DE2431483B2

DE2431483B2 - Verfahren zur Herstellung von Alkalioder Ammoniumsalzen von Insulin

Info

Publication number: DE2431483B2
Application number: DE2431483A
Authority: DE
Inventors: Richard Lee Indianapolis Ind. Jackson (V.St.A.)
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1973-07-16
Filing date: 1974-07-01
Publication date: 1980-11-27
Also published as: NL179910C; DK148282C; IL44950A; JPS5735825B2; CS183753B2; ES428329A1; IL44950A0; PL90037B1; HU171574B; BE817649A; AU6959774A; BG25803A3; AR199541A1; DK148282B; SE7409248L; PH13599A; ZA743424B; YU39922B; SU624563A3; FR2237879B1

Description

Die gegenwärtig gebräuchlichen Insulinzubereitungen zur Behandlung von Diabetes mellitus lassen sich normalerweise als solche mit kurzer, mittellanger oder verlängerter hypoglycämischer Wirkung bezeichnen. Bei manchen Diabetesfällen, insbesondere bei pädiatrischen Patienten, möchte man jedoch eine Insulinzubereitung haben, die anfangs sowohl rasch wirkt als auch über eine langer andauernde hypoglycämische Wirkung verfügt, und somit eine Insulinzubereitung mit einer Dualwirksamkeit

In den letzten Jahren wurden derartige Insulinzubereitungen mit Dualwirksamkeit hergestellt, indem man zumindest zwei verschiedene Insulinzubereitungen miteinander vermischte. Eine typische derartige Mischung besteht beispielsweise aus Zinkinsulin, das man von Schweinepankreas erhält, und einer Suspension von Rinderinsulin mit hohem Zinkanteil. Andere Zubereitungen sind Gemische aus einer Zink-Insulin-Lösung mit entweder einer Protamin-Insulin-Suspension oder einer Protamin-Zinkinsulin-Suspension.

Alle diese bekannten Insulinzubereitungen mit Dualwirksamkeit sind jedoch, sogar wenn man eine gewisse Dualwirksamkeit erreicht, mit Problemen behaftet. Die Probleme liegen normalerweise beim Lagern, bei der Konservierung, bei der Reinheit, der Stabilität, der Farbe sowie der Verunreinigung mit hyperglycämischem Faktor (Glucagon) und hochmolekularen antigenen Proteinen.

Die einer Reihe oder gegebenenfalls sogar allen diesen bekannten Insulinzubereitungen mit Dualaktivität anhaftenden Probleme lassen sich nun durch Verwendung von Zubereitungen gemäß US-PS 37 58 683 vermeiden, die aus einem Alkali- oder Ammoniuminsulin und Protamin bestehen. Die hierzu benötigten Alkali- und Ammoniuminsuline werden im allgemeinen nach US-PS 37 19 655 erzeugt Hiernach stellt man den pH-Wert einer insulinhaltigen Lösung auf etwa 7,2 bis 10,0 und die Alkali- oder Ammoniumionenkonzentration auf etwa 0,2- bis l.Omolar ein, wodurch es zur Kristallisation des Alkali- oder Ammoniuminsulins kommt Die mit einer Zinkkristallisation zusammenhängenden Probleme werden dabei zwar vermieden, es bleiben jedoch die normalerweise nur durch Zinkkristallisation entfernbaren Nicht-Insulinproteinbestandteile im Alkali- oder Ammoniuminsulin. Bei einer Insulinzubereitung mit Dualaktivität muß man sich daher entweder eines Alkali- oder Ammoniuminsulins, das oft die in Zinkinsulin nicht enthaltenen Nicht-Insulinpro- ; 5 teinbestandteile enthält, oder eines anderen bekannten Gemisches mit all den damit zusammenhängenden Problemen bedienen. Die auf Basis solcher Alkali- oder Ammoniuminsuline hergestellten protaminhaltigen Insulinzubereitungen haben somit zwar gewisse Vorteile gegenüber den sonstigen bekannten Zubereitungen dieser Art, jedoch zugleich auch die soeben erwähnten Nachteile hinsichtlich des in ihnen enthaltenen nicht optimalen Alkali- oder Ammoniuminsulins.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines

neuen Verfahrens zur Herstellung von Alkali- oder

Ammoniumsalzen von Insulin, die über eine besondere Reinheit verfügen und auch die sonstigen Nachteile der

bisher bekannten Salze dieser Art nicht aufweisen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß nun durch das aus den Ansprüchen hervorgehende Verfahren gelöst.

