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Verfahren zur Herstellung von kristallinem Insulin Es sind -injizierbare
Insulinzube_reitüngen bekannt, deren protrahierte Wirkung ausschließlich oder- hauptsächlich
auf der Gegenwart von Insulinkristallen". in wäßriger Suspension beruht. Es ist
auch bekannt, daß die protahierte Wirkung solcher wäßriger Insulinkristallsuspensionen
in einem gewissen Grade von der Größe der suspendierten Insulinkristalle abhängt.
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Bei den bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von kristallisiertem
Insulin wurden bisher keine Maßnahmen getroffen, die Größe der anfallenden Kristalle
zu beeinflussen. Es erschien auch zwecklos, eine solche Beeinflussung vorzunehtuen,
weil bisher die Kristalle als solche nicht als Bestandteil von Insulinzubereitungen
für den klinischen Gebrauch verwendet wurden. Erst nach dem Erscheinen von klinisch
brauchbaren Insulinkristallsuspensionen, deren verlängerte Wirkung einigermaßen
von der Größe der Insulinkristalle abhängig ist, entstand das Problem, wie Kristalle
von vorzugsweise gleicher Größe zu'.erhalten sind oder wie der Hauptgewichtsanteil
der Kristalle in bezug auf die Größe innerhalb bestimmter gewisser Grenzen zu halten
ist.
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Die Erfindung beschäftigt sich mit der Lösung des obenerwähnten Problems.
Gegenstand der Erfindung
ist es deshalb, Insulinkristalle von vorzugsweise
gleicher Größe herzustellen. Ein weiteres Ziel ist es, Insulinkristalle zu gewinnen,
die als Keimmaterial zur Herstellung von größeren-Kristallen von vorzugsweise gleicher
Größe geeignet sind.
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Der Erfindung liegt die Beobachtung zugrunde, daß der Kristallisationsprozeß
hinsichtlich der Größe der anfallenden Kristalle und der Menge von Kristallen ungefähr
gleicher Größe durch die Gegenwart von gefriergetrocknetem Insulin beeinflußt wird.
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Die Herstellung von kristallisiertem.Insulin ist allgemein bekannt
und bereits mehrfach beschrieben worden. Obgleich die Kristallisationsmethoden etwas
voneinander abweichen, sind sie doch auf demselben Prinzip aufgebaut, d. h., das
Insulin wird aus einer wäßrigen Lösung durch Änderung des px-Wertes des Mediums
bis in die Nähe des. isoelektrischen Punktes des Insulins zur Kristallisation gebracht.
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Der Kristallisationsvorgang wird bekanntlich durch die Anwesenheit
eines die Kristallisation fördernden Metalls, z. B. Zink, Kobalt, Nickel, Cadmium,
Kupfer, Mangan oder Eisen, verbessert; .am meisten wird Zink in Form eines wasserlöslichen
Salzes verwendet. Wenn das Insulin selbst kein solches. Metall in genügender Menge
enthält, so muß zu dem wäß@rigen Kristallisationsmedium ein entsprechender Zusatz
gemacht werden. Die erforderliche Menge des kristallisationsfördernden Metalls liegt
bei etwa o,4q/o des Insulingewichtes. Bei der praktischen Durchführung der Kristallisation
wird gewöhnlich ein zwei- bis fünfmal so hoher Betrag verwendet.
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Der pH-Wert für die Kristallisation liegt normalerweise zwischen 5,4
und 6,2. Zur Einstellung dieses Wertces werden im allgemeinen ein oder mehrere Pufferstoffe
gebraucht. Beispiele derartiger Pufferstoffe sind. Acetat-, Borat-, Citrat-, Phosphat-,
Diäthylbarbiturat- und Maleatpuffer.
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Es ist allgemein üblich, eine saure wäßrige Insulinlösung mit dem
notwendigen Metallgehalt und, falls erforderlich, mit Pufferstoffen herzustellen
und diese Lösung auf den für eine Kristallisation notwendigen p11-Wert einzustellen.
Man kann auch das Insulin amorph in einer wäßrigen Lösung ohne den notwendigen Metallgehalt
ausfällen und durch Hinzufügen der notwendigen Menge an Metallen in die kristalline
Form überführen, beispielsweise in Form einer wäßrigen Metallsalzlösung. Schließlich
ist es aber auch möglich, basische Insulinlösungen zu verwenden und durch Zusatz
von sauren Stoffen den erforderlichen pH-Wert zu erreichen.
