JPS6028813B2 - 遅行性アルフア及びベ−タ糖たん白質を得る方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本出願人に係るベルギー国特許第７５０６４１号には、
予め溶菌を受けた微生物菌株の培養物の抽出により遅行
性（ｓｌｏｗ）Ｑ−糠たん白質と８一糟たん白質との混
合物を得る方法が記載されている。

この方法によって得られた糖たん白質は、非常に興味あ
る治療学的性質を有する。

それらは、相当な抗炎症性と迅速でしかも非特異的な免
疫性とを付与されている。さらに、それらは、アレルギ
ーも高熱も発生させない利点、そして注射時における不
都合な現象を何ら超こさせない利点を持っている。これ
らの遅行性Ｑ−及び８一糠たん白質の構造は、既知の参
照物質の糖たん白質に関して、特に血酸糖たん白質に関
して示される密度勾配下での霞気泳動の挙動によって示
される。

本発明の遅行性Ｑ−及び８−糠たん白質とは、一定の亀
気泳動条件下に既知の参照糖たん白質（オロソムコィド
）と比較したときにその電気泳動が非常に遅い糠たん白
質であって、血糠のＱ−及び８−糠たん白質と同じ電気
泳動の挙動を示すものをいう。なお、皿糠の糠たん白質
は、Ｑ，Ｑ２，６及びｙの４種が分離されており、電気
泳動の挙動も知られている（Ａｈａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔ
び３０（１９５８）、ｐ１２６−１２７を参照）。これ
らの物質の化学的性質は、そのへキソース及びペントー
ス含有量のような化学的反応によって；変性セルロース
、セフアデツクスゲル又はモレキュラーシーブのような
選択的なクロマトグラフィー試剤を使用する分子量の近
似的同定によって；標準血清アルブミンに関して計算さ
れたビウレット形成館により評価されるたん白質（Ｐｒ
ｏｔｉｄｉｃ）画分含有量によって：へキソサミン含有
量によって；そしてシアリン酸含有量によって立証され
る。

前記の方法で得られる遅行性Ｑ−及び８一糟たん白質の
混合物は、酸に可溶であり且つ硫酸アンモニウム溶液に
可溶である遅行性の熱安定性Ｑ−及び８一礎たん白質か
らなるものと定義することができる。

また、この方法によって得られた遅行性Ｑ−及び８−糠
たん白質は、５０〜６０％の間の結合へキソース含有量
を有する。

本発明は、肺炎樺菌（Ｋ１ｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ）の既知の菌株の培養物より既知の方法で製
造された遅行性Ｑ−及び８一糖たん白質の既知混合物か
ら遅行性Ｑ−及びＢ−糖たん白質を精製された形で得る
にあたり、前記の遅行性Ｑ−及び８−糖たん白質の既知
混合物を分子節の役割をはたす１種又は数種類の１枚又
は数枚の関口規定した膜により水溶液で透析炉遇するこ
とによって精製し、不活性の又は僅かに活性の画分を分
離し、透析炉過セル内で膜により保持された非常に純粋
な画分を集め、この画分を親水性の重合ゲル上でクロマ
トグラフィーし、固定されなかった画分を集めることを
特徴とする精製された遅行性Ｑ−及び８−糖たん白質を
得る方法を目的とする。

本発明の方法は、遅行性Ｑ−及び８一糖たん白質を非常
に純粋な、したがって非常に活性な形で取得することを
可能にする。

また、混合物中で残存し得たたん白質分解生成物の大部
分を除去することを可能にし、その結果最終生成物を極
めて精製された形で取得することを可能にする。本発明
の方法は、特に次の点によって特徴づけられる。

【１｝ 透析炉週に用いられる膜は網状化された選択的
透過膜であって、好ましくは、商標“ＡｍｉｃｏｎＸＭ
３０び（米国アミコンコーポレーション社）として市販
されているものである。

■ また、選択的透過膜は、好ましくは、商標“Ａｍｉ
ｃｏｎＸＭ５０、ＰＭ３０及びＵＭ２’’として市販さ
れているものである。【３’親水性の重合ゲルは、セフ
ァロースゲル船である。

■ また、親水性の重合ゲルは、セフアデツクスゲルＧ
２００である。

本発明の方法によって得られる精製された遅行性Ｑ−及
び３−礎たん白質は、その分子量、結合へキソース含有
量及び結舎云員参寅スの比によって定義される。

本発明の方法に従って得られる非常に純粋な画分は、１
びｄａｌｔｏｎに等しいか又はそれ以上の分子量を有す
る糠たん白質からなり、６０〜６５％の間の結合へキソ
ースを含有し、７に近い寿夫旨房善の比を与える。