Die anliegende Zeichnung zeigt Analysen der Polyacrylamid-Scheibengel-Elekirophorese der Natriuminsulinausgangsmaterialien sowie der Natriuminsulinprodukte der Beispiele 2 und 3. J5 Unter Alkali werden erfindungsgemäß Elemente der Gruppe IA bis und einschließlich der Periode 5 des Periodensystems der Elemente (Robert C. Weast, »Handbook of Chemistry and Physics«, 53rd Auflage, The Themical Rubber C, Cleveland, Ohio, 1968, Seite B-3) verstanden. Lithium, Natriuk. vnd Kalium werden bevorzugt, wobei man insbesondere Natrium verwendet.

Von den angegebenen zweiwertigen Metallen wird Zink besotiders bevorzugt.

Der pH-Wert der erfindungsgemäß zu verwendenden wäßrigen Lösung v.'rd im allgemeinen auf etwa 7,6 bis etwa 8,6 und vorzugsweise auf etwa 8,2 eingestellt.

Die Konzetitration des Salzes aus Insulin und

zweiwertigem Metall in der wäßrigen Lösung wird erfindungsgemäß im allgemeinen auf etwa 10 bis etwa 1000 internationale Einheiten pro rnl Lösung (E/ml) und vorzugsweise auf etwa 500 E/ml eingestellt.

Beispiele für erfindungsgemäß zu verwendende Polymethylendiamintetraessigsäuren sind Hexamethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure und vorzugsweise Äthylendiamin-N,N,N',N'-tetra essigsäure.

Die jeweilige Polymethylendiamintetraessigsäure kann entweder in Form der freien Säure oder eines entsprechenden Alkali- oder Aminoniumsalzes eingesetzt werden. Bei Verwendung eines Salzes muß das Kation gleich sein mit dem Kation des gewünschten Alkali- oder Ammoniuminsulins. Darüber hinaus muß auch die Menge eines infolge der Verwendung eines solchen Salzes zugesetzten Kations in Betracht gezogen f>5 werden, wenn man die Menge der gewünschten Alkalioder Ammoniumionen ermittelt.

Zur Entfernung des zweiwertigen Metalls von dem Insulin und für eine rasche Kristallisation des Alkali-

oder Ammoniuminsulins muß die Komponente B) beim erfindungsgemäßen Verfahren in einem Molverhältnis von wenigstens etwa 3 :1 zu den in der Komponente A) enthaltenen Metallionen eingesetzt werden. Bei niedrigeren Verhältnissen ist die Kristallisationsgeschwindigkeit des Alkali- oder Ammoniuminsulins aus alkalischer Lösung niedriger. Darüber hinaus ist bei niedrigeren Verhältnissen die Wahrscheinlichkeit größer, daß zumindest einiges zwei weitiges Metall an das Insulin gebunden bleibt

Die Konzentration an Komponente B) muß demzufolge etwa 0,0002- bis etwa O.OSmolar sein. Bei einer Konzentration an zweiwertigem Metallinsulin von etwa 500 E/ml ist die bevorzugte Konzentration an Komponente B) etwa 0,01 molar.

Die Konzentration an Alkali- oder Aminoniumkationen ist beim vorliegenden Verfahren im allgemeinen etwa 0,2- bis etwa l.OmoIar.

