DE2307051B2 - Verfahren zum Reinigen von langsamen a - und ß -Glykoproteinen aus Mikrobenkörpern und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen - Google Patents

Verfahren zum Reinigen von langsamen a - und ß -Glykoproteinen aus Mikrobenkörpern und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen

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Description

In der DE-OS 20 24 586 wurde die Gewinnung eines Gemisches aus langsamen tx- und /?-Glykoproteinen durch Extraktion von Kulturen von Mikrobenstämmen, die vorher lysiert worden waren, beschrieben. Die langsamen tx- und ^-Glykoproteine sind hiernach erhältlich durch
a) Kultivierung eines Mikrobenstammes, ausgewählt aus der Gruppe von Pneumokokken, Streptokokken, Neisseria, Staphylokokken, Mikrokokken, Klebsiella pneumoniae und Haemophilus influenzae oder einer Mischung von zwei oder mehreren dieser Stämme oder einer Mischung von verschiedenen Typen eines dieser Stämme, wobei man die Mikrobenkörper nach vollständiger Kultivierung manuell oder automatisch sammelt und in einem wäßrigen Medium suspendiert,
b) in der Suspension die Mikrobenkörper chemisch, physikalisch und/oder enzymatisch lysiert und die Reste der Mikrobenkörper physikalisch abtrennt,
c) die so erhaltene Klare Lösung eindampft, den Rückstand mit Lipoidlösungsmitteln behandelt,
d) das von Lipoiden befreite Produkt in einem wäßrigen Lösungsmittel löst, daraus die Eiweißkörper physikalisch fällt und entfernt und
e) aus der erhaltenen klären, wäßrigen Lösung die langsamen Glykoproteine durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels oder einer Mischung derartiger Lösungsmittel ausfällt und gegebenenfalls durch in der Biochemie übliche Verfahren weiter reinigt.
Die nach dem genannten Verfahren erhaltenen Glykoproteine besitzen sehr interessante therapeutische Eigenschaften. Sie entfalten beträchtliche anti-inflammatorische Eigenschaften und schnell wirkende und nicht spezifische immunisierende Eigenschaften. Sie besitzen außerdem den Vorteil, daß sie weder Allergien hervorrufe« noch hyperthermisch wirken und daß sie keine Unverträglichkeitserscheinungen an der Injektionsstelle hervorrufen.
Die Struktur dieser Langsamen tx- und jS-GIykoproteine kann durch deren Verhalten bei der Elektrophorese gegenüber Vergleichs-Glykoproteinen und insbesonde-ο re gegenüber Serum-Glykoproteinen gezeigt werden.
Die chemische Natur dieser Substanzen wird durch chemische Reaktionen bestätigt, wie durch ihren Gehalt an Hexosen und Pentosen, durch die ungefähre Bestimmung des Molekulargewichts unter Verwendung von selektiven Chromatographie-Mitteln, wie modifizierte Cellulosen, Sephadex-Gel oder Molekularsiebe, durch den Gehalt an Protein-Fraktion des Moleküls, der bestimmt wird durch die biuretogene Wirkung, berechnet im Vergleich zu der Serum-Albumin-Eichung, durch den Gehalt an Hexosaminen und durch den Gehalt an Sialsäure.
Das durch das genannte Verfahren erhaltene Gemisch aus langsamen λ- und jä-Glykoproteinen kann als ein aus langsamen, thermostabilen, säurelöslichen und in Ammoniumsulfatlösungen löslichen tx- und 0-Glykoproteinen bestehendes definiert werden.
Die durch das erwähnte Verfahren erhaltenen langsamen tx- und /Ϊ-Glykoproteine haben einen Gehalt an gebundenen Hexosen zwischen 50 und 60%.
