SE451143B - Forfarande for framstellning av insulinderivat - Google Patents

Description

451 143 _,_ des-(Alaßso, AsnA2l)-insulin. Detta derivat ger efter de två efterföljande reaktionsstegen upphov till förorening med des- (AsnA21)-insulin i det framställda semisyntetiska humaninsulinet, vilket är en förorening, som ej lätt kan avlägsnas genom kända preparatíva metoder. Des-(AsnA21)-insulin uppvisar låg bio- logisk aktivitet (ca 5%), jfr. Amer.J.Med. 40, 750.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är åstadkommande av ett förfarande, vid vilket icke-humaninsulín omvandlas till humaninsulin.

Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är åstad- kommande av ett förfarande, vid vilket svininsulin och vissa orenheter däri via en treoninßso-ester av humaninsulin omvandlas till humaninsulin.

Ytterligare ändamål och fördelar med föreliggande upp- finning kommer att framgå av beskrivningen.

Föreliggande uppfinning baserar sig på den iakttagelsen, att aminosyran eller peptidkedjan som är bunden till karbonyl- gruppen LysB29 Ifrågavarande utbyte betecknas häri som transpeptidering.

Det häri använda uttrycket "insulinföreningar" omfattar insuliner och insulinliknande föreningar innehållande human-des- (rhrßflfi-insuiinaeien, i vina Bso-aminosyran i insuiinet är alanin (i insulin från ex.vis svin, hund, finval och spermacet- val) eller serin (kanin). Det häri använda uttrycket "insulín- liknande föreningar" omfattar proinsulin härrörande från en vilken som helst av ovannämnda arter och primater samt mellan- Som ex. i ínsulinföreningen kan utbytas med en treonin- ester. produkter från omvandlingen av proínsulin till insulin. på sådana mellanprodukter kan anges splitproinsulin, desdi- peptidproinsuliner, desnonapeptídproinsulin och diarginin- In Proceedings of the Seventh Congress R.R.Rodrigues & insulíner, jfr. R.Chance: of IDF, Buenos Aires 1970, 292-305, Utg.: J.V.-Owen, Excerpta Medica, Amsterdam.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning karakteriseras av att en insulinförening eller ett salt eller komplex därav transpeptíderas med en L-treoninester eller ett salt därav i en blandning av vatten, ett med vatten blandbart organiskt lösnings- medel och trypsin, varvid vatteninnehâllet i reaktionsblandningen är mindre än ca 50% (vol/vol), och reaktionstemperaturen är under ca 50°C. ~ -- ._ _ _ _ 1. _ - ß., 3 451 143 Även om trypsín är mest känt för sina proteolytiska egen- skaper har fackmän funnit, att trypsín är istånd till att kata- lysera kopplingen av des-(Alaßso)-insulin och en treonin-tert- butylester, jfr. Nature 280, 412. Vid förfarandet enligt före- liggande uppfinning användes trypsín för att katalysera trans- peptidering.

Transpeptideringen kan utföras genom att man upplöser 1) insulinföreningen, 2) en L-treoninester och 3) trypsín i en blandning av vatten och minst ett med vatten blandbart organiskt lösningsmedel, ev. i närvaro av en syra.

Föredragna med vatten blandbara organiska lösningsmedel är polära lösningsmedel. Som konkreta exempel på sådana lös- ningsmedel kan anges metanol, etanol, 2-propanol, 1,2-etandiol, aceton, dioxan, tetrahydrofuran, N,N-dimetylformamid, formamid, N,N-dimetylacetamid, N-metylpyrrolidon, hexametylfosfortriamid och acetonitril.

Beroende på vilket med vatten blandbart organiskt lös- ningsmedel som användes, den valda reaktionstemperaturen och när- varon av en syra i reaktionsblandníngen bör innehållet av vatten i reaktionsblandningen vara mindre än ca 50% (vol/vol), före- trädesvis mindre än ca 40% (vol/vol) och mer än ca 10% (vol/vol).

En fördel med att minska mängden vatten i reaktionsbland- ningen är att man därigenom minskar bildningen av biprodukter.

Genom att öka mängden av syra i reaktionsblandningen är det på motsvarande sätt möjligt att minska bildningen av biprodukt. Ökningen i utbyte är positivt korrelerad till en hög procentsats av organiskt lösningsmedel .

För tillämpningen av föreliggande uppfinning är det ej väsentligt vilken art av trypsín som användes. Trypsin är ett väl karakteriserat enzym, vilket kommersiellt är tillgängligt i hög renhet, i synnerhet från ox- och svinkällor. Man kan vidare använda trypsín av mikrobiellt ursprung. För utövning av före- liggande uppfinning är trypsinformen, ex.vis kristallint trypsín (löslig form), immobiliserat trypsín eller t.o.m. trypsinderivat (så länge trypsinaktiviteten bibehålles), vidare ej väsentlig.

Den häri använda beteckningen trypsín är avsedd att innefatta trypsiner av godtyckligt ursprung och alla trypsinformer, som bíbehâllit den transpeptiderande aktiviteten, innefattande pro- teaser med trypsínliknande specificitet, ex.vis Acromobacter 451 143 lyticus-proteas, jfr. Agric.Bio1.Chem. 42, 1443.

Som ex. pâ aktiva trypsinderivat kan nämnas acetylerat trypsin, succinylerat trypsin, glutaraldehydbehandlat trypsin och immobiliserade trypsinderivat.

Om ett immobiliserat trypsin användes, suspenderas det i mediet.

