DE60110372T2

DE60110372T2 - Pharmazeutische zusammensetzungen mit botulinumtoxin

Info

Publication number: DE60110372T2
Application number: DE60110372T
Authority: DE
Inventors: J. Terrence HUNT
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2000-02-08
Filing date: 2001-02-05
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2021-02-06
Also published as: KR20020084115A; KR100753765B1; EP1253932B1; DK1253932T3; ES2237551T3; ATE519494T1; KR100665469B1; CA2478621A1; BR0108173A; KR100799400B1; US20020064536A1; DE60125986T2; TW200711657A; JP2007332155A; JP2004256545A; EP1398038A1; JP2003522154A; EP1398038B2; CN1258379C; CA2478621C

Description

Hintergrund
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend ein Botulinumtoxin und Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung ist eine Formulierung, enthaltend einen oder mehrere Wirkstoffe sowie einen oder mehrere Exzipienten, Träger, Stabilisatoren oder Füllmittel (bulking agents), die zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten, um ein gewünschtes diagnostisches Ergebnis oder eine therapeutische Wirkung zu erreichen, geeignet ist.
Für Lagerungsstabilität und Bequemlichkeit der Handhabung kann eine pharmazeutische Zusammensetzung als lyophilisiertes (d.h. gefriergetrocknetes) oder vakuumgetrocknetes Pulver formuliert werden, das vor der Verabreichung an einen Patienten mit (physiologischer) Kochsalzlösung oder Wasser rekonstituiert werden kann. Alternativ kann die pharmazeutische Zusammensetzung als wässrige Lösung formuliert werden. Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann einen proteinförmigen Wirkstoff enthalten. Unglücklicherweise können Proteine sehr schwer zu stabilisieren sein, was zu einem Verlust an Protein und/oder Verlust der Proteinaktivität während der Formulierung, Rekonstituierung (falls benötigt) und während der Lagerung vor der Verwendung der proteinhaltigen pharmazeutischen Zusammensetzung führt. Stabilitätsprobleme können aufgrund von Proteindenaturierung, Abbau, Dimerisierung und/oder Polymerisierung auftreten. Verschiedene Exzipienten, wie Albumin und Gelatine, wurden mit unterschiedlichem Ausmaß an Erfolg verwendet, um zu versuchen, einen Proteinwirkstoff, der in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden ist, zu stabilisieren. Zusätzlich wurden Kälteschutzmittel, wie Alkohole, verwendet, um die Proteindenaturierung unter den Gefrierbedingungen der Lyophilisierung zu reduzieren.
Albumin
Albumine sind kleine, reichlich vorhandene Plasmaproteine. Menschliches Serumalbumin hat ein Molekulargewicht von etwa 69 Kilo-Dalton (kD) und wurde als Nicht-Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, wo es als Füllträger und Stabilisator von bestimmten, in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandenen Proteinwirkstoffen dienen kann.
Die Stabilisierungsfunktion von Albumin in einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann sowohl während der Mehrschrittformulierung der pharmazeutischen Zusammensetzung als auch bei der späteren Rekonstituierung der formulierten pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden sein. Daher kann einem proteinförmigen Wirkstoff einer pharmazeutischen Zusammensetzung durch Albumin Stabilität durch z.B. (1) Reduktion der Adhäsion (häufig als "Klebrigkeit" bezeichnet) des Proteinwirkstoffs an Oberflächen, wie den Oberflächen von Laborglasgegenständen, Gefäßen, an die Ampulle, in der die pharmazeutische Zusammensetzung rekonstituiert wird, und an die Innenoberfläche einer Spritze, die verwendet wird, um die pharmazeutische Zusammensetzung zu injizieren, verliehen werden. Adhäsion eines Proteinwirkstoffs an Oberflächen kann zu Verlust des Wirkstoffs und zur Denaturierung des restlichen, verbleibenden Proteinwirkstoffs führen, die beide die Gesamtaktivität des in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandenen Wirkstoffs reduzieren; und (2) Reduktion der Denaturierung des Wirkstoffs, die bei Herstellung einer Lösung des Wirkstoffs mit niedriger Verdünnung auftreten kann.
So wie es in der Lage ist, einen Proteinwirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu stabilisieren, hat Albumin auch den Vorteil einer im allgemeinen vernachlässigbaren immunauslösenden Wirkung (eine Immunantwort auslösenden Wirkung), wenn es in einem menschlichen Patienten injiziert wird. Eine Verbindung mit einer nennenswerten immunauslösenden Wirkung kann die Herstellung von Antikörpern gegen sie hervorrufen, was zu einer anaphylaktischen Reaktion und/oder zur Entwicklung einer Arzneimittelresistenz führen kann, wobei die zu behandelnde Krankheit oder Störung dadurch potenziell widerstandsfähig gegenüber der pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine immunogene Komponente hat, wird.