Die Alkali- oder Ammoniumionen lassen sich durch irgendeine wasserlösliche Verbindung beibringen, die sich unter den angewandten Verfahrensbedingungen nicht nachteilig auf das Insulin auswirkt. Die Alkali- oder Ammoniumionen können darüber hinaus νυη mehr als einer derartigen wasserlöslichen Verbindung geliefert werden. Das Kation des gewünschten Alkali- oder Ammoniuminsulins bestimmt natürlich die Frage, welche dieser Ionen man einsetzt

Wie bereits erwähnt läßt sich ein Teil der erforderlichen Alkali- oder Ammoniumionen auch durch Verwendung einer Polymethylendiamintetraessigsäure in Form eines Alkali- oder Ammoniumsalzes liefern. Die erforderlichen Ionen können ferner durch die basische Alkali- oder Ammoniumverbindung geliefert werden, die man normalerweise zum Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf die gewünschte Alkalitä' braucht Schließlich lassen sich die erforderlichen Ionen auch aus einem Alkali- oder Ammoniumsalz erhalten, dessen Anion unter anderem ein Chlorid, Bromid, Fluorid, jodid, Acetat Sulfat oder Phosphat sein kann. Die Chlorid- und Phosphatsalze werden hierzu bevorzugt wöbe, man insbesondere Chloride verwendet Die jeweils verwendeten besonderen Alkali- oder Ammoniumionen sollen, wie bereits gesagt gleich sein wie das Kation des gewünschten Alkali- und Ammoniuminsulins. Normalerweise gelangt man zu den erforderlichen Ionen durch eine Kombination aller drei obenerwähnten Materialien.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete alkalische wäßrige Lösung eines Salzes aus Insulin und dem jeweiligen zweiwertigen Metall läßt sich nach irgendeinem dem Fachmann bekannten Verfahren herstellen. Da alle Bestandteile dieser alkalischen wäßrigen Lösung unter den angewandten Verfahrensbedingungen löslich sind, ist die Art der Herstellung dieser alkalischen wäßrigen Lösung nicht kritisch.

Ein bekanntes und bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer solchen alkalischen wäßrigen Lösung besteht darin, daß man ein derartiges Insulinsalz in einem sauren wäßrigen Medium löst und den pH-Wert der erhaltenen Lösung dann mit einer geeigneten Base auf etwa 7,6 bii etwa 8,6 einstellt. Die Polymethylendiamintetraessigsäure sowie weitere Alkali- oder Ammoniumionen lassen Mch zu jeder Zeit zusetzen, und zwar entweder als Feststoffe oder in Form wäßriger Lösungen. Bei Verwendung von Lösungen muß die Zunahme des Ge^c.arntlösungsvolumens in Betrach' gezogen weiden, dam't man die gewünschte Endkonzeritration der Beständige erhält.

Die oben benötigte saure wäßrige Lösung des Insulinsalzes sollte einen pH-Wert von etwa 24 bis etwa 3,5 haben. Dies läßt sich durch irgendeine Mineralsäure erreichen, wobei Chlorwasserstoffsäure bevorzugt wird. Der bevorzugte pH-Wert der Lösung ist etwa 3, und man stellt ihn am besten dadurch her, daß man das zweiwertige Metallinsulin in verdünnter Salzsäure löst. Die saure wäßrige Lösung des Insulinsalzes kann gewünschtenfalls Konservierungsmittel und/oder sonstige Mittel, wie isotonische Mittel, enthalten. Beispiele geeignter Konservierungsmittel sind Phenol oder Methylparaben. Zu Beispielen geeigneter isotonischer Mittel gehören Glycerin oder Glucose.

Falls man ein Konservierungsmittel verwendet dann sollte dies in einer Konzentration von 0,4% (Gewicht pro Volumen) erfolgen, wobei eine Konzentration von etwa 0,2% bevorzugt wird. Die Verwendung eines Konservierungsmittels ist zweckmäßig, wobei Phenol bevorzugt wird. Der Einsatz von Phenol verbessert zugleich auch die Kristallisationsgeschwindigkeit des gewünschten Alkali- oder Ammonia ,!insulins.

