DE959584C - Verfahren zur Herstellung eines praktisch chlorionenfreien Naehrmediums zur Erzeugung von Tetracyclin durch Biosynthese - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, zur Herstellung eines praktisch chlorionenfreien, Nährmediums für die fermentative Tetracyclinerzeugung.

Vor kurzem wurde gefunden, daß einige Stämme von Mikroorganismen, die Chlortetracyclin durch Fermentation erzeugen, außerdem geringe Mengen Tetracyclin, besonders in einem Medium, das minimale Mengen an, Chlorionen enthält, bilden. Sorgfältige Selektion einschließlich Mutation dieser Mikroorganismen hat auch zur Isolierung von Stämmen geführt, die überwiegende. Mengen an Tetracyclin gegenüber der Menge gleichzeitig gebildeten Chlortetracyclins erzeugen. Es war jedoch in keinem Fall möglich, einen Mikroorganismus zu isolieren, der in einem Chlorionen enthaltenden Fermentationsmedium lediglich Tetracyclin unter Ausschluß von Chlortetracyclin bildet.

. Die therapeutischen Eigenschaften von Tetracyclin und Chlortetracyclin sind zwar sehr nahe verwandt, es bestehen, jedoch Unterschiede zwischen den beiden antibiotischen Substanzen,, insbesondere hinsichtlich ihrer Stabilität im Blutstrom. Auf Grund dieser Unterschiede und auch wegen, der

Zuverlässigkeit bei der Behandlung von auf diese Antibiotika ansprechenden Krankheiten, ist es erwünscht, daß die erzeugte und verwendete Substanz als praktisch reine, einheitliche antibiotische Substanz vorliegt. Wegen ihrer ähnlichen physikalischen und] chemischen Eigenschaften ist es sehr schwierig, Tetracyclin von Chlortetracyclin zu trennen, wenn diese beiden Antibiotika zusammen in rohen Fermentationsmaischeni vorkommen. Ein ίο Verfahren, zur Herstellung von Tetracyclin ohne gleichzeitige Erzeugung merklicher Mengen, an Chlortetracyclin erscheint deshalb äußerst wünschenswert.

Mittels eines Fermentationsmediums aus den wesentlichen Nährstoffen, aber frei von natürlich vorkommenden Chloriden, wurde· bereits ein gewisser Erfolg in dieser Hinsicht erzielt. Dabei war jedoch die Auswahl von praktisch reinen assimilierbaren Kohlehydraten, wie Stärke, Sacharose, Glukose, Zitronensäure od. dgl., und· einer Stickstoffquelle aus synthetischen Materialien wie Ammoniumnitrat, Harnstoff und Ammoniumsulfat oder der gereinigten und teuren Aminosäuren erforderlich. Weiterhin war es nötig, sorgfältig chloridfreie Mineralsalze auszusuchen, die üblicherweise bei Fermentationsverfahren zugefügt werden, um Phosphate und andere anorganische Kationen und Anionen zu liefern. Diese synthetischen Medien sind nicht nur teuer in der Herstellung, es wurde vielmehr, was noch wichtiger ist, keine vollständige und exakte Zusammensetzung aller wichtigen Nahrungserfordernisse des Mikroorganismus bei der Biosynthese von Tetracyclin erzielt. Daraus ergibt sich, daß die Erzeugung von Tetracyclin unter Verwendung chloridfreier synthetischer Medien immer noch teuer und wirtschaftlich untragbar ist

Die Erfahrung auf dem Gebiet der Antibiotikaherstellung durch Fermentationsverfahren hat gezeigt, daß es in den natürlich vorkommenden Nährstoffen Bestandteile (substituents) gibt, die für die Erzeugung großer Ausbeuten an Antibiotikum von sehr erheblicher Bedeutung sind. Dies gilt für die Herstellung verschiedener Typen und Arten von antibiotischen Substanzen. Obgleich eingehende Bemühungen angestellt worden sind, um die Eigenart dieser Bestandteile natürlich vorkommender Nährstoffe zu bestimmen, wurden bei ihrer Identifizierung nur geringe Fortschritte erzielt. Maisquellwasser beispielsweise wird als fast unentbehrlicher Nährstoff für die Erzeugung einer Anzahl von Antibiotika in maximalen Ausbeuten, angesehen. Derartige erwünschte Nährstoffe kommen in einem geringeren Ausmaß in einer Vielfalt anderer in der Natur auftretender Substanzen, wie Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Fischmehl, bei der Tierschlachtung anfallender Flüssigkeit und verschiedenen anderen üblicherweise verwendeten natürlich vorkommenden Substanzen, die biologisch assimilierbaren Stickstoff, Kohlenstoff und mineralische Elemente liefern können, vor.

