FI77876C - Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. - Google Patents

Description

! 77876 B30

Menetelmä lhmisinsuliinin tai ihmisinsuliinin treoniini esterin tai sen suolan ta-i kompleksin valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu menetelmään ihmisinsuliinin tai ihmi- B30 sinsuliinin treoniini -esterin tai sen suolan tai kompleksin valmistamiseksi.

Hoidettaessa diabetes mellitus -sairautta käytetään tavallisesti insuliinipreparaatteja, jotka sisältävät sian- ja naudan insuliinia. Naudan-, sian- ja ihmisinsuliinin välillä on pieniä eroja niiden aminohappokoostumuksen suhteen, jolloin ero ihmis- ja sianinsuliinin kohdalla rajoittuu yksinkertaiseen aminohappoon, ihmisinsuliinissa B30-aminohappo on treoniini, kun se taas sianinsuliinissa on alaniini. Kuitenkin voidaan sanoa, että ideaalinen insuliini ihmisten hoitoon on insuliinipreparaatti, jolla on tarkkaan sama rakenne kuin ih-misinsuliinilla.

Luonnollisen ihmisinsuliinin valmistamiseksi ei ole saatavilla tarpeeksi ihmisen haimarauhasia.

Synteettistä ihmisinsuliinia on valmistettu pienessä mittakaavassa suurin kustannuksin, Helv. Chim. Acta 57^ 2617, ja 60, 27. Sianinsuliinista on valmistettu semisynteettistä ihmisinsuliinia monimutkaisella menetelmällä, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 357, 759.

US-patenttijulkaisun 3 276 961 väitetään koskevan menetelmää semisynteettisen ihmisinsuliinin valmistamiseksi, jossa menetelmässä muita, animaalisia insuliineja saatetaan reagoimaan treoniinin kanssa entsyymin, kuten trypsiinin tai karboksipep-tidaasi A:n läsnäollessa. Ihmisinsuliinin saanto on kuitenkin hyvin pieni (jos ylipäätänsäkään saadaan ihmisinsuliinia), sillä menetelmä suoritetaan vedessä, joissa olosuhteissa 2 77876 B22 B23 trypsiini johtaa Arg -Gly -sidoksen lohkeamiseen, J. Biol. Chem. 236, 743.

Toinen tunnettu semisynteettinen menetelmä ihmisinsuliinin valmistamiseksi käsittää seuraavat kolme vaihetta: Ensimmäi- B30 sessä vaiheessa sianinsuliini lohkaistaan sian-des-(Ala )- insuliiniksi käsittelemällä karboksipeptidaasi A:11a, Hoppe-

Seyler's Z. Physiol. Chem. 359, 799. Toisessa vaiheessa Β3Ό— suoritetaan sian-des-(Ala )-insuliinille trypsiinin katalysoima kytkentä Thr-OBut:n kanssa, jolloin saadan ihmisinsu-B30 liinin Thr -tert.butyyliesteri. Kolmannessa vaiheessa mainittua esteriä käsitellään trifluorietikkahapolla, jolloin saadaan ihmisinsuliinia, Nature 280, 412. Ensimmäisessä a2 1 vaiheessa tapahtuu kuitenkin Asn :n osittaista poistumis- , B30 A21 ta, jolloin saadaan des-(Ala , Asn )-insuliinia. Tämä johdannainen antaa kahden seuraavan reaktiovaiheen aikana valmistettavaan semisynteettiseen ihmisinsuliiniin epäpuhtau-Δ 21 den des(Asn )-insuliini, joka epäpuhtaus on vaikeasti poistettavissa tunnetuin preparatiivisin menetelmin. Des-A21 (Asn )-insuliinilla on pieni biologinen aktiivisuus (n.

5 %), Amer. J. Med. 40, 70.

Nyt on yllättäen osoittautunut, että insuliiniyhdisteitä, jotka ovat erilaisia kuin ihmisinsuliini, kuten sianinsuliini ja sen sisältämät tietyt epäpuhtaudet, voidaan muuttaa ihmis- insuliiniksi menetelmällä, jossa insuliiniyhdisteet yhdessä B30 vaiheessa muutetaan suoraan ihmisinsuliinin treoniini esteriksi. Tällä menelmällä saadaan ihmisinsuliinia olennaisesti paremmalla saannolla kuin tunnetuilla menetelmillä ja ilman vaikeasti poistettavissa olevia sivutuotteita.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle ihmisinsuliinin tai ihmis- B30

insuliinin treoniini -esterin tai sen suolan tai kompleksin valmistamiseksi on tunnusomaista, että insuliiniyhdis-te, jolla on kaava I

i 3 , 77876 R -(1---A—21) I I 2 (1---B---29 )-R (I) jossa -(1---A---21) (1—-B---29)- , B30 A1 on ihmis-des(Thr )-insuliiniosa, jossa Glv on sitou- 1 B29 tunut substituenttiin R ja Lys on sitoutunut substi-2 2

tuenttim R , R on aminohappo tai peptidiket ju, joka sisältää korkeintaan 36 aminohappoa, ja R on vety tai ryhmä, jolla on yleinen kaava R -X-, jossa X on arginiini tai ly-siini ja R on peptidiketju, ^oka sisältää korkeintaan 35 aminohappoa, tai R yhdessä R :n kanssa on peptidiketju, joka sisältää korkeintaan 35 aminohappoa, sillä ehdolla, että R :ssä ja R :ssa olevien aminohappojen lukumäärä on pienempi kuin 37, tai sen suola tai kompleksi, joka voidaan muuttaa kaavan I mukaiseksi insuliiniyhdisteeksi, transpepti-doidaan L-treoniiniesterin kanssa, jolla on kaava II

, 5 4

Thr(R )-0R (II) ... 4 5 jossa R on karboksyylisuojaryhmä ja R on vety tai hyd- roksyylisuojaryhmä, tai sen suolan kanssa seoksessa, joka sisältää vettä, veteen sekoittuvaa orgaanista liuotinta ja trypsiiniä, jolloin vesipitoisuus reaktioseoksessa on alle 50 % (tilavuus/tilavuus) ja reaktiolämpötila on alle 50 C, ja mahdollisesti hapon läsnäollessa, jonka jälkeen saatu ih-.... .B30 misinsuliinin treoniini -esteri haluttaessa lohkaistaan.

Esillä oleva keksintö perustuu sille havainnolle^ että aminohappo tai peptidiketju, joka on sitoutunut Lys -karbon-yyliryhmään kaavan I mukaisessa insuliiniyhdisteessä, voidaan yhdessä vaiheessa vaihtaa treoniiniesteriin. Mainittua vaihtoa merkitään tässä transpeptidoinniksi.

