-analyysi osoittaa 91 %:n diargiini-insuliinin B30 konversiota (Thr-OMe) -h-In:ksi. Diargiini-insuliini eluoi sianinsuliinin HPLC-kolonnista, jolloin diargiini- B3 0 insuliinin eluointitilavuuden ja (Thr-OMe) -h-In:n välinen suhde on 0,50.
Esimerkki 33
C O
2 mg "sianvälituotteita" (ts. desdipeptidi-(Lys -Arg )- 31 32 proinsuliinia ja desdipeptidi-(Arg -Arg )-proinsu-liinia) annettiin reagoida vastaavalla tavalla kuin esi- ΟΟΛ merkissä 32. HPLC-analyysi osoittaa 88 %:n (Thr-OMe) h-In:a.
Esimerkki 34
20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 ml:aan 2 M etikkahappoa. Lisättiin 0,2 ml 2 M Thr-OMe:ta Ν,Ν-dimetyyliasetamidissa, ja seos jäähdytettiin -18°C:een. Lisättiin 2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,025 ml:aan 0,05 M
24 77876 kalsiumasetaattia, ja seosta säilytettiin 120 h -18°Ctssa.
B 3 0 HPLC-analyysi osoittaa, että konversio (Thr-OMe) -h--In:ksi on 83 %.
Esimerkki 35
Esimerkissä 34 kuvattu menetelmä toistettiin sillä erolla, että reaktio suoritettiin 50°C:ssa 4 h. HPLC-ana- B 3 0 lyysi osoittaa, että reaktio (Thr-OMe) -h-Intksi on 23 %.
Esimerkki 36 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 mitään 3 M etikka-happoa. Lisättiin 0,3 ml 0,33 M Thr-0(CH2)2-SO2-CH3, CH-jCOOH /treoniini-2- (metyylisulfonyyli) etyylesteri-hydroasetaattia/ N,N-dimetyyliasetamidissa. Seos jäähdytettiin 12°C:een ja lisättiin 2 mg trypsiiniä 0,025 mitään 0,05 M kalsiumasetaattia. HPLC osoittaa 24 hm jälkeen 12°C:ssa 77 %tn konversiota /Thr-0(CH-,) 9-S02~ _330 ^ ^ CH~/ -h-Intksi. Tuote eluoitui suunnilleen (Thr-OMe) -h-Intn kohdalla.
Esimerkki 37 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 mitään 10 M etik- kahappoa. Lisättiin 0,2 ml 2 M Thr-OEt (Et on etyyliä) Ν,Ν-dimetyyliasetamidissa, ja seos jäähdytettiin
12°Cteen. Lisättiin 2 mg trypsiiniä 0,025 mltssa 0,05 M
kalsiumasetaattia. HPLC osoittaa 24 htn jälkeen 12°Ctssa B 3 0 75 %tn konversiota (Thr-OEt) -h-Intksi. Tuote eluoitui B30 kohdalla, joka saadaan hieman (Thr-OMe) -h-In:n jälkeen.
Esimerkki 38 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 mitään 6 M etikka-happoa. Lisättiin 0,3 ml 0,67 M Thr(But)-0Buttta N,N-dimetyyliasetamidia. Seos jäähdytettiin 12°Cteen ja lisättiin 2 mg trypsiiniä 0,025 mltssa 0,05 M kalsiumase- 25 77876 taattia. 24 tunnin jälkeen 12°C:ssa on konversio (Thr(Bufc)-OBufc)B^^-h-In:ksi 77 %. Tuote eluoitiin HPLC-kolonnista käyttämällä asetonitriiligradienttia 27 %:sta 40 %:iin.
Esimerkki 39 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 ml:aan 4 M etikka-happoa. Lisättiin 0,2 ml 1,5 M Thr-OMe:ta liuotettuna tetrahydrofuraaniin, ja seos jäähdytettiin 12°C:een. Lisättiin 2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,02 5 ml saan 0,05 M kalsiumasetaattia. 4 h:n jälkeen 12°C:ssa B 3 0 HPLC-analyysi osoitti 75 %:n konversiota (Thr-OMe) -h-In:ksi.