För uppnående av ett lämpligt buffertsystem kan man till- sätta organiska eller oorganiska syror, såsom saltsyra, myrsyra, ättiksyra, propionsyra och smörsyra, och baser, såsom pyridin, TRIS, N-metylmorfolin och N-etylmorfolin. Organiska syror är Omsättningen kan emellertid utföras utan sådana till- Den tillsatta mängden syra är vanligen mindre än ca l0 föredragna. satser. ekvivalenter per ekvivalent L-treoninester. Mängden syra är företrädesvis mellan 0,5 och S ekvivalenter per ekvivalent L- Man kan tillsätta joner, som stabiliserar trypsin, såsom kalciumjoner. treoninester.

Förfarandet kan utföras vid en temperatur inom området mellan 50°C och reaktionsblandningens fryspunkt. För uppnående av tillräcklig reaktionshastighet utföres enzymatiska reaktioner med trypsin vanligen vid ca 37°C. För att undvika inaktivering av trypsin är det emellertid fördelaktigt att utföra förfarandet enligt föreliggande uppfinning vid en temperatur under rumstempe- I praktiken föredras reaktionstemperaturer över ca 0°C.

Beroende på reaktionstemperaturen, den tillsatta mängden trypsin och andra reaktionsbetingelser är reaktionstiden vanligen Iatul' . _mellan flera timmar och flera dagar.

Viktförhållandet mellan trypsin och insulinföreningen i reaktionsblandningen är vanligtvis över ca l:200, företrädesvis över ca 1:50 och under ca 1:1.

De L-treoninestrar som kan ifrågakomma vid utförandet av föreliggande uppfinning kan anges med den allmänna formeln II: Thr(R5)-o1z4 (11) vari R4 betecknar en karboxylskyddsgrupp och R5_betecknar väte eller en hydroxylskyddsgrupp, eller ett salt därav.

De treonin -estrar av humaninsulin som erhålles vid transpeptideringen kan anges med den allmänna formeln III: (Thr(1z5)-o1z4)B3°-h-1n (111) vari h-In betecknar human-des-(Thr B30)-insulindelen och R4 och R5 har ovan angiven betydelse. 451 143 Användbara L-treoninestrar med formeln II är sådana, i vilka R4 är en karboxylskyddsgrupp, som kan avlägsnas från treo- ninB30-estern av humaninsulin (formel III) under betingelser som icke medför väsentlig irreversibel förändring i insulinmolekylen.

Som ex. på sådana karboxylskyddsgrupper kan anges lägre alkyl, ex.vis metyl, etyl och tert-butyl, substituerad bensyl, såsom p-metoxibensyl och 2,4,6-trimetylbensyl och difenylmetyl, och grupper med den allmänna formeln-CHZCHZSOZRÖ, vari R6 betecknar lägre alkyl, såsom metyl, etyl propyl och n-butyl. Lämpliga hydroxylskyddsgrupper R5 är sådana, som kan avlägsnas från treonin- B30-estern av humaninsulín (formel III) under betingelser, som icke medför väsentlig, irreversibel förändring i insulinmolekylen.

Som ett exempel på en sådan grupp (Rs) kan nämnas tert-butyl.

Lägre alkylgrupper innehåller mindre än 7 kolatomer, före- trädesvis mindre än 5.kolatomer.

Ytterligare vanligen använda skyddsgrupper beskrives av Wünsch: Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), vol. XV/1, utg.: Eugen Müller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.

I (formel II) är kända föreningar och resterande L-treoninestrar (formel II) kan framställas ana- logt med framställningen av kända föreningar.

L-treoninestrarna med formeln II kan utgöras av de fria baserna eller lämpliga organiska eller oorganíska salter därav, företrädesvis acetater, propionater, butyrater och hydrohalo- genider, såsom hydroklorider.

Det är önskvärt att använda reaktanterna, dvs insulin- föreningen och L-treoninestern (formel II) i höga koncentra- tioner. Det molära förhållandet mellan L-treoninestern och in- sulinföreningen är företrädesvis över ca 5:1.

Det är önskvärt att koncentrationen av L-treoninestern (formel II) i reaktionsblandningen överstiger 0,1 molar. 0-estrar av human- Några L-treoninestrar Humaninsulin kan erhållas från treonínßs insulin (formel III) genom avlägsnande av skyddsgruppen R4 och en ev. motsvarande skyddsgrupp RS på känt sätt eller på i och för sig känt sätt. Försåvitt R4 är metyl, etyl eller en grupp med formeln -CHZCHZSOZRÖ, vari RÖ I ifrågavarande skyddsgrupp avlägsnas under milda, basiska betingel- ser i ett vattenhaltigt medium, företrädesvis vid ett pH-värde Å Som bas kan an- har ovan angiven betydelse, kan av mellan ca 8 och ca 12, ex.vís vid ca 9,5. 451 143 vändas ammoniak, trietylamin eller hydroxíder av alkalimetaller, såsom natriumhydroxid. Om R4 är tert-butyl, substituerad bensyl såsom p-metoxibensyl eller 2,4,6-trimetylbensyl eller difenylmetvl, kan ifrågavarande grupp avlägsnas genom acidolys, företrädesvis Trifluorättiksyran kan vara vattenfri eller kan innehålla något vatten eller den kan vara utspädd med Om RS är tert- butyl kan ifrågavarande grupp avlägsnas genom acidolys, jfr. ovan. -estrar av humaninsulin med formeln med trífluorättiksyra. ett organiskt lösningsmedel, såsom diklormetan.

Föredragna treoninßso III är föreningar, vari R5 är väte, och dessa kan framställas ut- gående från L-treoninestrar med formeln II, vari R5 är väte.