Bemühungern, Chloride aus diesen wünschenswerten natürlichen Nährstoffen zu entfernen, waren nicht erfolgreich. Die Behandlung von aus Maisquellwasser u. dgl. hergestellten Nährlösungen mit Ionenaustauscherharzen zum Zwecke der Entfernung von Chlorionen hatte enttäuschend niedrige Tetracyclinausbeuten bei der Verwendung der so behandelten Medien beim Fermentationsverfahren zum Ergebnis. Offensichtlich wird durch das Ionenaustauscherharz ein oder mehrere der unbekannten bei der Biosynthese wesentlichen Elemente aus dem Medium entfernt oder ein unerwünschtes Material hinzugefügt. Auf jeden Fall ist die gesamte, durch Fermentation mit einem geeigneten Nährmedium erzielte Ausbeute an antibiotischer Aktivität nach der Behandlung mit einem Ionena.ustauscherharz wesentlich niedriger, als man sonst hätte erwarten können.

Es sei bemerkt, daß das Wachstum des das Antibiotikum erzeugenden Mikroorganismus nicht notwendigerweise gleichbedeutend ist mit der Produktion an Antibiotikum. Nährmedien, die ein üppiges Wachstum des Fungus hervorbringen, können unter Umständen keine oder nur eine geringe Ausbeute an Antibiotikum liefern. Andererseits ist es möglich, daß ein Nährmedium, das lediglich ein normal erscheinendes Wachstum des Myzels unterstützt, sehr hohe Ausbeuten an antibiotischer Substanz liefert.

Chlortetracyclin erzeugende Organismen, insbesondere solche der Streptomyces-aureofaciens-Gruppe, sind äußerst gute Chloridverwerter und suchen und verwerten Chloride, die in dem Fermentationsmedium vorliegen, selbst wenn diese in Konzentrationen von weniger als 1 Teil/Million enthalten sind¹. Die Entfernung von Chloriden, um die Tetracyclinerzeugung zu ermöglichen, wird durch Verwendung von hohe Ausbeuten liefernden Stämmen noch erschwert, da diese hinsichtlich des Nährmediums sehr empfindlich sind und die Entfernung von für den Stoffwechsel wesentlichen Bestandteilen die Gesamtausbeut© an, erzeugbarem Antibiotikum sehr stark herabsetzt.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man aus diesen Fermentationsmedien. Chlorionen entfernen kann, ohne gleichzeitig beträchtliche Mengen von bei der Biosynthese von Tetracyclin wesentlichen Nährstoffen oder Elementen zu entfernen und ohne die sonst erhältliche Gesamtausbeute an- Antibiotikum merklich zu vermindern. Erfindungsgemäß wird eine wäßrige Lösung von chloridhaltigen Nährstoffen mit Silber- und/oder Ouecksilber(I)-ionen bei einem p_H-Wert von weniger als etwa 7 behandelt und aus dieser wäßrigen Lösung das gebildete Silber- und/oder Quecksilber (I) -chlorid abgetrennt. Die Bildung und Abtrennung dieser Chloride erfolgt offenr sichtlich ohne Störung des empfindlichen. Gleichgewichts der anderen Metaboliten, die zur Erzielung besonders hoher Ausbeuten, an Tetracyclin,, wie sie bei dem erfmdungsgemäßen Verfahren erhalten werden können, erforderlich sind. Die bei der Verwendung von Silber und Quecksilber zur Entfernung von Chlorionen aus dem Fermentationsmedium erzielten ausgezeichneten

Ergebnisse sind im Hinblick auf die Giftigkeit dieser Salze für Mikroorganismen ebenfalle völlig unerwartet.

Die für die Biosynthese von Tetracyclin bevorzugte Quelle für Nährstoffe umfaßt Naturprodukte, wie Maisquellwasser, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl, bei der Tierschlachtung anfallende Flüssigkeit u. dgl. Diese Produkte enthalten oft beträchtliche Mengen an Chlorionen, beispielsweise ίο kann Maisquellwasser 0,3 bis 0,5 %> Chlorionen enthalten. Im allgemeinen wird vorgezogen¹, die Chlorionen aus diesen natürlichen Bestandteilen zu entfernen, ehe man weitere Schritte zur Herstellung des Mediums durch Zugabe anderer Nährstoffe einschließlich Mineralsalze und Spurenelemente und die anschließende Sterilisation unternimmt. Die zugesetzten Nährstoffe sind im allgemeinen chlorionenfrei oder können durch verhältnismäßig einfache Behandlung chlorionenfrei gemacht v/erden.

