DE2218148A1

DE2218148A1 - Entzündungshemmendes Mittel und Ver fahren zur Herstellung desselben

Info

Publication number: DE2218148A1
Application number: DE19722218148
Authority: DE
Inventors: Setsuro Dr med Tokushima Otsuka Masatomi Naruto Osaki Yoshiyasu Takahara Tokushima Fujii (Japan) P
Original assignee: Otsuka Kagaku Yakuhin K K , Osaka (Japan)
Priority date: 1971-04-14
Filing date: 1972-04-14
Publication date: 1972-10-26
Also published as: SU436464A3; FR2133670B1; GB1390541A; AU4099172A; FR2133670A1; US3932618A; AU469815B2; CA975295A; NL7204988A; BR7202228D0; CH572341A5

Description

. R. Π -?. Dr.-!nc5· '

Dr.-!nc5· '^J- --' - · ' ^{z Jr}' J • Minchen £2. Slclnedarfetr. 1{jj 22 IQI /Q

76-18.63UP m. I». 1972

KAGAKU YAKUHIN KABUSHIKI KAISHA, Osaka-ahi (Japan)

Entzündungshemmendes Mittel und Verfahren zur Herstellung

desselben

Die Erfindung'bezieht sich auf ein anti-inflammatorisches bzw. entzündungshemmendea Mittel sowie auf ein Verfahren zur Herstellung desselben.

Bislang wurden unterschiedliche entzündungshemmende Substanzen verwendet wie beispielsweise Steroide, wie Gortison, Dexamethason} Nicht-Steroide, wie Anthranilsäurederivate, Salicylate, Indomethacin, Benzydamin; Goldsole; und Proteasen. Wegen beträchtlicher Nebenwirkungen war es jedoch bislang schwierig, diese Substanzen in zur Erzeugung befriedigender anti-inflammatorischer Wirkungen ausreichenden Dosen anzuwenden.

76-(OKG-21i/W/bx/E) NoHe

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So wurde beispielsweise bei der Überprüfung der Inhibitionswirkung unterschiedlicher Froteasen am durch Karrageenin (carrageenin) verursachten Ödem bei intraperitonealer Verabreichung (der derzeit am meisten angewandten Verabreichungsart) gefunden, daß diese Proteasen zwar eine merkliche Hennwirkung auf das Odem ausüben, bei einer zur Verbesserung der Wirkung erhöhten Dosis jedoch Blutungen in der Bauchhöhle oder Bauchwassersucht verursachen. Das bedeutet, daß die einzelnen Proteasen zur Verhinderung von Nebenwirkungen nur innerhalb begrenzter zulässiger Dosierungsbereiche verabreicht werden können. Eine derartige Tendenz wurde bei mannigfachen Proteasen gefunden.

Beispiele für Proteasen sind Trypsin, Chymotrypsin und dergl. (für Proteasen tierischen Ursprungs); Brcmelin, Papain u. dgl, (für Proteasen pflanzlichen Ursprungs) und Proteasen, die durch Mikroorganismen wie Streptomyces griseus, Bacillus aubtilis, Aspergillua melleua, Aspergillua niger und andere Bakterien der Genus Serratia und Genus Bacillus erhalten werden.

Ziel der Erfindung ist demgemäß eine anti-inflammatorische bzw. entzündungshemmende Substanz mit möglichst guter entzündungahemmender Wirkung, die praktiach frei von Nebenwirkungen iat. Eine solche Substanz sollte eine möglichst hohe entzündungshemmende Wirkung bei geringer Dosis entfalten und selbst bei Verabreichung in hoher Konzentration frei von Nebenwirkungen wie Blutungen und Ascites sein. Ziel der Erfindung sind weiter entsprechende entzündungshemmende Wirkstoffe enthaltende Mittel aowie Verfahren zur Herstellung solcher Substanzen.

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Las zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße entzündungshemmende Präparat bzw. Mittel besteht aua einem antiinflammatorisch wirksamen Reaktionaprodukt von Blut bzw. Blutanteilen mit einer Protease, das zusammen mit üblichen Hilfsstoffen in wirksamer Menge zu Arzneimittelformen konditioniert eein kann.

Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und Ansprüche soll die Bezeichnung "Blut" nicht nur Blut selbst sondern auch Blutanteile wie Blutplasma, Blutserum usw. bedeuten.

Untersuchungen der Erfinder haben gezeigt, daß ein durch Umsetzung von Blut mit Protease erhaltenes Produkt (dieses wird nachfolgend mit "Wirkstoff au3 modifiziertem Blut" oder "Blutabwandlungsstoff" bezeichnet) sehr hohe anti-inflammatorische Wirkungen praktisch ohne jede Störwirkung bei geringer Dosis und keine irgendwelchen Störeffekte bei Verabreichung in hohen Dosen ergibt.