Transpeptideringen av insulinföreningar till treoninB30- estrar av humaninsulin kan beskrivas mera detaljerat på basis av följande formel (I) för insulinföreningarna: ' R1-(1---A7--21) (1---1s---z9)-R2 (I) vari -(1---A---z1) (l---B---29)- betecknar human-des(ThrB30)insu1indelen, där GlyA1 är ansluten B29 är ansluten till till substítuenten betecknad RI och Lys substituenten betecknad R2, R2 betecknar en aminosyra eller en peptidkedja innehållande högst 36 aminosyror och R1 betecknar väte eller en grupp med den allmänna formeln R3-X-, där X be- tecknar arginin eller lysin, och R3 betecknar en peptidkedja innehållande högst 35 aminosyror, eller R2 tillsammans med R3 betecknar en peptidkedja innehållande högst 35 aminosyror, med det förbehållet att antalet aminosyror som är närvarande i R1 och R2 är mindre än 37.

Vid transpeptideringen enligt föreliggande uppfinning omvandlas en vilken som helst av ovannämnda insulínföreningar B30-estrar av humaninsulin (formel III), som sålunda till treonin därefter kan spjälkas till bildning av humaninsulin.

En ytterligare fördel med föreliggande uppfinning är det förhållandet, att insulinliknande föreningar, vilka är när- varande i räinsulin och i några kommersiella insulinpreparat och som täckes av formeln I, vid transpeptideringen enligt före- 7 451 1d3 B30 liggande uppfinning omvandlas till treonin -estrar av human- insulin, vilka föreningar därefter kan spjälkas under bildning Exempel på insulinliknande föreningar med formeln I framgår av det följande: Svindiarginininsulin (R1 är väte och R2 är Ala-Arg-Arg), svinproinsulin (R3 är samman med R2 -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn- Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-G1y-Leu- Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-G1u-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-, vari den terminala alanylen är bunden till Lysßzg), hundproinsulin (RS är samman med R2 -Ala-Arg-Arg-Asp-Val-G1u-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu~Gly-Gly- Leu-Gln-Pro-Elu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-, vari den terminala alanylen är bunden till LysB29), svinsplitproinsulin (R3 är Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-, och R2 är Ala-Arg-Arg- Glu-Ala~G1u-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-G1y- Leu-Gly41y-Leu-Gln-Ala-Leu), svindesdipeptidproinsulín (R är väte och R2 är A1a-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-G1n-Ala-Gly-Ala- Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu- Glu-Gly-Pro-Pro-Gln), humanproinsulin (R3 är samman med R2 -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu~Asp-Leu-Gln-Va1-Gly-Gln-Val-G1u-Leu- Gly-Gly-G1y-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu- Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, vari den termínala treonylen är bunden till Lysßzg) och abeproinsulin (R3 är samman med R2 -Thr-Arg- Arg-Glu-A1a-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-G1n-Va1-Glu-Leu-Gly-Gly- Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-G1n-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser- Leu-Gln-Lys-, vari den terminala treonylen är bunden till Lys I alla dessa föroreningar som täckes av formeln I utbytes sålunda den med R3-X- betecknade R1-substituenten mot väte.

En föredragen utföringsform för föreliggande uppfinning går ut på att omsätta råsvininsulin innehållande insulinliknande föreningar eller ett salt eller komplex därav med en L-treonin- ester (formel II) eller ett salt därav under ovannämnda betingel- ser, varefter skyddsgruppen R4 och en ev. närvarande skyddsgrupp R5 avlägsnas. Vid detta förfarande omvandlas svininsulin samt insulinliknande föreningar däri till humaninsulin. f Som exempel på ett komplex eller ett salt av en insulin- förening (formel I) kan anges ett zinkkomplex eller zinksalt.

När reaktionsbetingelserna väljas enligt ovan angivna förklaring och under hänsyn tagen till de resultat som uppnås i följande exempel är det möjligt att få ett utbyte av treonin- av humaninsulin. ßz9)_ ,. 451 143 i B30-ester av humaninsulin som är över 60% och t.o.m. över 80% och under vissa föredragna betingelser över 90%.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning har därför följande fördelar i jämförelse med den kända tekniken: a) Den enzymatiska hydrolysen till avlägsnande av Alaßso t.ex. med karboxipeptidas A, är utelämnad. b) Isoleringen av en mellanprodukt, såsom svin-des-(AlaB30)- insulin, är ej nödvändig. c) Förorening med des-(AsnA21)-insulinderivat undvikes. d) Proinsulin och andra insulinliknande föroreningar som är närvarande i råinsulin omvandlas genom förfarandet enligt före- B30-estern av humaninsulin - liggande uppfinning + via treonín till humaninsulin, varigenom utbytet ökar. e) Antigena ínsulinliknande föreningar, jfr. brittiska pa- tentskriften 1 285 023 omvandlas till humaninsulin.

Ett föredraget förfarande. för framställning av human- insulin är följande: 1) Det vid transpeptideringen använda utgångsmaterialet är råsvininsulin, ex.vis kristallint insulin, som framställts under användning av en citratbuffert, jfr. US-patentet 2 626 228. 2) Om efter transpeptideringen kvarstår trypsinaktivítet är det föredraget att avlägsna den, ex.vis under betingelser, vid vilka trypsin är inaktivt, ex.vis i surt medium vid ett pH-värde av under 3. Trypsin kan avlägsnas genom separation efter mole- kylvikt, ex.vis genom gelfiltrering på "Sephadex G-50" eller "Bio-Gel P-30" i 1 M ättiksyra, jfr. Nature 280, 412. 3) Andra föroreningar, såsom oomsatt svininsulin kan avlägsnas under användning av anjon- och/eller katjonbytarkromatografering, jfr. ex. 1 och 2. 4) Därefter spaltas treoninßso -estern av humaninsulin och humaninsulin isoleras, ex.vis kristalliseras, på i och för sig känt sätt.

På detta sätt kan man erhålla humaninsulin med en accep- tabel farmaceutisk renhet och humaninsulinet kan om det är önsk- värt renas ytterligare.

Föreliggande uppfinning avser vidare hittills okända treoninB30-estrar av humaninsulin, vari esterdelen skiljer sig från tert-butyl och metyl.

