DE2505306C2 - Verfahren zur Reinigung eines Alkali- oder Ammoniuminsulins - Google Patents

Description

Insulin wurde im Jahre 1921 als Komponente des Pankreas entdeckt und erlangte dann weltweise Bedeutung zur Behandlung von Diabetes mellitus. Bei der Extraktion von Insulin aus Pankreasgewebe werden jedoch auch ziemliche Mengen an Nichtinsulinprotein entfernt, und dieses muß zur Reinigung des Insulins durch geeignete Methoden abgetrennt werden. Die wichtigste handelsübliche Form von Insulin ist Zinkinsulin, so daß die letzte Stufe bei der Reinigung normalerweise in einer Auskristallisation mit Zinkionen besteht. In den letzten Jahren wurde nun jedoch festgestellt, daß auch in solchen handelsüblichen Zinkmischungen Nichtinsulinproteine, bei denen es sich hauptsächlich um Proinsulin und proinsulinähnliches Protein handelt, in geringer Menge vorhanden sind. Diese Komponenten machen im allgemeinen zwar weniger als etwa 8 Gew.-°/o aus, sind jedoch insofern störend, als man wenigstens einige von ihnen für antigen oder immunogen hält, wie beispielsweise berichtet wird in Science 161, 165 (1958), Diabetes 18, 725 (1968), Bio-Science 20, 701 (1970) und Ann. Rev. Med. 22, 1 (1971). Es besteht daher das Problem, wie man Nichtinsulinproteine in technischem Maßstab vom Insulin abtrennen kann.

Durch bekannte Auftrenntechniken für biologische Substanzen in analytischem Maßstab, wie durch Elektrophorese und Ionenaustauschchromatographie, lassen sich auch die Nichtinsulinbestandteile von der Insulinkomponente, die neben Insulin auch insulinähnliche Proteine einschließt, aus technischen oder sogar rohen Insulinpräparationen abtrennen. Hierdurch kann man sogar die Insulinkomponente im Insulin selbst und desamidierte Insuline auftrennen. Im technischen Maßstab sind diese Verfahren jedoch nicht sonderlich geeignet

Ein an einen technischen Maßstab leichter anpaßbares Verfahren ist die Gelfiltration, und zwar sowohl die Geiexklusionschromatographie als auch die Gelpermeationschromatographie. Hierbei werden Proteine auf einer mit einem vernetzten Gel bepackten Säule voneinander getrennt Solche Verfahren wurden daher in der Vergangenheit auch bereits zur Reinigung von Insulin herangezogen, wobei als Gele vorwiegend vernetzte Dextrane verwendet wurden.

In DE-OS 19 40 130 wird unter anderem ein Verfahren zur Reinigung von Insulin beschrieben, bei dem eine Lösung des zu reinigenden Insulins einer Gelfiltration oder einer Gelfiltration und einer Säulenchromatographie unterzogen wird. Dieses Verfahren geht von kristallinem Zinkinsulin aus, das sich wesentlich schlechter reinigen läßt als beispielsweise Natriuminsulin. Das hiernach erhältlich gereinigte Insulin hat eine» Ka- Wert von 0,5, und dies bedeutet daß die hierdurch erzielbare Abtrennung der störenden Verunreinigungen nicht sehr effektiv ist

Aus FEBS Letters 32, 27 bis 29 (1973) ist ein Verfahren zur Reinigung von Zinkinsulin (kristallines Rinderzinkinsulin) bekannt bei dem eine Lösung eines solchen Insulins in 0,01η Natriumhydroxid, die 6-moIar an Harnstoff ist einer Gelchromatographie an einem mit 0,01η Natriumhydroxid äquilibrierten Gel (Sephadex® G-50 fein) unterzogen wird. Die hiernach anzuwendende 0,01n Natriumhydroxidlösung weist einen pH-Wert von wenigstens 11,1 und gegebenenfalls ven über 12 auf. Entsprechende Untersuchungen haben nun jedoch gezeigt, daß sogar bei einer gelchromatographischen Reinigung einer Insulinlösung mit einem pH-Wert von 11 Zersetzungsprodukte vorwiegend durch cc, /?-Elimination des Cysteinschwefels gebildet werden, so daß die hierdurch erzielbare Reinigung noch immer sehr zu wünschen übrig läßt