Dieses Ergebnis, das mit Proteasen selbst nie erreicht werden konnte, wird allein durch die Modifikation bzw. Abwandlung von Blut durch die enzymatisch^ Wirkung von Proteasen erreicht. Dies geht in der Tat aus der unten angegebenen- Tabelle 1 hervor, welche die Ödemhemmwirkung des "Blutabwandlungsstoffs" gemäß der Erfindung im Vergleich zu derjenigen von unterschiedlichen Proteasen zeigt. Der geprüfte Blutabwandlungeatoff wurde in gleicher Weise wie im nachfolgenden Beispiel 1 durch Umsetzung von Kuhserum mit einer vom Bacillus 3p 0 - 20 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology, Japan, seit 20. 2. 1969» Hinterlegungenummer* FERM-P 270; Produkt von Otsuka Kagaku Yakuhin Kabushiki Kaisha, Osaka, Japan) erhaltenen Protease und Abtrennung nicht umgesetzter Protease vom resultierenden Reaktionsprodukt erhalten.

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Verfahren zur Prüfung der 50 ?Sigen Inhibition beim ödem

UnterschiedlichG in der nachfolgenden Tabelle 1 angegebene entzündungshemmende !»ittel wurden in physiologischer Salzlösung gelöst oder dispergiert und einer Gruppe von 6 Ratten mit einem Gewicht von 150 bis 160 g intraperitorieal verabreicht. In 30 Minuten wurden 0,05 ml 1 gew.^ige Karrageenin-Iösung m physiologischer Salzlösung subkutan in die Sohle der Hinterpfote jeder Ratte injiziert. 3 stunden danach wurde die Volumenzunahme der Hinterpfote zur Bestimmung der Hemmwirkung auf das ödem gemessen. Die ermittelte 50 $ige Inhibition wird in dafür erforderlichen Dosen (j*/kg) angegeben. Bei diesen Prüfungen wurde als Kontrolle physiologische Salzlösung verwendet.

Für 50 j* Ödem-Inhibition erforderliche Dosen

Tabelle 1

Anti-inflauauatorische Mittel

^5O <■	*j A**
	50
1	000
10	000
2	300
9	100
10	500
24	000
60	000
73	000
9 c	000

Blutabwandlungsstoff nach Beispiel 1

Protease vom BacilluB sp ü - 20

Bromelain

Indomethacin

Mefenaminaäure (liefenamic acid)

Flufenaminsaure (Flufenamic acid)

Phenylbutazon

Phenaceti.n

Aspirin

Cinchophane

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Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, ergibt der Blutabwandlungsatoff gemäß der Erfindung ausgezeichnete entzündungshemmende Wirkungen in viel geringeren Dosen als unterschiedliche damit verglichene Proteasen, Dabei ist zu bemerken, daß für eine 50 #ige Ödem-Inhibition durch die vom Bacillus sp 0 - 20 erhaltene Protease im Vergleich zu dem mit dieser Protease erhaltenen Blutabwandlungsstoff eine zwanzigfache Dosis erforderlich ist.

Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Produkt frei von Nebenwirkungen, bei so geringen Konzentrationen völlig harmlas und ergibt kaum irgendwelche Nebenwirkungen bei Verabreichungen in hohen Dosen. So treten in der Tat beispielsweise bei intraperitonealer Verabreichung des Blutabwandlungsstoffs gemäß Beispiel 1 an Hatten in hohen Dosen von 500 000 ^*/kg keinerlei Nebenwirkungen wie intraperitoneale Blutung oder Ascltes auf.

Weiterhin hat die mit so außerordentlich guten entzündungshemmenden Wirkungen begabte erfindungsgemäße Substanz eine hypotenaive Wirkung und eine depressive Wirkung auf das Zentralnervensystem. So ist es durch Ausnutzung solcher pharmakologischen Eigenschaften möglich, Wirkungen zu erzielen, wie sie mit herkömmlichen anti-inflammatorischen enzymatischen Mitteln bislang nicht erreicht werden konnten.

Der Blutabwandlungsstoff gemäß der Erfindung ist eine durch Modifikation von Blut mit einer Protease erhaltene Substanz und wasserlöslich, aber in Methanol unlöslich. E3 ist eine flüssige bis feste Substanz, die Peptid, Aminosäure und Zucker enthält.