Esimerkki 40 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 ml saan 4 M etikka-happoa. Lisättiin 0,8 ml 2 M Thr-OMestä liuotettuna 1,2-etaanidioliin, ja seos jäähdytettiin 12°C;een. Lisättiin 2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,025 ml s aan 0,05 M kalsiumasetaattia. 4 tunnin jälkeen 12°C:ssa HPLC-analyysi
DIA
osoittaa 48 %:n konversiota (Thr-OMe) -h-In:ksi. Esimerkki 41 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 mlsaan 4 M etikka-happoa. Lisättiin 0,2 ml Thr-OMesta liuotettuna etanoliin, ja seos j-äähdytettiin 12°C:een. Lisättiin 2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,025 mlsaan 0,05 M kalsiumasetaattia, ja reaktio suoritettiin 4 hsssa 12°C:ssa.
Β3Π HPLC-analyysi osoittaa 46 %:n konversiota (Thr-OMe) h-Insksi.
Esimerkki 42 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 mlsaan 4 M etikka-happoa. Lisättiin 0,2 ml 2 M Thr-OMesta asetonissa, ja seos jäähdytettiin 12°C:een. Lisättiin 2 mg trypsiiniä 26 77876 liuotettuna 0,025 mitään 0,05 M kalsiumasetaattia.
4 h:n jälkeen 12°C:ssa HPLC-analyysi osoitti 48 %:n konversiota (The-OMe)B30-h-In:ksi.
Claims (9)
1. Menetelmä ihmisinsuliinin tai ihmisinsuliinin treo- .B3° niini -esterin tai sen suolan tai kompleksin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että insuliiniyhdiste, jolla on kaava I R -(1---A 21) I I 2 (1——B----29 )-R (I) jossa -(1---A 21) (1—-B-—29)- B30 AI on ihmis-des(Thr )-insuliiniosa^ jossa Gly on sitoutunut substituenttiin R ja Lys on sitoutunut substi-..22 tuenttiin R , R on aminohappo tai peptidiketju, joka sisältää korkeintaan 36 aminohappoa, ja R on vety tai ryhmä, jolla on yleinen kaava R -X-, jossa X on arginiini tai ly-siini ja R on peptidiketju, ^oka sisältää korkeintaan 35 aminohappoa, tai R yhdessä R s n kanssa on peptidiketju, joka sisältää korkeintaan 35 aminohappoa, sillä ehdolla, että R :ssä ja R :ssa olevien aminohappojen lukumäärä on pie-nempi kuin 37, tai sen suola tai kompleksi, joka voidaan muuttaa kaavan I mukaiseksi insuliiniyhdiseeksi, transpepti-doidaan L-treoniiniesterin kanssa, jolla on kaava II 5 4 Thr(R )-0R (II) 4 5 jossa R on karboksyylisuojaryhmä ja R on vety tai hyd- roksyylisuojaryhmä, tai sen suolan kanssa seoksessa, joka sisältää vettä, veteen sekoittuvaa, orgaanista liuotinta ja trypsiiniä, jolloin vesipitoisuus reaktioseoksessa on alle 50 % (tilavuus/tilavuus) ja reaktiolämpötila on alle 50°C, ja mahdollisesti hapon läsnäollessa, jonka jälkeen saatu ih-. . ... ...B30 misinsuliinm treonnm -esteri haluttessa lohkaistaan. 28 7 7 8 7 6
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että L-treoniiniesterin pitoisuus reaktioseoksessa on suurempi kuin 0,1 M, että reaktiolämpötila on suurempi kuin reaktioseoksen jäätymispiste, ja että reaktioseos sisältää 0-10 ekvivalenttia jotain happoa yhtä ekvivalenttia L-treo-niiniesteriä kohti.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insuliiniyhdiste on sian tai kaniinin insuliini, sian diarginiini-insuliini tai sian proinsuliini.
4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insuliiniyhdiste on saatu siasta .
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insuliiniyhdisteenä käytetään suhteellisen raakaa insuliinia.
6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene- 0 telmä, tunnettu siitä, että reaktiolämpötila on alle 37 C, o edullisesti alle huoneen lämpötilan, ja yli 0 C.