Trotz seines bekannten stabilisierenden Effekts existieren unglücklicherweise signifikante Nachteile für die Verwendung von Albumin in einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Zum Beispiel sind Albumine teuer und in zunehmendem Maße schwierig zu erhalten. Außerdem können Blutprodukte, wie Albumin, den Patienten dem potenziellen Risiko des Erhalts von aus Blut stammenden Pathogenen oder infektiösen Stoffen aussetzen, wenn sie einem Patienten verabreicht werden. Daher ist bekannt, dass die Möglichkeit besteht, dass die Gegenwart von Albumin in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum unabsichtlichen Einschluss von infektiösen Elementen in die pharmazeutische Zusammensetzung führen kann. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die Verwendung von Albumin Prionen in eine pharmazeutische Zusammensetzung übertragen kann. Ein Prion ist ein proteinförmiger, infektiöser Partikel, von dem vermutet wird, dass er als anormale, konformationelle Isoform aus der gleichen Nukleinsäuresequenz stammt, die das normale Protein bildet. Es wurde weiter vermutet, dass die Infektivität in einer "Rekrutierungsreaktion" der normalen Isoform des Proteins in die Prionenproteinisoform auf einem posttranslationalen Niveau liegt. Offensichtlich wird das normale, endogene, zelluläre Protein dazu veranlasst, in eine pathogene Prionenkonformation umzufalten. Bedeutsamerweise wurden mehrere Chargen an menschlichem Serumalbumin aufgrund des Befunds, dass ein Blutspender in einem Pool, aus dem das Albumin hergestellt wurde, mit Creutzfeldt-Jacob-Krankheit diagnostiziert wurde, aus der Verteilung herausgenommen.
Die Creutzfeldt-Jacob-Krankheit (manchmal als Alzheimer-Erkrankung mit schnellem Fortschritt charakterisiert) ist eine seltene neurodegenerative Störung der menschlichen übertragbaren schwammartigen Encephalopathie, wo das Übertragungsmittel offensichtlich eine anormale Isoform eines Prionproteins ist. Ein Individuum mit Creutzfeldt-Jacob-Krankheit kann sich innerhalb von sechs Monaten von offensichtlicher perfekter Gesundheit zum akinetischen Mutismus verschlechtern.
Über eine mögliche iatrogene Übertragung von Creutzfeldt-Jacob-Krankheit durch Albumintransfusion wurde berichtet, und es wurde spekuliert, dass durch die gewöhnlichen Verfahren der Albuminherstellung kein ausreichender Schutz gegen die Übertragung der Creutzfeldt-Jacob-Krankheit bereitgestellt wird, wobei die Verfahren das Verwerfen von Blutzellelementen und Erwärmen auf 60°C für 10 Stunden einschließen. Daher kann ein potenzielles Risiko des Erwerbens einer Prion-mediierten Krankheit, wie der Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, durch die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Konzentrate von menschlichen Plasmaproteinen, wie Serumalbumin, enthalten, bestehen.
Gelatine wurde in einigen pharmazeutischen Zusammensetzungen mit Proteinwirkstoff als Albuminersatz verwendet. Beachtenswerter Weise ist Gelatine ein aus Tieren stammendes Protein und trägt daher das gleiche Risiko einer potenziellen Infektiosität, die Albumin besitzen kann. Daher ist es wünschenswert, einen Ersatz für Albumin zu finden, der keine Blutfraktion ist, und bevorzugt ist der Albuminersatz nicht Gelatine und stammt nicht aus einer Tierquelle.
Botulinumtoxin
Das anaerobe Gram-positive Bakterium Clostridium botulinum stellt ein potentes Polypeptid Neurotoxin, Botulinumtoxin, her, das bei Menschen und Tieren eine neuroparalytische Krankheit hervorruft, die als Botulismus bezeichnet wird. Clostridium botulinum und seine Sporen werden häufig in Erde gefunden, und das Bakterium kann in unsachgemäß sterilisierten und verschlossenen Nahrungsmittelbehältern von heimbasierten Konservenfabriken wachsen, was die Ursache von vielen Fällen von Botulismus ist. Die Wirkungen von Botulismus erscheinen typischerweise 18 bis 36 Stunden nach dem Essen des mit einer Clostridium botulinum-Kultur oder -Sporen infizierten Nahrungsmittels. Das Botulinumtoxin kann scheinbar ungeschwächt durch die Auskleidung des Darms gehen und periphäre motorische Neuronen attackieren. Die Symptome der Botulinumtoxinvergiftung können von Schwierigkeiten beim Gehen, Schlucken und Sprechen bis zur Paralyse der Atmungsmuskeln und dem Tod fortschreiten.