Wenn man die in der Flüssigkeit enthaltene Chlorionenmenge von vornherein kennt, ergibt eine einfache, stöchiometrische Berechnung die Menge an löslichem Silbersalz, die zur praktisch vollständigen. Chlorionenfällung erforderlich ist. Die gleichen Betrachtungen gelten auch für die Verwendung von Quecksilber(I)-salzen.

Zu den Silbersalzen, die dem wäßrigen Fermentationsmedium zugesetzt werden können, um die Ausfällung von Silberchlorid zu bewirken, gehören eine Anzahl allgemein bekannter Silbersalze, wie Silberacetat, Silberbenzoat, Silberpropionat, Silberchlorat, Silberperchlorat, Silberlactat, Silbersulfat und verschiedene andere Silbersalze, die zur Fällung von Chlorionen aus wäßrigen Lösungen als Silberchlorid zugesetzt werden können. Es ist zwar nicht nötig, daß diese Silbersalze gut löslich sind, doch ist dies im allgemeinen! erwünscht. Nahezu unlösliche Silbersalze, wie Silberoxyd, die sich mit Chlorionen in wäßriger Lösung umsetzen, können ebenfalls verwendet werden und haben, den. Vorteil, daß ihre verhältnismäßig große Unlöslichkeit die Einführung unnötig großer Menr gen löslichen Silbers in-das Fermentationsmedium verhindert. Bei ihrer Verwendung ist jedoch, eine längere Zeit zur Fällung erforderlich.

Der pjj-Wert, bei dem die Fällung durchgeführt wird, kann beträchtlich variieren, doch liegt er im allgemeinen, im sauren Gebiet. Silberchlorid, ist zwar bei einem p_H-Wert von etwa 7 weniger löslich als bei niedrigeren p_H-Werten, es ist jedoch vorteilhaft, die Fällung bei diesen niedrigeren Pj₁-Werten, durchzuführen, da das Silberchlorid,- unter solchen Bedingungen schneller ausfällt und die Gefahr, Phosphate aus dem Medium zu entfernen, geringer ist. Aus diesem Grunde wird ein p_H-Wert von unter etwa 4 bevorzugt. Das Medium kann mit irgendeiner üblichen Säure, .ausgenommen. Salzsäure, auf diese p_H-Werte eingestellt werden.
Die unter ähnlichen Bedingungen verwendbaren Quecksilber(I)-salze umfassen das Acetat, Benzoat, Chlorat, Nitrat, Sulfat u. dgl. von einwertigem Quecksilber.

Im Hinblick auf die Giftigkeit von Silber- und Quecksilber(I)-salzen wird der Überschuß über die zur Chlorionenfällung erforderliche stöchiometrische Menge vorzugsweise vor Beginn der Fermentation entfernt. Dies kann, leicht durch Behandlung mit Schwefelwasserstoff oder anderen Sulfiden erreicht werden, wodurch sich die BiI-dung von unlöslichem Silbersulfidi oder Quecksilber (I)-sulfid ergibt. Zu diesen Sulfiden gehören Ammoniumsulfid, Natriumsulfid, Kaliumsulnd u. dgl. Es sei jedoch erwähnt, daß die Wahrscheinlichkeit, die erwünschten Schwermetall, die in dem Nährmedium vorliegen können, auszufällen, bei niedrigeren p_H-Werten geringer ist. Der p_H-Wert soll deshalb bei der Fällung unterhalb von etwa 7 liegen. Bei Verwendung von Alkalisulfiden ist es zweckmäßig, die Lösung gut zu puffern oder von Wasserstoffionenkonzentrationen auszugehen, die so niedrig sind, daß der End/-p_H-Wert 7 nicht übersteigt. Die unlöslichen Salze werden, durch Abfiltrieren oder in anderer Weise gesammelt, und das darin, enthaltene wertvolle Silber oder Quecksilber kann wieder gewonnen werden.

Ist die Entfernung eines Teils der Phosphat- und Schwermetallionen erfolgt, dann ist es zweckmäßig, den notwendigen Phosphat- und Schwermetallgehalt wiederherzustellen, was in irgendeinem Stadium vor der Fermentation durch entsprechende Zugabe vorgenommen werden kann.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nährmedium ist sonst das gleiche,, wie es zur Zeit zur Herstellung von Chlortetracyclin oder Tetracyclin empfohlen wird.

