KR880001107B1 - 인체 인슐린 및 그의 유도체의 제조방법 - Google Patents

인체 인슐린 및 그의 유도체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

인체 인슐린 및 그의 유도체의 제조방법
본 발명은 돼지 인슐린 또는 이의 유도체로부터 인쇄 인슐린 또는 이의 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
인체의 인슐린과 돼지의 인슐린의 차이는 인슐린 B 쇄의 B-30에 위치한 카복실 말단 아미노산에 있다. 인체 인슐린의 경우에는, B29의 라이실기 다음에 트레오닌이 위치하는 한편, 돼지 인슐린의 경우에는 알라닌이 B-29의 라이실기 다음에 온다.
인체 인슐린의 총 합성방법[참조 : Markli et al., Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.360,1699-1632(1979)]외에, 여러가지 반합성방법으로 출발물질인 돼지 인슐린의 알라닌을 트레오닌으로 치환시킬 수 있게 되었다.
인체 인슐린의 다량 생산을 위한 총합성방법은 너무 비용이 많이 든다.
루텐버그(Ruttenberg, 미합중국 특허 제3,903,068호)와, 오버마이어 및 가이거[참조 : Obermeier et al.,Hoppe-Seyler's Z.physiol.Chem.357, 759-767(1976)]의 반합성방법에서는, 트립신 분해에 의해 수득된 데스 옥타 펩타이드-B 23-30 돼지 인슐린을 펩타이드-화학방법에 의해, 보호된 인체 인슐린 서열 B23-30의 합성 옥타 펩타이드에 연결시킨다. 모든 보호그룹을 분해 제거한후에, 복잡한 정제 단계가 뒤따른다. 인체 인슐린의 수율을 낮다.
효소 공정에 의하여 천연 돼지 인슐린을 인체 인슐린으로 전환시킨면 높은 수율이 얻어진다.
문헌[J.Am.Chem.Soc.101, 751-752)1979)]에는 이노우에 등(Inouye et al.)에 의해, 합성 옥타펩타이드-B23-30(인체)을 사용하여 트립신 촉매법으로 돼지 인슐린 데스 옥타 펩타이드 B23-30을 인체 인슐린으로 전환시키는 공정이 기술되어 있다. 이 반응에 따르는 단점은 루덴버그와 오버마이어의 경우에서와 같이 그의 제조에 상당한 경비가 드는 합성 옥타 펩타이드가 사용되는 점이다.
이 전환공정은 돼지 인슐린의 마지막 아미노산 B30만을 치환시키면 훨씬 경제적이 된다. 미합중국 특허 제3,276,961호에는 본단스즈키 등(Bondanszki et al.)에 의해, 트레오닌 존재하에 트립신 및 카복시펩티다제 A와 같은 효소를 사용하여 동물의 인슐린으로 부터 인체 인슐린을 제조하는 방법이 기술되었다. 그러나, 이 방법은, 기술된 조건하에서 Lys-Ala(B 29-30)뿐만 아니라 인슐린중의 다른 펩타이드 결합이 분해되므로 수행하기가 불가능하다.
문헌[참조 : H.G.Gattner et al. Insulin, ed. D. Bandenburg, A. Wollmer, 1980, proc. 2nd. Interm, Insulin Symposium 1979, pp. 118-123, 또는 K.Moeihara rt al., Nature 280, 412-413(1979)] 및 유럽특허(EP-A) 제0017938호에서는, Des-Ala-B 30 인슐린(돼지)으로 부터 트립신을 사용하여 2-단계 공정에 의해 트레오닌-메틸 에스테르 또는 트레오닌-3급-부틸 에스테르와 연결시켜 상응하는 인체 인슐린 에스테르를 제조하였다. 에스테르 그룹을 수산화나트륨 용액 또는 트리플루오로아세트산으로 처리하여 제거하면, 인체 인슐린이 고수율로 수득된다.
나중의 두 공정에는 출발물질로서 Des-Ala-B30 돼지 인슐린이 사용되었으며, 이는 카복시펩티다제 A(CPA)에 의하여 돼지 인슐린으로부터 수득할 수 있다. CPA는 펩타이드 및 단백질의 카복실이 위치한 중성 및 산성 L-아미노산을 단계적으로 분해한다. 아미노산은 각기 다른 분해 동력학 법칙에 따라 분해된다. 염기성 아미노산의 경우에는, 인슐린-B 쇄의 라이신-B29 또는 알기닌-B 22에서 효소적 분해가 중지된다. 따라서 인슐린 B-쇄의 B30-위치에 있는 알라닌기는 더이상 쇄를 분해시키지 않고 제거할 수 있다.