Använda förkortningar står i överensstämmelse med de regler 9 b 4ö1 143 som godkänts (1974) av IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, jfr. Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, Znd ed., Maryland 1975. ÅNALYTISKA UNDERSÖKNINGAR Omvandling av svininsulin och svinproinsulin till human- insulinestrar kan åskådliggöras genom DISC-PAGE~elektrofores i 7,5% polyakrylamidgel i en buffert bestående av 0,375 M TRIS, 0,06 M HCl och 8 M urinämne. Buffertens pH-värde är 8,7. Estrar med formeln III vandrar med en hastighetsom är 75% av svininsulins hastighet. Svinproinsulin som vandrar med 55% av svininsulins hastighet omvandlas vid förfarandet enligt uppfinningen till samma produkt. Identífikationen av omvandlingsprodukten som föreningar med formeln III baserar sig på följande kriterier: a) Den elektroforetiska vandringen av humaninsulinestrar med formeln III i förhållande till svininsulin motsvarar förlusten av en negativ laddning. b) Aminosyrasammansättningen av de färgade proteinbanden i gelen representerande föreningar med formeln III är identisk med aminosyrasammansättningen för humaninsulin, dvs 3 mol treonin och 1 mol alanin per mol insulin, och sammansättningen av svininsulin är 2 mol treonin och 2 mol alanin per mol insulin. Tekniken för analys av amínosyrasammansättningar av proteinband i polyakryl- amidgeler beskrives i Eur.J.Biochem. 25, 147. c) Beviset för att det inkorporerade treoninet är placerat som C-terminalaminosyra i B-kedjan kan fås genom oxidativ sulfi- tolys av S-S-bryggorna i insulin i 6 M guanídinhydroklorid åt- följt av separation av A- och B-kedjor genom jonbyteskromato- grafering på "SP Sephadex". Genom nedbrytning av B-kedje-S- sulfonatet med karboxipeptídas A frígöres endast den C-terminala amínosyran. Tekniken beskrives av Markussen i Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin och C-peptide, Tokushima, 12-14 juli, 1978 (utg.: Baba, Kaneko och Yaniahara) Int. Congress Series nr 468, Excerpta Medica, Amsterdam-Oxford). Analysen utföres efter det att estergruppen avspaltats från föreningar med formeln III.

Dessa tre analyser visar klart, att omvandling till human- insulin ägt rum.

Omvandlingcn av svininsulín och svinproinsulin till human- 451 143 10 insulinestrar kan följas kvantitativt med HPLC (high pressure liquid chromatography) på omvänd fas. Man använder en 4 x 300 mm " uBondapak C18-kolonn" (Waters Ass.) och elueringen utföres med en buffert innehållande 0,2 M ammoniumsulfat (som är in- ställd på ett pH-värde av 3,5 med svavelsyra) och innehållande 26-50% acetonitril. är avhängig av vilken ester med formeln III man önskar skilja Försâvitt R4 är metyl och RS är väte uppnås separation i 26% (vol/vol) acetonitril. Svininsulin och (Thr-0Me)B30-h-In (Me är metyl) eluerar efter 4,5 resp. 5,9 kolonnvolymer som klart separerade symmetriska toppar. Före påförandet på HPLC-kolonnen utfälles proteiner i reaktionsbland- ningen genom tillsats av 10 volymer aceton. Fällningen isoleras Den optimala acetonitrilkoncentrationen från svininsulin. genom centrifugering, torkas i vakuum och upplöses i 0,02 M svavelsyra.

Förfarandet för framställning av humaninsulinestrar och humaninsulin belyses närmare genom följande exempel, vilka illust- rerar några föredragna utföringsformer av förfarandet enligt uppfinningen.

EXEMPEL l 200 mg råsvininsulin som kristalliserats en gång upplöses i 1,8 ml 3,33 M ättiksyra. Man tillsätter 2 ml av en 2 M lösning av Thr-0Me (Me är metyl) i N,N-dimetylacetamid och 20 mg trypsin upplöst i 0,2 ml vatten. Efter lagring i 18 timmar vid 37°C utfälles proteinerna genom tillsats av 40 ml aceton och fäll- ningen isoleras genom centrifugering. Supernatanten kastas.

Analys av fällningen med HPLC under användning av 26% aceto- nitril (jfr. Analytiska undersökningar) visar 60% omvandling av svininsulin till (Thr-0Me)B30-h-In. Fällningen upplöses i 8 ml färskt avjoniserat 8 M urinämne, pH-värdet inställes på 8,0 med l M ammoniak, lösningen överföres på en 2,5 x 25 cm kolonn som är fylld med "QAE A-25 Sephadex", som'bringats i jämvikt med en 0,1 M ammoniumkloridbuffert, vilken innehåller 60% (vol/vol) etanol, och dess pH-värde inställes på 8,0 med ammoniak. Elu- eringen utföres med samma buffert och man uppsamlar fraktioner om 15 ml. (Thr-0Me)B30-h~In återfinnes i fraktionerna nr 26-46, icke omsatt svininsulin i fraktionerna 90-120. Fraktionerna nr 26-46 förenas, etanolen avdrives i vakuum och (Thr-0Me)B30-h- In kristallíseras i citratbuffert såsom beskrives av Schlichtkrull 11 451 143 et al, Handbuch der inneren Medizin, 7/ZA, 96, Berlin, Heidel- berg, New York 1975. Utbytet är 95 mg kristaller med samma rombiska form som svininsulin, som kristalliserats på analogt sätt. Aminosyrasammansättningen visar sig vara identisk med hu- maninsulins aminosyrasammansättning. Ytterligare analytiska undersökningar, som beskrives i ovanstående avsnitt: "Analytiska undersökningar", visar att den erhållna produkten är (Thr-0Me)- B30-h-In.