Botulinumtoxintyp A ist das letalste natürliche biologische Mittel, das dem Menschen bekannt ist. Etwa 50 Picogramm Botulinumtoxin-(gereinigter Neurotoxinkomplex) Typ A ist der LD₅₀ in Mäusen. Auf molarer Basis ist Botulinumtoxintyp A interessanter Weise 1,8 Milliarden Mal letaler als Diphtherie, 600 Millionen Mal letaler als Natriumcyanid, 30 Millionen Mal letaler als Cobrotoxin und 12 Millionen Mal letaler als Cholera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, Seiten 63-84 (Kapitel 9) von Natural Toxins II, hsg. von B.R. Singh et al., Plenum Press, New York (1976) (wo der genannte LD₅₀ von Botulinumtoxintyp A von 0,3 ng gleich 1 U entspricht, wird aufgrund der Tatsache, dass etwa 0,05 ng BOTOX^® 1 Einheit entspricht, korrigiert). Eine Einheit (U) an Botulinumtoxin ist als der LD₅₀ nach intraperitonealer Injektion in weibliche Swiss Webster-Mäuse, die jede 18–20 g wiegen, definiert. Sieben immunologisch unterschiedliche Botulinumneurotoxine wurden charakterisiert, diese sind die Botulinumneurotoxin-Serotypen A, B, C₁, D, E, F bzw. G, von denen jedes durch Neutralisation mit typspezifischen Antikörpern unterschieden wird. Die unterschiedlichen Serotypen an Botulinumtoxin variieren in den Tierarten, die sie befallen, und in der Schwere und Dauer der Paralyse, die sie hervorrufen. Zum Beispiel wurde bestimmt, dass Botulinumtoxintyp A 500 Mal potenter, wie durch die Rate der in der Ratte hervorgerufenen Paralyse gemessen, als Botulinumtoxintyp B ist. Zusätzlich wurde von Botulinumtoxintyp B bestimmt, dass es in Primaten bei einer Dosis von 980 U/kg nicht toxisch ist, was etwa 12 Mal dem Primaten LD₅₀ für Botulinumtoxintyp A entspricht. Die Botulinumtoxine binden offensichtlich mit hoher Affinität an die cholinergischen motorischen Neuronen, werden in das Neuron transloziert und blockieren die presynaptische Freisetzung von Acetylcholin.
Botulinumtoxine wurden in klinischen Szenarien zur Behandlung von neuromuskulären Störungen verwendet, die durch hyperaktive Skelettmuskeln gekennzeichnet sind. Botulinumtoxintyp A wurde durch die U.S. Food and Drug Administration in 1989 zur Behandlung von wesentlichem Blepharospasmus, Strabismus und hemifazialen Spasmen bei Patienten über dem Alter von 12 zugelassen. Die klinischen Wirkungen des peripheren intramuskulären Botulinumtoxintyp A werden gewöhnlich innerhalb von einer Woche nach Injektion gesehen. Die typische Dauer der Linderung der Symptome (d.h. der schlaffen Muskelparalyse) von einer einzelnen intramuskulären Injektion an Botulinumtoxintyp A kann etwa drei Monate betragen.
Obwohl alle Botulinumtoxin-Serotypen scheinbar die Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin an der neuromuskulären Kontaktstelle hemmen, tun sie dies durch Beeinflussung von unterschiedlichen neurosekretorischen Proteinen und/oder durch Spaltung dieser Proteine an unterschiedlichen Stellen. Botulinumtoxin A ist eine Zinkendopeptidase, die spezifisch eine Peptidbindung des intrazellulären, Vesikel-assoziierten Proteins SNAP-25 hydrolysieren kann. Botulinumtyp E spaltet auch das 25 Kilo Dalton (kD) synaptosomal assoziierte Protein (SNAP-25), aber zielt auf unterschiedliche Aminosäuresequenzen innerhalb dieses Proteins im Vergleich zu Botulinumtoxintyp A. Botulinumtoxintypen B, D, F und G wirken auf das Vesikel-assoziierte Protein (VAMP, auch Synaptobrevin genannt), wobei jeder Serotyp das Protein an einer unterschiedlichen Stelle spaltet. Schließlich wurde von Botulinumtoxintyp C₁ gezeigt, dass es sowohl Syntaxin als auch SNAP-25 spaltet. Diese Unterschiede im Wirkmechanismus können die relative Stärke und/oder Dauer der Wirkung der verschiedenen Botulinumtoxin-Serotypen beeinflussen.
Das Molekulargewicht des Botulinumtoxinproteinmoleküls ist für alle sieben der bekannten Botulinumtoxin-Serotypen etwa 150 kD. Interessanter Weise werden die Botulinumtoxine durch das Clostridium-Bakterium als Komplexe, umfassend das 150 kD Botulinumtoxinproteinmolekül zusammen mit assoziierten Nicht-Toxinproteinen freigesetzt. So kann der Botulinumtoxintyp A-Komplex durch das Clostridium-Bakterium als 900 kD-, 500 kD- und 300 kD-Formen hergestellt werden. Botulinumtoxintypen B und C₁ werden scheinbar nur als ein 500 kD-Komplex hergestellt. Botulinumtoxintyp D wird sowohl als 300 kD- als auch als 500 kD-Komplex hergestellt.