Demgegenüber betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Reinigen von langsamen tx- und 0-Glykoproteinen aus Mikrobenkörpern, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Pneumokokken, Streptokokken, Neisseria, Mikrokokken, Staphylokokken, Klebsiella pneumoniae und Haemophilus influenzae oder einer Mischung dieser Keime oder einer Kombination von verschiedenen Typen einer gleichen Mikrobenart, nach Patentanmeldung P 20 24 586.7-41, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die nach e) erhaltenen langsamen λ- und j3-Glykoproteine in wäßriger Lösung zur weiteren Reinigung einer Dialyse an einer oder mehreren kalibrierten Membranen unterwirft, indem durch Verwendung einer Art oder mehrerer Arten von Membranen die inaktiven oder wenig aktiven Fraktionen abgetrennt und die durch die Membran in der Dialysezelle zurückgehaltenen, sehr reinen Fraktionen gesammelt, diese einer Chromatographie über hydrophilem polymerisierten Gel unterworfen und die nichtgebundene Fraktion isoliert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, die langsamen tx- und j3-Glykoproteine in sehr reiner und demzufolge sehr aktiver Form zu erhalten. Ferner erlaubt es, den größten Teil der Abbauprodukte der Proteine, die noch in dem Gemisch verbleiben konnten, zu eliminieren und demzufolge ein Endprodukt in außerordentlich gereinigter Form zu erhalten.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren können folgende Membranen, die als Molekularsiebe wirken, zur Anwendung gelangen:
1.) netzförmige Membranen mit selektiver Permeabilität, vorzugsweise diejenigen, die unter dem Handelsnamen AMICON XM 300 (Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts, USA) erhältlich sind, und
2.) Membranen mit selektiver Permeabilität, vorzugsweise die unter dem Handelsnamen AMICON XM 50. PM 30 und UM 2 erhältlichen.
Folgende hydrophile polymerisierte Gele sind verwendbar:
1.) SEPKAROSEeB-GeI,
2.) SEPHADEX G 200-GeL
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen langsamen «- und 0-Glykoproteine werden durch ihr Molekulargewicht, ihren Gehalt an gebundenen Hexosen und durch das Verhältnis:
gebundene Hexosen
Proteine
definiert.
Die nach diesem Verfahren erhaltene sehr reine Fraktion besteht aus Glykoproteinen mit einem Molekulargewicht von 106 Dalton oder darüber, enthält zwischen 60 und 65% gebundene Hexosen, und weist ein Verhältnis:
Hexosen
Proteinsubstanzen
in der Nähe von 7 auf. Sie enthält im allgemeinen etwa 62% gebundene Hexosen. Auf Grund der Schwierigkeiten der Eichung des Maßes der Zucker kann jedoch dieser Gehalt zwischen 60% und 65% schwanken, ohne daß es möglich ist, daraus Rückschlttsse auf die Reinheit der Fraktion zu ziehen.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen langsamen λ- und 0-Glykoproteine sind anti-inflammatorisch wirksam und stimulieren die nichtspezifischen Abwehrkräfte des Organismus. Sie sind besonders geeignet für die Behandlung von Knochengelenkleiden, Bronchitiden und Mikrobeninfektionen.
Gegenüber den Produkten der DE-OS 20 24 586 zeichnen sich aufgrund von Vergleichsversuchen die erfindungsgemäß erhältlichen durch eine doppelt so hohe antiinfiammatorische Aktivität bei gleichzeitig geringfügig besserer Stimulierung der nichtspezifischen Abwehrkräfte des Organismus und gleich guter antibakterieller Aktivität aus.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist demnach eine pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen, perlingualen, oralen, rektalen, permucosen oder topischen Verabreichung, enthaltend die vorliegend erhältlichen langsamen α- und/?-Glykoproteine.
Genannt seien z. B. die injizierbaren Lösungen oder Suspensionen in Ampullen oder Mehrfachdosenfläschchen, Sublingualtabletten, Tabletten zur Auflösung im Darm, Aerosole, Pulver, Cremes, Salben, Lotionen, Suppositorien oder Kügelchen.
Die Dosierung ist abhängig von der Indikation und der Verabreichungsform.
Das nachfolgende Beispiel soll die Erfindung erläutern.
Herstellung der Ausgangssubstanz
1.) Gewinnung des Mikrobenextrakts
Der ausgewählte Mikrobenstamm (Klebsellia Pneumoniae) wird in einer Fermentiervorrichtung mit einem geeigneten Milieu kultiviert. Nach Stillegung der Kultur werden die Keime während 8 Tagen bis zur Stabilität der Mikrobensuspension lysiert.
Das Lysat wird anschließend konzentriert und mit einem Methylal/Methanol-Gemisch (4/1) von Lipoiden befreit. Der Bodensatz der Zentrifugierung wird mit Methanol gewaschen, in Wasser aufgenommen, und es wird Formol hinzugegeben. Der Mikrobenextrakt wird einer letzten Reinigung unterworfen durch Ausfällen seiner wäßrigen Lösung mit einem Methylal/Metiianol-Gemisch und Waschen des Niederschlags mit Methanol.