7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veden pitoisuus reaktioseoksessa on välillä 40-10 % (tilavuus/tilavuus).
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insuliiniyhdiste on sian insuliini, että L-treoniiniesteri on Thr-OMe tai Thr-OBu , että veteen sekoittuva, orgaaninen liuotin on Ν,Ν-dimetyyliformamidi tai . o Ν,Ν-dimetyyliasetamidi, että reaktiolämpötila on noin 37 C, että veden pitoisuus reaktioseoksessa on välillä 41-43 %, että trypsiinin ja insuliiniyhdisteen painosuhde on noin 1:8, että L-treoniiniesterin ja insuliiniyhdisteen moolisuhde on 29 7 7 8 7 6 noin 120:1, ja että lisätään 1,2-1,5 ekvivalenttia etikkahap-poa yhtä ekvivalenttia L-treoniiniesteriä kohti.
9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että valmistetaan ihmisinsuliinia.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK57480 | 1980-02-11 | ||
| DK57480A DK147109C (da) | 1980-02-11 | 1980-02-11 | Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere eller et salt eller kompleks deraf |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI810385L FI810385L (fi) | 1981-08-12 |
| FI77876B FI77876B (fi) | 1989-01-31 |
| FI77876C true FI77876C (fi) | 1989-05-10 |
Family
ID=8095095
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI810385A FI77876C (fi) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS56135452A (fi) |
| AR (1) | AR231277A1 (fi) |
| AU (1) | AU541528B2 (fi) |
| BE (1) | BE887480A (fi) |
| CA (1) | CA1162868A (fi) |
| CH (1) | CH655949A5 (fi) |
| DE (1) | DE3104949C2 (fi) |
| DK (3) | DK147109C (fi) |
| ES (1) | ES8205858A1 (fi) |
| FI (1) | FI77876C (fi) |
| GB (1) | GB2069502B (fi) |
| GR (1) | GR73844B (fi) |
| IT (1) | IT1195038B (fi) |
| NL (1) | NL178797C (fi) |
| NO (1) | NO156247C (fi) |
| NZ (1) | NZ196224A (fi) |
| PT (1) | PT72485B (fi) |
| SE (2) | SE427025B (fi) |
| ZA (1) | ZA81898B (fi) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK147437A (en) | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
| AU551174B2 (en) * | 1981-09-15 | 1986-04-17 | Nordisk Insulinlaboratorium | Enzymatic preparation of human insulin or b-30 esters thereof |
| DK149824C (da) * | 1982-01-22 | 1987-03-16 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner |
| EP0087238A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-31 | Biogen N.V. | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| NL8201650A (nl) * | 1982-04-21 | 1983-11-16 | Akzo Nv | Semisynthetische bereiding van humane insuline. |
| EP0367302A3 (en) * | 1982-04-23 | 1991-06-19 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for semi-synthesis of human insulin, water-soluble cross-linked achromobacter protease i for use therein and a process for preparing the same |
| DK55183D0 (da) * | 1983-02-09 | 1983-02-09 | Nordisk Insulinlab | Fremgangsmade til fremstilling af human insulin |
| DE3334407A1 (de) * | 1983-09-23 | 1985-04-04 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | In position b 30 modifizierte insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DK119785D0 (da) * | 1985-03-15 | 1985-03-15 | Nordisk Gentofte | Insulinpraeparat |
| US5157021A (en) * | 1985-03-15 | 1992-10-20 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives |
| SE449472B (sv) * | 1985-10-15 | 1987-05-04 | Mth Gruppen Ab | Utrustning vid facklager |
| WO1988006599A1 (en) * | 1987-02-25 | 1988-09-07 | Novo Industri A/S | Novel insulin derivatives |
| DK134189D0 (da) * | 1989-03-20 | 1989-03-20 | Nordisk Gentofte | Insulinforbindelser |
| FI96503C (fi) * | 1994-08-26 | 1996-07-10 | Hymatic Ltd Oy | Menetelmä ja laitteisto maston ohjaamiseksi |
| WO2005072803A1 (en) | 2004-01-16 | 2005-08-11 | Biodel, Inc. | Sublingual drug delivery device |
| US20080090753A1 (en) | 2004-03-12 | 2008-04-17 | Biodel, Inc. | Rapid Acting Injectable Insulin Compositions |
| US7713929B2 (en) | 2006-04-12 | 2010-05-11 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