4 77876

Kaavan I mukaiset insuliiniyhdisteet ovat insuliineja ja in- suliininkaltaisia yhdisteitä, jotka sisältävät ihmis-des-B30 (Thr )-insuliiniosan, jossa B30-aminohappo insuliinissa on alaniini (esimerkiksi sian, koiran ja evävalaan ja kaskelo-tin insuliini) tai seriini (kaniini). Tässä käytetty merkintä "insuliinin kaltaiset yhdisteet" käsittää myös proinsuliinin, joka saadaan jostakin yllä mainitusta lajista ja apinoista sekä välituotteita muutettaessa proinsuliinia insuliiniksi. Esimerkkeinä tällaisista välituotteista voidaan antaa lohkaistu proinsuliini, desdipeptidiproinsuliinit, desnonapepti-diproinsuliini ja diarginiini-insuliinit, R. Chance: In Proceedings of the Seventh Congress of IDF, Buenos Aires 1970, 292-305, R.R. Rodriques & J.V.-Owen, Excerpta Medica, Amsterdam.

Vaikkakin trypsiini tunnetaan parhaiten proteolyyttisten omi- naisuuksiensa puolesta, ovat asiantuntijat havainneet, että B304 trypsiini voi katalysoida des-(Ala )-insuliinm ja treo-niini-tert-butyyliesterin kytkemisen, Nature 280, 412. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään trypsiiniä katalysoimaan transpeptidointi.

Edellä esitetyn mukaisesti julkaisu Nature 280, 412 koskee menetelmää peptidien kytkemiseksi, kun taas esillä oleva keksintö koskee menetelmää peptidien transpeptidoimiseksi. Jos se vaihe, jossa ihmisinsuliiniesteri hydrolysoidaan, jätetään huomioimatta, on julkaisun Nature 280, 412 mukaan käytettävä kaksi vaihetta ihmisinsuliiniesterin valmistamiseksi, nimittäin peptidin lohkaisuvaihe ja peptidin kytkemisvaihe. Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan ihmisinsuliiniesteri suoraan yhdessä vaiheessa, joka on transpep-tidointivaihe.

Julkaisussa Nature 280, 412 esitetään, että on yllättävää, - B22 B23 ettei tuotteessa tapahdu Arg -Gly -sidoksen lohkea-mista. On tunnettua, että trypsiini vesipitoisessa väliai- i s 77876 B22 B23 neessa lohkaisee sekä kohdassa Arg -Glv että kohdas-B29 B30 sa Lys -Ala ja niinpä julkaisun Nature 280, 412 perusteella on odotettavissa, että trypsiini orgaanisessa vä- B29 B30 liaineessa ei myöskään lohkaise Lys -Ala -sidosta.

Julkaisussa Nature 280, 412 ei ole mitään mainintaa siitä, B29 —B30 tapahtuuko Lys -Ala -sidoksen lohkaisua orgaanisessa väliaineessa. Näin ollen on keksinnön mukaisesti erityisen yllättävää, että sianinsuliinille voidaan suoraan suorittaa transpeptidointi.

Julkaisussa Biochem. Biophys. Res. Corn. 9^, 396, on kuvattu menetelmä ihmisinsuliinin valmistamiseksi, joka menetelmä on olennaisesti identtinen julkaisussa Nature 280, 412, kuvatun menetelmän kanssa, jolloin siinä kuitenkin entsyyminä käytetään Achromobacter lyticus -proteaasia. Edellä esitetty tarkastelu koskien julkaisua Nature 280, 412, pätee näin ollen myös julkaisulle Biochem. Biophys. Res. Com. 92, 396.

Keksinnön mukaisesti transpeptidointi voidaan suorittaa liuottamalla insuliiniyhdiste, L-treoniiniesteri ja trypsiini seokseen, joka sisältää vettä ja vähintään yhtä veteen sekoittuvaa orgaanista liuotinta, mahdollisesti hapon läsnäollessa.

Edullisia veteen sekoittuvia orgaanisia liuottimia ovat polaariset liuottimet. Esimerkkeinä tällaisista liuottimista voidaan antaa metanoli, etanoli, 2-propanoli, 1,2-etaanidio-li, asetoni, dioksaani, tetrahydrofuraani, N,N-dimetyyliform-amidi, formamidi, Ν,Ν-dimetyyliasetamidi, N-metyylipyrrolido-ni, heksametyylifosforitriamidi ja asetonitriili.

Veden määrä reaktioseoksessa riippuu käytettävästä veteen sekoittuvasta orgaanisesta liuottimesta, reaktiolämpötilasta, ja siitä, onko happoa läsnä reaktioseoksessa, ja sen tulee olla pienempi kuin noin 50 % (tilavuus/tilavuus), ja edullisesti pienempi kuin noin 40 % (tilavuus/tilavuus), ja suurempi kuin noin 10 % (tilavuus/tilavuus).

6 77876

Eräs etu veden määrän vähentämisellä reaktioseoksessa on, että sivutuotteiden synty tällöin pienenee. Hapon määrän lisäämisellä reaktioseoksessa on mahdollista vastaavasti pienentää sivutuotteiden syntyä. Saannon lisääntyminen korreloituu orgaanisen liuottimen korkeaan pitoisuuteen.

Käytetty trypsiinilaji ei tämän keksinnön suorittamisessa ole oleellinen. Trypsiini on hyvin karakterisoitu entsyymi, joka on kaupallisesti saatavissa hyvin puhtaana, erityisesti naudasta ja siasta. Voidaan vielä käyttää mikrobiologisesti saatua trypsiiniä. Tämän keksinnön suorittamisessa ei trypsiinin muoto, esim. kiteinen trypsiini (liukoinen muoto), immobili-soitu trypsiini tai jopa trypsiinijohdannaiset (kunhan trypsiinin aktiivisuus säilyy) ole oleellinen. Tässä käytetty trypsiini käsittää kaikista lähteistä saadun trypsiinin ja kaikki trypsiinimuodot, joilla on transpeptidoiva aktiivisuus, käsittäen myös proteaasit, joilla on trypsiinin tapainen spesifisyys, Achromobacter lyticus -proteaasi, Agric. Biol. Chem. 42, 1443.

Esimerkkeinä aktiivisista trypsiinijohdannaisista voidaan antaa asetyloitu trypsiini, sukkiniloitu trypsiini, glutaralde-hydillä käsitelty trypsiini ja immobilisoidut trypsiinijohdannaiset.

Mikäli käytetään immobilisoitua trypsiiniä, tämä suspendoi-daan väliaineeseen.

Sopivan puskurisysteemin aikaansaamiseksi voidaan lisätä orgaanisia tai epäorgaanisia happoja, kuten suolahappoa, muurahaishappoa, etikkahappoa, propionihappoa tai voihappoa tai emäksiä, kuten pyridiiniä, TRIS'iä, N-metyylimorfoliinia tai N-etyylimorfoliinia. Orgaaniset hapot ovat edullisia. Reaktio voidaan kuitenkin suorittaa ilman tällaisia lisäyksiä. Lisätty happomäärä on tavallisesti pienempi kuin noin 10 ekvivalenttia yhtä ekvivalenttia L-treoniiniesteriä kohden. Hapon 7 77876 määrä on edullisesti välillä 0,5-5 ekvivalenttia yhtä ekvivalenttia L-treoniiniesteriä kohden. Voidaan myös lisätä ioneja, jotka stabilisoivat trypsiinin, kuten esimerkiksi kalsiumio-nit.