In Acta Biol. Med. Germ. 33, 399 bis 406 (1974) wird ebenfalls ein Verfahren zur Reinigung von kristallinem Insulin durch Gelchromatographie einer entsprechenden Lösung an Dextrangel (Sephadex® G-50 fein) beschrieben. Diese Gelfiltration wird in 5O°/oiger Essigsäure, und somit in einem sauren System, durchgeführt, was ebenfalls nur ungenügenden Reinigungseffekt zur Folge hat.

Aus Experientia 28, 1169 (1972) und aus Chem. Abstracts 81 (1974), Referat 16 731 sind Verfahren zur Abtrennung höhermolekularer Fraktionen von Insulin und

so somit zur Reinigung von Insulin bekannt Das erste Verfahren besteht in einer Gelfiltration α einem sauren System. Beim zweiten Verfahren werden keine Angaben oemacht, welches Lösungsmittelsystem hierfür verwendet wird. Es dürfte sich dabei jedoch ebenfalls um ein essigsaures System handeln. Diese beiden Verfahren ergeben somit genau wie die oben beschriebenen Arbeitsweisen unter Verwendung 50%iger Essigsäure wiederum nur eine unvollständige Reinigung.
Die bekannten Verfahren zur Reinigung von Insulin durch Gelfiltration sind obigen Angaben zufolge insgesamt unbefriedigend, da sie trotz des dabei auftretenden Verlusts an Insulin kein Insulin mit der an sich er= wünschten Reinheit ergeben, nämlich ein Produkt, das neben Insulin selbst praktisch nur noch nichtstörende insulinähnliche Proteine enthält.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Reinigung von Insulin, das in einfacher Weise ein Produkt mit hohem Reinheitsgrad er-

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gibt, und diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch das aus den Ansprüchen hervorgehende Verfahren gelöst.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren vorgeschriebenen verschiedenen Parameter ergeben nun überraschenderweise ein Insulin mit einer so hohen Reinheit, daß der darin enthaltene Proinsulingehalt weniger als 0,05 Gew.-% beträgt, während sich unter Anwendung eines bekannten Reinigungsverfahrens nur ein Insulin erzielen läßt, das immer noch etwa 5 Gew.-% Proinsulin enthält Nach der in DE-OS 19 40 130 beschriebenen Arbeitsweise ergibt sich beispielsweise ein gereinigtes Insulin mit einem IQ-Wert von OA während erfindungsgemäß gereinigtes Insulin über einen ^j-Wert von etwa 0,7 bis 0,8 verfügt, was eine wesentlich bessere Abtrennung der störenden Verunreinigungen belegt Erfindungsgemäß, läßt sich daher im allgemeinen ein Insulin mit einer Reinheit von bis zu 99% erzielen, was einen mit bekannten Verfahren nicht zu erreichenden Reinigungseffekt bedeutet Der Reinheitsgrad von Insulin steht mit seiner andienen Wirksamkeit in umgekehrter Beziehung, so daS jede noch so geringe prozentuale Verringerung der in Insulinen vorhandenen Verunreinigungen für den am Diabetes mellitus leidenden und mit Insulin zu behandelnden Patienten ganz wesentlich ist Daß sich dieser hohe Reinigungsgrad praktisch nur unter Anwendung der beim erfindungsgemäßen Verfahren vorgeschriebenen verschiedenen "Parameter erreichen läßt, ist inv,Lichte des Standes der Technik als besonders überraschend anzusehen.