Die saure wäßrige Lösung des !nsuünsalzes wird dann mit einer geeigneten Base alkalisch gestellt Bei der verwendeten Base handelt es sich im allgemeinen um ein Alkali- oder Ammoniumhydroxid oder -carbonat oder eine sonstige ähnliche basische Verbindung. Eine konzentrierte wäßrige Lösung des jeweiligen Hydroxids wird bevorzugt, da sich hierdurch eine übermäßige Verdünnung der Insulinsalzlösung und die Bildung von Wärme durch einige Verbindungen, wie beispielsweise durch feste Alkalihydroxide, vermeiden lassen.

Die Polymethylendiamintetraessigsäure und die Alkali- oder Ammoniumionen können der Insulinsalzlösung, wie bereits gesagt, zu jeder Zeit zugegeben

)5 werden. Das Insulinsalz läßt sich beispislsweise in verdünnter wäßriger Salzsäure lösen, die die Polymethylendiamintetraessigsäure enthält Wahlweise kann man letztere auch zur sauren wäßrigen Lösung des Insulinsalzes geben. Ferner läßt sich die Polymnhylendiamintetraessigsäure zu der Insulinsalzlösung geben, nachdem die Lösung alkalisch gestellt wurde.

Die Polymethylendiamintetraessigsäure wird normalerweise zu sauren Lösungen in Form eines Alkalioder Ammoniumsalzes zugesetzt. Wegen einer verbesserten Wasserlöslichkeit ist eine vollständige Neutralisation aller in ersterer vorhandener Carboxylgruppen zweckmäßig. Andererseits wird die Polymethylendiamintetraessigsäure zu der alkalischen Lösung normalerweise auch als freie Säure zugegeben. Bei dem bevorzugten Verfahren zur Herstellung der alkalischen wäßrigen Lösung an Insulinsalz setzt man Alkali- oder Ammoniumionen in Verbindung mit der Zugabe der jeweiligen Polymethylendiamintetraessigsäure zu. Weitere Ionen werden durch die Base geliefert, die man verwendet, um die saure Lösung alkalisch zu stellen. Die restlichen erforde -liehen Ionen werden Jurch Zusatz einer entsprechenden Menge an Alkali- oder Ammoniumsalz geliefert Dieses Salz gibt man normalerweise vor dem Alkalischstellen der Lösung zu. Eine derartige Zugabe kann zu jeder Zeit erfolgen, wie dies für den Zusatz von Poly-nethylendiamintetraessigsäure beschrieben wurde.

Ein anderes bekanntes Verfahren zor Herstellung einer alkalischen wäßrigen Lösung an Insulinsalz

f>5 besteht darin, daß man das jeweilige Insulinsalz in einem wäßrigen alkalischen Medium, das einen pH-Wert von etwa 8 bis etwa 9,5 hat, löst und den pH-Wert der erhaltenen Lösune dann auf etwa 7.6 bis etwa 8.6

einstellt. Die Alkalität der ursprünglichen wäßriger; Lösung erhält man normalerweise durch Verwendung einer Alkali- oder Ammoniumbase, wie dies oben beschrieben wurde. Die Alkalinitätserniedrigung IaQt sich dann durch Zugabe einer verdünnten Mineralsäure erreichen, wobei Chlorwasserstoffsäure und Phosphorsäure bevorzugt werden. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, das Lösungen höherer Konzentrationen an Insulinsalz sich möglicherweise schwieriger herstellen lassen als verdünnte Lösungen, da dessen Löslichkeit in alkalischen Lösungen niedriger ist.

Die Zugabe an Polymethylendiamintetraessigsäure und eventuell erforderlichen Alkali- oder Ammoniumionen kann zu jeder Zeit vorgenommen werden. Normalerweise gibt man beides vor der abschließenden Einstellung des pH-Wertes zu.