Riittävä reaktionopeuden saavuttamiseksi entsymaattiset reaktiot trypsiiniä käyttäen suoritetaan tavallisesti noin o 37 C:ssa. Trypsiinin inaktivoitumisen välttämiseksi suoritetaan esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä edullisesti lämpötilassa, joka on alle ympäristön lämpötilan. Käytän- o nossa reaktiolämpötilat, ]otka ovat yli noin 0 C ovat edullisia .

Riippuen reaktiolämpötilasta, lisätystä trypsiinin määrästä ja muista reaktio-olosuhteista reaktioaika on tavallisesti välillä useita tunteja - useita päiviä.

Trypsiinin ja insuliiniyhdisteen painosuhde on tavallisesti suurempi kuin noin 1:200, edullisesti suurempi kuin noin 1:50, ja pienempi kuin noin 1:1.

B30

Transpeptidoinnissa saadut ihmisinsuliinin treoniini -esterit voidaan kuvata yleisellä kaavalla III: 5 4 B30 (Thr(R )—OR ) -h-In (III) B30 4 jossa h-In on ihmis-des-(Thr )-insuliiniosa, ja R ja 5 R merkitsevät samaa kuin yllä.

Kaavan II mukaisia käyttökelpoisia L-treoniiniestereitä ovat sellaiset, joissa R on karboksyylisuojaryhmä, joka voidaan B30 poistaa ihmisinsuliinin treoniini -esteristä (kaava III) sellaisissa olosuhteissa, joissa insuliinimolekyylissä ei tapahdu oleellisesti palautumattomia muutoksia. Esimerkkeinä tällaisista karboksyylisuojaryhmistä voidaan antaa alemmat al-kyylit, esim. metyyli, etyyli ja tert.butyyli, substituoidut 8 77876 bentsyylit, kuten p-metoksibentsyyli ja 2,4,6-trimetyylibent- syyli ja difenyylimet^yli, ja ryhmiä, joilla on yleinen kaava -CH CH SO R , jossa R on alempi alkyyli, kuten metyyli, 2 2 2 etyyli, propyyli ja n-butyyli. Sopivia hydroksyylisuojaryhmiä 5 R ovat sellaiset, jotka voidaan poistaa ihmisinsuliinin B30 treoniini -esteristä (kaava III) sellaisissa olosuhteissa, joissa insuliinimolekyylissä ei tapahdu oleellisesti palautu- 5 mattomia muutoksia. Esimerkkinä tällaisesta ryhmästä R voidaan antaa tert.-butyyli.

Alemmat alkyyliryhmät sisältävät vähemmän kuin 7 hiiliatomia, edullisesti vähemmän kuin 5 hiiliatomia.

Tavallisesti käytettyjä suojaryhmiä kuvataan teoksessa Metho-den der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Voi. XV/1, Eugen Muller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.

Jotkin kaavan II mukaiset L-treoniiniesterit ovat tunnettuja yhdisteitä, ja muut L-treoniiniesterit (kaava II) voidaan valmistaa analogisesti tunnettujen yhdisteiden valmistusmenetelmin .

Kaavan II mukaiset L-treoniiniesterit voivat olla vapaina emäksinä tai sopivina orgaanisina tai epäorgaanisina suoloina, edullisesti asetaatteina, propionaatteina, butyraatteina ja hydrohalogenideina, kuten hydroklorideina.

On suositeltavaa käyttää reagoivien ainesosien, eli insulii-niyhdisteen ja L-treoniiniesterin (kaava II) korkeita pitoisuuksia. L-treoniiniesterin ja insuliiniyhdisteen moolisuhde on edullisesti suurempi kuin noin 5:1.

On toivottavaa, että L-treoniiniesterin (kaava II) pitoisuus reaktioseoksessa on suurempi kuin 0,1 M.

i 9 77876 B30

Ihmisinsuliinia saadaan ihmisinsuliinin treoniini -este- 4 ristä (kaava III) poistamalla suojaryhmä R ja mahdollisesti läsnä oleva suojaryhmä^R tunnetulla tavalla tai sinänsä tunnetulla tavalla. Kun R on metyyli, etyyli tai ryhmä, 6 6 jolla on kaava -CH CH SO R , jossa R merkitsee samaa kuin 2 2 2 yllä, voidaan mainittu suojaryhmä poistaa lievissä, emäksisissä olosuhteissa vesiväliaineessa, edullisesti pH-arvossa noin 8 - noin 12, esimerkiksi noin 9,5. Emäksenä voidaan käyttää ammoniakkia, etyyliamiinia tai alkalimetallien hyd- 4 roksidejä, kuten natriumhydroksidia. Kun R on tert.butyyli, substituoitu bentsyyli, kuten p-metoksibentsyyli tai 2,4,6-trimetyylibentsyyli tai difenyylimetyyli, voidaan mainittu ryhmä poistaa asidolyysillä, edullisesti käyttäen trifluori-etikkahappoa. Trifluorietikkahappo voi olla vedetön ja se voi sisältää vettä, tai se voidaan laimentaa orgaanisella liuottimena, kuten dikloorimetaanilla. Kun R on tert.butyyli, voidaan mainittu ryhmä poistaa asidolyysillä, kuten yllä on mainittu.

B30

Ihmisinsuliinin kaavan III mukaisia edullisia treoniini - 5 estereitä ovat yhdisteet, joissa R on vety, ja näitä yhdisteitä voidaan valmistaa kaavan II mukaisista L-treoniini- 5 estereistä, joissa R on vety.

Keksinnön mukaisessa transpeptidoinnissa muutetaan mikä tahansa edellä mainituista insuliiniyhdisteistä siten ihmisin- B30 suliinin treoniini -esteriksi (kaava III), joka tämän jälkeen voidaan lohkaista ihmisinsuliinin saamiseksi.

Tämän keksinnön vielä eräs etu on se, että kaavan I mukaiset insuliinin tapaiset yhdisteet, joita on läsnä raakainsulii- nissa ja joissakin kaupallisissa insuliinipreparaateissa, voidaan tämän keksinnön mukaisella transpeptidoinnilla muut- B30 taa ihmisinsuliinin treoniini -esteriksi, jotka yhdisteet tämän jälkeen voidaan lohkaista ihmisinsuliinin saamiseksi.

10 77876

Esimerkkejä kaavan I mukaisista insuliinin tapaisista yhdisteistä on esitettty seuraavassa: ,1 .2

Sian diarginiini-insuliini (R on vety ja R on -Ala-Arg- 3 2

Arg), sian proinsuliini (R on yhdessä R :n kanssa -Ala-

Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Glu-

Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Gly-Gl^-Pro-Pro-

Gln-Lys-, jossa pääte-alanyyli on sitoutunut Lys tään), 3 2 koiran proinsuliini (R on yhdessä R :n kanssa -Ala-Arg-

Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-

Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-, jossa pääte-alanyyli B29 % . . . ,.. .

on sitoutunut Lys tään), lohkaistu sian proinsuliini (R on Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-, ja R on -Ala-

Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-

Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu), sian despeptidiproinsu-1 2 liini (R on vety ja R on -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-

Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-

Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln), ihmisproinsuliini 3 2 (R on yhdessä R :n kanssa -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-

Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-

Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gl^-Ser-Leu-Gln-Lys-, jossa pääte-treonyyli on sitoutunut Lys tään) ja apinaproinsu-, 3 2 liini (R on yhdessä R tn kanssa -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-

Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-

Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, ^3 2 ^3 jossa pääte-treonyyli on sitoutunut Lys tään).