EXEMEL 2 100 mg svininsulin, som uppfyller de' renhetskriterier som anges i brittiska patentskriften l 285 023 upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättiksyra och man tillsätter därefter en 1 ml av en 2 M lösning av treoninmetylester i N,N-dimetylformamid och 12 mg TPCK-behandlat (TPCK är tosylfenylalaninklormetylketon) trypsin som upplösts i 0,1 ml vatten. Efter inkubering i 24 timmar vid 37°C avbrytes reaktionen genom tillsats av 4 ml 1 M fosforsyra.

Brhållet (Thr-0Me)B30-h-In separeras från icke omsatt svininsulin genom jonbytarkromatografi på en 2,5 x 25 cm kolonn av "SP Sephadex" med ett elueríngsmedel innehållande 0,09 M natrium- klorid och 0,02 M natriumdivätefosfat (pH-värde av buffert: 5,5) i 60% etanol. Fraktioner innehållande (Thr-OMe) 0-h-In upp- samlas, etanolen avlägsnas i vakuum och produkten kristallíseras på analogt sätt som beskrivits i ex. l. Utbytet är 50 mg (Thr-oMe)B3°-h-In.

EXEMPEL 3 100 mg svinproinsulin upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättiksyra och omvandlas till (Thr-OMe)B3O-h-In och renas på analogt sätt som beskrivits för svininsulin i ex. 1. Omvandlíngen av proinsu- lin till (Thr-OMe)B30-h-In visar sig vara 73% vid HPLC-analys av acetonfällningen. Utbytet av kristallínt (Thr-0Me)B30-h-In är 54 mg.

EXEMPEL 4 100 mg svininsulin upplöses i 0,9 ml 2,77 M ättíksyra i vatten och omsättes på analogt sätt som beskrivits i ex. 2.

Efter avslutad omsättning utfälles proteinerna genom tillsats av volymer aceton. Analys med DISC PAGE visar en omvandling :iii (rhr-oMe)B3°-h-In av 10%.

EXEMPEL 5 100 mg svininsulin upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättíksyra Ä"Sephadex" bundna trypsinet. 451 143 12 och man tillsätter l ml 2 M Thr-0Me i N-metylpyrrolidon. Om- sättningen utföres på analogt sätt som beskrivits i ex. 4 och omvandlingen till (Thr-0Me)B30-h-In är 20%.

EXEMPEL 6 100 mg svininsulin upplöses i 0,9 ml 2,77 M ättiksyra i vatten och man tillsätter l ml 2 M Thr-0Me i HMPA (hexametyl- fosfortriamid). Omsättningen utföres på analogt sätt som be- skrivits i ex. 4. Omvandlingen till (Thr-0Me)B30-h-In är 80%.

EXEMPEL 7 100 mg svininsulin upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättiksyra och man tillsätter l ml 2 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamid. Omsätt- ningen utföres på analogt sätt som beskrivits i ex. 4. Omvand- lingen till (Thr-0Me]B30-h-In är 80%.

EXEMPEL 8 100 mg svininsulin upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättiksyra och man tillsätter l ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimetylacetamíd. Därefter tillsättes 200 U (units = enheter) trypsinaktivitet (bestämt med substratet BABE) immobiliserat på 1'g glaspärlor, och efter in- kubering vid 37°C i 24 timmar frånfiltreras det till glaset bundna Efter avslutad omsättning utfälles proteinerna genom tillsats av 10 volymer aceton. Analys med DISC. PAGE visar en smvandiing :111 (Thr-ommßso-h-In av 40%.

EXEMPEL 9 100 mg svininsulin upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättiksyra och man tillsätter l ml 2 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamid. Därefter tillsättes 300 U trypsinaktivitet (mätt med substratet BAEE), trypsinet. “som är immobíliserat på 200 dg'CNBr-aktiverat "Sephadex G-150".

Efter inkubering vid 37°C i 24 timmar frånfiltreras det till Efter avslutad omsättning utfälles proteinerna genom tillsats av 10 volymer aceton. Analys med DISC PAGE visar en omvandling till (Thr-OMe)B30-h-In av 70%.

EXEMPBL l0_ Den i ex. 7 angivna proceduren upprepas med den skillna- den, att den använda estern är 2 M Thr-0But (But är tert-butyl) i N,N-dimetylacetamid. Omvandlingen till (Thr-0But)B30-h-In är 80%.

EXEMPEL ll _ Den i ex. 8 angivna proceduren upprepas med det förbe- hållet, att den använda estern är 2 M Thr-0But i N,N-dimetyl- 1, 451 143 acetamid. Omvandlingen till (Thr-0But)B30-h-In är 30%.

EXEMPEL 12 Den i ex. 9 angivna proceduren upprepas med det förbe- hållet att den använda estern är 2 M Thr-Oßut i N,N-dimetyl- acetamíd. Omvandlingen till (Thr-0But)B30-h-In är 70%.

EXEMPEL 13 100 mg svinproinsulin upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättiksyra och man tillsätter l ml 2 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamid. Om- sättningen utföres på analogt sätt som beskrivits i ex. 4. Om- vendiingen till (Th:-oMe)B3Û-h-In är 80%.

EXEMPEL 14 100 mg svinproinsulin upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättiksyra och man tillsätter 1 ml 2 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamíd. Bland- ningen behandlas med immobilíserat trypsin på analogt sätt so: een beskrivits 1 ex. s. omvandlingen 1111 (Thr-oMe)B3°-h-In är 40%.

EXEMPEL 15 100 mg svinproinsulin upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättiksyra och man tillsätter l ml 2 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamid. Bland- ningen behandlas med immobiliserat trypsin på analogt sätt som beskrivits i ex. 9. Omvandlingen till (Thr-0Me)B30-h-In är 70%.

EXEMPEL 16 100 mg svinproinsulin upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättiksyra een men tilieafrer 1 m1 2 M Tnr-oßut 1 N,N-ainetyieeetenia.