Sobald die alkalische wäßrige Lösung des Insulinsalzes hergestellt ist, kristallisiert das Alkali- oder Ammonium aus der Lösung aus. und zwar normalerweise bei Umgebungstemperatur, wobei man gewünschtenfalls jedoch auch bei höheren oder niedrigeren Temperaturen arbeiten kann. Die Kristallisationstemperatur sollte im allgemeinen jedoch bei weniger als etwa 30⁰C liegen.

Die so hergestellten Kristalle von Alkali- oder Ammoniuminsulin werden dann in bekannter Weise isoliert. Diese Isolierung erfolgt am besten durch Zentrifugieren, wobei man anschließend mit verdünnter Alkali- oder Ammoniumsalzlösung (normalerweise etwa 0,5molar), Aceton, absolutem Alkohol und Äther wäscht und die erhaltenen Kristalle dann im Vakuum trocknet.

Beispiel 1

3 g Zinkinsulin, bestehend aus 70% Rinderinsulin und 30% Schweineinsulin. werden in 400 ml saurem Phenolwasser gelöst, das man durch Lösen von 0.8 g Phenol in 400 ml 0,01 η wäßriger Chlorwasserstoffsäure herstellt. Die erhaltene Lösung wird in vier gleiche Teile aufgeteilt, und jeden dieser Teile versetzt man mit 0.2 g Natriumchlorid. Die vier Teilmengen werden als Proben 1 bis 4 gekennzeichnet. Drei der vier Proben werden in der im folgenden beschriebenen Art mit Äthylendiamintetraejsigsäure-tetranatriumsalz versetzt.

EDTA

Menge (g)

Molarkonzentration

0,416
1,04
2,08

0,010
0,025
0,050

man einmal mit Aceton, zweimal mit absolutem Alkohol und einmal mit Äther wäscht. Nach Trocknen im Vakuum erhält man folgende Ausbeuten an Natriuminsulin:

Probe	Ausbeute	τη Natriuminsulin	E/mg
	Gramm	%	25,6
10 1	1,705	85,2	25,0
2	1,842	92,1	23.5
3	1,929	96,4	23,5
4	1,971	98,5

Die Stärke des Natriiiminsulins (sowie aller bei den folgenden Beispielen erhaltenen Insuline) wird durch einen immunologischen Versuch nach dem Verfahren von G. W. Probst, et al- J. Pharm. ScL 55. 1408 (l%6) ermittelt. Die normale Standard-Abweichung bei diesem Verfahren beträgt ± 15 bis 25%.

Jede Lösung wird dann durch Zugabe von 40prozentigem wäßrigem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8.2 eingestellt Bei den Proben 2 bis einschließlich 4 beginnen sich unmittelbar darauf Kristal'e von Natriuminsulin zu bilden. Die Probe 1 bildet jedoch sogar nach 3stündigem Rühren keine Kristalle.

Die Probe 1 wird mit 0.1 molarer wäßriger Äthylendiamintetraessigsäure (in Form des Tetranatriumsalzes) behandelt Bei einer EDTA-Konzentration von etwa 0,006 Mo! beginnt die Kristallisation von Natriuminsulin. Jede Probe rührt man über Nacht. Die Kristalle von Natriuminsulin werden dann abzentrifueiert. worauf