Schließlich werden Botulinumtoxintypen E und F nur als ungefähr 300 kD-Komplexe hergestellt. Von den Komplexen (d.h. Molekulargewicht größer als etwa 150 kD) wird angenommen, dass sie ein Nicht-Toxinhämaglutininprotein und ein Nicht-Toxin und nicht-toxisches Nicht-Hämaglutininprotein enthalten. Diese zwei Nicht-Toxinproteine (die zusammen mit dem Botulinumtoxinmolekül den relevanten Neurotoxinkomplex bilden können) können wirken, um dem Botulinumtoxinmolekül Stabilität gegen Denaturierung und Schutz gegen Verdauungssäuren, wenn das Toxin aufgenommen wird, zu verleihen. Zusätzlich ist es möglich, dass die größeren (größer als etwa 150 kD Molekulargewicht) Botulinumtoxin-Komplexe zu einer langsameren Diffusionsgeschwindigkeit des Botulinumtoxins weg von der Stelle der intramuskulären Injektion eines Botulinumtoxin-Komplexes führen können. Die Toxinkomplexe können durch Behandlung des Komplexes mit roten Blutzellen bei pH 7,3 in Toxinprotein und Hämagglutininprotein dissoziiert werden. Das Toxinprotein hat eine bemerkenswerte Instabilität nach Entfernung des Hämagglutininproteins.
Alle Botulinumtoxin-Serotypen werden durch Clostridium botulinum Bakterien als inaktive Einzelkettenproteine hergestellt, die durch Proteasen gespalten oder eingeschnitten werden müssen, um neuroaktiv zu werden. Die Bakterienstämme, die die Botulinumtoxin-Serotypen A und G herstellen, besitzen endogene Proteasen, und die Serotypen A und G können deshalb aus Bakterienkulturen überwiegend in ihrer aktiven Form gewonnen werden. Im Gegensatz werden die Botulinumtoxin-Serotypen C₁, D und E durch nicht-proteolytische Stämme synthetisiert und sind deshalb typischerweise nicht aktiviert, wenn sie aus der Kultur gewonnen werden. Serotypen B und F werden sowohl durch proteolytische als auch nicht-proteolytische Stämme hergestellt und können deshalb entweder in der aktiven oder der inaktiven Form gewonnen werden. Sogar die proteolytischen Stämme, die z.B. Botulinumtoxintyp B-Serotyp herstellen, spalten jedoch nur einen Teil des hergestellten Toxins. Der exakte Anteil der eingeschnittenen zu den nicht eingeschnittenen Molekülen hängt von der Länge der Inkubation und der Temperatur der Kultur ab. Daher ist ein bestimmter Prozentsatz jedes Präparats von z.B. dem Botulinumtoxintyp B-Toxin wahrscheinlich inaktiv, was möglicherweise für die bekannte signifikante niedrigere Stärke von Botulinumtoxintyp B im Vergleich zum Botulinumtoxintyp A verantwortlich ist. Die Gegenwart von inaktiven Botulinumtoxinmolekülen in einem klinischen Präparat wird zur Gesamtproteinbeladung des Präparats beitragen, die mit der gesteigerten Antigenizität in Verbindung gebracht werden kann, ohne zu seiner klinischen Wirksamkeit beizutragen. Zusätzlich ist bekannt, dass Botulinumtoxintyp B nach intramuskulärer Injektion eine kürzere Wirkdauer hat und bei der gleichen Dosis auch weniger wirksam als Botulinumtoxintyp A ist.
Kristallines Botulinumtoxintyp A mit hoher Qualität kann aus dem Hall A-Stamm von Clostridium botulinum mit Eigenschaften von ≥ 3 × 10⁷ U/mg, einem A260/A278 von weniger als 0,60 und einem bestimmten Muster an Bändern in der Gelelektrophorese hergestellt werden. Das bekannte Shantz-Verfahren kann verwendet werden, um kristallines Botulinumtoxintyp A zu erhalten, wie in E.J. Shantz et al., Properties and Use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol. Rev., 56: 80-99 (1992) ausgeführt. Im allgemeinen kann der Botulinumtoxintyp A-Komplex aus einer anaeroben Fermentation durch Kultivieren von Clostridium Botulinum Typ A in einem geeigneten Medium isoliert und gereinigt werden. Rohes Toxin kann durch Ausfällen mit Schwefelsäure geerntet und durch Ultramikrofiltration konzentriert werden. Die Reinigung kann durch Lösen des Säurepräzipitats in Calciumchlorid durchgeführt werden. Das Toxin kann dann mit kaltem Ethanol ausgefällt werden. Das Präzipitat kann in Natriumphosphatpuffer gelöst und zentrifugiert werden. Nach Trocknen kann dann ein ungefähr 900 kD kristalliner Botulinumtoxintyp A-Komplex mit einer spezifischen Stärke von 3 × 10⁷ LD₅₀ U/mg oder größer erhalten werden. Dieses bekannte Verfahren kann auch verwendet werden, um nach Abtrennung der Nicht-Toxinproteine reine Botulinumtoxine zu erhalten, wie z.B.: gereinigtes Botulinumtoxintyp A mit ungefähr 150 kD Molekulargewicht mit einer spezifischen Stärke von 1–2 × 10⁸ LD₅₀ U/mg oder größer; gereinigtes Botulinumtoxintyp B mit ungefähr 156 kD Molekulargewicht mit einer spezifischen Stärke von 1–2 × 10⁸ LD₅₀ U/mg oder größer, und gereinigtes Botulinumtoxintyp F mit ungefähr 155 kD Molekulargewicht mit einer spezifischen Stärke von 1–2 × 10⁷ LD₅₀ U/mg oder größer.