Kaavassa I vaihdetaan R -substituentti, joka on merkitty 3 R -X- siten vetyyn.

Esillä olevan keksinnön eräs edullinen suoritusmuoto käsittää sian raakainsuliinin sisältämien insuliinin kaltaisten yhdisteiden tai näiden suolan tai kompleksin reaktion L-treonii- niesterin (kaava II) tai tämän suolan kanssa yllä mainituissa 4 olosuhteissa, jonka jälkeen suojaryhma R ja mahdollisesti 5 läsnäoleva suojaryhmä R poistetaan. Tällöin tällä menetel- 11 77876 mällä muutetaan sianinsuliini, sekä sen sisältämät insuliinin kaltaiset yhdisteet ihmisinsuliiniksi.

Esimerkkeinä insuliiniyhdisteiden (kaava I) kompleksista tai suolasta voidaan antaa sinkkikompleksi tai sinkkisuola.

Kun reaktio-olosuhteet valitaan yllä olevan mukaan ottaen huomioon ne tulokset, jotka saavutetaan seuraavissa esimer-, . .. . B30 keissa, on mahdollista saada ihmisinsuliinin treoniini esteriä saannolla, joka ylittää 60 % ja jopa 80 % ja joissakin edullisissa olosuhteissa saanto on yli 90 %.

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä on siten tunnettuun tekniikan tasoon seuraavat edut: . B30 a) Entsymaattinen hydrolyysi Ala :n poistamiseksi, esimerkiksi karboksipeptidaasi A:11a, vältetään.

X . , B30 V

b) Välituotteen eristäminen kuten sian-des-(Ala )-insu-liini on tarpeeton.

x A21 c) Vältetään epäpuhtautena esiintyvät des(Asn )-insulii- nijohdannaiset.

d) Proinsuliini ja muut insuliinin kaltaiset epäpuhtaudet, jotka ovat läsnä raakainsuliinissa, muutetaan keksinnön mu- B30 kaisella menetelmällä - ihmisinsuliinin treoniini -esterin kautta - ihmisinsuliiniksi, jolloin saanto suurenee.

e) Antigeeniset insuliinin kaltaiset yhdisteet, GB-patentti-julkaisu 1 285 023, muutetaan ihmisinsuliiniksi.

Eräs edullinen menetelmä ihmisinsuliinin valmistamiseksi esitetään seuraavassa: 1) Transpeptidointiin käytetään raaka-aineena raakaa sianin-suliinia, esim. kiteistä insuliinia, joka valmistetaan sit-raattipuskuria käyttäen, US-patenttijulkaisu 2 626 228.

i2 7 7 8 7 6 2) Transpeptidoinnin jälkeen mahdollisesti jäljellä oleva trypsiinin aktiivisuus poistetaan edullisesti, esimerkiksi olosuhteissa, joissa trypsiini on inaktivoitu, esimerkiksi happamassa väliaineessa, jonka pH-arvo on alle 3. Trypsiini voidaan poistaa erottamalla molekyylipainon mukaan, esim. geelisuodatuksella "Sephadex G-50":llä tai "Bio-gel P-30":llä 1 M etikkahapossa. Nature 280, 412.

3) Muut epäpuhtaudet, kuten reagoimaton sianinsuliini voidaan poistaa käyttäen anionin- ja/tai kationinvaihtokromato-grafiaa, katso esimerkit 1 ja 2.

, B30 4) Tämän jälkeen lohkaistaan ihmisinsuliinin treoniini esteri, ja ihmisinsuliini eristetään, esimerkiksi kiteytetään sinänsä tunnetulla tavalla.

Tällä tavoin saadaan ihmisinsuliinia, jolla on farmaseuttisesti hyväksyttävä puhtausaste, ja haluttaessa voidaan ihmisinsuliini vielä puhdistaa.

Seuraavassa käytetyt lyhenteet ovat IUPAC-IUB Commissionin (1974) hyväksymien ohjeiden mukaisia biokemialliselle sanastolle, Collected Tentative Rules Se Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2nd ed., Maryland 1975.

Analyyttiset kokeet:

Sianinsuliinin ja sianproinsuliinin muuttaminen ihmisinsulii-niesteriksi voidaan havainnollistaa DISC-PAGE-elektroforeesil-la 7,5-%:sessa polyakryyliamidigeelissä puskurissa, jossa on 0,375 M TRIS, 0,06 M HC1 ja 8 M ureaa. Puskurin pH-arvo on 8,7. Kaavan III mukaiset esterit migroituvat nopeudella, joka on 75 % sianinsuliinin nopeudesta. Sianproinsuliini, joka mig-roituu 55 %:n nopeudella verrattuna sianinsuliinin nopeuteen, 13 77876 muutetaan keksinnön mukaisella menetelmällä viimeksi mainituksi tuotteeksi. Reaktiotuotteet tunnistettiin kaavan III mukaisiksi yhdisteiksi seuraavien kriteerien perusteella: a) Kaavan III mukaisten ihmisinsuliiniestereiden elektroforeettinen migraatio vastaa verrattuna sianin-suliiniin yhden negatiivisen varauksen menettämisen.

b) Geelissä olevien värjättyjen proteiinijuovien, jotka vastaavat kaavan III mukaisia yhdisteitä, aminohappokoostumus on identtinen ihmisinsuliinin aminohappo-koostumuksen kanssa, eli siinä on 3 moolia treoniinia ja 1 mooli alaniinia 1 moolia insuliinia kohti, ja sianinsuliinin koostumus on 2 moolia treoniinia ja 2 moolia alaniinia 1 moolia insuliinia kohti. Menetelmiä aminohappokoostumuksien analysoimiseksi polyakryy-liamidigeeleissä olevissa proteiinijuovissa on kuvattu julkaisussa Eur. J. Biochem. 2J5, 147.

c) Todiste siitä, että lisätty treoniini sijoittuu C-terminaalisen aminohapon B-ketjuun, saadaan insuliinin S-S-siltojen hapettavalla sulfitolyysillä 6 M gua-nidiinihydrokloridissa, jota seuraa A- ja B-ketjujen erottaminen ioninvaihtokromatografoinnilla "SP Sepha-dex":illa. Kun B-ketju-S-sulfonaatti pilkotaan karboksi-peptidaasi A:11a vapautuu C-terminaalinen aminohappo.

Tätä menettelyä on kuvattu julkaisussa Markussen, Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima, 12-14 juli, 1978 (julkaisu:

Baba, Kaneko ja Yanihara) Int. Congress Series n:o 468, Excerpta Medica, Amsterdam-Oxford. Analyysi suoritetaan sen jälkeen kun esteriryhmä on lohkaisut kaavan III mukaisista yhdisteistä.

Yllä mainitut kolme analyysiä osoittavat selvästi, että on tapahtunut muuttumista ihmisinsuliiniksi.