Όο·ι- Blutabwandlungsstoff gemäß der Erfindung istwesentlieh unterschiedlich vom Blut aelbst, da ^r^terer eine anti-

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inflammatorische Wirkung höherer Ordnung, letzteres jedoch keine solchen Wirkungen ergibt. Weiter zeigt der erfindungsgemäße Blutabwandlungsatoff keine enzymatieche Wirkung und iat so wesentlich verschieden von Proteasen.

Das gemäß der Erfindung als Auagangsmaterial zu verwendende Blut umfaßt selbst, Blutplaema, Blutseruta und unterschiedliche Substanzen, die vom Blut per se von Säugetieren wie Mensch, Kaninchen, Ratte, Pferd, Kuh, Vögel wie Kenne, Ente und einer weiten Vielzahl von Tieren erhalten werden, von denen insbesondere Blut selbst und Blutserum von Säugetieren bevorzugt werden. Wegen der leichten Verfügbarkeit werden Blut und Blutserum von Kuh und Pferd am meisten bevorzugt.

Zu den für die Modifizierung des Blutes verwendeten Proteasen gehören unterschiedliche Proteasen, die von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen erhalten werden. Beispielse für Proteasen tierischen Ursprungs sind Trypsin, Pepsin, Chymotrypsin, Pancreatin·, etc.} für Proteasen pflanzlichen Ursprungs Bromelin, Papain, etc.j für von Mikroorganismen erhaltene Proteasen solche von Mikroorganismen wie Fadenpilzen, Basidiomyceten, Bakterien, Strahlenpilzen etc. Proteasen von fadenförmigen Pilzen sind beispielsweise solche vom Aspergillus melleus, Aspergillus oryzae, Penicillium notatum, Rhizopus chinensis, Mucor racemosua, etc. Proteasen von Basidiomyceten sind z.B. solchen vom Trametes eanguinea, Llodella subpileata, etc. Proteasen von Bakterien sind z.B. solche vom Bacillus subti-Ils, Pseudomonas myxogenes, etc. Proteasen von Strahlenpilzen sind z.B. solche vom Streptomyces griseus, Streptomyces fradiase, etc.

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Von diesen Proteasen werden Chymotrypsin, Bromelin und Proteasen vom Bacillus subtilis und Aspergillu3 melleus bevorzugt.

Weiter können an Stelle von Proteasen selbst auch Substanzen verwendet werden, die durch chemische Modifizierung von Proteasen in bekannter Weise erhalten werden. Für diesen Zweck werden Proteasen chemisch durch Umsetzung mit einer hochmolekularen Substanz wie mit Aminosäurepolymeren und Polysacchariden durch Diazotieren Peptidbildung, Dehydrohalogenierung usw. modifiziert oder durch Umsetzung mit einer hochmolekularen Substanz mit Ionenaustauschgruppen oder durch Vernetzung bzw. Verknüpfung von Lysin-£-aminogruppen vom Enzymen oder von oC-Aminogruppen am End-Stickstoffatom desselben oder der Phenolgruppe von Enzym-Iyrosin oder von SH von Enzym-Cystein mit hochmolekularen Substanzen mit zumindest zwei funktionellen Gruppen abgewandelt.

Derartige Verfahren chemischer Modifizierung von Proteasen sind bereits bekannt. Brauchbare Methoden sind bzw. wurden beispielsweise in "Nature" 210, Nr. 23, von Rolf Axen und Jerker Porath; in "The Journal of Biological Chemistry" 237, Nr. 6, (1962) S. 1832 bis 1838; in der Japanischen Patent-Publikation Kr. 27492/1964; in der US-PS 3 167 485$ und in "Seventeenth Collection of Lectures at Enzyme Chemistry Symposium" (1965) Seite 21 von Toru Takami und Toshio Ando beschrieben. Dieses Symposium wurde vom 2. bis 5. Mai 1965 an der Tokushima Universität, Japan abgehalten.

Gemäß der Erfindung wird die Liodifizierung von Blut durch Proteasen üblicherweise bei Zimmertemperatur oder mäßig erhöhter Temperatur, vorzugsweise bei 20 bis 60⁰C durchgeführt.

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Allgemein hängt der pH-Wert des Reaktionasystems vom Typ des BlutB und der verwendeten Protease ab, er liegt jedoch vorzugsweise im neutralen Bereich. Die Lienge an Protease relativ zum Blut, die auch von der Art der Protease und des Blutes abhängen mag, liegt vorzugsweise bei 200 bis 2000 Jf pro ml Blut. Die Umsetzung zur Erzielung des Blutabwandlungsstoffs iat im allgemeinen innerhalb von 0,5 bis 5 Stunden beendet.