그러나, CPA분해에서의 단점은 이 효소가 인슐린-A 쇄의 A 21-위치에 있는 C-말단 아미노산 아스파라긴에 대해서도 동시에 작용하는 점이다. CPA의 일반적 분해 조건하에서는, 서로 다른 분해 속도로 인해 약 10 내지 20%의 아스파라긴과 동시에 80 내지 90%의 알라닌이 돼지 인슐린으로부터 제거된다. 그러므로, 이와같은 분해 산물은 반응되지 않은 인슐린외에 Des-Ala-B30-Asn-A21, Des-Ala-B30 및 Des-Asn-A21 인슐린의 혼합물을 함유한다.
이.더블유.슈미트 등[E.W.Schumitt et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.359, 799-802(1978)참조]은 Des-Ala-B30-des-Asn-A21 인슐린의 생성을 NH4 +-함유 완충제에 의해 5 내지 10%미만으로 줄이는 데 성공하였다. 그러나, 컬럼 크로마토그라피로 정제했음에도 불구하고, 이렇게 하여 제조된 인체 인슐린은 여전히 명백한 면역학적 반응을 야기시킨다는 사실을 배제할 수는 없었다.
본 발명에 이르러, CPA분해는 피하면서 트립신을 사용하여 1단계로 돼지 인슐린을 인체 에스테르로 전환시킬 수 있는 반합성 공정이 발견하였다. 이 에스테르로 부터 통상의 방법으로 인체 인슐린이 수득된다. 1단계 반응의 총 수율은 50 내지 65%이다. 반응 조작이 현전히 간소화된 외에, 본 발명의 방법의 장점은 상기에서 언급된 불순물을 포함하지 않고 따라서 면역학적으로 문제가 되는 경우까지도 투여가 적합한 인체 인슐린을 수득하는데에 있다.
본 발명의 목적은 돼지 인슐린 또는 이의 유도체를 트립신 또는 트립신-양 효소의 존재하에 그의 등전점(isoelectric poinr)이하의 pH에서 유리 아미노 그룹을 함유하는 과량의 트레오닌 에스테르 또는 이의 유도체 중 하나의 반응시킴을 특징으로 하여, 돼지 인슐린 또는 이의 유도체로부터 인체 인슐린 또는 이의 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명에 따르는 반응에 적합한 출발물질은 본래의 돼지 인슐린, 및 이의 유리 작용기에 보호그룹을 도입하거나 개개의 아미노산을 치환시키거나 분해시켜 수득할 수 있는 돼지 인슐린의 유도체이다. 돼지 인슐린의 유도체를 사용할때는 상응하는 보호그룹 또는 서열을 함유하는 인체 인슐린이 제조된다. 본 발명의 반응에 적용될 바람직한 돼지 인슐린 유도체는 상응하는 Des-PheB1 돼지 인슐린이며, 이는 Des-PheB1 인체 인슐린 으로 전환된다.
돼지 인슐린의 바람직한 유도체는 NB1-위치에 보호기를 갖는 것이다. 이 위치에서의 바람직한 유도체는 NB1-위치에 보호기를 갖는 것이다. 이 위치에서의 바람직한 보호기는 특히 t-부틸옥시카보닐-(Boc) 또는 디메톡시페닐-프로필옥시카보닐-(DOZ)-기이다. 기타 보호기는 문헌[참조 : E.W"unsch, Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Vol.XV/1, Stuttgart 1974]에 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 반응은 출발 인슐린 또는 이의 유도체의 등전점 이하의 pH에서 수행한다. 돼지 인슈린의 등전점은 pH5.4이므로, 돼지 인슐린을 출발물질로 사용할때는 pH5.4이하에서 조작하는 것이 바람직하다. 한편, 인슐린 및 효소 활성도는 강한 산성매질중에서 안정성이 저해되므로 낮은 pH에서의 조작은 제한되어야 한다. 그러므로, 반응은 pH 4 내지 6에서 수행하여야 한다.