Beim erfmdungsgemäßen Verfahren kann im allgemeinen jedes in Was.« «sr quellbare und für Proteinlösungen geeignete Gel eingesetzt werden, das im Trockenzustand und somit im nichtgequollenen Zustand, eine Wasserrückaufnahme von wenigstens etwa 4 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Trockeneis, und, einen Teilchendurchmesser von weniger als etwa 0,1 mm aufweist Die Wesserrückaufnahme des Gels beträgt vorzugsweise etwa 4 bis 98%, und insbesondere etwa 5 bis 20%. Die Durchmesser der Trockengelteilchen sind vorzugsweise kleiner als etwa 0, 08 mm und liegen insbesondere zwischen etwa 0,02 und 0,08 mm. Beispiele geeigneter Gele sind Stärke (unter Einschluß von Maisstärke), vernetztes Galactomannan, vernetztes Dextran, Agar und Agarose, Polyacyiamide, Copolymere aus Acylamid und Methylenbisacrylamid, Copolymere aus Methylenbisacrylamid und' Vinylethylcarbitol und/oder Vinylpyrrolidon. Bevorzugte Gele sind vernetzte Dextrangele.

Die Art der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Säule ist nicht kritisch. Wahl von Höliie, Durchmesser oder Konfiguration der Säule hängen von den gewünschten Verfahrensparametern ab. Mit zunehmender Säulenhöhe wird natürlich die Fließgeschwindigkeit langsamer, da der Säulenrückdruck umgekehrt proportional zur Säulenhöhe ist. Ein übereinander aufgestockter Säulenaufbau wird daher bevorzugt. Für normale Produktionszwecke ist im allgemeinen eine Anordnung aus sechs Sektionen ausreichend.

Die Insulin-Gesamtmenge (Alkali- oder Ammoniuminsulin) ist beim erfindungsgemäßen Verfahren so gewählt, daß sie für eine Säulenbeladung von etwa 0,8 bis 6,7 g pro Liter Bettvolumen ausreicht, wobei eine Säulenbeladung von etwa 3,5 bis 5,0 g pro Liter Bettvolumen bevorzugt ist und am besten bei einer Säulenbeladung von etwa 4,5 g pro Liter Bettvolumen gearbeitet wird. Natürlich lassen sich ohne weiteres optimale Bedingungen für jede vorgegebene Säule ermitteln.

Das Gel läßt sich nach irgendeiner bekannten Methode aufquellen und dann in die Säule packen. Im allgemeinen wird das Gel im Elutionsmittel aufgequollen. Wahlweise kann man das Gel jedoch auch in 30%igem wäßrigem Ethanol aufquellen, dann dekantieren und das Quellmittel durch das Elutionsmittel ersetzen.

Im allgemeinen löst man das Alkali- oder Ammoniuminsulin in destilliertem Wasser und stellt den pH-Wert mit verdünnter Base oder mit verdünntem organischem Puffer je nach Wunsch auf etwa 7,5 bis 9,5 ein. Hierzu geeignete Basen sind Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid oder Ammoniumhydroxid. Natriumhydroxid wird bevorzugt Beispiele geeigneter organischer Puffer sind Glycin-Natriumhydroxid oder Tris(hydroxymethyl)aminoinethan.

Das als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren benötigte Alkali- oder Ammoniuminsulin muß eine Reinheit von wenigstens etwa 80% haben and kann nach irgendeinem bekannten Verfahren hergestellt werden. Es wird vorzugsweise gemäß US-PS 37 19 655 hergestellt Unter einer Reinheit von wenigstens 80% ist zu verstehen, daß der Insulingehalt unter Einschluß der nichtinsulinähnlichen Proteine mit hypoglykämischer Wirksamkeit wenigstens etwa 80% der gesamten vorhandenen Proteine betragen muß.