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Die Erfindung bezieht sich auf einverfahren der obenerwähnten Art,
wobei das charakteristische Merkmal der Erfindung darin besteht, daß die Kristallisation
in Gegenwart von 'einem Insulin vor sich geht, das der Gefriertrocknung unterworfen
wurde.
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Das gefriergetrocknete Insulin kann dabei dem insulimhaltigen Kristallisationsmedium
nach dessen Einstellung auf den für die Kristallisation geeigneten p),-Wert zugesetzt
werden. Die Kristallbildung darf jedoch noch nicht begonnen haben. In einer weiteren
Ausgestaltung des Verfahrens wird das insulinhaltige Kristallisationsmedium .durch
Mischen einer sauren wäßrigen Insulinlösung und einer basischen Lösung erhalten,
die, wenn es erforderlich ist, kristallisationsfördernde Metalle und Pufferstoffe
enthält, um den für die Kristallisation erforderlichen pn-Wert zu stabilisieren.
Das gefriergetrocknete Insulin wird der basischen Lösung vor dem Mischprozeß zugesetzt.
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Die Kristallisation erfolgt im allgemeinen bei einem pH Bereich von
5 bis 7, zweckmäßig jedoch zwischen 6,2 und 6,5. Als Ausgangsmaterial für das der
Gefriertrocknung zu unterwerfende Insulin wird vorzugsweise ein kristallines Insulin
oder ein Insulin von ähnlicher Reinheit verwendet. Die Gefriertrocknung wird in
einer an sich bekannten Weise durchgeführt. Es kann z. B. das in einer verdünnten
Säure oder in einer verdünnten Base gelöste kristalline Insulin der Gefriertrocknung
unterworfen werden, wobei -die Lösung einen pn-Wert von beispielsweise 3 bzw. 7,5
hat. Es kann auch eine Insulinlösung gefriergetrocknet werden, welche derjenigen
des Kristallisationsmediums entspricht, zu dem später das gefriergetrocknete Insulin
hinzugefügt wird. Schließlich ist es auch möglich, eine Lösung von amorphem Insulin
(frei von Metall) der Gefriertrocknung zu unterwerfen. Normalerweise werden klare
Lösungen der Gefriertrocknung unterworfen, es macht aber nichts, wenn ein Teil des
Insulins vor der Gefriertrocknung amorph .ausgefallen ist.
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Es wurde weiterhin gefunden, daß auch die Menge des gefriergetrockneten
Insulins, das dem Kristallisationsmedium zugefügt wird, den Verlauf der Kristallisation
beeinflußt. Es hat sich herausgestellt, daß die Kristalle unter sonst gleichen Umständen
um so kleiner werden, je mehr gefriergetrocknetes Insulin zugesetzt wird. Es ist
deshalb zweckmäßig, das gefriergetrocknete Insulin in einem Gewichtsbetrage zuzufügen,
der einen vorherbestimmten Teil des Gewichtsbetrages des zu kristallisierenden Insulins
.ausmacht.
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Schließlich ist es nicht notwendig, daß die Kristallisationsflüssigkeit
von vornherein Insulin enthält. Die gewünschte Insulinkonzentration in der Kristallisationsflüssigkeit
kann durch das Hinzufügen von gefriergetrocknetem Insulin erreicht werden.
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Erfindungsgemäß weiden Insulinkristalle hergestellt, denen Größe von
etwa 2 bis etwa 7 ,u variiert werden kann. Die Größe ist abhängig von der
Höhe des Zusatzes an gefriergetrocknetem Insulin, der Zusammensetzung desselben
und den Kristallisationsbedingungen.
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Obwohl die nach dem beanspruchten Verfahren hergestellten Kristalle
oder Kristallsuspensionen therapeutische Verwendung finden.können, eignen sie sich
jedoch vorzugsweise als Material zum Animpfen bei der Herstellung größerer Insulinkristalle
von gleichmäßiger Größe. Hierfür sind
sie besonders geeignet, weil
die Kriställchen vollkommen voneinander getrennt sind und auf diese Weise in Form
von individuellen freien Kristallkörpern erscheinen.