一般に、それは約６２％の結合へキソースを含有する。
それにもかかわらず。糖類の割合を標準化することの困
難のために、この含及量は、その画分の純度について結
論を導き出すことができないので、６０〜６５％の間で
変化し得る。本発明の方法により得られた遅行性Ｑ−及
び３一糠たん白質は、生体の非特異的防衛のための抗炎
症剤及び刺激剤として有用である。それらは、特に骨関
節感染症、気管支炎及び細菌感染症の処置に有用である
。それらは、非経口的に、経舌的に、経口的に、直腸経
路で、粘膜経路で又は局所経路で投与するように適合さ
れた製薬組成物の活性成分として使用することができる
。

例えばアンプル又は多回分用薬びん中に調剤された注射
可能溶液又は懸濁液、舌下錠、腸溶皮を有する圧縮錠剤
、ェーロゾル、贋霧剤、クリーム、軟膏、ローション、
坐薬又は丸薬を列挙できる。有効薬量は、治療指示及び
投与方法に大いに依存して変化する。

下記の例は本発明を例示するものであって、それを制限
するものではない。

出発物質の調製 ‘１｝ 細菌抽出物の取得 ベルギー国特許第７５０６４１号に記載の方法に従って
、選ばれた菌株、肺炎梓菌（Ｋ１ｅｂｓｉｅｌｌａｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅＮＣＴＣ５０５５（又はパスツール研
究所寄託第５２１４５号））を適当な培地により発酵器
で培養する。

培養が止ったときに、微生物を細菌懸濁液が安定となる
まで８日間溶解（１＄ｉｓ）させる。

次いで溶解物を濃縮し、そしてこれからメチラールーメ
タノール混合物（４−１）により脂質を除去する。

遠Ｄ分離残留物をメタノールで洗浄し、水で熔解し、ホ
ルモールを混合する。この細菌抽出物は、その水溶液の
メチラール−メタノール混合物による沈殿及びその沈殿
のメタノールによる洗浄により最終的に処理される。■
細菌抽出物の性質 得られた抽出物は透明であり、水性嬢質に可溶である。

それは０．州週塩素酸中の１０％（ｐ／ｖ）トリクロル
酢酸煤質中で又は軸＝７．０及び１５００で３．８Ｍ硫
酸アンモニウム中で沈殿しない。部分的な沈殿は、硫酸
マンガン又は塩化セチルピリジニウム（Ｃ．Ｐ．Ｃ．）
の溶液を加えることによって得られる。この細菌抽出物
の主要成分を評価したが、それは特にバッチ法によって
２６〜３２％の結合中性へキソース含有量及び６．２％
のＱ−アミノ窒素を示した。

例 前記の調製法に従って肺炎梓菌（Ｋ１ｅｂｓｅｌｌｉａ
ｐＭｕｍｏｎｉａｅＮＣＴＣ５０５５）の培養物から出
発して得られた２夕の遅行性Ｑ−及び８−糠たん白質の
混合物を４００ｃｃの水に溶解する。

この溶液を、ＡｍｊｃｏｎＸＭ３００で作った膜で閉じ
た透析セルに入れる。その溶液を僅かな圧力（０．７バ
ール）の下に絶えず蝿梓しつづける。炉過された容積を
桶なうことによって透析のバランスを絶えず移動させて
透析を続ける。このために等容積の蒸留水を加える。こ
の操作は連続的に行い、そして透析炉過された全体の容
積が初期の容積の１の割こ等しいか又はそれ以上となっ
たときに透析炉過操作は終了したものとみなす。透析炉
過セルの残留物を集めてセフアロースゲル曲上でクロマ
トグラフィーし、そしてそのセファロースゲル船上に固
定されなかった画分を集めて凍結乾燥させる。また、透
析炉過は、まずＡｍｊｃｏｎＰＭ３０で作った膜を透析
セル中で、次いでＡｍｉＣｏｎＸ５０で作った膜を入れ
た第２の透析セル中で、そして最後にＡｍｉｃｏｎＸＭ
で作った膜を入れた第三の透析炉過セル中で数回で実施
することができ、次いでセファロースゲル紙上でクロマ
トグラフイ‐し、そして排除された画分を凍結乾燥した
後、膜による一度の透析炉週により得られた画分と同一
の画分を得る。このようにして得られた（Ａｍｉｃｏｎ
ＸＭ３００の膜に保持され、そしてセファロースゲル紐
から排除された）遅行性Ｑ−及び８−糖たん白質は、１
びｄａｌｔｏｎに等しいか又はそれよりも高い分子量の
ものである。

これらの巨大分子物質は、前記のベルギー国特許の方法
で得られた物質、即ちそれほど純粋でない画分よりも高
いへキソース組成を有する。それは一般に６２％に近い
。他方、Ｑーアミノ窒素含有量は小さく（１．６％）、
先に得られた物質の画分の状態よりも低い。このように
して得られた遅行性Ｑ−及び８−糖たん白質は、母け尿
素溶液によって又は還元剤溶液によって部分的に解離さ
れるにすぎない。