Die Konzentration an Alkali- oder Ammoniuminsulin in der auf die Säule aufgegebenen Insulinlösung beträgt etwa 1 bis 8%, auf Gewicht pro Volumen bezogen. Die bevorzugte Konzentration liegt bei etwa 4 bis 6%.

Das Alkali- oder Ammoniuminsulin soll zur Erzielung sauberer Ergebnisse in einem Lösungsmittelvolumen gelöst werden, das geringer ist als das Auftrennvolumer., worauf im folgenden näher eingegangen wird.

Bei der Chromatographie wird der Verteilungskoeffizient Kd als das Verhältnis aus der Konzentration an gelöstem Stoff in der mobilen Phase und der Konzentration an gelöstem Stoff in der stationären Phase definiert Bei der Gelfiltration ist die mobile Phase das sich im Hohlraum zwischen den Gelteilchen bewegende Lösungsmittel. Die stationäre Phase ist das in den Gelteilchen aufgesogene Lösungsmittel, nämlich das in den Poren der Gelteilchen eingefangene Lösungsmittel. Der Wert Kd gibt somit den Teil an ausgesogenem Lösungsmittel an, der von einem gelösten Stoff durchdrungen werden kann.

Über den Verteilungskoeffizienten Kd läßt sich das Elutionsvolumen V^ eines gelösten Stoffs durch folgende Gleichung ausdrücken:

V_e = V₀ + Kd ■ Vi,

worin V₀ das Leervolumen der Säule und V, das Volumen des aufgesogenen Lösungsmittels darstellen. Löst man diese Gleichung nach Kd auf, dann ergibt sich folgender Zusammenhang:

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65 Wird die Dichte von Wasser als Einheit angenommen, dann gilt

V₁ ■ = a · W_n

worin a das Gewicht des Gels im Trockenzustand ist und W_r die WasseiYückaufnahme bedeutet. Der Verteilungskoeffizient Kd läßt sich demnach aus folgender

Gleichung bestimmen:

Enthält eine Lösung zwei gelöste Stoffe, dann ergibt sich das Elutionsvolumen für jeden gelösten Stoff aus folgenden Gleichungen:

V_c' = Vo + KJVi

Ve" = V₀+ KJ¹Vi.

Das Abtrennvolumen V_s ist die Differenz zwischen den Elutionsvolumina aus den beiden gelösten Stoffen, wobei folgendes gilt:

V_s = Ve'-' - Ve' V_s = (KJ' - KJ)V,

Das Ausmaß der Trennung zweiter (oder mehrerer) gelöster Stoffe ist somit wenigstens zum Teil von der Säulenbeladung abhängig. Da sich die Meng2 an niedermolekularem gelöstem Stoff der Grenze der verfügbaren Poren nähert, muß die Trennung zweier gelöster Stoffe notwendigerweise abnehmen. Innerhalb der beim erfindungsgemäßen Verfahren vorgeschriebenen Werte für die Säulenbeladung kann das Ausmaß der Trennung daher schwanken.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende wäßrige Lösung eines Alkali- oder Ammoniuminsulins hat, wie bereits erwähnt, einen pH-Wert von etwa 7,5 bis 9^. Normalerweise ist das Elutionsmittel eine wäßrige Lösung der gleichen Base oder des gleichen Puffers, wie man sie auch zur Herstellung der Insulinlösung verwendet.

Das Elutionsmittel kann gewünschtenfalls bis zu etwa 0,02 Mol eines anorganischen Salzes pro Liter enthalten, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Ammoniumchlorid. Bevorzugt wird eine Salzkonzentration von 0,01 MoI, vobei vorzugsweise Natriumchlorid verwendet wird. Durch Verwendung eines solchen Salzes läßt sich die Auftrennung verbessern und die Absorption basischer Substanzen durch das Gel verhindern.

Die Eiution der Säule wird bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 30° C durchgeführt. Vorzugsweise wird bei Umgebungstemperatur oder da; unter gearbeitet.