Die zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in Frage kommenden Mikroorganismen umfassen beliebige Tetracyclin erzeugende Mikroorganismen, die ebenfalls Chlortetracyclin erzeugen können. Die einzigen bisher beschriebenen Organismen gehören, zum Genus Streptomyces. Tatsächlich sind alle bekannten Chlortetracyclin und Tetracyclin, erzeugenden. Streptomyces als Strepto^· myces aureofaciens zu klassifizieren.

Die absolute Entfernung der gesamten Chlorionen aus dem Fermentationsmedium ist unnötig und sehr wahrscheinlich unmöglich zu erreichen·. Jedoch ist ein Produkt erwünscht, das von Chlortetracyclin möglichst frei ist, weshalb' zu diesem Zweck der größtmögliche Anteil an Chlorionen entfernt werden, soll. Grob· umrissen kann die Gegenwart von, ι g/ml Chlorionen in dem vorliegenden Fermentationsmedium etwa 14 g/ml Chlortetracyclin in der Fermentationsflüssigkeit bilden. Wenn sich bei dem gewählten; Fermentationsmedium und speziellen Stamm von· Streptomyces aureofaciens eine Erzeugung von. nur 500 g/ml an Gesamtantibiotikum. ergibt und wenn das Medium ι Teil/Million. Chlorionen enthält, kann man ail·- nehmen, daß die Fermentationsflüssigkeit 14 g/ml Chlortetracyclin oder etwa 3% der Gesamtmenge enthalten wird. Wenn, andererseits das Fermentationsmedium und der Streptomyces-aureofaciens-Stamm so beschaffen sind-, daß 5000 /tg/ml Antibiotikum gebildet werden — ein derartiges

Resultat ist bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens durchaus möglich — enthält das End produkt weniger als 0,3% Chlortetracyclin in der Fermentationsflüssigkeit.
Da für praktische Zwecke gegenüber einem antibiotischen Produkt dieser Art, das etwa 5 oder 6 °/o Chlortetracyclin enthält, keine grundsätzlichen Bedenken bestehen und da das erfindungsgemäße Verfahren besonders dann angewandt wird, wenn

to Tetracyclin in Ausbeuten von 2000 g/ml und höher erzeugt werden soll, ist leicht ersichtlich, daß das Fermentationsmedium bis zu 20 Teilen/Million Chloorionen enthalten kann, wenn· die Ausbeute bei der Fermentation 5000 ,ag/ml übersteigt; bei Erzeugung von Ausbeuten von nur etwa 2000 μg/ml an Gesamtantibiotikum soll das Medium nicht mehr als etwa 8 Teile/Million Chlorionen enthalten. Obwohl höhere Ausbeuten liefernde Streptomyces-aureofaciens-Stämme eine weniger gründ-

ao liehe Chlorionenentfernung erlauben, machen die großen Mengen an, Chlorionen in den meisten natürlich vorkommenden Nährstoffen die Chloridentfernung nach dem erfindungsgemäßen. Verfahren erforderlich, wenn die überraschenden hierin beschriebenen Ergebnisse erzielt werden sollen,.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1 30

200 Gewichtsteile Maisquellwasser werden mit 600 Volumteilen Wasser vermischt, mit Magnesiumsilikatfilterhilfe gerührt und abfiltriert. Der p_H-Wert der Lösung, der ursprünglich 4 beträgt, wird mit 6 η-Schwefelsäure auf 2,3 eingestellt, wofür 60 Teile erforderlich sind. Nach Zugabe von 60 Teilen einer io°/oigen wäßrigen Silbernitratlösung wird, die Mischung gerührt und die entstandene, das Silberchlorid enthaltende Fällung durch Zentrifugieren abgetrennt und zur Wiedergewinnung des Silbers aufgehoben. Die überstehende Flüssigkeit wird mit Schwefelwasserstoff gesättigt und das gebildete Silbersulfid durch Filtrieren abgetrennt. Der Überschuß an Schwefelwasserstoff wird mit Hilfe von Stickstoff im Vakuum entfernt..Nach der Entfernung· des Schwefelwasserstoffs wird das p_H mit konzentriertem Ammoniakwasser auf 4 eingestellt und das Volumen durch Zugabe von Wasser auf 1000 Volumen gebracht. Dieses enthalogenierte Maisquellwasser wird als natürlicher organischer Nährstoff für eine Fermentationsflüssigkeit verwendet.