Omsättningen utföres på analogt sätt som beskrivits i ex. 4.

Omvandlingen till (Thr-0But)B30-h-In är 80%¿ EXEMWEL 17 ' 100 mg svinproinsulin upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättiksyra och man tillsätter 1 ml 2 M Thr-OBut i N,N-dimetylacetamid.

Blandningen behandlas med trypsin, som immobilíserats på glas- pärlor, på analogt sätt som beskrivits i ex. 8. Omvandlingen tili (The-oßut)B3°-h-In är 402.

EXEMPEL 18 100 mg svinproinsulin upplöses i 0,9 ml 3,33 M ättiksyra och man tillsätter 1 ml 2 M Thr-Oßut i N,N-dimetylacetamid.

Blandningen behandlas med trypsin, som immobilíserats till CNBr- aktiverat "Sephadex G-150" på analogt sätt som beskrivits i ex. 9. 'omvandlingen till (rhr-oBut)B3°-h-In är 70:. _... _ _" _ __ 451 143 14 EXEMPEL 19 100 mg svininsulin upplöses i 0,5 ml 6 M ättiksyra och man tillsätter 1 ml l M Thr-0Tmb (Tmb är 2,4,6-trimetylbensyl) i N,N-dimetylacetamid. Man tillsätter ytterligare 0,5 ml N,N- dimetylacetamid och 5 mg TPCK-behandlat trypsin i 0,1 ml vatten.

Reaktionsblandningen får stå vid 32°C i 44 timmar. Efter av- slutad omsättning utfälles proteinerna genom tillsats av 10 volymer aceton. Analys med DISC PAGE visar en omvandling till (Thr-0Tmb)B30-h-In av 50%.

EXEMPEL 20 100 mg svininsulin upplöses i 0,9 ml 3 M ättiksyra och man tillsätter l ml 2 M Thr-OMe i dioxan. på analogt sätt som beskrivits i ex. 4 och omvandlingen till (rhr-oMe)B3°-h-In är 10%.

EXEMPEL 21 100 mg svininsulin upplöses i 0,9 ml 3 M ättiksyra och man tillsätter 1 ml 2 M Thr-OMe i acetonitril. Omsättningen ut- föres på analogt sätt som beskrivits i ex. 4 och omvandlingen :in (rhr-omeflšm-h-In är 10%.

EXEMPEL 22 250 mg krístallint (Thr-OMe) vatten och upplöses genom tillsats av 1 N natriumhydroxidlösning till ett pH-värde av 10,0. pH-värdet hålles konstant vid 10,0 i 24 timmar vid 25°C. Det bildade humaninsulinet kristalliseras genom tillsats av 2 g natriumklorid, 350 mg natriumacetattri- hydrat och 2,5 mg zinkacetatdihydrat följt av tillsats av 1 N saltsyra till dess att ett pH-värde av 5,52 uppnås.

Omsättningen utföres B30-h-In dispergeras i 25 ml De rombo- idiska kristallerna isoleras genom centrifugering efter lagring i 24 timmar vid 4°C, tvättas med 3 ml vatten, isoleras genom centrifugering och torkas i vakuum. Utbyte: Exfimrfit z3_ 100 mg (Thr-0Tmb) ättiksyra, och lösningen får stå i 2 timmar vid 0°C.

B30-h-ln upplöses i 1 ml iskylä trifluor- Det bil- dade humaninsulinet utfälles genom tillsats av 10 ml tetrahydro- furan och 0,97 ml 1,03 M saltsyra i tetrahydrofuran. Den bil- dade fällningen isoleras genom centrífugeríng, tvättas med 10 ml tetrahydrofuran, isoleras genom centrifugering och torkas i vakuum. Fällningen upplöses i 10 ml vatten och lösningens pH- värde inställes på 2,5 med 1 N natriumhydroxídlösning. Human- 220 mg humaninsulin} 451 143 insulinet utfälles genom tillsats av 1,5 g natriumklorid och isoleras genom centrifugering. Fällningen upplöses i 10 ml vatten, och humaninsulinet utfälles genom tillsats av 0,8 g nat- riumklorid, 3,7 mg zinkacetatdihydrat och 0,14 g natriumacetat- trihydrat âtföljt av tillsats av 1 N natriumhydroxidlösning till dess att ett pH-värde av 5,52 uppnås. Fällningen isoleras genom centrifugering efter att ha fått stå í 24 timmar vid 4°C, tvättas med 0,9 ml vatten, isoleras genom centrifugering och torkas i vakuum. Utbyte: EXEMPEL 24 100 mg svininsulin upplöses i 0,5 ml 10 M ättiksyra och man tillsätter 1,3 ml 1,54 M Thr-OMe i N,N-dimetylacetamid. Bland- ningen kyies-:iii 1z°c. man tiiisätter 10 mg trypsin upplöst i 0,2 ml 0,05 M kalciumacetat. Efter 48 timmar vid l2°C utfälles proteinerna genom tillsats av 20 ml aceton. Omvandlingen av svininsulin tiil (rhr-oMe)B3°-h-in är 97% enligt HPLc.

EXEMPEL 25 mg svininsulin upplöses i en blandning av 0,08 ml 10 M ättiksyra och 0,14 ml vatten. Man tillsätter 0,2 ml 2 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamíd och blandningen kyles till -l0°C. Man tillsätter 2 mg trypsín upplöst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat.

Efter 72 timmar vid -l0°C utfälles proteínerna genom tilläats av B 0 90 mg humaninsulin. ml aceton. Omvandlingen av svininsulin till (Thr-0Me) h-In är 64% enligt HPLC. “ EXEMPEL 26 mg svininsulin dispergeras i 0,1 ml vatten. Vid till- sats av 0,6 ml 2 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamid går insulinet Blandningen kyles till 7°C. Man tillsätter 2 mg Efter 24 timmar till lösning. trypsin upplöst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat. vid 7°C utfälles proteinerna genom tillsats av 5 ml aceton. Om- vandlingen av svininsulin till (Thr-OMe)B30-h-In är 62% enligt HPLC.