Der Verlauf der Elution wird in geeigneter Weise, beispielsweise durch Messung der Ultraviolettabsorption einer jeden Fraktion bei 280 mn verfolgt. Die das gewünschte gereinigte Insulin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt uand dann normalerweise zu Zinkinsulin umgesetzt, da dies die derzeit wichtigste Insulinform darstellt.

Die Umwandlung zu Zinkinsulin von erfindungsgemäß gereinigtem Alkali- oder Ammoniuminsulin erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,0 in Gegenwart eines Ammoniumacetatpuffers. Eine Isolierung des Alkali- oder Ammoniuminsulins aus dem Elutionsmittel oder eine Konzentrierung der Lösung des gereinigten Insulins vor der Kristallisation mit Zink sind nicht erforderlich. Die beim erfindungsgemäßen Verfahren als EIuat anfallende gereinigte Insulinlösung ist nämlich bereits so konzentriert, daß Salz- oder isoelektrische Ausfällungen nicht erforderlich sind, obwohl derartige Verfahren gewünschtenfalls zusätzlich angewandt werden können.

Die gegenüber bekannten Verfahren erfindungsgemäß erzielbare höhere Reinheit des jeweiligen Alkalioder Ammoniuminsulins und somit auch des daraus gegebenenfalls anschließend hergestellten Zinkinsulins läßt sich durch mehrere Methoden belegen. Eine Möglichkeit hierzu besteht in einer direkten Analyse von Zinkinsulin bezüglich seiner Nichtinsuiinproteinkomponenten, wie Proinsulin und Glucagon. Die Gegenwart hochmolekularer Proteine, wozu normalerweise auch das proteolytische Enzym Proaminase gehört, läßt sich ermitteln, indem man die Stabilität einer Protamininsulinsuspension bei erhöhter Temperatur mißt. Bei Anwesenheit von Protaminase dissoziiert der Protamin-Insu-Iin-Komplex nämlich infolge Protaminabbau. Weiter kann man auch andere physikalische Eigenschaften messen, wie die Löslichkeit des Zinkinsulins bei neutralem pH-Wert und die Färbung der erhaltenen Lösung. Schließlich läßt sich die Reinheit des jeweiligen Insulins auch anhand seiner spezifischen Wirksamkeit bei biologischen und immunologischen Versuchen ermittein.

Das in obiger Weise erhaltene Zinkinsulin ist infolge seiner besonderen Reinheit ein begehrtes Material zur Formulierung der verschiedener, pharmazeutischen Formen von Insulin, wie normalem insulin, Isonhaninsulin, Protaminzinkinsulin, Zinkinsulinsu^pensionen oder Globininsulin. Ferner erlaubt dieses reinere Zinkinsulin die Herstellung eines neutralen Insulins, das stabiler ist als saures Insulin, da die bisher in Zinkinsulin vorhandenen λ erunreinigungen bei neutralem pH-Wert häufig teilweise ausfallen. Zu solchen Verunreinigungen gehören beispielsweise insulinabbauende Enzyme, wie Trypsin und Chymotrypsin, die die Stärke der Insulinpräparate vermindern. Weiter lassen sich mit einem solchen reineren Zinkinsulin auch langer wirksame Schweine- und Rinderinsulinzubereitungen formulieren, ohne da3 wie bisher eine weitere Reinigung erforderlich ist. Bei der Herstellung von Isophaninsulin aus solchem Zinkinsulin braucht man zudem beispielsweise weniger Protamin, da durch das Fehlen der sauren Proteinverunreinigungen nur die zur Ausfällung des Insulins erforderliche Proteinmenge verwenden werden muß.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann gewünschtenfalls auch mit anderen Reinigungsverfahren kombiniert werden. Man kann die Alkali- oder Ammoniuminsulinlösung daher vor Durchführung dieses Verfahrens beispielsweise ein- oder mehrmals filtrieren, und gleiches gilt auch für das eiuierte Insulin vor seiner Umwandlung zu Zinkinsulin.