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Beispiel i 50o mg kristallines Insulin mit ungefähr 0,4% Zink werden.
in 5o ml Wasser gelöst, das ¢ ml o, i n-Salzsäure enthält. Die hergestellte Lösung
wird der Gefriertrocknung in bekannter Weise bei einem Druck von etwa 0,o5 mm Quecksilber
oder niedriger unterworfen.
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Wenn das gefriergetrocknete. Insulin nunmehr einem wäßrigen Kristallisationsmedium,
das 50m9 Zitronensäure (als Natriumcitrat) auf ioo ml, 2 mg Zink (als Zinkchlorid)
auf ioo ml, 1/z°/0 Insulin und i 0/0o von Methyl-p-oxybenzoat enthält, in einem
Betrag von 20°/o der Menge des Insulins im Kristallisationsmedium zugesetzt und
auf einen pn-Wert von 6,5 eingestellt wird, so fällt das Insulin in Form von Kristalleis
an, die gleichförmig in ihrer Gestalt eine Größe von etwa 5 fc aufweisen.
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Beispiel 2 50o mg von kristallinem Insulin gemäß Beispiel i werden
in So ml Wasser gelöst, das 4,3 ml o,i n-Salzsäure enthält. Die Lösung wird mit
So ml einer Pufferlösung versetzt, die aus So mg Zitronensäure, io ml einer o, i
n-Natriumhydroxydlösung, 2 mg Zink (als Zinkchlorid) und i,6%o Methyl-p-oxybenzoat
besteht. Der p,1-Wert der Mischung wird auf 6,3 eingestellt, wobei die Lösung durch
das Ausfallen von amorphem Insulin trüb wird. Die trübe Lösung wird in gleicher
Weise bei dem gleichen Druck wie im Beispiel i gefriergetrocknet. Wenn dieses gefriergetrocknete
Insulin derselben Kristallisationsflüssigkeit und in gleicher Menge wie im Beispiel
i zugefügt wird, so kristallisiert das Insulin in einer Kristallgröße von etwa 5
bis 7 ,u aus.
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Beispiel 3 Das Verfahren ist dasselbe wie im Beispiel :2 mit der einzigen
Modifikation, daß die Insulinlösung, die gefriergetrocknet werden soll, auf einen
pH-Wert von 6,6 anstatt 6,3 eingestellt wird. Die Lösung bleibt klar, und es fällt
kein amorphes Insulin aus. Die Insulinkristalle fallen in einer Größe von etwa 2,u
an..
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Beispiel ¢ Es wird dasselbe Verfahren wie im Beispiel :2 angewendet,
nur mit dem Unterschied, daß die Insulinlösung, selche, gefriergetrocknet werden
soll, auf einen Wert von PH 7 eingestellt wird. Auch in diesem Falle haben die Insulinkristalle
eine Größe von 2 /c.
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Beispiel s Das Verfahren ist dasselbe wie im Beispiel e, mit dem einzigen
Unterschied,' daß die Insulin-Lösung, welche gefriergetrocknet wird, auf einen pH-Wert
von 7,5 eingestellt wird. In diesem Falle besitzen die Insulinkristalle eine Größe
von r bis 1,5 Aa- . .
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Beispiel 6 50o mg eines hochgereinigten amorphen Insulins, das keine
die Kristallisation fördernde Metalle enthält, werden in So ml Wasser gelöst, das
¢,3 ml o, i n-Salzsäure enthält. Die so hergestellte Lösung wird mit So ml einer
Lösung gemischt, die aus So mg Zitronensäure, io ml o, i n-Natriumhydroxydlösung
und i,6 0 /oo Methylp-oxybenzoat besteht. Daraufhin wird der pH-Wert der Mischung
auf 6,7 eingestellt. Die so hergestellte Mischung wird in der gleichen Weise wie
im Beispiel i gefriergetrocknet.
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Wenn das genannte gefriergetrocknete Insulin derselben Kristallisationsflüssigkeit
und in gleicher Menge wie im Beispiel i zugesetzt wird, so fallen Insulinkristalle
in der Größe von 5,u an.