14 77876

Sianinsuliinin ja sianproinsuliinin muuttaminen ihmis-insuliiniesteriksi voidaan seurata kvantitatiivisesti käyttämällä HPLC:tä (high pressure liquid chromatography) käänteisfaasissa. Käytetään 4 x 300 mm: n "^,uBonda-pak C-^g-kolonnia" (Waters Ass.) / ja eluointi suoritetaan puskurilla sisältäen 0,2 M ammoniumsulfaattia, (jonka pH-arvo on säädetty 3,5:een rikkihapolla) ja sisältäen 2'6-50 % asetonitriiliä. Optimaalinen asetonitriilipitoi-suus riippuu siitä, mikä kaavan III mukainen esteri ha- 4 lutaan erottaa sianinsuliinista. Kun R on metyyli, ja R on vety, erottuminen saavutetaan 26 %:sessa (tila- vuus/tilavuus) asetonitriilissä . Sianinsuliini ja B 3 0 (Thr-OMe) -h-In (Me on metyyli) eluoituu 4,5:n ja 5,9:n kolonnitilavuuden jälkeen selvästi erottuvina symmetrisinä huippuina. Ennen HPLC-kolonniin viemistä proteiinit saostetaan reaktioseoksesta lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. Sakka kerätään sentrifugoimalla, kuivataan tyhjössä ja liuotetaan 0,02 M rikkihappoon.

Menetelmää ihmisinsuliiniestereiden ja ihmisinsuliinin valmistamiseksi kuvataan lähemmin seuraavilla esimerkeillä, jotka kuvaavat eräitä keksinnön mukaisen menetelmän edullisia suoritusmuotoja.

Esimerkki 1 200 mg kerran kiteytettyä sian raakainsuliinia liuotettiin 1,8 mliaan 3,33 M etikkahappoa. Lisättiin 2 ml 2 M liuosta, jossa oli Thr-OMe (Me on metyyli) N,N-dimetyyliasetamidissa, ja 20 mg trypsiiniä liuotettuna 0,2 ml:aan vettä. Proteiinit saostettiin seoksen seistyä 18 h 37°C:ssa lisäämällä 40 ml asetonia, ja sakka eristettiin sentrifugoimalla. Liuosfaasi heitettiin pois. Sakan analyysi HPLCrllä käyttäen 26 % asetonitriiliä (katso analyyttiset kokeet) osoittaa, että 60 % sianin- B30 suliinista on muuttunut (Thr-OMe) -h-In:ksi. Sakka liuotettiin 8 ml:aan juuri deionisoitua 8 M ureaa, 15 77876 pH-arvo säädettiin 8,Oraan käyttäen 1 M ammoniakkia, ja liuos lisättiin 2,5 x 25 cm:n kolonniin, joka oli täytetty "QAE A-25 Sephadex":illa, ja joka oli tasapainotettu 0,1 M ammoniumkloridipuskurilla sisältäen 60 % (tilavuus/tilavuus) etanolia, ja tämän pH-arvo säädettiin 8,Oraan ammoniakilla. Eluointi suoritettiin samalla puskurilla ja kerättiin 15 ml:n fraktioita. (Thr-OMe) B 3 0 -h-In:ää löydettiin fraktioissa 26-46, reagoimatonta sianinsuliinia fraktioissa 90-120. Fraktiot 26-46 yhdis- B3 0 tettiin, etanoli haihdutettiin tyhjössä, ja (Thr-OMe) -h-In kiteytettiin sitraattipuskurissa kuten julkaisussa Schlichtkull et ai., Handbuch der inneren Medizin, 7/2A, 96, Berlin, Heidelberg, New York 1975 kuvataan. Saantona saatiin 95 mg kiteitä, joilla oli sama rombinen muoto kuin analogisella tavalla kiteytetty sianinsuliini. Aminohappokoostumus osoittautui identtiseksi ihmisinsu-liinin aminohappokoostumuksen kanssa. Tämän lisäksi suoritetut analyyttiset kokeet, joita on kuvattu edellä, B 3 0 osoittivat, että saatu tuote oli (Thr-OMe) -h-In. Esimerkki 2 100 mg sianinsuliinia, joka täyttää GB-patenttijulkaisussa 1 285 023 kuvatut puhtauskriteerit, liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M etikkahappoon, johon tämän jälkeen lisättiin 1 ml 2 M liuosta, joka sisälsi treoniinimetyy-liesteriä Ν,Ν-dimetyyliformamidissa ja 12 mg TPCK-kä-siteltyä (TPCK on tosyylifenyylialaniinikloorimetyyli-ketoni)-trypsiiniä liuotettuna 0,1 mlraan vettä. Reaktio pysäytettiin kun reaktioseosta oli inkuboitu 24 h 37°C:ssa lisäämällä 4 ml 1 M fosforihappoa. Saatu B3 0 (Thr-OMe) -h-In erotettiin reagoimattomasta sianinsu- liinista ioninvaihtokromatografoinnilla käyttäen 2,5 x 25 cm "SP Sephadex"-kolonnia ja eluenttia sisältäen 0,09 M natriumkloridia ja 0,02 M natriumdivetyfosfaattia (puskurin pH-arvo on 5,5) 60 %:sessa etanolissa. Frak- B30 tiot, jotka sisälsivät (Thr-IMe) -h-In kerättiin, 16 77876 etanoli poistettiin vakuumissa, ja tuote kiteytettiin kuten esimerkissä 1 on esitetty. Saanto oli 50 mg (Thr-OMe)B3^-h-In.

Esimerkki 3

100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M

Β3Π etikkahappoa ja muutettiin (Thr-OMe) -h-In:ksi ja puhdistettiin kuten sianinsuliinille on kuvattu esimer- R 3 0 kissä 1. Proinsuliinin konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 73 % HPLC-analyysin mukaan määritettynä asetonisa- B 3 0 kasta. Kiteisen (Thr-OMe) -h-In:n saanto oli 54 mg. Esimerkki 4 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 2,77 M etikkahappoa vedessä ja annettiin reagoida kuten esimerkissä 2 on kuvattu. Reaktion päätyttyä proteiinit saos- tettiin lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. DISC-PAGE- B 3 0 analyysi osoitti 70 %:n konversiota (Thr-OMe) -h-In: ksi.

Esimerkki 5

100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M

etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N-metyy- lipyrrolidonissa. Reaktio suoritettiin kuten esimerkissä B 3 0 4 on kuvattu, ja konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 20 %.

Esimerkki 6 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 2,77 M etikkahappoa vedessä, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä HMPA:ssa (heksametyylifosforitriamidi). Reaktio suoritettiin kuten esimerkissä 4 on kuvattu. Konversio

Dlf| (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 80 %.

Esimerkki 7

100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M

17 77876 etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N- dimetyyliasetamidissa. Reaktio suoritettiin kuten esi- E 3 0 merkissä 4 on kuvattu. Konversio (Thr-OMe) h-In:ksi oli 80 %.

Esimerkki 8 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N-dimetyyliasetamidissa. Tämän jälkeen lisättiin 200 U (units) trypsiiniaktiivisuutta (määritettynä substraatilla BAEE) immobilisoituna 1 g:aan lasihelmiä, ja kun oli inkuboitu 24 h ajan 37°C:ssa lasiin sidottu trypsiini suodatettiin pois. Reaktion loputtua seostettiin proteiinit lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. DISC-PAGE-analyysi osoitti 40 %:n konversiota (Thr-OMe)B30-h-In:ksi.