Beispiel

5,53 g Natriuminsulin vom Rind mit einer Stärke von 26,4 Einheiten/mg (was einer Reinheit von etwa 91 bis 92% entspricht) und einem Proinsulingehalt von 7,2 Gew.-% werden in destilliertem Wasser suspendiert.

Sodann gibt man bis zur Einstellung eines pH-Wertes von 9,0 verdünntes Natriumhydroxid zu. Das Volumen der erhaltenen Lösung beträgt 100 ml. Hierauf wild ein vernetztes Dextrangel mit einer Wasserrückaufnahme von 5% und einer Teilchengröße von 0,02 bis 0,08 mm in wäßrigem Natriumhydroxid mit einem pH-Wert von 9,0 äquilibriert. Mit Jem so gequollenen Gel wird eine 4,0 ■ 43,0 cm messende Säule mit einem Bettvolumen von 540 ml bepackt. Auf die Säule wird dann eine 40 ml Teilmenge der zu reinigenden lnsulin!ö;ung gegeben.

Die Säule wird mit wäßrigem Natriumhydroxid vom pH 9,0 eluiert, wobei etwa 6,5 ml Fraktionen aufgefangen werden. Die Elutioii wird durch Messung der Ultraviolettabsorption bei 280 πιμ überwacht. Die der Insulin-

komponente entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und mit 6n Chlorwasserstoffsäure auf pH 3,0 angesäuert. Die Lösung wird filtriert und mit Zinkchlorid versetzt, worauf man das Zinkinsulin bei einem ph-Wert von 6,0 aus Ammoniumacetatpuffer isoliert. Die Ausbeute an Zinkinsulin beträgt 1,83 g, was einer auf das Ausgangsmaterial bezogenen Ausbeute von 82,5% entspricht. Das erhaltene Insulin hat eine Stärke von 26,8 Einheiten/mg (was einer Reinheit von 99% entspricht) und einen Proinsulingehalt von weniger als 0,05 Gew.-%. Die auf Einheiten bezogene Ausbeute beträgt 83,8%.

Vergleichs versuch

Eine 37,5 ml-Teilmenge der ursprünglichen Insulinlösung wird in der beschriebenen Weise ohne Gelfiltration direkt zu Zinkinsulin umgewandelt. Hierbei erhält man eine Ausbeute von 1.87 g (90,1%) Zinkinsulin mit einem Proinsiilinpeh.'ilt vnn 5 4 Clpu. -Wn 20,

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Reinigung eines Alkali- oder Ammoniuminsulins durch Aufbringen einer wäßrigen Lösung eines Insulinsalzes auf eine ein gequollenes Gel enthaltende Säule, wobei das Gel im Trockenzustand eine Wasserrückaufnahme von wenigstens etwa 4 Gewichtsprozent und einen Teilchendurchmesser von weniger als etwa 0,1 mm aufweist, und Eluieren des Insulins bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 30⁰C mit einem wäßrigen Elutionsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines Alkali- oder Ammoniuminsulins mit den Kenndaten:

   a) Reinheit des Insulins wenigstens etwa 80%,

   b) Konzentration an Insulin von etwa 1 bis 8%, auf Gewicht pro Volumen bezogen,

   c) Insulin-Gesamtmenge für eine Säulenbeladung von etwa 0,8 bis 6,7 g pro Liter Bettvolumen ausreichend und

   d) einem pH-Wert von etwa 7,5 bis 9,5

   auf die Säule aufbringt und mit einem wäßrigen Elutionsmittel dessen pH-Wert in dem unter d) angegebenen Bereich iiegt eluiert

   Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelfiltration bei einer Säulenbeladung von etwa 3,5 bis 5,0 g Insulin pro Liter Bettvolumen durchführt

   3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelfiltration bei einer Säulenbeladung von etwa 4,5 g Insulin pro Liter Bettvolumen durchführt