Zur Gewinnung wird derresultierende Blutabwandlungsatoff von nicht umgesetztem Blut und ggf. nicht umgesetzter Protease beispielsweise durch Anwendung von organischen Lösungsmitteln, Molekularsieb, Ionenaustauscherharzen, durch Zentrifugieren, Gegenstromverteilungsmethoden, Elektrophorese oder durch andere bekannte Verfahren abgetrennt. Diese Verfahren können einzeln oder in Kombination angewandt werden. Ea iat nicht erforderlich, die nicht umgesetzte Proteaoa von der Reaktionsmischung abzutrennen, wenn diese nur in geringer Menge vorliegt. Weiter kann die nicht umgesetzte Protease 3tatt der Abtrennung durch physikalische oder chemische ilittel wie durch Aufheizen inaktivi.ert werden. In einigen Fällen braucht das nicht umgesetzte Blut vom resultierenden Produkt nicht entfernt zu werden.

Der erfindungsgemäüe Blutabwandlungsatoff liegt in flüssiger bis fester Form vor und wird in üblicher Weise für die Verabreichung als anti-infiaramatorischee Mittel in unterschiedliche Formen gebracht. Beispielsweise kann «r in physiologischer Salzlösung gelöst oder zu Tabletten, Granalien oder Pulver in herkömmlicher Veiae verarbeitet werden. Alternativ kann in herkömmlicher Weise Salbe bereitet werden. Abhängig voii der Präparationsforn kann die Substanz intraperitoneal oder oral verabreicht oder lokal angewandt werden.

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Ea folgen Beispiele zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Zu 10 1 Blutserum von Kühen wurde 1 g Protease zugegeben, die von Bakterien vom. Senus Bacillus (Bacillus sp O - 20; der weiter oben angegebenen Art) erhalten wurde. Die in diesem Beispiel verwendete Protease hatte eine proteolytische Aktivität von 4 000 000 PE/g. Die proteolytische Wirksamkeit zeigt die enzymatische Wirksamkeit der nicht-proteinische Substanz mit Folinfarbe (folin colour) erzeugenden Protease, wobei 1^ Tyrosin in 1 Minute einer Einheit der enzymatischen Aktivität entspricht.

Die Mischung wurde 4 Stunden lang in einem thermostatisierten Wasserbad auf 45°G erwärmt. Zu der Reaktionsmischung wurde (dann) Aceton (70 Gew.^) gegeben und die resultierende Wischung zur Abtrennung von Enzym, Protein usw. 10 Minuten lang mit 3000 Upm zentrifugiert und der Niederschlag entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Aceton versetzt (auf 90 Gew.# Aceton gebracht), und die Mischung 1 Tag lang stehengelassen. Der resultierende Niederschlag wurde durch Zentrifugieren mit 3000 Upm über eine Zeitdauer von 30 Minuten hinweg gesammelt und im Vakuum getrocknet.

Das gewonnene Produkt wurde in Wasser gelöst und zur Entfernung anorganischer Substanzen und niedermolekularer Stoffe der Gelfiltration mit "Sephadex G-15" (Warenzeichen für Dextran der Pharmacia Pine Chemicals, Schweden) unterworfen. Der ödemhemmende Anteil des Produkts (sichergestellt durch Prüfung an ödem der Rattenferse) wurde gefriergetrocknet und weiter zur vollständigen Entfernung eines methanollöslicheri .Materials sorgfältig mit Methanol gewaschen. Durch Ent-

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fernung von Methanol von methanolunlöslichen Anteil wurden 25 mg eines Blutabwandlungaatoff3 in festem Zustand erhalten, Die Zusammensetzung dieser Substanz war folgende:

Anteile !,.enge

Aminosäure * 14 $ (berechnet ala Leucin)

Aminosäure ** 70 Gew.';£ (berechnet als Leucin)

Zucker 12 Gew. ¹Jo (berechnet als Glucose)

äermerkungi * Durch Ninhydrinreaktion der Substanz bestimmte Aminosäuremenge;

** durch liinhydrinreaktion der mit 6 η HGl 36 Stunden lang bei 110⁰G hydrolysieren Substanz bestimmte Aminosäuremenge.

Die Hauptaminoaäurezusamuensetzung war folgende: Aminosäure Gehalt

Asparaginsäure 7 Gew.i>

Glutaminsäure 8 Gew.56

Glycin 3 Gew.#

Die Substanz wurde in physiologischer Salzlösung in einer Konzentration von 8^/ml gelöst und Hatten mit einem Gewicht von 150 bis 160 g intraperitoneal verabreicht. Tn 30 kinuten wurden 0,05 al einer 1 gew.^igen Lösung von Karrageenin in physiologischer Salzlösung in die Sohle der Hinterpfote jeder Ratte subkutan injiziert. Zur 3e3timuung der ödemhecnenden

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Wirkung der Protease wurde 3 Stunden später die Volumenzunahiae der Hinterpfote gemessen. Auf diese Weise wurde gefunden, daß eine Dosis von 8 f /\ 50 g (Körpergewicht der Ratte) eine 60 ?iige Cdeminhibition ergibt. Dabei trat keinerlei intraperitoneale Blutung oder Ascitesbildung auf.