Esimerkki 9 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N-dimetyyliasetamidissa. Tämän jälkeen lisättiin 300 U trypsiiniaktiivisuutta (mitattuna substraatille BAEE), joka oli immobilisoitu 200 ^ugraan CNBr-aktivoitua "Sephadex G-150". Kun oli inkuboitu 24 h ajan 37°C:ssa suodatettiin "Sephadex":iin sidottu trypsiini pois. Reaktion loputtua proteiinit saostettiin lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. DISC-PAGE-analyysi osoitti 70 %:n konversiota (Thr-OMe)B30-h-In:ksi.

Esimerkki 10

Esimerkissä 7 kuvattu menetelmä toistettiin käyttäen esterinä 2 M Thr-OBut (But on tert.butyyli) N,N-dimetyy-liasetamidissa. Konversio (Thr-OBut)B30-h-In:ksi oli 80%.

Esimerkki 11

Esimerkissä 8 kuvattu menetelmä toistettiin käyttäen 18 77876 esterinä 2 M Thr-OBut:tä N,N-dimetyyliasetamidissa. Konversio (Thr-OBut)B30-h-In:ksi oli 30 %.

Esimerkki 12

Esimerkissä 9 kuvattu menetelmä toistettiin käyttäen esterinä 2 M Thr-OBu^itä N,N-dimetyyliasetamidissa. Konversio (Thr-OBu^)B3<"*-h-In: ksi oli 70 %.

Esimerkki 13

100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M

etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N- dimetyyliasetamidissa. Reaktio suoritettiin kuten esi- B 3 0 merkissä 4 on kuvattu. Konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 80 %.

Esimerkki 14

100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M

etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N- dimetyyliasetamidissa. Seosta käsiteltiin immobilisoi- dulla trypsiinillä vastaavalla tavalla kuin esimerkissä B 3 0 8 on kuvattu. Konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 40 %. Esimerkki 15

100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M

etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä N,N-di- metyyliasetamidissa. Seosta käsiteltiin immobilisoidulla trypsiinillä vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 9 on B3 0 kuvattu. Konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 70 %. Esimerkki 16 100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OBut:tä N,N-dimetyyliasetamidissa. Reaktio suoritettiin vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 4 on kuvattu. Konversio (Thr-OBu*·) B3B-h-In:ksi oli 80 %.

19 77876

Esimerkki 17 100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OBut:tä N,N-dimetyyliasetamidissa. Seosta käsiteltiin trypsiinillä, joka oli immobilisoitu lasihelmille vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 8 on kuvattu. Konversio (Thr-OBut)B3^-h-In:ksi oli 40 %.

Esimerkki 18

100 mg sianproinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3,33 M

etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OBut:tä N,N- dimetyyliasetamidissa. Seosta käsiteltiin trypsiinillä, joka oli immobilisoitu CNBr-aktivoidulle "Sephadex- G-150":lle, vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 9 +* B 3 0 on kuvattu. Konversio (Thr-OBu ) -h-In:ksi oli 70 %. Esimerkki 19 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,5 ml:aan 6 M etikkahappoa, ja lisättiin 1 ml 1 M Thr-OTmb:ta (Tmb on 2,4,6-trimetyylibentsyyliä) N,N-dimetyyliasetamidissa. Edelleen lisättiin 0,5 ml Ν,Ν-dimetyyliasetamidia ja 5 mg TPCK-käsiteltyä trypsiiniä 0,1 ml:ssa vettä. Reak-tioseosta säilytettiin 32°C:ssa 44 h. Reaktion päätyttyä saostettiin proteiinit lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. DISC-PAGE-analyysi osoitti 50 %:n konversiota (Thr-OTmb)B30-h-In:ksi.

Esimerkki 20 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3 M etikka- happoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä dioksaanissa.

Reaktio suoritettiin vastaavalla tavalla kuin esimerkis- B 3 Π sä 4, ja konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 10 %. Esimerkki 21 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,9 ml:aan 3 M etikka-happoa, ja lisättiin 1 ml 2 M Thr-OMe:tä asetonitrii- 20 77876

Iissä. Reaktio suoritettiin vastaavalla tavalla kuin B3 0 esimerkissä 4, ja konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 10 S.

Esimerkki 22 B30 250 mg kiteistä (Thr-OMe) -h-In dispergoitiin 25 mlraan vettä ja liuotettiin lisäämällä 1 N natriumhydroksidi-liuosta pH-arvoon 10,0. pH-arvo pidettiin vakiona 10,0: ssa 24 h:n ajan 25°C:ssa. Muodostunut ihmisinsuliini kiteytettiin lisäämällä 2 g natriumkloridia, 350 mg natriumasetaattitrihydraattia ja 2,5 mg sinkkiasetaatti-dihydraattia jonka jälkeen lisättiin 1 N suolahappoa pH-arvon 5,52 saamiseksi. Romboedriset kiteet eristettiin sentrifugoimalla, sen jälkeen kun niitä oli pidetty 24 h 4°C:ssa, pestiin 3 ml:11a vettä, eristettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. Saanto: 220 mg ihmisinsuliinia.

Esimerkki 23 B 3 0 100 mg (Thr-OTmb) -h-In:ää liuotettiin 1 ml:aan jääkylmää trifluorietikkahappoa, ja liuosta säilytettiin 2 h 0°C:ssa. Muodostunut ihmisinsuliini erotettiin lisäämällä 10 ml tetrahydrofuraania ja 0,97 ml 1,03 M suolahappoa tetrahydrofuraanissa. Muodostunut sakka eristettiin sentrifugoimalla, pestiin 10 ml:11a tetrahydrofuraania, eristettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. Sakka liuotettiin 10 ml:aan vettä, ja liuoksen pH-arvo säädettiin 2,5:een 1 N:llä natriumhydroksidiliuosta. Ihmisinsuliini erotettiin lisäämällä 1,5 g natriumkloridia ja eristettiin sentrifugoimalla. Sakka liuotettiin 10 ml:aan vettä, ja ihmisinsuliini erotettiin lisäämällä 0,8 g natriumkloridia, 3,7 mg sinkkiasetaattidihydraattia ja 0,14 g natriumasetaattitrihydraattia, jonka jälkeen lisättiin 1 N natriumhydroksidiliuosta pH-arvon 5,52 saavuttamiseksi. Sakka eristettiin sentrifugoimalla 24 h:n seisotuksen 21 77876 jälkeen 4°C:ssa, pestiin 0,9 mlrlla vettä, eristettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. Saanto: 90 mg ihmisinsuliinia.

Esimerkki 24 100 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,5 ml:aan 10 M etik- kahappoa, ja lisättiin 1,3 ml 1,54 M Thr-0Me:tä N,N- dimetyyliasetaatissa. Seos jäähdytettiin 12°C:een.

10 mg trypsiiniä liuotettuna 0,2 ml:aan 0,05 M kalsium- asetaattia lisättiin. Seoksen seistyä 48 tuntia 12°C:ssa saostettiin proteiinit lisäämällä 20 ml asetonia. Sian- B 3 0 insuliinin konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi on 97 % HPLC:llä.