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Beispiel 7 500m9 kristallines Insulin mit ungefähr o,¢0/0 Zink werden
in So ml Wasser gelöst, das 4,3m1 o,i n-Salzsäure enthält. Diese Lösung wird mit
So ml einer Lösung gemischt; die So mg Zitronensäure, 2 mg Zink (als Zinkchlorid),
io ml o,i n-Natriumhydroxydlösung und i,6%o Methylp-oxybenzoat enthält. Der pH-Wert,
auf den die Mischung eingestellt wird,- liegt bei 5. Danach werden ioo mg nach Beispiel
3 gefriergetrocknetes Insulin hinzugefügt und das Gemisch umgerührt. Das Insulin
kristallisiert in Form von Kristallen in der Größe von etwa :2,5,u, welche jedoch
dazu neigen, sich aneinander anzulagern, und die deshalb weniger für die Verwendung
als Saatkristalle geeignet sind.
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Beispiel 8 Das Verfahren ist dasselbe wie im Beispiel 7,
mit
dem einzigen Unterschied, daß die Kristallisation bei einem pH-Wert von 5,5 anstatt
von 5 durchgeführt wird. Die so erhaltenen Kristalle haben eine Größe von etwa 2,u
und hängen weniger aneinander als die nach dem Beispiel 7 hergestellten.
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Beispiel 9 Das-Verfahren ist das gleiche wie im Beispiel 7, mit dem
einzigen Unterschied, daß die Kristallisation bei einem pH-Wert von 6 stattfindet.
Bei diesem Verfahren werden Kristalle von 2,u erhalten, welche vollkommen voneinander
getrennt sind.
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Beispiel io Das Verfahren ist das gleiche wie im Beispiel 7, nur daß
die Kristallisation bei einem pHWert von 6,3 vorgenommen wird. Auf diese Weise wird
dasgelbe
Resultat erhalten, wie es im. Beispiel 9 angegeben ist.
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Beispiel ii Das Verfahren ist das gleiche wie im Beispiel 7, nur mit
dem Unterschied, daß die Kristallisation bei einem pg-Wert von 7 durchgeführt wird.
Bei diesem Verfahren werden Insulinkristalle von einer Größe von i bis 2,u erhalten.
Entsprechend der relativ großen Löslichkeit des Insulins unter den genannten Kristallisationsbedingungen
wird jedoch nur ein Teil desselben in Kristallform erhalten. Beispiel 12 50o mg
kristallines Insulin mit ungefähr o,40/0 Zink werden in 5o ml Wasser gelöst, das
4,3m1 o,i n-Salzsäure enthält. Die so hergestellte Lösung wird mit 5o ml einer wäßrigen
Lösung gemischt, die 178 mg von Nag H P 041 2 mg Zink (als Zinkchlorid), 3,8m1 o,i
n-Salzsäurelösung und 1,60/00 Methyl-p-oxybenzoat enthält. Der pH-Wert der Mischung
wird auf 6,3 eingestellt, wonach ioo mg von gefriergetrocknetem Insulin, das entsprechend
dem Beispiel 3 hergestellt wurde, zugesetzt werden. Die Mischung wird umgerührt,
bis die Kristallisation beendet ist. Die Insulinkristalle haben eine Größe von etwa
2 lt.
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Beispiel 13 50o mg kristallines Insulin mit ungefähr 0,q.0/0 Zink
werden in 5o ml Wasser gelöst, das 4,3m1 o,1 n-Salzsäure enthält. Diese Lösung wird
mit 5o ml einer wäßrigen Lösung gemischt, welche 136 mg CH 3 C O O Na, 3H201
2 mg Zink (als Zinkchlorid), 4,5 ml o,i n-Natriumhydroxydlösung und i,6%o Methyl-p-oxybenzoat
enthält. Der pH-Wert dieser Mischung wird auf etwa 6,3 eingestellt, wonach ioo mg
gefriergetrocknetes Insulin, das entsprechend dem Beispiel 3 gewonnen wurde, zugefügt
werden. Die Mischung wird umgerührt. Die Insulinkristalle, die auf diese Weise erhalten
werden, haben eine Größe von etwa 2 lt.
