DE2307051A1

DE2307051A1 - Verfahren zur gewinnung von langsamen alpha- und beta-glykoproteinen

Info

Publication number: DE2307051A1
Application number: DE2307051A
Authority: DE
Inventors: Jeanpierre Buret; Jean Hirsch
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1972-02-15
Filing date: 1973-02-13
Publication date: 1973-08-23
Also published as: JPS59219236A; ES411602A2; HU168849B; NL174267C; JPS6028813B2; CA993389A; SE425833B; JPS4896792A; DE2307051B2; FR2171907A2; FR2171907B2; DK146724C; NL7302132A; CH564084A5; BE795417A; GB1412202A; DK146724B; DE2307051C3

Description

POSTSCHECKKONTO: MÜNCHEN 8Π38

BANKKONTO: BANKHAUS H. AUFHAUSER

Cas 1341/2.add.

ROUSSEL-UCLAF, Paris/Frankreich

Verfahren zur Gewinnung von

langsamen α- und ß-Glykoproteinen

sssss:

[Zusatz zu Patent (Patentanmeldung P 20 24 586.7)]

In der deutschen Patentanmeldung P 20 24 586.7 wurde die Gewinnung eines Gemisches aus langsamen α- und ß-Glykoproteinen durch Extraktion von Kulturen von Mikrobenstämmen, die vorher lysiert worden waren, beschrieben.

Die nach dem genannten Verfahren erhaltenen Glykoproteine besitzen sehr interessante therapeutische Eigenschaften. Sie entfalten beträchtliche anti-inflammatorische Eigenschaften und schnell wirkende und nicht spezifische immunisierende Eigenschaften. Sie besitzen außerdem den Vorteil, daß sie weder Allergien hervorrufen noch hyperthermisch wirken und daß sie keine Unverträglichkeitserscheinungen an der Injektionsstelle hervorrufen.

Die Struktur dieser langsamen α- und ß-Glykoproteine kann durch deren Verhalten bei der Elektrophorese gegenüber Vergleichs-Glykoproteinen und insbesondere

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gegenüber Serum-Glykoproteinen gezeigt werden.

Die chemische Natur dieser Substanzen wird durch chemische Reaktionen bestätigt, wie durch ihren Gehalt' an Hexosen und Pentosen, durch die ungefähre Bestimmung des Molekulargewichts unter Verwendung von selektiven Chromatographie-Mitteln, wie modifizierte Cellulosen, Sephadex-Gel oder Molekularsiebe, durch den Gehalt an Protein-Fraktion des Moleküls, der bestimmt wird durch.die biuretogene Wirkung, berechnet im Vergleich zu der Serum-Albumin—Eichung, durch den Gehalt an Hexosaminen und durch den Gehalt an Sialsäure.

Das durch das genannte Verfahren erhaltene Gemisch aus langsamen α- und ß-Glykoproteinen kann als ein aus langsamen, thermostabilen,säurelöslichen und in Ammoniumsulfatlösungen löslichen "α- und ß-Glykoproteinen bestehendes definiert werden.

Die durch das erwähnte Verfahren erhaltenen langsamen α- und ß-Glykoproteihe haben einen Gehalt an gebundenen Hexosen zwischen 50 und 60 %.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von langsamen α- und ß-Glykoprqteinen, extrahiert aus Kulturen von Mikrobenstammen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Pneumokokken, Streptokokken, Neisseria, Mikrokokken, Staphylokokken, Klebsellia Pneumoniae und Haemophilus Influenzae, oder einer Mischung dieser Keime oder einer Kombination von verschiedenen Typen einer gleichen Mikrobenart, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die langsamen α- und ß-Glykoproteine in wäßriger Lösung an einer oder mehreren geeichten Mem- ■ branen, die als Molekularsiebe wirken, einer Dialyse unterwirft, durch Verwendung eines oder mehrerer Typen der Membranen die inaktiven oder wenig aktiven Fraktionen abtrennt, die durch die Membran in der Dialysezelle zurückgehaltenen, sehr reinen Fraktionen isoliert, diese einer Chromatographie an hydrophilem polymerisieren Gel unterwirft und die nicht-, gebundene Fraktion isoliert. . '.