Esimerkki 25 20 mg sianinsuliinia liuotettiin seokseen, jossa oli 0,08 ml 10 M etikkahappoa ja 0,14 ml vettä. Lisättiin 0,2 ml 2 M Thr-OMe:ta N,N-dimetyyliasetamidissa, ja seos jäähdytettiin -10°C:een. 2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,025 ml:aan 0,05 M kalsiumasetaattia lisättiin. Seoksen oltua 72 h-10°C:ssa saostettiin proteiinit lisäämällä B30 5 ml asetonia. Sianinsuliinin konversio (Thr-OMe) --h-In:ksi oli 64 % HPLC:llä.

Esimerkki 26 20 mg sianinsuliinia dispergoitiin 0,1 ml:aan vettä. Lisäämällä 0,6 ml 2 M Thr-OMe:tä H,Ν-dimetyyliasetami-dissa insuliini hajosi. Seos jäähdytettiin 7°C:een.

2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,025 ml:aan 0,05 M kalsiumasetaattia lisättiin. Seoksen oltua 24 h 7°C:ssa saostettiin proteiinit lisäämällä 5 ml asetonia. Sian- B 3 0 insuliinin konversio (Thr-OMe) -h-In:ksi oli 62 % HPLC:llä.

Esimerkki 27

20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,135 ml:aan 4,45 M

77876 propionihappoa. 0,24 ml 1,67 M Thr-OMe N,N-dimetyyli-asetamidissa lisättiin. 2 mg trypsiiniä 0,025 ml 0,05 M kalsiumasetaatissa lisättiin, ja seosta säilytettiin 37°C:ssa 24 tuntia. Proteiinit saostettiin lisäämällä 10 tilavuutta 2-propanolia. Sianinsuliinin konversio (Thr-OMe) B3^-h-I:n: ksi oli 75 % HPLCrllä.

Esimerkki 28 20 mg sianinsuliinia dispergoitiin 0,1 ml:aan vettä. Lisättiin 0,4 ml 2 M Thr-OMe:ta N,N-dimetyyliasetamidis-sa, jonka jälkeen lisättiin 0,04 ml 10 N suolahappoa, jolloin insuliini hajosi. 2 ml trypsiiniä liuotettuna 0,025 ml:aan 0,05 M kalsiumasetaattia lisättiin, ja seosta säilytettiin 37°C:ssa 4 tuntia. HPLC-analyysi B 3 0 osoittaa 46 %:n sianinsuliinin konversiota (Thr-OMe) --h-In:ksi.

Esimerkki 29 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,175 ml:aan 0,57 M etikkahappoa. Lisättiin 0,2 ml 2 M Thr-OMe:ta N,N-dimetyyliasetamidissa, jonka jälkeen lisättiin 0,025 ml 0,05 M kalsiumasetaattia. 10 mg Achromobacter lyticus-proteaasin raakapreparaattia lisättiin ja seosta säilytettiin 22 h 37°C:ssa. Proteiinit saostettiin lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. Sianinsuliinin konversio (Thr-OMe)B30-h-In:ksi oli 12 % HPLC:llä.

Esimerkki 30 20 mg sianinsuliinia dispergoitiin 0,1 ml:an 0,5 M etikkahappoa. Lisäämällä 0,2 ml 0,1 M Thr-OMe:tä N,N-dimetyyliasetamidissa insuliini hajosi. Seos jäähdytettiin 12°C:een, ja lisättiin 2 mg trypsiiniä 0,025 ml:ssa 0,05 M kalsiumasetaattia. Seoksen oltua 24 h 12°C:ssa osoittaa HPLC-analyysi 42 %:n sianinsuliinin B30 konversiota (Thr-OMe) -h-In:ksi.

23 77876

Esimerkki 31 2 mg kaniinin insuliinia liuotettiin 0,135 ml:aan 4,45 M etikkahappoa. Lisättiin 0,24 ml 1,67 M Thr-©Me:ta Ν,Ν-dimetyyliasetamidissa, jonka jälkeen lisättiin 1,25 mg trypsiiniä 0,025 ml:ssa 0,05 M kalsiumase-taattia. Seosta säilytettiin 37°C:ssa 4 h. HPLC-ana- lyysi osoitti 88 %:n kaniini-insuliinin konversiota B 3 0 (Thr-OMe) -h-In:ksi. Kaniini-insuliini eluoi sian- insuliinin HPLC-kolonnista, jolloin kaniini-insuliinin B 3 0 eluointitilavuuden ja (Thr-OMe) -h-In:n välinen suhde on 0,72.

Esimerkki 32 B 31 B 3 2 2 mg siandiargiini-insuliinia (Arg -Arg -insuliini) liuotettiin 0,135 ml:aan 4,45 M etikkahappoa. Lisättiin 0,24 ml 1,67 M Thr-0Me:tä Ν,Ν-dimetyyliasetamidissa, jonka jälkeen lisättiin 1,25 mg trypsiiniä 0,025 mlrssa 0,05 M kalsiumasetaattia. Seosta säilytettiin 37°C:ssa 4 h.HPLC-analyysi osoittaa 91 %:n diargiini-insuliinin B30 konversiota (Thr-OMe) -h-In:ksi. Diargiini-insuliini eluoi sianinsuliinin HPLC-kolonnista, jolloin diargiini- B3 0 insuliinin eluointitilavuuden ja (Thr-OMe) -h-In:n välinen suhde on 0,50.

Esimerkki 33

C O

2 mg "sianvälituotteita" (ts. desdipeptidi-(Lys -Arg )- 31 32 proinsuliinia ja desdipeptidi-(Arg -Arg )-proinsu-liinia) annettiin reagoida vastaavalla tavalla kuin esi- ΟΟΛ merkissä 32. HPLC-analyysi osoittaa 88 %:n (Thr-OMe) h-In:a.

Esimerkki 34

20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 ml:aan 2 M etikkahappoa. Lisättiin 0,2 ml 2 M Thr-OMe:ta Ν,Ν-dimetyyliasetamidissa, ja seos jäähdytettiin -18°C:een. Lisättiin 2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,025 ml:aan 0,05 M

24 77876 kalsiumasetaattia, ja seosta säilytettiin 120 h -18°Ctssa.

B 3 0 HPLC-analyysi osoittaa, että konversio (Thr-OMe) -h--In:ksi on 83 %.

Esimerkki 35

Esimerkissä 34 kuvattu menetelmä toistettiin sillä erolla, että reaktio suoritettiin 50°C:ssa 4 h. HPLC-ana- B 3 0 lyysi osoittaa, että reaktio (Thr-OMe) -h-Intksi on 23 %.

Esimerkki 36 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 mitään 3 M etikka-happoa. Lisättiin 0,3 ml 0,33 M Thr-0(CH2)2-SO2-CH3, CH-jCOOH /treoniini-2- (metyylisulfonyyli) etyylesteri-hydroasetaattia/ N,N-dimetyyliasetamidissa. Seos jäähdytettiin 12°C:een ja lisättiin 2 mg trypsiiniä 0,025 mitään 0,05 M kalsiumasetaattia. HPLC osoittaa 24 hm jälkeen 12°C:ssa 77 %tn konversiota /Thr-0(CH-,) 9-S02~ _330 ^ ^ CH~/ -h-Intksi. Tuote eluoitui suunnilleen (Thr-OMe) -h-Intn kohdalla.