EXEMPEL 27 mg svininsulin upplöses i 0,135 ml 4,45 M propionsyra.

Man tillsätter 0,24 ml 1,67 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamid. 2 mg trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat tillsättes och bland- ningen förvaras vid 37°C i 24 timmar. Proteinerna utfälles genom tillsats av 10 volymer 2-propanol. Omvandlingen av svininsulin till (rhr-oMe)B3°-h-In är 15% enligt HPLC. 451 143 16 EXEMPEL 28 mg svíninsulin dispergeras i 0,1 ml vatten. Man till- sätter 0,4 ml Thr-0Me i N,N-dimetylacetamid åtföljt av 0,04 ml N saltsyra, varvid ínsulínet går i lösning. 2 ml trypsin upplöst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat tillsättes och bland- HPLC-analys visar 46% om- B30-h-In. ningen förvaras vid 37°C i 4 timmar. vandling av svíninsulin till (Thr-OMe) EXEMPEL 29 mg svíninsulin upplöses i 0,175 ml 0,57 M ättiksyra. 0,2 ml 2 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamid tillsättes åtföljt av tillsats av 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat. Man tillsätter 10 mg av ett råpreparat av Achromobacter lyticus-proteas, och bland- Proteinerna utfälles genom tillsats av 10 volymer aceton. Omvandlingen av svíninsulin till (Thr-oMe)B3°-h-In är 12% enlig: HPLC. ningen förvaras i 22 timmar vid 37°C.

EXEMPEL 30 mg svíninsulin dispergeras i 0,1 ml 0,5 M ättiksyra.

Vid tillsats av 0,2 ml 0,1 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamid upp- löses ínsulínet. Blandningen kyles till l2°C, och man tillsätter 2 mg trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat. Efter 24 timmar vid l2°C visar HPLC-analysen en 42% omvandling av svíninsulin till (Thr-oMe)B3°-h-In.

EXEMPEL 31 Z mg kanininsulin upplöses i 0,135 ml 4,45 M ättiksyra. 0,24 ml 1,67 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamid tillsättes åtföljt av tillsats av 1,25 mg trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat.

Analys med HPLC visar B30-h-In. Kanin- insulin elueras före svíninsulin från HPLC-kolonnen, i det att Blandningen förvaras vid 37°C i 4 timmar. 88% omvandling av kanininsulin till (Thr-OMe) förhållandet mellan elueringsvolymen för kanininsulin och (rhr-oMe)B3°-h-In är 0,72.

EXEMPEL 32 . . . . . _ B31 B32 . _ 2 mg svindiarginininsulin (Arg -Arg -insulin) upp- löses i 0,135 ml 4,45 M ättiksyra. Man tillsätter 0,24 ml 1,67 M Thr-OMe i N,N-dimetylacetamid åtföljt av tillsats av 1,25 mg trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat. vid 37°C i 4 timmar. HPLC-analys visar 91% omvandling av di- arginininsulin till (Thr-0Me)B30-h-In.. Díarginininsulin eluerar före svíninsulin från HPLC-kolonnen, i det att förhållandet Blandningen förvaras . kyles till -1s°c. _ i 0,025 m1 0,05 M kalciumacetat. 1, 451 143 mellan elueringsvolymen för diarginíninsulin och (Thr-0Me)B30- h-In är 0,50.

EXEMPEL 33 2 mg "svinmellanprodukter" (dvs en blandning av desdi- peptíd-(Lysóz-Arg63)proinsu1ín och desdipeptid-[Arg3l-Arg32)- proinsulin) omsättes på analogt sätt som beskrivits i ex. 32.

HPLC-analys visar 88% (Thr-0Me)B30 EXEMPEL 34 mg svininsulin upplöses i 0,1 ml 2 M ättiksyra. 0,2 ml 2 M Thr-0Me i N,N-dimetylacetamíd tillsättes och blandningen Man tillsätter 2 mg trypsin upplöst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat och blandningen förvaras i 120 timmar vid -18°C. HPLC-analys visar att omvandlingen till (Thr-0Me)B30- h-In är 83%. -h-In.

EXEMPEL 35 Den i ex. 34 angivna proceduren upprepas med det förbe- hållet, att omsättningen utföres vid 50°C i 4 timmar. HPLC- analys visar att omvandlingen till (Thr-OMe)B30-h-In är 23%.

EXEMPEL 36 mg svininsulin upplöses i 0,1 ml 3 M ättiksyra. Man tillsätter 0,3 m1 0,33 M Thr-o(cH2)2-soz-cH3,cH3cooH (cre0nin- 2-(metylsulfonyl)etylesterhydroacetat) i N,N-dímetylacetamid.

Blandningen kyles till l2°C och man tillsätter 2 mg trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat. HPLC visar efter 24 timmar vid l2°C en 77% omvandling till (Thr-0(CH2)2-S02-CH3) -h-In.

Produkten eluerar ungefär vid positionen för (Thr-0Me) -h-In.

EXEMPEL 37 mg svininsulin upplöses i 0,1 ml 10 M ättiksyra. Man tillsätter 0,2 ml 2 M Trh-OEt (Et är etyl) i N,N-dimetylacetamid och blandningen kyles till 12°C. 2 mg trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat tillsättes. HPLC visar efter 24 timmar vid l2°C 75% omvandling till (Thr-0Et)B30-b-In. Produkten eluerar i en position något efter (Thr-0Me)B30-h-In.