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Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, die langsamen a- und ß-Glykoproteine in sehr reiner und demzufolge sehr akti- ; ver Form zu erhalten. Ferner erlaubt es, den größten Teil der Abbauprodukte der Proteine, die noch in dem Gemisch verbleiben konnten, zu eliminieren und demzufolge ein Endprodukt in außerordentlich gereinigter Form zu erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere durch die nachfolgenden Punkte charakterisiert:

1.) die netzförmigen Membranen mit selektiver Permeabilität sind vorzugsweise diejenigen, die unter dem Handelsnamen AMICON XM 300 (Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts, USA) verkauft werden,

2.) die Membranen mit selektiver Permeabilität sind vorzugsweise die unter dem Handelsnamen AMICON XM 50, PM 30 und UM 2 verkauften,

3.) das hydrophile polymerisierte Gel ist das SEPHAROSE 6B-GeI,

4.) das hydrophile polymerisierte Gel ist das SEPHADEX G 200-GeI.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen langsamen α- und ß-Glykoproteine werden durch ihr Molekulargewicht, ihren Gehalt an gebundenen Hexosen und durch das Verhältnis:

gebundene Hexosen _definiert.
Proteine

Die nach diesem Verfahren erhaltene sehr reine Fraktion besteht aus Glykoproteinen mit einem Molekulargewicht von 10 Dalton oder darüber, enthält zwischen 60 und 65 %

gebundene Hexosen,und weist ein Verhältnis:

in der Nähe von 7 auf. Sie enthält im allgemeinen etwa -62 % gebundene Hexosen. Auf Grund der Schwierigkeiten der Eichung des Maßes der Zucker kann jedoch dieser Gehalt zwischen 60 % und 65 % schwanken, ohne daß es möglich ist, daraus Rückschlüs se auf die Reinheit der Fraktion zu ziehen.

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Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen langsamen α- und ß-Glykoproteine sind anti-inflammatorisch wirksam und stimulieren die nicht-spezifischen Abwehrkräfte des Organismus. Sie, sind besonders geeignet für die Behandlung von Knochengelenkleiden, Bronchitiden und Mikrobeninfektionen·

Sie können als Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die der parenteralen, perlingualen, oralen, rektalen, permucosen oder topischen Verabreichung angepaßt sind, Genannt seien z.B. die injizierbaren Lösungen oder Suspensionen in Ampullen oder Mehrfachdosenflaschchen, Sublingualtabletten, Tabletten zur Auflösung im Darm, Aerosole, Pulver, Cremes, Salben, Lotionen, Suppositorien oder Kügelchen.

Die Dosierung ist abhängig von der Indikation und der Verabreichungsform.

Das nachfolgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken*

Herstellung der Ausgangssubstanz

il.) Gewinnung des Mikrobenextrakts

Der ausgewählte Mikrobenstamm (Klebsellia Bieumoniae) wird * in einer Fermentiervorrichtung mit einem geeigneten Milieu kultiviert. Nach Stillegung der Kultur werden die Keime während 8 Tagen bis zur Stabilität der Mikrobensuspension lysiert. '

Das Lysat wird anschließend konzentriert und mit einem Methylal/Methanol-Gemisch (4/l) von Lipoiden befreit. Der Bodensatz der Zentrifugierung wird mit Methanol gewaschen, in Wasser aufgenommen, dnd es wird .Formol hinzugegeben. Der Mikrobenextrakt wird, einer letzten Reinigung unterworfen durch Ausfällen seiner wäßrigen Lösung mit einem Methylal/Methanol-Gemisch und Waschen des Niederschlags mit Methanol.

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2.) Eigenschaften des Mikrobenextrakts

Der erhaltene Extrakt' ist klar und in wäßrigem Milieu löslich, und er fällt in einem 10%-igen (Gewicht/Volumen) Trichloressigsäure-Milieu in O,6n-Perchlorsäure oder in 3,6-molarem Ammoniumsulfat bei einem p„-Wert von 7,0 und bei einer Temperatur von 15°C nicht aus. Eine partielle Ausfällung wird durch Zugabe einer Mangansulfatlösung oder Cetylpyridiniumchlorid-Lösung (C.P.C.) erhalten.

