FI79853C - Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. - Google Patents

Description

1 79353

Menetelmä insuliinijohdannaisten valmistamiseksi

Insuliinia muodostuu in vivo esiasteen, preproinsu-liinin muodossa. Esijakso muodostaa signaalialueen memb-5 raanien kanssa tapahtuvaa vuorovaikutusta varten ja pilkkoutuu vielä synteesin yhteydessä tai välittömästi sen jälkeen. Proinsuliini sitävastoin on molekyyli, jota on todettavissa vähäisinä määrinä haimauutteista. Muuttuessaan insuliiniksi C-peptidi pilkkoutuu spesifisen entsyy-10 misysteemin vaikutuksesta.

Jaksot Arg-Arg, asemissa B31 ja B32 (B30 on B-ket-jun myöhempi C-pääteasema), ja Lys-Arg, asemissa 62 (tai AI) ja 63 (tai AO), jotka sijaitsevat N-terminaalisesta myöhempään A-ketjuun nähden, muodostavat katkaisukohdat 15 pilkkomisentsyymeille. Proinsuliini voidaan muuttaa kätevästi insuliiniksi in vitro, entsyymeillä, joilla on tryp-siinin ja karboksipeptidaasi B:n aktiivisuus [Kemmler et ai., JBC 246 (1971), ss. 6786 - 6791]. Pelkästään tryp-siinillä tai trypsiinin kaltaisilla entsyymeillä suoritet-20 tu proteolyysi johtaa sitä vastoin edullisesti sellaisiin välituotteisiin, jotka sisältävät B-ketjun C-pääteasemassa asemissa 31 ja 32 yhtä suuren arginiinin tai molemmat ar-giniinit, sellaisten insuliinien hajoamistuotteiden ohella, jotka ovat muodostuneet pilkkoutumalla B-ketjun päästä 25 alkaen lysiini-(B29)-insuliiniksi [= des-alaniini-(B39)-sikainsuliini, des-treoniini-(B30)-ihmisinsuliini] tai argiini-(B22)-insuliiniksi [= desoktapeptidi-insuliini] [Chance, Proc. VII Congress of International Diabetes Fed. (1970); D. E. Steiner et ai., Fed. Proc. 33 (1974), ss.

30 2105 - 2115; J. Markussen, Proc. Symp. on Proinsulin, In sulin, C-peptides, Tokushima (1978)].

Preproinsuliineja voidaan nykyään saada geeniteknologisin menetelmin prokaryoottisista soluista, erityisesti E. coli'sta. Erityisen kiinnostavia ovat tällöin sel-35 laiset kannat, jotka tuottavat ihmisinsuliinijakson sisäl- 2 79853 täviä proinsuliineja. Plasmideja modifioimalla, erityisesti muuntamalla proinsuliinijakson asemia 31 - 33 ja 61 -63 siten, että insuliinin tai insuliinijohdannaisten vapauttamiseksi entsymaattisesti tai kemiallisesti pilkko-5 maila tarvittavat kohdat säilyvät, on lisäksi mahdollista rakentaa haluttuja uusia jakson osia. Niihin kuuluvat esimerkiksi sellaiset johdannaiset, jotka sisältävät asemissa 31 ja 32 toisen tai kummankin arginiinin tilalla jonkun muun emäksisen aminohapon, ts. lysiinin tai histidiinin, 10 niin että pilkkomiseen voidaan käyttää spesifisyydeltään trypsiinin kaltaisia entsyymejä. Ketjuun voidaan kuitenkin liittää myös jaksoja, jotka ovat muiden tunnettujen pro-teolyyttisten entsyymien substraatteja, tai jaksoja, joiden kohdalla pilkkominen on mahdollista kemiallisin mene-15 telmin. Tämän keksinnön edellytyksenä on ainoastaan se, että proinsuliinianalogia sopivalla tavalla pilkottaessa muodostuu insuliinijohdannainen, joka ei sisällä yhtään ylimääräistä aminohappoa liittyneenä A-ketjun N-päätease-maan ja jossa B-ketjun C-pääteasemaan liittyneistä (ase-20 missä 31 - 33 sijaitsevista) enintään kolmesta ylimääräisestä aminohaposta vähintään yksi on emäksinen aminohappo.