?.) Eigenschaften des Mikrobenextrakts
Der erhaltene Extrakt ist klar und in wäßrigem Milieu löslich, und er fällt in einem 10%igen (Gewicht/Volumen) Trichloressigsäure-Milieu in 0,6 n-Perchlorsäure oder in 3,6molarem Ammoniumsulfat bei einem
ίο pH-Wert von 7,0 und bei einer Temperatur von 15°C nicht aus. Eine partielle Ausfällung wird durch Zugabe einer Mangansulfatlösung oder Cetylpyridiniumchlorid-Lösung (C.P.C.) erhalten.
Die Hauptbestandteile des Mikrobenextrakts wurden ausgewertet, und die Dosierungen zeigten insbesondere einen Gehalt an neutralen gebundenen Hexosen von 26 bis 32% je nach den Proben und 6,2% a-Aminostickstoff.
Beispiel
Man löst 2 g der langsamen ac- und 0-Glykoproteine, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren, ausgehend von einer Klebsellia Pneumoniae-Kultur, erhalten worden waren, in 400 ecm Wasser. Man führt diese Lösung in eine Dialysezelle, die durch eine AMICON XM 300-Membran verschlossen wild, ein. Die Lösung wird unter stetigem Rühren und unter leichtem Überdruck (0,7 Bar) gehalten. Man führt die Dialyse durch durch stetiges Verdrängen des Dialysen-
jo gleichgewichts durch Ersatz des filtrierten Volumens. Zu diesem Zweck gibt man ein gleiches Volumen destilliertes Wasser hinzu. Dieses Einbringen wird kontinuierlich durchgeführt, und man nimmt den Dialyseschritt als beendigt an, wenn das gesamte dialysierte Volumen gleich oder mehr als das lOfache des Anfangsvolumens beträgt. Der Rückstand der Dialysezelle wird gesammelt und auf SEPHARO-SE 6 B-Gel Chromatographien, und die auf das SEPHA-ROSE 6 B-Gel nichtfixierte Fraktion wird aufgefangen und durch Lyophilisierung zur Trockne gebracht.
Man kann gleichfalls in mehreren Schritten vorgehen, indem man zunächst eine Dialyse in einer Dialysezelle mit einer AMICON PM 30-Membran durchführt, dann in einer zweiten Dialysezelle mit einer AMICON X 50-Membran und schließlich in einer Zelle mit einer AMICON XM 300 eine dritte Dialyse durchführt. Man erhält nach der Chromatographie auf SEPHARO-SE 6 G-GeI und nach Lyophilisierung der nicht gebundenen Fraktion eine Fraktion, die mit derjenigen, die nach einer einzigen Dialyse an einer Membran durchgeführt wurde, identisch ist.
Die so erhaltenen (an der Membran XM 300 zurückgehaltenen und an SEPHAROSE 6 B-Gel nicht zurückgehaltenen) langsamen λ- und ß-Glykoproteine weisen ein Molekulargewicht von ΙΟ6 Dalton und darüber auf. Diese makromolekularen Substanzen haben einen Gehalt an Hexosen, der höher liegt als derjenige der weniger reinen Fraktionen, die durch das Verfahren der DE-OS 20 24 586 erhalten werden. Er beträgt im allgemeinen etwa 62%. Im Gegensatz dazu ist der «-Aminostickstoff-Gehalt gering (1,6%) und niedriger als derjenige der früher erhaltenen Fraktionen.
Die so erhaltenen langsamen α- und /?-Glykoproteine werden durch Harnstoff in Smolarer Lösung oder durch Lösungen von Reduktionsmitteln nur zum Teil dissoziiert. Im Gegensatz dazu können sich die Moleküle mit niedrigerem Molekulargewicht, die im Laufe der
Dialyse abgetrennt wurden, bei Abwesenheit des Dissoziationsmitteis spontan reassoziieren. Jedoch unterscheiden sich diese so »dencvo« erhaltenen Makromoleküle von den langsamen «- und /?-Glykoproteinen, die an der AMICON XM SOO-Membran zurückgehalten werden, wenn man die langsamen «- und /?-Glykoproteine der Einwirkung verschiedener Enzyme (Pronase, Trypsin, Pankreatin, Hyalaronidase) mit nachfolgender Fraktionierung an Membranen unterwirft Man stellt fest, daß nur ein geringer Anteil der Makromoleküle gegenüber diesen Enzymen empfindlich ist und daß die pharmakologische Aktivität nicht merklich verändert ist
Die Ausbeute der Reinigung gemäß dem vorstehend beschriebenen Vorgehen beträgt etwa 30 bis 35%. Die so erhaltenen langsamen α- und ^-Glykoproteine weisen einen Gehalt an gebundenen Hexosen von etwa 62% und einen Gehalt an Proteinsubstiyizen von etwa 9% auf; das Verhältnis:
gebundene Hexosen Proteinsubstanzen
liegt in der Nähe von 7. Jedoch wird die Auswertung durch die Tatsache erschwert daß die Eichung der Färbungen mit Methylresorcin nicht mit Zuckern erfolgt, die tatsächlich in den langsamen oc- und /3-Glykoproteinen enthalten sind, sondern willkürlich mit Galaktose und Mannose.