Die Hauptbestandteile des Mikrobenextrakts wurden ausgewertet, und die Dosierungen zeigten insbesondere einen Gehalt an neutralen gebundenen Hexosen von 26 bis 32 % je nach den Proben und 6,2 % a-Aminostickstoff.

Beispiel

Man löst 2 g der langsamen α- und ß-Glykoproteine, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren, ausgehend von einer Klebsellia Pneumoniae-Kultur, erhalten worden waren, in 400 ecm Wasser. Man führt diese Lösung in eine Dialysezelle, die durch eine AMICON XM 300-Membran verschlossen wird, ein. Die Lösung wird unter stetigem Rühren und unter leichtem Überdruck (0,7 Bar) gehalten. Man führt die Dialyse durch durch stetiges Verdrängen des Dialysengleichgewichts durch Ersatz des filtrierten Volumens. Zu diesem Zweck gibt man ein gleiches Volumen destilliertes Wasser hinzu. Dieses Einbringen wird kontinuierlich durchgeführt, und man nimmt den Dialyseschritt als beendigt an, wenn das gesamte dialysierte Volumen gleich oder mehr als das 10-fache des Anfangsvolumens beträgt. Der Rückstand der Dialysezelle wird gesammelt und auf SEPHAROSE 6 B-Gel chromatographiert, und die auf das SEPHAROSE 6 B-Gel nicht-fixierte Fraktion wird aufgefangen und durch Lyophilisierung zur Trockne gebracht.

Man kann gleichfalls in mehreren Schritten vorgehen, indem man zunächst eine Dialyse in einer Dialysezelle mit einer AMICON PM 30-Membran durchführt, dann in einer zweiten Dialysezelle mit einerAMICON X 50-Membran und schließlich in einer Zelle ini-t einer AMICON XM 300 eine dritte Dialyse durchführt. Man

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erhält nach der Chromatographie auf SEPHAROSE 6 G-GeI und nach Lyophilisierung der ausgeschlossenen Fraktion eine Fraktion, die mit derjenigen, die nach einer einzigen Dialyse an einer Membran durchgeführt wurde, identisch ist.

Die so erhaltenen (an der Membran XM 300 zurückgehaltenen und vom SEPHAROSE 6 B-Gel ausgeschlossenen) langsamen α- und ß-Glykoproteine weisen ein Molekulargewicht von 10 Dalton und darüber auf. Diese makromolekularen Substanzen haben einen Gehalt an Hexosen, der höher liegt als derjenige der weniger reinen Fraktionen, die durch das Verfahren der oben genannten deutschen Patentanmeldung erhalten werden. Er beträgt im allgemeinen etwa 62 %. Im Gegensatz dazu ist der a-Aminostickstoff-Gehalt gering (1,6 %) und niedriger als derjenige der früher erhaltenen Fraktionen.

Die so erhaltenen langsamen α- und ß-Glykoproteine sind durch Harnstoff in 8-molarer Lösung oder durch Lösungen von Reduktionsmitteln nur zum Teil dissoziiert. Im Gegensatz dazu können die Moleküle mit niedrigerem Molekulargewicht, die im Laufeder Dialyse abgetrennt wurden, bei Abwesenheit des Dissoziationsmittels spontan sich reassoziieren. Jedoch unterscheiden sich diese so "de novo" erhaltenen Makromoleküle von den langsamen α- und ß-Glykoproteinen, die an der AMICON XM 300-Membran zurückgehalten werden, wenn man die langsamen α- und ß-Glykoproteine der Einwirkung verschiedener Enzyme (Pronase, Trypsin, Pankreatin, Hyaluronidase) unterwirft mit nachfolgender Fraktionierung an Membranen, stellt man fest, daß nur ein geringer Anteil der Makromoleküle gegenüber diesen Enzymen empfindlich ist und daß die pharmakologische Aktivität nicht merklich verändert ist.