EXEMPEL 38 _ mg svininsulin upplöses i 0,1 ml 6 M ättiksyra. Man tillsätter 0,3 ml 0,67 M Thr(But)-0But i N,N-dimetylacetamíd.

Blandningen kyles till l2°C, och man tillsätter 2 mg trypsin Efter 24 timmar vid l2°C är omvandlingen till (Thr(But)-0But)B30-h-In 77%. Produkten elu- 45-1 Ms 1, eras från HPLC-kolonnen under användning av en gradient i aceto- nitril från 27 till 40%.

EXEMPEL 39 mg svíninsulin upplöses i 0,1 ml 4 M ättiksyra. Man tillsätter 0,2 ml 1,5 M Thr-OMe upplöst i tetrahydrofuran, och blandningen kyles till l2°C. 2 mg trypsin upplöst i 0, 025 ml 0,05 M kalciumacetat tillsättes. Efter 4 timmar vid 12°C visar HPLC-analys en omvandling till (Thr-OMe)B30-h-In av 75%.

EXEMPEL 40 _ mg svíninsulin upplöses i 0,1 ml 4 M ättiksyra. 0,8 ml 2 M Thr-OMe upplöst i 1,2-etandiol tillsättes, och blandningen kyles till l2°C. 2 mg trypsin upplöst i 0,025 ml 0,05 M kalcium- acetat tillsättes. Efter 4 timmar vid l2°C visar HPLC-analys en omvandling till (Thr-0Me)B30-h-In av 48%.

EXEMPEL 41 mg svíninsulin upplöses i 0,1 ml 4 M ättíksyra. 0,2 ml 2 M Thr-OMe upplöst i etanol tillsättes, och blandningen kyles till l2°. 2 mg trypsin upplöst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat tillsättes, och omsättningen utföres i 4 timmar vid l2°C. HPLC- analys visar 46% omvandling till (Thr-0Me)B30-h-In.

EXEMPEL 42 mg svíninsulin upplöses i 0,1 ml 4 M ättiksyra. 0,2 ml 2 M Thr-OMe i aceton tillsättes, och blandningen kyles till l2°C. 2 mg trypsin upplöst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat tillsättes.

Efter 4 timmar vid 12°C visar HPLC-analys omvandling till (rnr-oueflßfïh-In av 48%.

Claims (9)

19 e451 143 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för framställning av humanínsülín eller tre- oninB3Û-estrar av humaninsulin eller ett salt eller komplex därav, k ä n n e t e c k n a t därav, att en insulinförening med for- meln (1): R1-(1---A---21) 1 (1---B---29)-R2 vari (I) -(l---A---21) 1 å (l---B---29)- betecknar human-des(ThrB3Q}insulindelen, där GlyA1 år ansluten till substituenten betecknad R1 och LysB29 är ansluten till sub- stítuenten betecknad Rz, R2 betecknar en aminosyra eller en pep- tidkedja innehållande högst 36 aminosyror och R1 betecknar väte eller en grupp med den allmänna formeln R5-X-, där X betecknar argínin eller lysin, och R3 betecknar en peptidkedja innehållande högst 35 aminosyror, eller R2 tillsammans med R3 betecknar en pep- tidkedja innehållande högst 35 aminosyror, med det förbehållet att antalet aminosyror som är närvarande i R1 och R2 år mindre än 37, eller ett salt eller komplex därav som kan omvandlas därtill, transpeptidernas med en L-treoninester med formeln (11): rhr(R5)-oR4 (II) vari R4 betecknar en karboxylskyddsgrupp och R5 betecknar väte eller en hydroxylskyddsgrupp eller ett salt därav i en blandning av væten ett med vatten blandbart organiskt lösningsmedel och trypsin, varvid innehållet av vatten i reaktionsblandningen är under 50% (vol/vol) och reaktionstemperaturen är under 50°C och ev. i närvaro av en syra, varefter den bildade treoninB50-estern av humaninsulin om det är nödvändigt spjälkas.

2. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t därav, att koncentrationen av L-treoninester i reaktionsblandníngen ö- verstiger 0,l molar, att reaktionstemperaturen är över reaktions- blandningens fryspunkt, och att reaktionsblandningen innehåller 451 143 20 från 0 till 10 ekvivalenter av en syra per ekvivalent L-treonin- ester.

3. Förfarande enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att insulinföreningen år en förening, som är utvald ur gruppen bestående av svin-, hund-, fínval-, spermacetval- och kanininsulin, svindiarginininsulin, svínsplitproinsulin, svin- desdipeptidproinsulín, svin-, hund-, ap- och humanproinsulin och blandningar därav. Q

4. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e - t e c k n a t därav, att_insulinföreningen är av svinursprung.

5. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t där- av, att som insulinförening användes relativt rått insulin.

6. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e - t e c k n a t därav, att reaktionstemperaturen är under 37°C, företrädesvis under rumstemperatur, och över 0°C.

7. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e - t e c k n a t därav, att innehålletavvatten i reaktionsblandning- en âr mellan 40 och 10% (vol/vol).

8. Förfarande enligt något av krav 1-6, k ä n n e t e c k - n a t därav, att insulinföreningen är svininsulin, att L-treo- ninestern är Thr-0Me eller Thr-0But, att det med vatten blandba- ra organiska lösningsmedlet är N,N-dimetylformamid eller N,N- dimetylacetamid, att reaktíonstemperaturen är ca 37°C, att inne- hållet av vatten i reaktionsblandningen år mellan 41 och 43%, att viktförhållandet mellan trypsin och insulínföreningen är ca 1:8, att molförhållandet mellan L-treoninestern och insulinföre- ningen är ca l:l20, och att per ekvivalent L-treoninester till- satts mellan 1,2 och 1,5 ekvivalenter âttiksyra.

9. Förfarande enligt något av föregående krav för framställ- ning av humaninsulin.