他方、透析炉過中に分離された低分子量の分子は、解離
剤が除去されると自然に再会合できる。それにもかかわ
らず、このようにして新たに得られた巨大分子はＡｍｊ
ｃｏｎＸＭ３００の膜上に保持された遅行性Ｑ一及び８
−糠たん白質と異なり、したがってその遅行性以−及び
Ｂ−糠たん白質にいくかの酵素（プロナーゼ、トリプシ
ン、パンクレアチン、ヒアルロニダーゼ）を作用させ、
続いて膜で分別するならば、その巨大分子のごく小部分
がこれらの酵素に対して感応性であり、またその薬理学
的活性は感知するほどには変わらないことが決定される
。前記の製造法に従う精製収率は約３０〜３５％である
。

このようにして得られた綾性Ｑ−及び８−糖たん白質は
、約６２％の結合へキソース含有量、９％に近いたん白
買物質含有量を有し、そして恒喜寿吉彦唇スの比はほぼ
７である。ただし、この正確な解明は難しいであろう。
なぜならば、オルシノール染色による標準化が遅行性Ｑ
−及び８−糖たん白質中に実際に含まれているが任意に
ガラクトース及びマンノースの形にある糠類についてな
されないからである。構造の研究 真空下での酸加水分解は、セルロースプレート上で分離
後、異なった分子成分を示す。

したがって、非常に多種類のアミノ酸を示すことができ
、このことは遅行性Ｑ−及びＢ−糖たん白質をべプチド
グリカンやオサミンから識別するものである。糖類の中
ではグルコース、ガラクトース及びマンノースの存在が
立証される。リボーヌの存在は示されなかった。

○−オシジル結合の解裂を伴なうアルカリ加水分解をし
た後、形成されたフラグメントの研究は長いグリカン（
ｇ’ｙｃａｎｉｃ）鎖がたん白質の小さい鎖の論にグラ
フトしていることを示す。

それ故に、それらは、巨大分子性、たん白溶解酵素に対
する抵抗性、脂肪分解酵素（リパーゼ、パンクレアチン
）に対する抵抗性によって証明される糠たん白質の種類
の分子を有する。

さらに、塩化セチルピリジニウムによって沈殿できない
のでムコ多種類の凝し、はない。ナトリウムバルビター
ル緩衝剤の存在下、ｐＨ＝８．２で、密度勾配下での露
気泳動はとりわけＱ−Ｂ易動度のピークを示す。

薬理学的研究 ａ 抗炎症活性 ラットの足にカラゲニンを局部注射して足底部炎症性水
腫を形成させた。

被検化合物は、刺激剤注射の１時間前に腹腔内投与した
。次いで刺激剤注射の前後で足の容積を測定した。足の
容積の増大は炎症の度合の尺度であるので、Ｄへ。薬量
（即ち、対照動物と比較して処理動物の４０％を保護す
る薬量）を決定した。比較は、前記した「‘１油発細菌
抽出物の調製例」に記載したようにして製造した物質（
糠たん白質Ａ）と本発明の方法で製造された精製遅行性
Ｑ−及び８−糖たん白質（糖たん白質Ｂ）と、最も普通
に用いられている抗炎症剤とにつ．章し、て行った。

結果は次の通り。

本発明の糠たん白質８は被検化合物の中で最も効力のあ
る抗炎症剤であることがわかる。

なお、糠たん白質Ａ及びＢは、他の化合物と比較して濃
爆発現性はなかった。ｂ 非特異的防衛の刺激この刺激
は、Ｈａｌｐｅｍ氏により発展された方法によるマウス
での「炭素浄化試験」により研究した。

この方法は、動物の眼洞にコロイド状炭素の懸濁液を注
射し、皿中への炭素の消失量を光学密度の測定により時
間の関数として評価することからなる。被検化合物は、
試験の２独特間及び４雛寺間前に腹腔内投与した。

結果は、コロイド状炭素のみを注射し且つ炭素粒子数の
１００％に相当する対照例と比較して、炭素粒子の除去
率として表わす。ｃ 抗細菌活性 糠たん白質Ｂをマウスに投与してから微生物を注射した
。

１仏タ／ｋ９の薬量では糠たん白質Ｂは肺炎樟菌（Ｋ１
ｅ広ｉｅｌｌａｐｎｅｍｍｏｎｉａｅ）に対して、処置
マウスの９０％を死亡から保護した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ Ｐｎｅｕｍｏｎ
   ｉａｅ）の既知の菌株の培養物より既知の方法で製造さ
   れた遅行性α−及びβ−糖たん白質の既知混合物から遅
   行性α−及びβ−糖たん白質を精製された形で得るにあ
   たり、前記の遅行性α−及びβ−糖たん白質の既知混合
   物を分子篩の役割をはたす１種又は数種類の１枚又は数
   枚の開口規定した膜により水溶液で透析濾過することに
   よつて精製し、不活性の又は僅かに活性の画分を分離し
   、透析濾過セル内で膜により保持された非常な純粋な画
   分を集め、この画分を親水性の重合ゲル上でクロマトグ
   ラフイーし、固定されなかつた画分を集めることを特徴
   とする精製された遅行性α−及びβ−糖たん白質を得る
   方法。