Strukturuntersuchung
Die saure Hydrolyse im Vakuum erlaubt es, die verschiedenen Bestandteile der Moleküle nach der Trennung auf Celluloseplatten nachzuweisen. Man kann so eine sehr große Anzahl von Aminosäuren nachweisen, was diese langsamen α- und 0-Glykoproteine von den Peptidgl.ykanen und den Osaminen unterscheidet. Unter den Zuckern stellt man die Anwesenheit von Glucose, Galaktose Galaktose und Mannose fest.
Die Anwesenheit von Ribose wurde nicht nachgewiesen.
Nach der alkalischen Hydrolyse, die eine Spaltung der O-Glykosidischen Bindungen herbeiführt, ergibt eine Untersuchung der gebildeten Spaltstücke, daß die langen Glykanketten auf kleine Proteinschleifen aufgepfropft sind.
Es liegt somit ein Molekül vom Glykoproteincharakter vor, was aus der makromolekularen Beschaffenheit, der Beständigkeit gegenüber proteolytischen Enzymen und der Beständigkeit gegenüber lipolytischen Enzymen (Lipase, Pankreatin) hervorgeht. Es handelt sich im übrigen nicht um ein Mucopolysaccharid. da es durch Cetylpyridiniumchlorid nicht ausfällbar ist.
Die Elektrophorese bei einem pH-Wert von 8,2 in Gegenwart eines Natriumbarbital-Puffers beweist in der Hauptsache einen Mobilitätspeak <x — ß.
Versuchsbericht
Pharmakologische Untersuchung der Glykoproteine a) Antiinflammatorische Aktivität
Zur Untersuchung der antiinflammatorischen Aktivität verwendet man den Test des Pfotenödems, das durch lokale Injektion verschiedener phlogogener Mittel, die eine geringfügig verschiedene inflammatorische Reaktion hervorrufen, herbeigeführt wird.
Die Messung des Ödems erfolgt plethysmometrisch vor und nach der Injektion des nhlogogenen Mittels.
Die zu untersuchenden Produkte werden intraperitoneal eine Stunde vor der Injektion des irritierenden Produkts verabreicht Man bestimmt die aktive Dosil in mg/kg, die zu einer 40%igen Rückbildung des Ödems in bezug auf die Vergleichstiere führt
Versuchsergebnisse, erhalten mit den langsamen a- und jS-Glykoproteinen, hergestellt gemäß der PA P 20 24 586.7-41
Phlogogene Mittel
Dosis
Karragheenin
Kaolin
Ovalbumin
Hämolysin
0,05 mg/kg
0,5 mg/kg
1 mg/kg
0,2 mg/kg
Vergleichsergebnisse zwischen den langsamen λ- und /J-Glykoproteinen,
hergestellt gemäß dem Verfahren der Patentanmeldung P 20 24 586.7-41, bezeichnet als Glykoproteine A und den langsamen λ- und ^-Glykoproteinen, die erfindungsgemäß erhalten wurden, bezeichnet als Glykoproteine B.
Man führte einen Vergleich hinsichtlich des Pfotenödems mit Karragheenin zwischen den Glykoproteinen A und den Glykoproteinen B und den am häufigsten
jo experimentell verwendeten antiinflammatorischen Mitteln durch.
Antiinflammatorische Mittel
Zu 40 % aktive Dosis
Indomethacin
Deltacortison
Phenylbutazon
Glykoproteine A
Glykoproteine B
2 mg/kg
5 mg/kg
50 mg/kg
0,05 mg/kg
0,025 mg/kg
Die Glykoproteine A und vor allem die Glykoproteine B erweisen sich als die am besten wirksamen antiinflammatorischen Mittel. Diese antiinflammatorisehe Wirkung ist außerdem durch ihre Vielseitigkeit bei der überwiegenden Anzahl der pharmakologischen Untersuchungen gekennzeichnet.