인슐린 또는 인슐린 유도체와 트레오닌 에스테르 아세테이트와의 반응은 약한 유기산, 바람직하게는 아세트산에 의해 pH 약 5의 약산성으로 조정된 수성 매질중에서 수행하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다. 이러한 특별한 변형방법의 장점은 무엇보다도 수성 유기 용매중에서의 조작에 비해 높은 수율이 얻어지는데 있다. 또 다른 잇점은 유기 용매를 절약할 수 있으며, 또 유기 용매를 분리할 필요가 없기 때문에 반응 혼합물의 후처리 조작이 용이한 점이다.
반응은 실온에서 이루어질 수 있으나, 반응을 가속시키기 위해서는 약간 가온된 온도가 바람직하다. 한편, 40℃의 온도를 초과해서는 안되며, 냉각시키면서 하는 조작은 어떤 잇점도 제공하지 않는다.
트립신 외에, 본 발명에 적합한 효소는 트립신과 유사한 것으로 문헌에 알려진 효소, 즉 염기성 아미노산의 말단 카복실에서 특정 펩타이드 결합을 분해제거하는 효소이다. 사용된 효소의 양은 그렇게 중요한 것은 아니나, 효소에 대한 돼지 인슐린의 중량비는 1 : 1 내지 100 : 1에 이르는 범위일 수 있다. 그러나, 약 10 : 1의 중량비가 특히 바람직하다.
적합한 트레오닌 에스테르느 모두 알려진 L-트레오닌 에스테르, 예를 들면 L-트레오닌 -3급-부틸 에스테르, L-트레오닌-O-3급-부틸 -3급-부틸 에스테르 또는 L-트레오닌 -메틸 에스테르들이다. 본 발명에 따르는 트레오닌 에스테르 유동체는 트레오닌의 OH 작용기에 보호기, 특히 에테르 보호기를 함유하는 것이다.
트레오닌 에스테르는 인슐린에 대해, 인슐린의 약 10-내지 100-배 몰량의 과량으로 사용되어야 한다.
본 발명의 반응으로 먼저 인체 인슐린의 B30 에스테르가 수득되고, 경우에 따라 이는 공지 방법에 따라서 에스테르 그룹을 분해제거하여 유리 인체 인슐린으로 전환시킬 수 있다.
이 에스테르는, 유리 인슐린으로 전환시키기 전에 예를들어 컬럼 크로마토그라피 방법에 따라 정제하는 것이 유리하다. 따라서, 수득된 인슐린은 통상의 투여용 제제로서 당뇨병 치료에 사용될 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명한다.
[실시예 1]
120mg의 돼지 인슐린 및 231mg의 Thr-(O-tBu)-TbU를 pH4.0의 0.1M 피리딘-아세테이트 완충액 2ml에 현탁시키고 3ml의 DMF를 가하여 용해시킨다. 용액의 pH를 검사하고 아세트산 또는 피리딘을 사용하여 새로이 pH4.0으로 임의 조정한다. 5mg의 TPCK-트립신을 30℃에서 투명한 용액에 가한다. 각기 4시간의 간격을 두고 5mg의 TPCK-트립신을 2회 더 가한다. 반응매질을 16시간동안 35℃에서 교반시킨다. 용액을 1NHCl을 사용하여 pH2 내지 3으로 산성화시키고 1ml의 에탄올 및 5ml의 에테르를 가하여 침전시키다. 침전물을 원심 분리시키고 에테르로 연마한다. 분말상 잔류물을 오버마이어 등의 방법에 따라 세파덱스(R)LH20상에서 분배 크로마토그라피시켜 정제한다. 따라서 분리된 인체 인슐린 에스테르를 함유하는 획분을 실온에서 진공 농축시키고 아세톤/에테르도 침전시킨다. 반응되지 않은 돼지 인슐린은 회수하여 반합성방법에 재사용할 수 있다.
생성된 침전물을 회수하여 건조시킨다.
수율 : 81mg
보호 그룹을 분해제거하기 위해, 생성물을 단시간동안 40℃로 가열시키면서 아니솔로 포화된 6N Hcl 3ml에 용해시킨다. 계속해서, 냉각시키고 0℃에서 10%수산화나트륨 용액을 사용하여 pH2 내지 3으로 저정한다. 30ml의 아세톤을 가하면 인체 인슈린이 침전된다. 침전물을 원심분리시키고 감압하에서 건조시킨다.