Die Ausbeute der Reinigung gemäß dem vorstehend beschriebenen Vorgehen beträgt etwa 30 bis 35 %. Die so erhaltenen langsamen α- und ß-Glykoproteine weisen einen Gehalt an gebundenen Hexosen von etwa 62 % und einen Gehalt an Proteinsubstanzen von

, ο cv j= j „ ..., . . gebundene Hexosen ' ,' '

etwa 9 % auf; das Verhältnis: Protexnsubstanzen ¹^ ^{in der}

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Nähe von 7. Jedoch wird die Auswertung durch die Tatsache er-^: schwert, daß die Eichung der Färbungen mit Methylresorcin nicht mit Zuckern erfolgt, die tatsächlich in den langsamen α- und ß-Glykoproteinen enthalten sind, sondern willkürlich mit Galaktose und Mannose.

Strukturuntersuchunq

Die saure Hydrolyse im Vakuum erlaubt es, die verschiedenen Bestandteile der Moleküle nach der Trennung auf Celluloseplatten nachzuweisen. Man kann so eine sehr große Anzahl von Aminosäuren nachweisen, was diese langsamen α- und ß-Glykoproteine von den Peptidglykanen und den Osaminen unterscheidet. Unter den Zuckern stellt man die Anwesenheit von Glucose, Galaktose und Mannose fest.

Die Anwesenheit von Ribose wurde nicht nachgewiesen.

Nach der alkalischen Hydrolyse, die eine Spaltung der O-Glykosidischen Bindungen herbeiführt, ergibt eine Untersuchung der gebildeten Spaltstücke, daß die langen Glykanketten auf kleine Proteinschleifen aufgepfropft sind.

Es liegt somit ein Molekül vom Glykoproteincharakter vor, was aus der makromolekularen Beschaffenheit, der Beständigkeit gegenüber proteolytischen Enzymen und der Beständigkeit gegenüber lipolytischen Enzymen (Lipase, Pankreatin) hervorgeht. Es handelt sich im übrigen nicht um ein Mucopolysaccharid, da es durch Cetylpyridiniumchlorid nicht ausfällbar ist.

Die Elektrophorese bei einem p„-Wert von 8,2 in. Gegenwart eines Natriumbarbital—Puffers beweist in der Hauptsache einen Mobilitätspeak α - ß.

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Claims

Patentanspruch e

Verfahren zur Gewinnung von langsamen α- und ß-Glykoproteinen, extrahiert aus Mikrobenstammkulturen, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Pneumokokken, Streptokokken, Neisseria,Mikrokokken,Staphylokokken, Klebsellia Pneumoniae und Haemophilus Influenzae oder einer Mischung dieser Keime oder einer Kombination von verschiedenen Typen einer gleichen Mikrobenart, dadurch gekennzeichnet_r daß man die langsamen α- und ß-Glyk©proteine in wäßriger Lösung einer Dialyse an einer oder mehreren kalibrierten Membranen," die als Molekularsiebe wirken, unterwirft, durch Verwendung einer Art oder mehrerer Arten von Membranen die inaktiven oder wenig aktiven Fraktionen abtrennt, die durch die Membran in der Pialysezelle zurückgehaltenen, sehr reinen Fraktionen sammelt, diese einer Chromatographie über hydrophilem polymerisierten Gel unterwirft und die nichtgebundene Fraktion isoliert.

,2») Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die kalibrierte Membran eine Membran von selektiver Permeabilität mit Netzstruktur ist,und insbesondere Membranen, die unter dem Handelsnamen AMICON XM 300 verkauft werden.

3.) Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die kalibrierten Membranen diejenigen sind, die unter den Handelsnamen AMICON PM 30, AMICON UM 2 und AMICON XM 50 verkauft werden.

4.) Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile polymerisierte Gel SEPHAROSE 6 B-GeI ist»

5.) Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile polymerisiert© Gel SEPHADEX G 20P-GeI ist,-

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6.) Langsame α- und ß-Glykoproteine, erhalten gemäß den Ansprüchen 1 bis 5.

7.) Langsame α- und ß-Glykoproteine gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Molekulargewicht von 10 Dalton oder darüber aufweisen und einen Gehalt an gebundenen He-

xosen zwischen 60 und 65 %' besitzen, wobei das Verhältnis Hexosen

Proteinsubstanzen

in der Nähe von 7 liegt.

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