Zu Vergleichsswecken wurde die in diesem Beispiel ver wendete Protease Ratten in gleicher Weise wie oben intraperitoneal verabreicht. 3 stunden nach der Verabreichung wurde bei einer Dosi3 von 8^/150 *5 lediglich eine 5 /feige Inhibition des Ödems erreicht. Eine Dosis von 17OJ*/15D g ergab eine 60 ^iige Ödeminhibition, jedoch verbunden mit ausgeprägter intraperitonealer Blutung.

Beispiel 2

Zu 5 ml Blutserum von Ratten wurden 2 mg Protease (proteolytische Aktivität von 4 000 000 PE/g; Bestimmung in gleicher Weise wie in Beispiel 1), die vom Bacillus sp 0 - 20 (der gleiche wie in Beispiel 1) erhalten worden war, hinzugefügt und die Mischung 1 Stunde lang in einem thennostatisiertem Wasserbad von 37⁰C geschüttelt. Das so erhaltene Produkt wurde zur vollständigen Inaktivierung des Enzyms 2 Stunden lang auf 60⁰C erwärmt, wodurch ein Blutabwandlungsstoff gemäß der Erfindung in rohani Zustand erhalten wurde. Diese Substanz enthielt Peptid, Aminosäure und Zucker und war in Wasser löslich.

Der Blutabwandlungsstoff wurde in physiologischer Salzlösung in einer Konzentration von 400 //ml gelöst und dann in einer Dosis von 1 ml/200 g (Körpergewicht der Ratten) intraperitoneal an Ratten mit einem Gewicht von 150 bis 200g

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zur Prüfung der Hemciwirkung auf ein durch subkutane Injektion von Karrageenin in die Ferse der Hinterpfote der Ratte erzeugtes ödem verabreicht. 3 Stunden nach der Verabreichung wurde bei einer Dosis von 400 ^/200 g eine 65 ^ige Ödeminhibition erreicht, wie durch Liessung des Volumens der Hinterpfote bestimmt wurde. Dabei wurden keine Anzeichen von intraperitonealer Blutung festgestellt.

Im Gegensatz dazu wurde bei Verabreichung eines nicht mit Protease abgewandelten Serums in gleicher V/eise wie oben

keine ödeminhibierende Wirkung erreicht. Die V/irKung der als Ausgangsmaterial verwendeten Protease auf-das ödem wurde in gleicher Weise wie oben bestimmt. Dabei wurde bei einer Dosis von 400 ^[*/200 g zwar eine 64 ?£ige Hercmwirkung erreicht, jedoch trat daneben eine intraperitoneale Blutung auf.

Beispiel 3

5 mg Bromelin wurden mit 5 ml menschlichem Serum 1,5 Stunden lang bei 35 G umgesetzt und die Reaktionsinischung dann auf 3°G abgekühlt. Kaltes Aceton von 3°G wurde zu der Mischung für eine Konzentration von 60 Gew.-% hinzugegeben, wonach zur Abtrennung von Bromelin gefrierzentrifugiert würde. Das so erhaltene Produkt zeigte keino proteolytischen Wirkungen.

Die Abtrennung von Aceton von dem Produkt unter verhindertem Druck ergab 2,5 mg rohen Blutabwandlungsstoff, der dicht und hellgelb war und Peptid, Aminosäure und Zucker entnielt. Die Substanz war wasserlöslich.

Der Blutabwandlungsstoff wurde dann in physiologischer Salzlösung in einer Konzentration von 0,5 nig/nii gelönt und

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ao in einer Menge von 1 ml/200 g (Körpergewicht der Ratte) zur Überprüfung seiner Hemmwirkung auf durch 3ubkutane Injektion von Dextran in die Ferse der Rattenhinterpfote erzeugte Ödeme intraperitcrieal an Ratten verabreicht. In 3 Stunden wurden 70 °/o Ödeminhibition erreicht. Es wurden keine Anzeichen von intraperitonealer Blutung festgestellt. Im Gegensatz dazu wurde bei Verabreichung von nicht mit Protease umgesetztem Blutserum in gleicher V/eise wie oben keine Ödemhemmwirkung beobachtet. Die inhibierende Y/irkung des als Ausgangsmaterial dienenden Bromelins auf das Ödem wurde in gleicher tfeise wie oben geprüft. Dabei wurde eine 55 $ige Inhibition bei ausgeprägter intraperitonealer Ascites festgestellt.