Bereits hergestellte und gereinigte Botulinumtoxine und Toxinkomplexe, die zur Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen geeignet sind, können von List Biological Laboratories, Inc., Campbell, Kalifornien; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, GB; Wako (Osaka, Japan) sowie von Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, erhalten werden.
Reines Botulinumtoxin ist so unbeständig, dass es beschränkte praktische Verwendbarkeit hat, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen. Außerdem sind die Botulinumtoxin-Komplexe, wie der Toxintyp A-Komplex, auch extrem anfällig für Denaturierung aufgrund von Oberflächendenaturierung, Wärme und alkalischen Bedingungen. Inaktiviertes Toxin bildet Toxoidproteine, die immunogen sein können. Die resultierenden Antikörper können einen Patient unempfänglich gegenüber Toxininjektion machen.
So wie bei Enzymen im allgemeinen, sind die biologischen Aktivitäten von Botulinumtoxinen (die intrazelluläre Peptidasen sind) zumindest teilweise von ihrer dreidimensionalen Konformation abhängig. Daher wird Botulinumtoxintyp A durch Wärme, verschiedene Chemikalien, Oberflächenstrecken und Oberflächentrocknung enttoxifiziert. Zusätzlich ist bekannt, dass Verdünnung des durch das bekannte Kultivieren, Fermentieren und Reinigen erhaltenen Toxinkomplexes auf die viel viel niedrigeren Toxinkonzentrationen, die zur Formulierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, zu einer schnellen Enttoxifizierung des Toxins führen, außer ein geeignetes Stabilisierungsmittel ist zugegen. Verdünnung des Toxins von Milligrammmengen zu einer Lösung, enthaltend Nanogramm pro Milliliter bringt aufgrund des schnellen Verlusts der spezifischen Toxizität bei so einer großen Verdünnung signifikante Schwierigkeiten mit sich. Da das Toxin Monate oder Jahre, nachdem die toxinhaltige pharmazeutische Zusammensetzung formuliert wurde, verwendet werden kann, muss das Toxin mit einem Stabilisierungsmittel stabilisiert werden. Die einzigen erfolgreichen Stabilisierungsmittel zu diesem Zweck waren die aus Tieren stammenden Proteine Albumin und Gelatine. Und wie angegeben, bringt die Gegenwart von aus Tieren stammenden Proteinen in der Endformulierung potenzielle Probleme mit sich, da bestimmte stabile Viren, Prione oder andere infektiöse oder pathogene Verbindungen, die aus den Donoren durchgetragen wurden, das Toxin kontaminieren können.
Außerdem kann jede der harschen Bedingungen der pH-, Temperatur- und Konzentration, die benötigt werden, um eine Botulinumtoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzung in ein Toxinversand- und -lagerungsformat (fertig zur Verwendung oder Rekonstituierung durch einen Arzt) zu lyophilisieren (gefrierzutrocknen) oder vakuumzutrocknen, das Toxin enttoxifizieren. Daher wurden aus Tieren stammende oder Donorpoolproteine, wie Gelatine und Serumalbumin, mit einigem Erfolg verwendet, um Botulinumtoxin zu stabilisieren.
Eine kommerziell erhältliche Botulinumtoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzung wird unter der Marke BOTOX^® (erhältlich von Allergan, Inc., Irvine, Kalifornien) verkauft. BOTOX^® besteht aus einem gereinigten Botulinumtoxintyp A-Komplex, Albumin und Natriumchlorid, verpackt in steriler, vakuumgetrockneter Form. Das Botulinumtoxintyp A wird aus einer Kultur des Hall-Stamms von Clostridium botulinum hergestellt, die in einem Medium, enthaltend N-Z-Amin und Hefeextrakt, gezogen wurde. Der Botulinumtoxintyp A-Komplex wird aus der Kulturlösung durch eine Serie von Säurepräzipitationen zu einem kristallinen Komplex aufgereinigt, der aus dem aktiven Toxinprotein mit hohem Molekulargewicht und einem assoziierten Hämagglutininprotein besteht. Der kristalline Komplex wird in einer Lösung, enthaltend Kochsalzlösung und Albumin, wieder gelöst und vor Vakuumtrocknung steril filtriert (0,2 μm). BOTOX^® kann vor der intramuskulären Injektion mit steriler, nicht-konzentrierter Kochsalzlösung rekonstituiert werden. Jede Ampulle BOTOX^® enthält etwa 100 Einheiten (U) Clostridium-Botulinumtoxin Typ A-Komplex, 0,5 mg menschliches Serumalbumin und 0,9 mg Natriumchlorid in einer sterilen, vakuumgetrockneten Form ohne Konservierungsmittel.