Es wird ein Fermentationsmedium hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthält: 55 g Stärke, 5 g Ammoniumsulfat, 1,2 g Magnesiumsulfat, 60 mg Eisem(II)-sulfat-heptahydrat, 50 mg Mangansulfat-tetrahydrat, 100 mg Zinksulfat-heptahydrat, 6,1 mg Kobalt(II)-nitrat-hexahydrat, 20 ml Specköl, 9 g chloridfreies Calciumcarbonat, 80 mg Phosphorsäure, 100 g entchlorierte Maisquellwasserlösung, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, destilliertes Wasser zum Auffüllen auf ι Liter.

Das Fermentationsmedium wird 15 Minuten bei I2O° gekocht, abgekühlt und mit einem hohe Auebeuten erzeugenden Stamm von Streptomyces aureofaciens S-77 beimpft. Dann wird unter Rühren und Belüften fermentiert. Nach 120 Stunden hält das fermentierte Medium über 5000 /ig/ml an Tetracyclin, was durch spektrophotometrische Analyse bestimmt wird. Die chromatographische Analyse ergibt, daß nicht mehr als etwa S °/o Chlortetracyclin, bezogen auf den Gesamtantibiotikumgehalt, vorhanden sind.

Beispiel 2

Bei Wiederholung der Arbeitsweise gemäß Beispiel ι unter Verwendung von nicht behandeltem Maisquellwasser an Stelle des im Beispiel 1 angegebenen entchlorierten Maisquellwassers, aber des gleichen Stammes von Streptomyces aureofaciens wird etwa die gleiche Gesamtausbeute an Antibiotikum je ml Substanz erzielt, doch sind 1300· bis 1600 ,«g/ml davon Chlortetracyclin.

85 Beispiel 3

Bei Verwendung von durch Behandlung von lonenaustauscherharzen entchloriertem Maisquellwasser bei der Arbeitsweise gemäß Beispiel 1 beträgt die Gesamtausbeute an Antibiotikum weniger als etwa 2000 /ig/ml. Daraus ergibt sich, daß durch die Behandlung mit Ionenaustauschern wichtige Metaboliten aus dem Maisquellwasser entfernt wurden.

Beispiel 4

200 Gewichtsteile Maisquellwasser werden mit 600 Volumteilen Wasser vermischt, mit Magnesiumsilikatfilterhilfe verrührt und abfiltriert. Das Pu der Lösung wird mit Salpetersäure auf 2,5 eingestellt, dann werden 60 Teile io%iges Quecksilber(I)-nitrat in 3 /oiger wäßriger Salpetersäurelösung zugesetzt. Die Mischung wird gerührt, und der entstandene das Quecksilber(I)-chlorid enthaltende Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt. Die geklärte Lösung wird mit Schwefelwasserstoff gesättigt und das gebildete Quecksilber^)-sulfid durch Filtrieren abgetrennt. Der Überschuß wird unter Rühren mit Luft im Vakuum entfernt. Nach der Entfernung des Schwefelwasserstoffs wird das p_H mit konzentriertem Ammoniak auf einen Wert von: 4 eingestellt und das Volumen durch Zugabe von, Wasser auf 1000 Volumen gebracht.

Das in dieser Weise entchlorierte Maisquellwasser wird für eine wie im Beispiel 1 .angeführte Fermentation verwendet. Es wird eine Ausbeute von etwa 5000 /ig/ml Tetracyclin, erhalten. Die Chlortetracyclinmenge bei diesem Ansatz beträgt ebenso weniger als etwa 5 % des gesamten erzeugten Antibiotikums.

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE:

   i. Verfahren zur Herstellungeines praktisch chlorionenfreien Nährmediums zur · Erzeugung von Tetracyclin durch Biosynthese, dadurch ge-

   kennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von chloridhaltigen Nährstoffen mit Silber- und/oder Quecksilber(I) -ionen bei einem pg-Wert von weniger als etwa 7 behandelt und aus dieser wäßrigen. Lösung das gebildete Silber- und/oder Quecksilber (I) -chlorid abtrennt. Z. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung nach Entfernung des Niederschlags mit Sulfidionen behandelt und die gebildeten unlöslichen Stoffe aus dieser wäßrigen Lösung abgetrennt werden. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als der zu behandelnde chloridhaltige Nährstoff natürlich vorkommende Stoffe, z. B. Maisquellwasser, verwendet werden.

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