Beispiel 2

2 g gereinigtes Nairiuminsulin (von Rinderpankreas), das über eine Stärke von 27,0 E/mg verfügt und kleinere Mengen weniger saurer Proteinverunreinigungen enthält, werden in <00 mt 0,5 η-Essigsäure gelöst. Die erhaltene Lösung versetzt man mit etwa 20 ml absolutem Alkohol sowie 0,4 ml einer 20prozentigen Zinkchloridlösung, wobei letztere 40 mg Zinkchlorid pro Gramm Insulin entspricht. Der pH-Wert der Lösung wird dann durch Zugabe von 20prozentigem Ammoniumhydroxid auf 535 eingestellt, und die Lösung hält man dann etwa 72 Stunden auf etwa 5⁰C. Die dabei entstandenen Zinkinsulinkristalle werden abzentrifugiert, einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und dann in 50 ml saurem Phenolwasser gelöst, das wie in Beispiel 1 hergestellt wird. Die Lösung wird mit saurem Phenolwasser auf 100 ml verdünnt Die erhaltene Lösung versetzt man dann mit 2,0 g Natriumchlorid (was zu einer an Natriumchlorid 034molaren Lösung führt) sowie mit 0208 g EDTA (in Form des Tetranatriumsalzes, was zu einer 0,005molaren Lösung an Äthylendiamintetraessigsäure führt). Die Lösung wird hierauf mit 40prozentigem wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 8^ eingestellt Es beginnen sich Kristalle von Natriuminsulin zu bilden. Man läßt die Kristallisation über Nacht bei Raumtemperatur fortlaufen. Die dabei erhaltenen Kristalle von Natriuminsulin "verden abzentrifugiert gewaschen und wie in Beispiel 1 beschrieben getrocknet Die Ausbeute an Natriuminsi ■ liri beträgt 1364 g, was einer prozentualen Ausbeute von 93,2% entspricht Die Stärke des Natriuminsulins liegt bei 27,0 E/mg.

Proben des Natriuminsulinausgangsmaterials und des Natriuminsulinendproduktes von Beispiel 2 werden durch Polyaniidscheiben-Gel-EIektrophorese nach dem

M) Verfahren von R. L Jackson, et al. Diabetes, 21, 235 (1972) untersucht

F i g. 1 zeigt eine Darstellung der elektrophoretischen Analyse des Natriuminsulinausgangsmaterials. F i g. 2 ist eine Darstellung der elektrophoretischen Analyse des

b5 Natriuminsulinendprodukts. Bei diesen Figuren ist mit 1

H« Pr%lvar*rvlami/icTi»l üna^ophpn Hi** ^vmhnlp 7 linH 1

bezeichnen Nichtinsulinproteine, und die Symbole 4 sowie 5 geben Insulin und insulinähnliche Proteine an.

Beispiel 3

Die Arbeitsweise von Beispiel 2 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß man als Ausgangsmaterial ein aus Schweinepankieas isoliertes Natriuminsulin verwendet, das eine Stärke von 25,0 E/mg aufweist. Die Endausbeute an Natriuminsulin beträgt 1,862 g, was einer prozentualen Ausbeute von 93,1% entspricht. Die Styke des Produkts liegt bei 28,9 E/mg.

Das Ausgangsmaterial (Fig. 3) und das Endprodukt (Fig.4) von Beispiel 3 werden durch Polyacrylamidscheibengel-Elektrophorese nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren untersucht. In diesen Figuren ist mit 1 das Polyacrylamidgel angegeben, die Symbole 6, 7 sowie 8 bezeichnen Nichtinsulinproteine, und die Symbole 9 und 10 sind Insulin oder insulinähnliche Proteine.

Aus den F i g. 1 bis 4 wird klar, daß durch das Verfahren die Nichtinsulinproteine entfernt werden.

D;C3C entscheidende Verbesserung der Reinheit des erhaltenen Alkali- oder Ammoniuminsulins läßt sich darüber hinaus nicht aus der Stärke sowie anderen Daten allein entnehmen.