Beispiel 4

Mit 1000 ml Kuhblut mit einem Gehalt an Hatriumcitrat (als gerinnungshemmendes Mittel) wurde 1 g Protease (unter dem Warenzeichen "llagase", vertriebenes Produkt der liagase Sangyo Co., Ltd., Osaka, Japan), die vom Bacillus subtilis erhalten worden war, 2 Stunden lang bei 37⁰C umgesetzt. Zu dem so behandelten Blut wurde bei 10 C Aceton für eine Konzentration von 60 Gew.-% hinzugegeben und die resultierende Mischung zur Entfernung von Blutsediment, Enzym usw. gefrierzentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit erwies sich als frei von enzymatischer Wirksamkeit. Kaltes Aceton wurde weiter zur überstehenden flüssigkeit für eine Konzentration von 80 Gew.$ hinzugegeben und der (-dabei gebildete) lii ed erschlag durch Gefrierzentrifugieren gesammelt, der Peptid, Aminosäure und Zucksr enthielt und in Wasser löslich war.

Die Gesamtmenge des so erhaltenen Blutabwandlungsstoffs wurde in 10 ml physiologischer Salzlösung gelöst und die resultierende Lesung weiter mit physiologischer Salzlösung auf

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das Fünffache, Zehnfache und Einhundertfache der Originalmenge verdünnt. Die Originaliösung und die verdünnten Lesungen wurden an Ratten in einer Menge von 1 ml/200 g (Körpergewicht der Ratte) zur Überprüfung der Hemmwiricung auf das durch subkutane Injektion von Karrageenin in die Ferse der Hinterpfote jeder Ratte erzeugte ödem intraperitoneal an Ratten verabreicht.

Die in 3 Stunden nach Verabreichung erzielte Inhibition betrug 80 ^CJ> bei der Originallöaungj 62 °/o bei fünffacher Verdünnung; 53 fi bei zehnfacher Verdünnung und 51 °h> bei hundertfacher Verdünnung. Nachteilige Wirkungen wi-e intraperitaneale Blutung und Ascites warden nicht beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde bei Verabreichung des nicht rait Protease abgewandelteit Blutes in gleicher Weise wie oben keine inhibierende Wirkung festgestellt. Außerdem wurde "Nagase" (gleiche Protease wie oben) zur Bestimmung der ödeminhibierenden WirKung in gleicher Weise verabreicht. Dabei wurde bei einer Dosis von 1 mg/200 g (Körpergewicht der Ratte) eine 40 #ige Inhibition erreicht. Bine Erhöhung der Dosis auf 1,2 mg/200 g (Körpergewicht dor Ratte) brachte eine 51 $ige Inhibition, verursachte jedoch eine ausgeprägte intraperitoneale Blutung.

Beispiel 5

^!1Semialkali protease" (Warenzeichen für ein Produkt der Seikagaku Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan), die vom Aspergillua melleus erhalten worden war, wurde mit 1 1 Kuheerum in Mengen von 500 PE*/ml (Serum) 1 Stunde lang bei 30⁰G umgesetzt. Zu dem 30 behandelten Serum wurde Aceton für 70 (rew.-# zugegeben und die Mischung 20 Hinuten lang mit 3000 Upm zentrifugiert, wonach da3 resultierende Sediment entfernt und weiter Aceton iüv 95 Gew.-90 zugegeben /.urde. Die so her-

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geatellte Mischung wurde 1 Tag lang stehengelassen und dann 30 Minuten lang mit 3000 Upm zentrifugiert. Der Blutabwandlungsstoff wurde gesammelt und vakuumgetrocknet zur Erzielung von 2,9 g eines braunen Pulvera, das frei von proteolytischen Wirksamkeiten gefunden wurde. Die Substanz enthielt Peptid, Aminosäure und Zucker und war in Wasser löslich, aber unlöslich in Methanol.

Die resultierende Substanz wurde in physiologischer Salzlösung aufgelöst und ihre inhibierende Wirkung bei Ratten in gleicher Weise wie in Beispiel 1 überprüft. Dabei wurde bei einer Dosis von 290 mg/kg eine 54 ^ige'Inhibition erreicht. Anzeichen von intraperitonealer Blutung und Ascites wurden nicht entdecktj*(Menge an trichloreesigsäurelöslicher Substanz, die der Erzeugung von 1 }f Tyrosin/Hinute-bei 30⁰C-entspricht).