Beispiel 14 Zu 5o ml einer wäßrigen
Lösung, die 5o mg Zitronensäure, 4,5 mg Nickel (als Nickelchlorid), io ml o,i n-Natriumhydroxydlösung
und i,6%o Methyl-p-oxybenzoat enthält, werden 5o ml einer Insulinlösung hinzugefügt,
welche dieselbe Zusammensetzung hat wie die Insulinlösung, die entsprechend dem
Beispiel 6 der Gefriertrocknung unterworfen wurde, wonach ioo mg gefriergetrocknetes
Insulin nach Beispie13 sofort hinzugefügt werden. Der pH-Wert der Mischung wird
auf etwa 6,2 eingestellt. Bei der Kristallisation ergeben sich Insulinkristalle
von 2 y. Beispiel 15 Zu ioo ml einer wäßrigen Lösung, die 5o mg Zitronensäure, 2
mg Zink (als Zinkchlorid) und o,8%o Methyl-p-oxybenzoat enthält und die auf einen
p11-Wert von 6,5 mit Hilfe von Natiiumhydroxyd eingestellt ist, werden unter Rühren
60o mg gefriergetrocknetes " Insulin hinzugefügt, wie es im Beispiel 3 beschrieben
ist. Nachdem einige Stunden gerührt worden ist, kristallisiert das hinzugefügte
Insulin in Form von Kristallen, die eine Größe von etwa 2 ,u haben.
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Beispiel 16 Zu 5o ml einer wäßrigen Lösung, die 50 mg Zitronensäure,
2 mg Zink (als Zinkchlorid), io ml o,i n-Natriumhydroxydlösung und i,6%o Methylp-Oxybenzoat
enthält, werden unter Rühren ioo mg von gefriergetrocknetem Insulin, das entsprechend
dem Beispiel 3 hergestellt ist, hinzugefügt; unmittelbar danach werden
500 mg kristallines, zinkhaltiges Insulin zugegeben, die in 5o ml Wasser
gelöst sind, das 4,3 ml einer o, i n-Salzsäure enthält, wonach der pg-Wert # der
Mischung auf 6 eingestellt wird. Die Kristallisation wird unter Rühren durchgeführt.
Die Insulinkristalle haben eine Größe von etwa 2,u. Beispiel 17 Zu. 5o ml einer
wäßrigen Lösung, die 50 mg .Zitronensäure, 2 mg Zink (als Zinkchlorid) und
etwa g, ml o, i n-Natriümhydroxydlösung (bis zu einem pH-Wert von etwa . 11,8) enthält,
werden ioo mg gefriergetrocknetes Insulin, das nach dem Beispiel 3 hergestellt ist,
hinzugefügt.
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Das gefriergetrocknete Insulin scheint hierbei in Lösung zu gehen.
Dann werden 50 ml einer Insulinlösung hinzugefügt, die 500 mg kristallines,
ungefähr 0,4% Zink enthaltendes Insulin, 4,3 ml o,i n-Salzsäure und i,6%o Methyl-p-oxybenzoat
enthält und deren p11-Wert auf etwa 6,3 eingestellt ist.
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Nach einigen Stunden ist die Kristallisation beendet. Die Größe der
Kristalle liegt zwischen 2 und 3,u.
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Wenn die erfindungsgemäß nach den oben angegebenen Beispielen hergestellten
Insulinkristalle als Saatkristalle für die industrielle Erzeugung von injizierbaren
Insulinkristallsuspensionen verwendet werden, ist es zweckmäßig, Vorkehrungen zu
treffen, um Änderungen der hergestellten Keimkristalle in dem Suspensionsmedium
während einer möglichen Lagerung zu verhindern. Für diesen Zweck ist es vorteilhaft,
eines der die Kristallisation beschleunigenden Metalle zu dem Suspensionsmedium
der Keimkristalle hinzuzufügen, damit die Suspension bei einem pH-Wert von etwa
7 stabil bleibt. Die Lösung wird dann mit Natronlauge auf diesen p11-Wert eingestellt.
Auf diese Weise kann jede der, nach den Beispielen hergestellte Suspension von Insulinkristallen
im Verhältnis i : i mit einer wäßrigen 5o mg Zink (als Zinkchlorid) auf ioo ml und
i 0/0o Methyl-p-oxybenzoat enthaltenden Lösung verdünnt werden.
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Es sei jedoch bemerkt, daß bei einer industriellen Durchführung des
Prozesses die Kristallisation unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden muß.
Die so erhaltenen sterilen Kristallsuspensionen können dann'entweder für den direkten
therapeutischen
Gebrauch oder zur Herstellung von sterilen Suspensionen von größeren Insulinkristallen
für den unmittelbaren therapeutischen Gebrauch benutzt werden.