| US8084420B2 (en) | 2005-09-29 | 2011-12-27 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
| CA2649109A1 (en) | 2006-04-12 | 2007-10-25 | Biodel, Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
| US9060927B2 (en) | 2009-03-03 | 2015-06-23 | Biodel Inc. | Insulin formulations for rapid uptake |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3064479D1 (en) * | 1979-04-13 | 1983-09-08 | Shionogi & Co | Process for preparing a b30-threonine insulin |
| DK147437A (en) | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
-
0
- DK DK147437D patent/DK147437A/da unknown
-
1980
- 1980-02-11 DK DK57480A patent/DK147109C/da not_active IP Right Cessation
-
1981
- 1981-02-09 DK DK54081A patent/DK147437C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-02-09 ES ES499238A patent/ES8205858A1/es not_active Expired
- 1981-02-10 SE SE8100926A patent/SE427025B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 IT IT19620/81A patent/IT1195038B/it active
- 1981-02-10 AR AR284258A patent/AR231277A1/es active
- 1981-02-10 CA CA000370483A patent/CA1162868A/en not_active Expired
- 1981-02-10 NL NLAANVRAGE8100624,A patent/NL178797C/xx not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 FI FI810385A patent/FI77876C/fi not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 GB GB8104114A patent/GB2069502B/en not_active Expired
- 1981-02-10 PT PT72485A patent/PT72485B/pt not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 NO NO810443A patent/NO156247C/no unknown
- 1981-02-10 SE SE8100928A patent/SE451143B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 JP JP1758081A patent/JPS56135452A/ja active Granted
- 1981-02-10 NZ NZ196224A patent/NZ196224A/en unknown
- 1981-02-11 AU AU67180/81A patent/AU541528B2/en not_active Ceased
- 1981-02-11 GR GR64097A patent/GR73844B/el unknown
- 1981-02-11 DE DE3104949A patent/DE3104949C2/de not_active Expired
- 1981-02-11 BE BE6/47396A patent/BE887480A/fr not_active IP Right Cessation
- 1981-02-11 ZA ZA00810898A patent/ZA81898B/xx unknown
- 1981-02-11 CH CH910/81A patent/CH655949A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI77876C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. | |
| US4343898A (en) | Process for preparing esters of human insulin | |
| CA1246478A (en) | Process for the preparation of insulin derivatives, the b chain of which is lengthened c-terminally, novel insulin derivatives modified by bases, agents containing these derivatives and their use | |
| CA1246548A (en) | Insulin derivatives, processes for their preparation and their use, and pharmaceutical agents for the treatment of diabetes mellitus | |
| RU2205836C2 (ru) | Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками | |
| US3950517A (en) | Insulin derivatives | |
| US20100210815A1 (en) | Insulin production methods and pro-insulin constructs | |
| KR880001107B1 (ko) | 인체 인슐린 및 그의 유도체의 제조방법 | |
| EP0382732B1 (en) | Superactive human insulin analogues | |
| US4489159A (en) | Process for preparing esters of human insulin | |
| FI79853C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. | |
| EP0017938A1 (en) | Process for preparing a B30-threonine insulin | |
| FI78119C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenskligt insulin eller b-30-estrar daerav. | |
| EP0089007B1 (de) | Verfahren zur Umwandlung von Präproinsulinanaloga zu Insulinen | |
| EP0171147B1 (en) | Anti-diabetic compounds | |
| DK173007B1 (da) | Fremgangsmåde til semisyntetisk fremstilling af humaninsulin og modificeret humaninsulin til brug ved fremgangsmåden | |
| EP0087238A1 (en) | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin | |
| Katsoyannis et al. | Insulin peptides. VII. The synthesis of two decapeptide derivatives containing the C-terminal sequence of the B-chain of insulin | |
| LU83197A1 (de) | Verfahren zur herstellung von threonin b30-estern menschlichen insulins sowie threonin b30-ester menschlichen insulins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: NOVO INDUSTRI A/S |