Um vakuumgetrocknete BOTOX^®-sterile normale Kochsalzlösung ohne Konservierungsmittel zu rekonstituieren, wird 0,9 % Natriumchlorid-Injektion durch Aufziehen der richtigen Menge an Verdünnungsmittel in einer Spritze mit zweckmäßiger Größe verwendet. Da BOTOX^® durch Blasenbildung oder ähnliche heftige Bewegung denaturiert wird, wird das Verdünnungsmittel sanft in die Ampulle injiziert. BOTOX^® soll innerhalb 4 Stunden nach Rekonstituierung verabreicht werden. Während dieser Zeitspanne wird rekonstituiertes BOTOX^® in einem Kühlschrank (2 bis 8°C) gelagert.
Rekonstituiertes BOTOX^® ist klar, farblos und frei von partikulärer Materie. Das vakuumgetrocknete Produkt wird in einem Gefrierschrank bei oder unter –5°C gelagert. BOTOX^® wird innerhalb von 4 h, nachdem die Ampulle aus dem Gefrierschrank entnommen und rekonstituiert wurde, verabreicht. Während diesen 4 Stunden kann rekonstituiertes BOTOX^® in einem Kühlschrank (2 bis 8°C) gelagert werden.
Es wurde berichtet, dass eine geeignete Alternative zu Albumin als Botulinumtoxinstabilisator ein anderes Protein oder alternativ eine Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht (kein Protein) sein kann. Carpender et al., Interactions of Stabilizing Additives with Proteins During Freeze-Thawing and Freeze-Drying, International Symposium on Biological Product Freeze-Drying and Formulation, 24.–26. Oktober 1990; Karger (1992), 225–239.
Viele häufig als Träger und Füllmittel in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendete Substanzen haben sich als ungeeignet als Albuminersatz in einer neurotoxinhaltigen pharmazeutischen Zusammensetzung herausgestellt. Zum Beispiel wurde von dem Disaccharid Cellobiose herausgefunden, dass es als Toxinstabilisator ungeeignet ist. Daher ist bekannt, dass die Verwendung von Cellobiose als Exzipient in Verbindung mit Albumin und Natriumchlorid in einem viel niedrigeren Grad an Toxizität (10 % Wiederfindung) nach Lyophilisierung des kristallinen Botulinumtoxintyps A mit diesen Exzipienten im Vergleich zu der Toxizität nach Lyophilisierung nur mit Albumin (75 bis 90 % Wiederfindung) resultiert. Goodnough et al., Stabilization of Botulinum Toxin Type A During Lyophilization, App. & Envir. Micro. 58 (10) 3426-3428 (1992).
Außerdem sind Saccharide, einschließlich Polysaccharide, im allgemeinen schlechte Kandidaten, um als Proteinstabilisatoren zu dienen. Daher ist bekannt, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Proteinwirkstoff, inhärent instabil ist, wenn die Proteinformulierung ein Saccharid (wie Glucose oder ein Polymer von Glucose) oder Kohlenhydrate umfasst, da von Proteinen und Glucose bekannt ist, dass sie miteinander wechselwirken und aufgrund der reduzierenden Natur von Glucose und Glucosepolymeren die gut beschriebene Maillard-Reaktion eingehen. Viel Arbeit wurde auch für die meist nicht erfolgreichen Versuche aufgewandt, diese Protein-Saccharid-Reaktion durch z.B. Reduktion von Feuchtigkeit oder Verwendung von nicht reduzierenden Zuckern zu verhindern. Signifikanter Weise kann der abbauende Weg der Maillard-Reaktion zu einer therapeutischen Unzulänglichkeit des Proteinwirkstoffs führen. Eine pharmazeutische Formulierung, umfassend Protein und ein reduzierendes Saccharid, Kohlenhydrat oder einen Zucker, wie ein Glucosepolymer, ist daher inhärent instabil und kann nicht ohne signifikanten Verlust der gewünschten biologischen Aktivität des Wirkstoffproteins über eine lange Zeitspanne gelagert werden.
Bemerkenswerter Weise ist einer der Gründe, dass menschliches Serumalbumin effektiv als Stabilisator eines Proteinwirkstoffs in einer pharmazeutischen Zusammensetzung wirken kann, der, dass Albumin, das ein Protein ist, nicht mit dem Proteinwirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung die Maillard-Reaktion eingehen kann. Daher würde man erwarten, einen Ersatz für Albumin unter anderen Proteinen zu finden und zu suchen.