Esimerkki 37 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 mitään 10 M etik- kahappoa. Lisättiin 0,2 ml 2 M Thr-OEt (Et on etyyliä) Ν,Ν-dimetyyliasetamidissa, ja seos jäähdytettiin

12°Cteen. Lisättiin 2 mg trypsiiniä 0,025 mltssa 0,05 M

kalsiumasetaattia. HPLC osoittaa 24 htn jälkeen 12°Ctssa B 3 0 75 %tn konversiota (Thr-OEt) -h-Intksi. Tuote eluoitui B30 kohdalla, joka saadaan hieman (Thr-OMe) -h-In:n jälkeen.

Esimerkki 38 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 mitään 6 M etikka-happoa. Lisättiin 0,3 ml 0,67 M Thr(But)-0Buttta N,N-dimetyyliasetamidia. Seos jäähdytettiin 12°Cteen ja lisättiin 2 mg trypsiiniä 0,025 mltssa 0,05 M kalsiumase- 25 77876 taattia. 24 tunnin jälkeen 12°C:ssa on konversio (Thr(Bufc)-OBufc)B^^-h-In:ksi 77 %. Tuote eluoitiin HPLC-kolonnista käyttämällä asetonitriiligradienttia 27 %:sta 40 %:iin.

Esimerkki 39 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 ml:aan 4 M etikka-happoa. Lisättiin 0,2 ml 1,5 M Thr-OMe:ta liuotettuna tetrahydrofuraaniin, ja seos jäähdytettiin 12°C:een. Lisättiin 2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,02 5 ml saan 0,05 M kalsiumasetaattia. 4 h:n jälkeen 12°C:ssa B 3 0 HPLC-analyysi osoitti 75 %:n konversiota (Thr-OMe) -h-In:ksi.

Esimerkki 40 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 ml saan 4 M etikka-happoa. Lisättiin 0,8 ml 2 M Thr-OMestä liuotettuna 1,2-etaanidioliin, ja seos jäähdytettiin 12°C;een. Lisättiin 2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,025 ml s aan 0,05 M kalsiumasetaattia. 4 tunnin jälkeen 12°C:ssa HPLC-analyysi

DIA

osoittaa 48 %:n konversiota (Thr-OMe) -h-In:ksi. Esimerkki 41 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 mlsaan 4 M etikka-happoa. Lisättiin 0,2 ml Thr-OMesta liuotettuna etanoliin, ja seos j-äähdytettiin 12°C:een. Lisättiin 2 mg trypsiiniä liuotettuna 0,025 mlsaan 0,05 M kalsiumasetaattia, ja reaktio suoritettiin 4 hsssa 12°C:ssa.

Β3Π HPLC-analyysi osoittaa 46 %:n konversiota (Thr-OMe) h-Insksi.

Esimerkki 42 20 mg sianinsuliinia liuotettiin 0,1 mlsaan 4 M etikka-happoa. Lisättiin 0,2 ml 2 M Thr-OMesta asetonissa, ja seos jäähdytettiin 12°C:een. Lisättiin 2 mg trypsiiniä 26 77876 liuotettuna 0,025 mitään 0,05 M kalsiumasetaattia.

4 h:n jälkeen 12°C:ssa HPLC-analyysi osoitti 48 %:n konversiota (The-OMe)B30-h-In:ksi.

Claims (9)

77876

1. Menetelmä ihmisinsuliinin tai ihmisinsuliinin treo- .B3° niini -esterin tai sen suolan tai kompleksin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että insuliiniyhdiste, jolla on kaava I R -(1---A 21) I I 2 (1——B----29 )-R (I) jossa -(1---A 21) (1—-B-—29)- B30 AI on ihmis-des(Thr )-insuliiniosa^ jossa Gly on sitoutunut substituenttiin R ja Lys on sitoutunut substi-..22 tuenttiin R , R on aminohappo tai peptidiketju, joka sisältää korkeintaan 36 aminohappoa, ja R on vety tai ryhmä, jolla on yleinen kaava R -X-, jossa X on arginiini tai ly-siini ja R on peptidiketju, ^oka sisältää korkeintaan 35 aminohappoa, tai R yhdessä R s n kanssa on peptidiketju, joka sisältää korkeintaan 35 aminohappoa, sillä ehdolla, että R :ssä ja R :ssa olevien aminohappojen lukumäärä on pie-nempi kuin 37, tai sen suola tai kompleksi, joka voidaan muuttaa kaavan I mukaiseksi insuliiniyhdiseeksi, transpepti-doidaan L-treoniiniesterin kanssa, jolla on kaava II 5 4 Thr(R )-0R (II) 4 5 jossa R on karboksyylisuojaryhmä ja R on vety tai hyd- roksyylisuojaryhmä, tai sen suolan kanssa seoksessa, joka sisältää vettä, veteen sekoittuvaa, orgaanista liuotinta ja trypsiiniä, jolloin vesipitoisuus reaktioseoksessa on alle 50 % (tilavuus/tilavuus) ja reaktiolämpötila on alle 50°C, ja mahdollisesti hapon läsnäollessa, jonka jälkeen saatu ih-. . ... ...B30 misinsuliinm treonnm -esteri haluttessa lohkaistaan. 28 7 7 8 7 6

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että L-treoniiniesterin pitoisuus reaktioseoksessa on suurempi kuin 0,1 M, että reaktiolämpötila on suurempi kuin reaktioseoksen jäätymispiste, ja että reaktioseos sisältää 0-10 ekvivalenttia jotain happoa yhtä ekvivalenttia L-treo-niiniesteriä kohti.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insuliiniyhdiste on sian tai kaniinin insuliini, sian diarginiini-insuliini tai sian proinsuliini.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insuliiniyhdiste on saatu siasta .

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insuliiniyhdisteenä käytetään suhteellisen raakaa insuliinia.

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene- 0 telmä, tunnettu siitä, että reaktiolämpötila on alle 37 C, o edullisesti alle huoneen lämpötilan, ja yli 0 C.

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veden pitoisuus reaktioseoksessa on välillä 40-10 % (tilavuus/tilavuus).

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insuliiniyhdiste on sian insuliini, että L-treoniiniesteri on Thr-OMe tai Thr-OBu , että veteen sekoittuva, orgaaninen liuotin on Ν,Ν-dimetyyliformamidi tai . o Ν,Ν-dimetyyliasetamidi, että reaktiolämpötila on noin 37 C, että veden pitoisuus reaktioseoksessa on välillä 41-43 %, että trypsiinin ja insuliiniyhdisteen painosuhde on noin 1:8, että L-treoniiniesterin ja insuliiniyhdisteen moolisuhde on 29 7 7 8 7 6 noin 120:1, ja että lisätään 1,2-1,5 ekvivalenttia etikkahap-poa yhtä ekvivalenttia L-treoniiniesteriä kohti.

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että valmistetaan ihmisinsuliinia.