수율 : 인체 인슐린 77g.
수득된 인체 인슐린은, 토끼에 대한 혈당 저하시험에서 돼지 인슐린에 비해 26 I.U./mg의 만족스런 생물학적 활성도를 나타냈다.
아미노산 분석은 인체 인슐린의 이론치와 상응하였다 :
Figure kpo00001
[실시예 2]
120mg의 돼지 인슐린과 133mg의 트레오닌메틸 에스테르를 실시예 1에 따라 인체 인슐린 에스테르로 전환시키고, 정제한다. 수득된 생성물(73mg)을 0℃에서 0.1ml의 0.1N NaOH와 함께 15분간 교반한다. 계속하여, 0.5ml의 0.1N HCl로 중화시키고 투석한 후 동결건조시킨다. 생성된 인체 인슐린(68mg)은 충분한 생물학적 활성도를 지니며 아미노산 분석은 이론치와 상응한다.
[실시예 3]
120mg의 돼지 인슐린 및 175mg의 트레오닌-3급 부틸 에스테르를 실시예 1에 따라 반응시키고 정제한다. 수율 : 인체 인슐린-3급-부틸 에스테르 76mg. 이 생성물을 1ml의 트리플루오로 아세트산 및 0.05ml의 아니솔에 용해시키고 실온에서 60분간 교반시킨다. 보호되지 않은 인체 인슐린 생성물은 8ml의 에테르를 가하여 침전시키고 원심분리한다. 잔류물을 물에 용해시키고 투석하여 동결건조시킨다. 수율 : 충분한 생물학적 활성도 및 정확한 아미노산 저성을 지닌 인체 인슐린 71mg
[실시예 4]
115mg의 Des-PheB1돼지 인슐린을 실시예 1의 방법에 따라 231mg의 Thr-(tBu)-O-tBu와 반응시켜 정제한다. 수율 : Des-PheB1인체 인슐린 B 30-디-3급-부틸 에스테르 75mg, 3급-부틸 그룹을 분해 제거한 후에, 실시예 1에 따라 분리하여 유리 Des-PheB1 인체 인슐린 70mg을 수득한다.
생물학적 활성도 ; 26 I.U./mg.
아미노산 분석 :
[실시예 5]
120mg의 돼지 인슐린을 실시예 1에 따라 231mg의 Thr-(tBu)-O-tBu와 반응시킨다. 트립신 대신에 아가로즈 겔과 결합된 트립신 0.50ml를 사용한다. 트립신 아가로즈를 여과 제거한후에, 용액을 실시예 1에 기술된 바와같이 후처리한다.
인체 인슐린의 수율 : 61mg.
[실시예 6]
5g의 돼지 인슐린 및 30g의 Thr-(tBu)-O-tBu-아세테이트를 20ml의 물에 용해시키고 아세트산을 사용하여 pH 5.0내지 5.2로 저정한다. 2ml의 물에 용해시킨 400mg의 트립신을 가하여 반응물을 용해시킨다. 반응과정을 아세테이트 필름 전기영동법으로 관찰한다. 사용된 돼지 인슐이 최대한 전환 (약 90%)되면 200ml의 메탄옥과 50ml의 디-이소프로필 에티르를 가하여 조 반응 생성물을 침전시킨다. 원심분리 및 건조후에, 조물질 5.1g이 수득되는데, 이를 HPLC 분석하면 인체 인슐린-B30-tBu2가 90%함유되어 있는 것으로 나타난다.