Das Auffinden eines geeigneten Ersatzes für Albumin als Stabilisator des in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandenen Botulinumtoxins ist schwierig und problematisch, da von Albumin angenommen wird, dass es in einer pharmazeutischen Zusammensetzung als mehr als ein einfaches Füllmittel wirkt. So kann Albumin offensichtlich mit Botulinumtoxin wechselwirken, so dass die Stärke des Neurotoxins erhöht wird. Zum Beispiel ist bekannt, dass Rinderserumalbumin als mehr als ein bloßer stabilisierender Exzipient für Botulinumtoxintyp A wirken kann, da Rinderserumalbumin offensichtlich auch die Geschwindigkeit der Katalyse von synthetischen Peptidsubstraten, die dem SNAP-25-intraneuronalen Substrat für Botulinumtoxintyp A ähneln, steigern kann, Schmidt et al., Endoproteinase Activität of Type A Botulinum Neurotoxin Substrate Requirements and Activation by Serum Albumin, J. of Protein Chemistry, 16(1), 19-26 (1997). So kann Albumin einen potenzierenden Effekt haben, offensichtlich durch Beeinflussung der Geschwindigkeitskinetik bei der intrazellulären proteolytischen Wirkung eines Botulinumtoxins auf das Substrat des Toxins. Diese potenzielle Wirkung kann durch Albumin, das das Botulinumtoxin bei der Endozytose des Toxins in einer Zielnervenzelle begleitet hat, verursacht sein, oder die potenzielle Wirkung kann durch die vor-existierende Gegenwart von zytoplasmischem Albumin innerhalb des Neuronproteins vor der Endozytose des Botulinumtoxins verursacht sein.
Die Entdeckung des Vorhandenseins einer die kinetische Geschwindigkeit stimulierenden Wirkung durch Rinderserumalbumin auf die proteolytische Aktivität von Botulinumtoxintyp A macht die Suche nach einem geeigneten Ersatz für Albumin in einer Butulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Formulierung besonders problematisch. Daher kann ein Albuminersatz mit gewünschten Toxin-stabilisierenden Eigenschaften einen unbekannten und möglicherweise schädlichen Effekt auf die Geschwindigkeit der Substratkatalyse durch das Toxin haben, da zumindest mit Bezug auf Rinderserumalbumin die beiden Eigenschaften (Toxinstabilisierung und Toxinsubstratkatalysepotenzierung) offensichtlich dem gleichen Albuminexzipienten inhärent sind. Diese potenzierende Wirkung von Albumin zeigt, dass Albumin nicht als bloßer Exzipient in der Formulierung wirkt und macht daher die Suche nach einem geeigneten Ersatz für Albumin schwieriger.
Zusätzlich gibt es viele einzigartige Eigenschaften von Botulinumtoxin und seiner Formulierung in eine geeignete pharmazeutische Zusammensetzung, die die Suche nach einem Ersatz für das Albumin, das in den derzeitigen Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Formulierungen verwendet wird, beschränken und behindern und sehr problematisch machen. Beispiele von vier dieser einzigartigen Eigenschaften folgen. Zuerst ist Botulinumtoxin ein relativ großes Protein zum Einschluss in eine pharmazeutische Formulierung (das Molekulargewicht des Botulinumtoxintyp A-Komplexes ist 900 kD) und ist daher inhärent fragil und labil. Die Größe des Toxinkomplexes macht es viel anfälliger und labiler als kleinere, weniger komplexe Proteine, wodurch die Formulierungs- und Handhabungsschwierigkeiten verschlimmert werden, wenn die Toxinstabilität erhalten werden soll. Ein Albuminersatz muss daher in der Lage sein, mit dem Toxin auf eine Weise wechselzuwirken, die das Toxinmolekül nicht denaturiert, fragmentiert oder anders enttoxifiziert oder eine Disassoziierung der in dem Toxinkomplex vorhandenen Nicht-Toxinproteine hervorruft. Als das letalste bekannte biologische Produkt erfordert es zweitens außergewöhnliche Sicherheit, Präzision und Exaktheit bei allen Schritten der Formulierung einer Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzung. Daher sollte ein bevorzugter potenzieller Albuminersatz nicht selbst toxisch oder schwierig handzuhaben sein, so dass die bereits extrem stringenten Formulierungsanforderungen für Botulinumtoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzungen nicht erschwert werden.
Da Botulinumtoxin das erste mikrobielle Toxin war, das zur Injektion für die Behandlung von menschlichen Krankheiten zugelassen wurde, mussten drittens spezielle Protokolle entwickelt und für die Kultivierung, Rohmaterialproduktion, Formulierung in ein Pharmazeutikum und Verwendung des Botulinumtoxins zugelassen werden. Wichtige Erwägungen sind die Toxinreinheit und Dosis zur Injektion. Die Herstellung durch Kultivierung und die Reinigung müssen so durchgeführt werden, dass das Toxin nicht mal in Spurenmengen einer Substanz ausgesetzt wird, die das Endprodukt kontaminieren könnte und unzulässige Reaktionen im Patienten hervorrufen könnte. Diese Limitierungen verlangen das Kultivieren in vereinfachtem Medium ohne die Verwendung von Tierfleischprodukten und die Reinigung durch Vorgehensweisen, die keine synthetischen Lösungsmittel oder Harze mit sich bringen. Die Herstellung von Toxin unter Verwendung von Enzymen, verschiedenen Austauschern, wie den in Chromatographiesäulen vorhandenen, und synthetischen Lösungsmitteln, kann Verunreinigungen einführen und ist daher von den bevorzugten Formulierungsschritten ausgeschlossen. Außerdem wird Botulinumtoxintyp A einfach bei Temperaturen über 40°C denaturiert, verliert Toxizität, wenn sich Blasen an der Luft/Flüssigkeitsgrenzfläche bilden, und denaturiert in Gegenwart von Stickstoff oder Kohlendioxid.