Sellaisia insuliinijohdannaisia, jotka sisältävät B-ketjun C-pääteasemassa ylimääräisiä positiivisia varauksia, menetelmiä niiden valmistamiseksi, niitä sisältäviä 25 aineita sekä niiden käyttöä käsittelevät DE-patenttihake-mukset P 3 326 472,4 ja P 3 326 473,2. DE-patenttihakemus P 3 327 709,5 koskee menetelmää niiden kiteyttämiseksi.

Nyt on todettu, että näitä insuliinijohdannaisia voidaan valmistaa erityisen kätevästi vastaavista väli-30 tuotteista proinsuliineista, preproinsuliineista tai sopivista analogeista toteuttamalla proteolyyttinen hajotus tai kemiallinen pilkkominen halutun johdannaisen isoelekt-risen pisteen läheisyydessä yhden tai useamman fenolin läsnäollessa. Tällä tavalla saavutetaan paitsi se, että 35 lopputuote saostuu reaktioliuoksesta ja reaktiotasapaino 3 79353 siirtyy siten haluttuun suuntaan, myös se, että esitetyissä olosuhteissa syntyy suoraan väliaineessa teräväreunai-sia prismamaisia kiteitä, jotka ovat pienen pintansa vuoksi paljon vähemmän alttiita jatkoreaktiolle kuin esimer-5 kiksi amorfiset sakat. Siten on esimerkiksi hämmästyttävää, että insuliinijohdannainen ArgB31-OH on kiteisessä muodossa erityisen stabiili trypsiinin vaikutuksesta tapahtuvaa edelleenhajotusta vastaan.

Tästä syystä keksintö koskee menetelmää insuliini-10 johdannaisten, joilla on kaava I

AI - S - S—| A21 I--

H- JGly A-ketju Asn -OH

15 ' | i

SS I

I i S s B2 B29 20 --- Y- Vai B-ketju -R30-x„ jossa R30 merkitsee aminohappotähdettä Ala, Thr tai Ser, 25 X merkitsee samanlaisia tai erilaisia neutraaleja tai emäksisiä aminohappotähteitä, joista vähintään yksi on emäksisen aminohapon tähde, Y on Phe tai H, ja n on 1, 2 tai 3, 30 valmistamiseksi pilkkomalla välituotteita proinsuliinia, preproinsuliinia tai niiden analogeja, jolle menetelmälle on tunnusomaista se, että pilkkomisreaktio toteutetaan kaavan I mukaisten insuliinijohdannaisten isoelektrisen pisteen läheisyydessä yhden tai useamman fenolin läsnäol-35 lessa.

4 79353 Y on edullisesti Phe.

Geneettisesti koodattavia L-aminohappoja ovat seu-raavat: Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp ja Pro (al-5 leviivatut ovat neutraaleja aminohappoja).

Neutraalilla aminohapolla tarkoitetaan siten erityisesti aminohappoja Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Met, Phe tai Pro; emäksisellä aminohapolla tarkoitetaan erityisesti aminohappoja Arg, Lys tai His.

10 Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan valmistaa esimerkiksi seuraavat insuliinijohdannaiset (keksinnön rajoittumatta näihin):

Ihmisinsuliini-ArgB 3 1 -OH Sikainsuliini-ArgB 3 1 -OH 15 Nautainsuliini-ArgB 3 1 -OH

Ihmisinsuliini-ArgB 3'ArgB 3 2-OH Sikainsuliini-ArgB 31-ArgB 3 2-OH Nautainsuliini-ArgB 31 -ArgB 3 2-OH Ihmisinsuliini-LysB 31 -OH 20 Ihmisinsuliini-AlaB 31 -LysB 3 2-OH Ihmisinsuliini-ValB 31 -ArgB 3 2-OH Ihmisinsuliini-LeuB 31 -ArgB 3 2-ArgB 3 3-OH Sikainsuliini-ValB 31 -HisB 3 2-Arg® 3 3-OH Sikainsuliini-LeuB 31-ValB 3 2-Arg®3 3-OH 25 Ihmisinsuliini-Arg® 3 1 -Phe® 3 2-OH

0

Ihmisinsuliini-Arg-NH η— O3

Keksinnön mukainen menetelmä toteutetaan edullises-30 ti pH-alueella, joka ulottuu yhden pH-yksikön isoelektri-sen pisteen alapuolelta yhden p-yksikön tämän pisteen yläpuolelle, fenolin tai useamman fenolin seoksen ollessa mukana. pH:n säätämiseen voidaan käyttää soveltuvia puskureita (kuten asetaatti-, sitraatti- tai fosfaattipuskurei-35 ta).