[실시예 7]
37.5% 아세트산 수용액 30ml에 5g의 NαB1-BOC-돼지 인슐린 및 24g의 Thr(tBu) OtBu를 차례로 용해시키고 물 2ml중의 트립신 400mg을 실시예 6에 기술된 바와같이 가한다. 반응을 실시예 6에서와 같이 진행시키고 최대로 전환되면 메탄올/디-이소프로필 에테르로 침전시켜 반응을 중지시킨다. 분리 및 건조후에 5.0g의 조 물질이 수득되며 이를 HPLC 분석하면 NαB1-BOC 인체 인슐린 -B30-tBu2가 87%함유되어 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 8]
물 45ml에 5ml의 아세트산을 가하면서 10g의 돼지 인슐린을 용해시킨다. 33g의 Thr(tBu)-O-tBu-아세테이트를 인슐린 용액에 가하고, 5ml의 물중의 트립신 0.8g의 물중의 트립신 0.8g의 용액을 교반하면서 투명한 용액에 가한다. 실온에서 16시간동안 방치시킨후 메탄올/디-이소프로판올의 혼합물(500ml, 4 : 1=V/V)을 사용하여 반응 혼합물을 침전시켜 반응을 중지시키고 실시예 1에 기술된 바와같이 후처리한다. 인체 인술린 에스테의 수율 : 4.0g.
[실시예 9]
물 40ml에 5ml의 아세트산을 가하면서 10g의 돼지 인슐린돠 60g의 Thr(tBu)-O-tBu-아세테이트를 용해시킨다. 2ml의 물에 용해시킨 0.8g의 트립신을 반응 혼합물에 가한다. 실온에서 16시간후에 실시예 8에 기술된 바와같이 반응을 중지시키고 반응 혼합물을 통상의 방법으로 후 처리한다. 정제후의 수율 : 인체 인슐린 에스테르 4.1g.
[실시예 10]
120mg의 돼지 인슐린을 380mg의 Thr(tBu)-O-tBu-아세테이트와 함께 0.5ml의 물 및 0.04ml의 아세트산에 용해시킨다. 10단위의 라이실엔도펩티다제-Lys-Cl(5mg의 단백질)을 용액에 가한다. 실온에서 16시간후에, 반응 혼합물을 실시예 8에서와 같이 후 처리하여 정제한다. 인체 인슐린 에스테르의 수율 : 61mg.
[실시예 11]
1.35kg의 Thr(tBu)-O-tBu를 1ℓ의 석유 에테르에 용해시키고 얼음으로 냉각시킨다. 340ml의 아세트산을 교반하면서 용액에 가하여 결정화가 완결될 때까지 용액을 0℃에서 냉각시킨다. 결정화된 Thr(tBu)-O-tBu-아세테이트를 여과해내어 석유 에테르 (0℃)로 세척하고 진공중에서 건조시킨다. Thr(tBu)-O-tBu-아세테이트의 수율 : 1.44kg(융점 : 58 내지 60℃).

Claims (14)

  1. 돼지 인슐린 또는 그의 유도체를 그의 등전점이하의 pH에서 트립신 또는 트립신-양 효소의 존재하에 과량의 트레오닌 에스테르 또는 그의 유도체중 하나와 반응시킨후, 임의로 존재하는 보호그룹을 분해제거시킴을 특징으로 하여, 인체 인슐린 또는 그의 유도체를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 반응을 유기 용매의 부재하에 수행하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, Des-PheB1 돼지 인슐린으로부터 Des-PheB1인체 인슐린을 제조하는 방법
  4. 제1항에 있어서, pH4 내지 6에서 조작하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 돼지 인슐린의 유도체가 NαB1-위치에 보호 그룹을 갖는 돼지 인슐린인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 보호 그룹이 BOC 또는 DDZ인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 인체 인슐린-Thr B30-(tBu0-O-tBu를 제조하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, Des-PheB1-인체 인슐린-Thr B30-(tBu)-O-tBu를 제조하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, NαB1위치가 NH2-보호그룹으로 보호된 인체 인슐린 Thr B30(tBu)0tBu를 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, NαB1-BOC-인체 인슐린-Thr B30-(tBu)-O-tBu를 제조하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, NαB1-DDZ-인체 인슐린-Thr B30-(tBu)O-tBu를 제조하는 방법.
  12. 인체 인슐린-Thr B30(tBu)-O-tBu의 보호그룹을 제거하는인체 인슐린의 제조방법.
  13. NαB1-보호된 인슐린-Thr B30-(tBu)-O-tBu의 보호그룹을 제거하는 인체 인슐린의 제조방법.
  14. Des-PheB1-인체 인슐린-Thr B30-(tBu)-OtBu의 보호그룹을 제거하는 Des-PheB1-인체 인슐린의 제조방법.
KR8200188A 1981-01-17 1982-01-18 인체 인슐린 및 그의 유도체의 제조방법 KR880001107B1 (ko)

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