Beispiel 6

Protease (proteolytlache Aktivität von 4 000 000 PE/g; in gleicher Weise bestimmt wie in Beispiel 1) die vom Bacillus sp 0 - 20 (gleicher wie in Beispiel 1) erhalten worden war, wurde suceinyliert und das Enzym an DEAF-Sephadex (Warenzeichen für Diäthylaminoäthyl-dextran der Pharmacia Pins Chemicals, Schweden) adsorbiert zur Herstellung eines wasaerunlöalichen Enzyms in folgender Weise:

5 mg Protease wurden in 4,5 ml einer 0,1 molaren Boratpufferlösung (mit 0,01 Ii CaGl₂) bei pH 8,0 gelöst und mit 1 mg Bernateinsäureanhydrid (succinyl anhydride) - gelöst in 0,5 ml Dioxan - versetzt und 30 Minuten lang unter Rühren zur Reaktion gebracht. Die Reaktionamischung wurde 1 Tag Bit

2 C 9 8 4 /, / 11 7 E

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0,005 M GaGl₂ dialysiert und die dialysierte Substanz an DEAF-Sephadex (wie oben) adsorbiert, das mit 0,01 molarem Boratpuffer (mit 0,05 M CaCl₀) bsi 8,0 gepuffert und in eine Säule gefüllt worden war; nach Gefriertrocknen wurden 200 mg wasserunlösliches Enzym erhalten.

Die als Ausgangsinaterial dienende Protease (Protease-1) und die resultierende wasserunlösliche Protease (Protease-2) wurden bezüglich der proteolytischen Aktivität und der esterolytischen Aktivität wie folgt miteinander verglichen. Die eeterolytiache Aktivität ist in Werten ausgedrückt, die erhalten wurden, wenn die jeweilige Protease j.n einer für eine proteolytieche Aktivität von 100 erforderliche Menge verwendet wurde.

Protease	proteolytische Aktivität *1) (Casein)	esterolytische Akti vität *2) (Acethyl-tyrosin- äthylester)
Protease -1	100	100
Protease -2	100	1 500
*D	Caaein-Folin-Methodej
*2)	Hestefin-Methode.

Die Protease-1 bzw. die Prctease-2 wurden jeweils zu 5 ml Blutserum vom Kaninchen in solcher Menge hinzugegeben, daß die Aktivität gegenüber (on) Aeetyl-tyrositi-äthylester 500 in M/min betrug (bestimmt nach der Heaterin-Methode) , und die Reaktion wurde 50 kinuten lang bei 37⁰G durchgeführt. Eine anti-inflammatorische Substanz wurde aus der Reaktionsmischung in folgender Weiee abgetrennt.

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I)aa mit Protease-1 modifizierte Serum wurde unter Verwendung einea Membranfilters filtriert ("Diafilter G-O5T"j Warenzeichen für ein Produkt der Hihon Shinku Gijutsu Go., Ltd., Tokyo, Japan). 5 ml V/asser wurden zu der unfiltrierten Flüssigkeit zur Verdünnung hinzugegeben und die verdünnte Flüssigkeit wurde weiter filtriert, wodurch 8 ml Filtrat erhalten wurden. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt zur Erzielung von 5 ml einer Flüssigkeit mit einer anti-inflammatorisch wirksamen Substanz. (Die Flüssigkeit war frei von Aktivität auf bzw. gegen Acetyl-tyrosin-äthyleater und wird nachfolgend als Probe-I bezeichnet).

Das mit Protease-2 modifizierte Blutserum wurde mit 3000 TJpm 10 kinuten lang zentrifugiert zur Entfernung von Enzym, wodurch 4,!? ml überstehende Flüssigkeit erhalten wurde, die mit Wasser zur Herstellung einer eine entzündungshemmende Substanz enthaltenden Flüssigkeit verdünnt wurde. (Die Flüssigkeit zeigte keine Aktivität auf bzw. gegen Acetyl-tyroainäthylester und wird nachfolgend als Probe-II bezeichnet).

Jedes der so hergestellten modifizierten Blutseren enthielt Peptid, Aminosäure und Zucker und war wasserlöslich.

Außerdem wurden 5 ml Kaninchenblutaerum 50 Minuten lang 57⁰O stehengelassen zu:
probe dienenden Probe-III.

bei 37⁰O stehengelassen zur Herstellung einer ala Vergleicha-

Die anti-inflamiaatoriache Wirkung dieser 3 Proben wurde überprüft. Dazu wurden die Proben I, II und III an männliche Wistar-liatten mit einem Gewicht von etwa 150 g in einer Menge von 5 ml/kg (Körpergewicht der Ratte) intraperitoneal verabreicht. In 30 Minuten wurden 0,05 ml 1 #ige Karrageeninlösung

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subkutan in die Sohle der Hinterpfote jeder Hatte injiziert. Die Volumenzunähme der Hinterpfote wurde 3 Stunden 3päter gemessen. Zur Kontrolle wurde physiologische Salzlösung in gleicher Weise wie oben verabreicht. Die beim Ödem erzielte Inhibition betrug 62 ^ bei α er Probe-I und 64 i° bei der Probe-II, während die Probe-III und die Kontrollprobe Keine inhibierende Wirkung zeigten.