li 5 79853

Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti reaktio suoritetaan edullisesti siten, että lähtöaineen pitoisuus on 0,5 - 30 mg/ml, edullisesti 1-10 mg/ml, ja reaktionopeus on merkityksettömän vähän suurempi tai sama kuin ki-5 teiden muodostumisnopeus. Näin saadaan aikaan se, että syntyy paljon kidealkioita eikä keskimääräinen kidekoko ylitä 30 pm. Reaktionopeutta voidaan kontrolloida hyvin tarkasti halutulla tavalla ennen kaikkea entsyymikatalyy-tin yhteydessä.

10 Esitettyä menetelmää käytettäessä on siis mahdol lista ohjata reaktiota paremmin halutun tuotteen suuntaan ja siten parantaa saantoa huomattavasti. Tuote saostuu helposti jatkokäsiteltävässä muodossa, josta pilkkomisrea-genssiylimäärä, esimerkiksi proteaasit, voidaan jokseenkin 15 täydellisesti poistaa yksinkertaisella pesulla.

Pilkkomisreagenssiksi valitaan esimerkiksi proteaa-si, jonka spesifisyys on sellainen, että haluttu ryhmä Xn säilyy, kun taas A-ketju sisältää tapahtuneen pilkkoutumisen jälkeen vapaan N-pääteaseman H-Gly. Jos proinsuliini-20 jakson asianmukaisiin kohtiin liitetään metioniineja, pilkkominen voi tapahtua bromisyäänillä, jolloin C-ter-minaalinen homoseriinilaktoniryhmä säilyy.

Kaavan I mukaiset insuliinijohdannaiset ja näitä sisältävät farmaseuttiset aineet merkitsevät täysin uusia 25 hidastusperiaatteita, jotka voidaan saada toimiviksi ilman depot-apuaineita, kuten sinkkiä tai protamiinisulfaattia. Depot-vaikutus perustuu proteiinijohdannaisen vaikealiu-koisuuteen isoelektrisessä pisteessä. Sen uudelleen liukeneminen fysiologisissa olosuhteissa on mahdollista saa-30 vuttaa lohkaisemalla ylimääräiset emäksiset ryhmät pois, joka lohkaisu tapahtuu johdannaisesta riippuen trypsiinin tai trypsiinin kaltaisen entsyymin ja/tai karboksipepti-daasi B:n tai karboksipeptidaasi B:n kaltaisen entsyymin ja/tai esteraasin vaikutuksesta.

6 79353

Esimerkki 1

Siasta peräisin olevan desnonapeptidi-proinsuliinin hajottaminen trypsiinillä ilman fenolin mukanaoloa ja fenolin ollessa mukana.

5 350 mg desnonapeptidi-sikaproinsuliinia liuotettiin happoon ja lisättiin 215 ml:aan 0,1 M tris-puskuria (pH = 7,5) joka sisälsi 200^ug trypsiiniä (nauta). Muutaman minuutin sisällä tapahtui sameneminen. Reaktion päätyttyä (noin 1 h:n kuluttua) lisättiin 100/Ug trypsiini-10 inhibiittoria, sentrifugoitiin, ja valkoinen sakka liuotettiin 20 ml:aan 0,05 M ammoniumasetaattipuskuria (pH 4,0), joka sisälsi 0,1 % soveltuvaa detergenttiä, ja puhdistettiin kationinvaihtimessa käyttäen keittosuolagradienttia O->1 M.

B 31 B 3 2

Saatiin eristetyksi: 96 mg (36,6 %) insuliini-Arg -Arg B 31 B 3 2 15 OH puhtaana ja 72 mg (27,4 %) insuliini-Arg -Arg -OH:n B 31 ja insuliini-Arg -OH:n seosta sekä ainakin kahta muuta epäpuhtautta /Isoelektrisen pisteen määrityksen ja suur-painenestekromatografiän (HPLC) mukaan?· Reaktioseoksen supernatantista eristettiin 56 mg (noin 21 %) seosta, 20 joka sisälsi 14,9 % lähtöainetta, 8,7 % di- ja monoarginii-nijohdannaista, 49,3 % des-alaniini(B30)-insuliinia ja 12,2 % desoktapeptidi-insuliinia joidenkin pienempien tunnistamattomien huipujen ohella (HPLC).