Beispiel 4

6 g Zinkinsulinkristalle (70% aus Rinderpankreas, 30% aus Schweinepankreas) werden in 300 ml Säure-Phenol-Wasser, hergestellt gemäß Beispiel 1, gelöst. Eine 100-ml-Teilmenge dieser Lösung löst man mit 2,5 g (0,033 Mol) Kaliumchlorid. Der pH-Wert der leicht tii'.'en Lösung wird durch Zugabe von 3,5 ml lOprozentigem wäßrigem Kaliumhydroxid auf 8,2 eingestellt. Die erhaltene trübe Lösung versetzt man mit 0,3 g (0,001 Mol) Äthylendiamintetraessigsäure. Der pH-Wert der Lösung wird dann durch Zusatz von lOprozentigem Kaliumhydroxid erneit eingestellt, bis er sich bei 8,2 stabilisiert. Die Lösung wird 48 Stunden bei Umgebungstemperatur (etwa 25° C) gerührt. Während der ersten 12 Stunden beginnt die Kristallisation. Das erhaltene Kaliuminsulin wird abfiltriert, zweimaj mit absolutem Alkohol und dann einmal mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an Kaliuminsulin beträgt 1,736 g (86,8%). Das erhaltene Produkt hat eine Stärke von 24,9 E/mg, sein Kaliumgehalt beträgt 1,48%, und der Feuchtigkeitsgehalt liegt bei -, 10,1%.

Beispiel 5

Eine 100-ml-Teilmenge der gemäß Beispiel 4

in hergestellten Zinkinsulinlösung wird mit 1,4 g (0.033 Mol) Lithiumchlorid versetzt. Die Lösung stellt man durch Zugabe von 6,2 ml 1 n-Lithiumhvdroxid auf pH 8,2 ein. Die trübe Lösung wird mit Äthylendiamintetraessigsäure behandelt, und den pH-Wert dieser

ii Lösung stabilisiert man dann nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren mit I n-Lithiumhydroxid auf 8,2. Das Kristallisationsverfahren erfolgt ebenfalls in der in Beispiel 4 beschriebenen Weise, wobei man ähnliche Ergebnisse erhält. Das erhaltene Lithiuminsulin wird in

_>ir u'ei in Beispiel 4 angegebenen Weise gesammelt, wodurch man 1,234 g (61,6%) Produkt erhält, das über eine Stärke von 27,8 E/mg verfügt, einen Lithiumgehalt von 2.37% aufweist und einen Feuchtigkeitsgehalt von 3,6% hat.

Beispiel 6

Die in Beispiel 5 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, wobei man anstelle von Lithiumchlorid 1,8 g

in Ammoniumchlorid, und anstelle von Lithiumhydroxid 60 ml 1 n-Ammoniumhydroxid verwendet. Nach Zugabe von Äthylendiamintetraessigsäure und Einstellen des pH-Wertes mit 1 n-Ammoniumhydroxid kommt es sogar nach 24 Stunden zu keiner Kristallisation. Es

j> werden weitere 1.8 g Ammoniumchlorid zugesetzt. Nach weiterem 24stündigem Rühren kommt es zu einer Kristallisation. Das erhaltene Ammoniuminsulin wird in der in Beispiel 4 beschriebenen Weise isoliert, wodurch man 1,018 g (50,9%) Produkt erhält, das über eine Stärke von 27,6 E/mg verfügt und einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,3% hat. Das Insulin ergibt eine sulfatierte Asche von 0,08%.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Alkali- oder Ammoniumsalzen von Insulin aus einer Insulin und Alkalimetall- oder Ammoniumionen enthaltenden wäßrigen Lösung oberhalb pH 7,2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert der wäßrigen Lösung von etwa 7,6 bis etwa 8,6

A) ein Salz aus Insulin und zweiwertigen Mangan-, Eisen-, Kobalt-, Nickel-, Kupfer-, Zink- und/oder Cadmiumionen in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 1000 E/ml mit

B) einer Polymethylendiamintetraessigsäure in einer molaren Konzentration von etwa 0,0002 bis etwa 0,05 und

C) Alkali- oder Ammoniumionen in einer molaren Konzentration zwischen etwa 0,2 und etwa 1,0

umsetzt, wobei man die Komponente B) in einem Molverhältnis von wenigstens etwa 3 :1 zu den in A) enthaltenen Metallionen einsetzt und das Alkalioder Änunoniumsälz von Insulin äüskristaüisieren läßt.

2. Verfahren nach Anspruch J, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses mit einem Zinksalz von Insulin durchfahrt

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses mit Äthylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure oder einem ihrer Alkalioder Ammoniumsalze durchführt