Im Gegensatz zu den anderen antiinflammatorischen Mitteln hat man für die Glykoproteine A ebenso wie für die Glykoproteine B keine ulcerogene Wirkung beobachtet.
b) Stimulierung der nichtspezifischen
Abwehrkräfte
Diese Stimulierung wurde mit dem »clearance«-Test mit Kohle bei der Maus untersucht, wobei man die Technik von Halpern verwendete, die darin besteht, dem Tier in die Augenhöhle eine kolloidale Kohlesuspension zu injizieren und in Abhängigkeit der Zeit die Kinetik des Verschwindens der Kohle in dem Blut zu bestimmen, indem man Messungen der optischen Dichte vornimmt.
Die Produkte werden dem Tier intraperitonea! 24 und 48 Stunden vor dem Test verabreicht, und die Ergebnisse werden als prozentuale Aktivität in bezug auf die Vergleichstiere ausgedrückt, die lediglich eine kolloidal? Kohleip. jsktion erhalten haben.
7 Produkte 23 07 051 % Aktivität
8 Minuten nach
der Injektion 		δ
Glykoproteine A
Glykoproteine B
Glykoproteine A
Glykoproteine B		 Dosen 5ö %
52%
46%
45%		 Vergleich
30 Minuten nach
der Injektion
1 mg/kg
1 mg/kg
0,5 mg/kg
0,5 mg/kg		 Si %
84%
77%
82%
Die Untersuchung der Ergebnisse führt zur Feststellung, daß beide Produkte eine ausgeprägte Stimulierung der Abwehrkräfte des Organismus hervorrufen.
c) Antibakterielle Aktivität der erfindungsgemäß
erhaltenen langsamen «- und /?-Glykoproteine
Die langsamen λ- und ^-Glykoproteine führen zu einem intensiven und anhaltenden antibakteriellen Schutz bei sehr geringen Dosen. Diese Wirkung ist vielseitig und tritt sowohl bei Gram-positiven als auch Gram-negativen Stämmen auf. Die Wirkung ist stärker schützend als heilend.
Das Produkt wird Mäusen vor der Injektion der Stämme verabreicht. Die Untersuchungen wurden an zahlreichen Stammarten durchgeführt, jedoch wurde aufgrund der Bekanntheit von Klebsieila Pneumoniae und ihrer Leichtigkeit der Handhabung diese am häufigsten verwendet.
Bei einer Dosis von ly/kg an Glykoproteinen A und Giykoproieinen B wird der gleiche Schutz vor. 90% gegenüber Klebsieila Pneumoniae erhalten. Bei der gleichen Dosis und bei den gleichen Produkten beträgt der Schutz 30% gegenüber Staphylococcus. Bei einer Dosis von 20 y/kg beträgt er gegenüber dem gleichen Mikroorganismus 77%.
Die antibakterielle Aktivität im Hinblick auf Klebsiel-Ia Pneumoniae variiert in Abhängigkeit des Verabreichungszeitpunkts der langsamen «- und j3-Glykoproteine. Demgemäß werden sie 48 Stunden vor der Infektion, zum Zeitpunkt der Infektion oder 48 Stunden nach der Infektion verabreicht, und der prozentuale Schutz beträgt entsprechend 100, 55 bzw. 10%. Die langsamen α- und j3-Glykoproteine besitzen somit eine sehr ausgesprägte schützende antibakterielle Wirkung.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Reinigen von langsamen ot- und /?-GIykoproteinen aus Vakrobenkörpern, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Pneumokokken, Streptokokken, Neisseria, Mikrokokken, Staphylo, kokken, Klebsiella pneumoniae und Haemophilus influenzae oder einer Mischung dieser Keime oder einer Kombination von verschiedenen Typen einer gleichen Mikrobenart, nach Patentanmeldung P 2024586.7-41, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach e) erhaltenen langsamen tx- und /J-Glykoproteine in wäßriger Lösung zur weiteren Reinigung einer Dialyse an einer oder mehreren kalibrierten Membranen unterwirft, indem durch Verwendung einer Art oder mehrerer Arten von Membranen die inaktiven oder wenig aktiven Fraktionen abgetrennt und die durch die Membran in der DiaJysezelJe zurückgehaltenen, sehr reinen Fraktionen gesammelt, diese einer Chromatographie über hydrophilem polymerisierten Gel unterworfen und die nichtgebundene Fraktion isoliert werden.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen, perlingualen, oralen, rektalen, permucosen oder topischen Verabreichung, enthaltend die gereinigten langsamen tx- und /J-Glykoproteine nach Anspruch 1.
DE2307051A 1972-02-15 1973-02-13 Verfahren zum Reinigen von langsamen a - und ß -Glykoproteinen aus Mikrobenkörpern und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen Expired DE2307051C3 (de)

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