Rinnakkaisvalmistuksessa 100 mg desnonapeptidi- 25 sikaproinsuliinia liuotettiin happoon ja lisättiin 50 ml:aan 0,1 M tri-puskuria (pH = 7,5), joka sisälsi 2,5 mg/ml m-kre-solia ja 50^ug trypsiiniä (nauta). Noin 15 minuutin kuluttua muodostui kiteinen saostuma, joka sisälsi teräväreunai-sia, kooltaan noin 5-15^um olevia prismoja. Reaktio kas-30 keytettiin kuvatulla tavalla 3 h:n kuluttua. Tuotteiden eristäminen tapahtui kuten edellä.

D O 1 r> O O

Saannot: 56 mg (74,7 %) insuliini-Arg -Arg -OH

11 mg (14,7 %) di- ja monoarginiinijohdannaisen seosta.

35 Supernatantti sisältää vain pienen määrän insuliini- tyyppisiä aineita.

il 7 79853

Esimerkki 2 g 21

Ihmisinsuliini-Arg -OH:n valmistaminen E.colissa ilmennetystä apinan preproinsuliinista trypsiinillä hajottaen.

10 mg apinan preproinsuliinia liuotetaan happoon ja

5 lisätään 5 ml:aan 0,1 M fosfaattipuskuria, joka on 0,5 M

keittosuolan suhteen (pH =6,8) ja joka sisältää 1,5 mg/ml fenolia ja 0,7 mg/ml m-kresolia sekä 25^ug trypsiiniä (nauta). Haluttu tuote saostuu reaktioliuoksesta terävä- reunaisina, kooltaan noin 5-20 ,um olevina prismoina. Kiteet 10 sisältävät 92 % insuliinia ja insuliinijohdannaisia, josta B31 määrästä HPLC:n mukaan 78 % on ihmisinsuliini-Arg -OH ja B31 B32 14 % ihmisinsuliini-Arg -Arg -OH. Reaktioseoksen kirkkaasta supernatantista todetaan alle 5 % insuliinityyppistä proteiinia. Annettaessa kidesuspension seisoa huoneen lämpö-15 tilassa trypsiinin läsnä ollessa vielä 2 lisävuorokautta vielä peräti 87 % teoreettisesta insuliini- ja insuliini- johdannaismäärästä on kiteisessä olomuodossa, josta määräs- B31 tä 79 % on ihmisinsuliini-Arg -Oh ja 11 % ihmisinsuliini- , B31 . B32

Arg -Arg -OH.

Claims (7)

8 79853

1. Menetelmä insuliinijohdannaisten, joilla on kaava I 5 AI | S — S —j A21 H- Gly A-ketju Asn -OH I I s s I I i

10 SS B2_|_|_B29 Y- Vai B-ketju_] -R30-Xn jossa

15 R30 merkitsee aminohappotähdettä Ala, Thr tai Ser, X merkitsee samanlaisia tai erilaisia neutraaleja ja/tai emäksisiä aminohappotähteitä, joista vähintään yksi on emäksisen aminohapon tähde, Y on Phe tai H, ja 20 n on 1, 2 tai 3, valmistamiseksi pilkkomalla välituotteita proinsu-liinia, preproinsuliinia tai niiden analogeja, tunnettu siitä, että pilkkomisreaktio toteutetaan kaavan I mukaisten insuliinijohdannaisten isoelektrisen pis-25 teen läheisyydessä yhden tai useamman fenolin läsnäollessa .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavassa I Y on Phe.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että kaavan I mukainen insuliini- johdannainen sisältää ihmisinsuliini-, sikainsuliini- tai nautainsuliinisekvenssin.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktiono- 35 peus valitaan sellaiseksi, että reaktiotuote saostuu edullisesti kooltaan korkeintaan 30 μιη olevina kiteinä. 9 79353

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktion alussa välituotteen, proinsuliinin tai sen analogin pitoisuus reaktioväliaineessa on 0,5 - 30 mg/ml.

6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 -5 mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktioväli-aineena on vettä sisältävä, sopivalla tavalla puskuroitu väliaine.

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukai-10 nen menetelmä, tunnettu siitä, että pilkkomis- reagenssina on proteaasi, jonka spesifisyys on sellainen, että haluttu ryhmä X säilyy, kun taas A-ketju sisältää tapahtuneen pilkkoutumisen jälkeen vapaan N-pääteaseman. 10 79853