Beispiel 7

Mit 5 nil Hühnerblut serum wurden 100 ng einer unlöslichen Protease (i.e. unlösliches Chymotrypsin, das durch Unlöslichmachen von Chymotrypsin nach der Azid-Lethode unter Verwendung von Carboxymethylcellulose, wie weiter unten beschrieben werden wird, erhalten worden war) 50 Minuten lang bei 35⁰G umgesetzt. Die unlösliche Protease wurde dann durch Filtrieren abgetrennt zur Erzielung von 4,8 ml Piltrat, das frei von enzymatischer Aktivität war. Das Piltrat enthielt Peptid, Aminosäure und Zucker und war wasserlöslich, aber in Methanol unlöslich.

Das Piltrat wurde zur Untersuchung seiner Hemmwirkung auf das durch subkutane Injektion von Karrageenin in die Perse der Rattenhinterpfote erzeugte ödem in einer Menge von 1 nl/200 g (Körpergewicht der Ratte) intraperitoneal an eine Ratte verabreicht. 3 Stunden nach Verabreichung wurde eine 68 i»ige Ödeminhibition erreicht, ohne daß irgendeine intraperitoneale .Blutung auftrat. Im Gegensatz dazu zeigte sich keine Ödemhemmwirkung bei Verabreichung von Hühnerblutaerum, das nicht mit unlöslicher Protease umgesetzt worden war.

Uie oben erwähnte unlösliche Protease wurde in folgender

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Weise hergestellt» Hydrazin wurde zu einer inethanolischen Lösung von Carboxymethylcellulose hinzugefügt zur Herstellung eines Garboxymethylcellulosehydrazids, das in verdünnter Salzeäurelösung mit Natriumnitrat umgesetzt wurde. Das Reaktionsprodukt wurde dann bei 5 G mit Chymotrypsin bei pH 8,7 unter Rühren ungesetzt, wodurch unlösliches Chymotrypsin erhalten wurde. Die reaktive Ausbeute des Produkts betrug 20 5*, ausgedrückt in proteolytiacher Wirkung auf Casein.

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Claims

2218U8 Patentansprüche

1. Anti-inflammatorisches Präparat bestehend aus einem anti-inflammatorisch wirksamen Reaktionsprodukt von Blut bzw. Blutbestandteilen mit einer Protease.

2. Anti-inflammatorisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt mit Blut selbst, Blutplasma oder Blutserum und insbesondere Blut- oder Blutserum erhalten worden ist.

3. Anti-inflammatoriaches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt mit einer Protease aua der Gruppe Trypsin, Pepsin, Chymotrypsin und Pancreatin sowie Bromelin und Papain erhalten worden ist.

4. Anti-inflammatorisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt mit einer Protease erhalten worden iat, die von einem Mikroorganismus au3 der Gruppe Aspergillus melleus, Aspergillus oryzae, Penicillium notatum, Rhizopue chinensia, Mucor racemosua, Trametes sanguinea, Llodella aubpileata, Bacillus subtilis, Pseudoidonas myxogenes, Streptomycea griaeus und Btreptomyces fradia3e stammt.

5. Anti-inflammatorieches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt mit einer Protease aua der Gruppe Chymotrypsin, Bromelin oder einer Protease vom Bacillus aubtilis oder Aspergillus melleus erhalten worden ist.

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6. . Verfahren zur Erzeugung von anti-inflammatorischem Präparat nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Blut bzw. Blutbestandteile vorzugsweise unter neutralen Bedingungen bei 20 bis 60 G mit einer Protease etwa 0,5 bis 5 Stunden lang umsetzt und das resultierende Produkt von der Reaktionsmischung abtrennt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, da:s die Protease in einer Lienge von 200 bis 2000 ^pro ml Blut verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease in wasserunlöslicher modifizierter Form verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame Substanz aus der Reaktionsmischung durch AcetonftLllungen und Gelfiltration gewonnen wird.

10. Anti-inflammatorisches Mittel, gekennzeichnet durch eine wirksame Menge an Präparat nach Anspruch 1 zusammen mit üblichen Arzneihilfsstoffen.

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