Viertens existieren besondere Schwierigkeiten, um Botulinumtoxintyp A zu stabilisieren, da Typ A aus einem Toxinmolekül von etwa 150 kD in nichtkovalenter Assoziierung mit Nicht-Toxinproteinen, die etwa 750 kD wiegen, besteht. Von den Nicht-Toxinproteinen wird angenommen, dass sie die Sekundär- und Tertiärstrukturen, von denen die Toxizität abhängt, konservieren oder stabilisieren helfen. Vorgehensweisen oder Protokolle, die für die Stabilisierung von Nicht-Proteinen oder relativ kleineren Proteinen anwendbar sind, sind für die Probleme, die der Stabilisierung des Botulinumtoxin-Komplexes, wie dem 900 kD Botulinumtoxintyp A-Komplex, inhärent sind, nicht anwendbar. Während von pH 3,5 bis 6,8 das Typ A Toxin und die Nicht-Toxinproteine nichtkovalent miteinander verbunden sind, wird so unter leicht alkalischen Bedingungen (pH > 7,1) das sehr labile Toxin aus den Toxinkomplex freigesetzt. Aufgrund seiner Labilität hat das reine Toxin keinen oder beschränkten Nutzen zur medizinischen Verabreichung.
Im Licht der einzigartigen Natur des Botulinumtoxins und der oben ausgeführten Anforderungen muss die Wahrscheinlichkeit des Findens eines geeigneten Albuminersatzes für das derzeit in Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendete Albumin realistisch als gegen Null strebend angesehen werden. Vor der vorliegenden Erfindung war nur von den aus Tieren stammenden Proteinen Albumin und Gelatine bekannt, dass sie als geeigneter Stabilisator für das in einer pharmazeutischen Formulierung vorhandene Botulinumtoxin nützlich sind. So ist von Albumin allein oder mit einer oder zusätzlichen Substanz(en), wie Natriumphosphat oder Natriumcitrat, bekannt, dass es hohe Wiederfindung der Toxität von Botulinumtoxintyp A nach Lyophilisierung erlaubt. Wie bereits ausgeführt, kann Albumin als Produkt aus gesammeltem Blut unglücklicherweise zumindest potenziell infektiöse oder Krankheiten hervorrufende Elemente tragen, wenn es in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden ist. Tatsächlich kann jedes Tierprodukt oder Protein, wie Gelatine, auch potenziell pyrogene Stoffe oder andere Substanzen, die negative Reaktionen in einem Patienten hervorrufen können, enthalten.
Die chinesische Patentanmeldung CN 1215084A diskutiert ein Albuminfreies Botulinumtoxintyp A, das mit Gelatine, einem aus Tieren stammenden Protein, formuliert ist. Diese Formulierung beseitigt daher das Risiko der Übertragung eines aus einem Tierprotein stammenden oder begleitenden infektiösen Elements nicht.
Hydroxyethylstärke
Ein Polysaccharid kann aus Hunderten oder sogar Tausenden von Polyssacharid-Einheiten aufgebaut sein, die durch Glycosid(ether)bindungen zusammengehalten werden. Zwei wichtige Polysaccharide sind Cellulose und Stärke. Cellulose ist das Hauptstrukturmaterial in Pflanzen, das den Pflanzen ihre Festigkeit und Form verleiht. Stärke bildet den Reservenahrungsvorrat von Pflanzen und wird hauptsächlich in verschiedenen Samen und Knollen gefunden.
Stärke tritt als Körnchen auf, deren Größe und Form für die Pflanze, aus der die Stärke erhalten wird, charakteristisch sind. Im allgemeinen ist etwa 80 % der Stärke eine wasserunlösliche Fraktion, genannt Amylopektin. Amylopektin ist aus Ketten von D-Glucose- (als Glucopyranose) Einheiten aufgebaut, wobei jede Einheit durch eine α-glycosidische Bindung an C-4 der nächsten Glucoseeinheit gebunden ist. Wie Stärke ist auch Cellulose aus Ketten von D-Glucoseeinheiten aufgebaut, wobei jede Einheit durch eine Glucosidbindung an das C-4 der nächsten Einheit gebunden ist. Im Unterschied zu Stärke sind die Glycosidbindungen in Cellulose jedoch R-Bindungen. Behandlung von Cellulose mit Schwefelsäure und Essigsäureanhydrid liefert das Disaccharid Cellobiose. Wie zuvor ausgeführt, waren Versuche, Botulinumtoxin unter Verwendung von Cellobiose zu stabilisieren, nicht erfolgreich.
Ein besonderes Stärkederivat, das durch Behandlung von Stärke mit Pyridin und Ethylenchlorhydrin erhalten werden kann, ist 2-Hydroxyethylstärke, auch Hetastarch, genannt. US-Patent 4,457,916 offenbart eine Kombination von einem nicht-ionischen Tensid und Hydroxyethylstärke, um wässrige Lösungen des Tumornecrosefaktors (TNF) zu stabilisieren. Zusätzlich ist eine 6%ige wässrige Lösung von 2-Hydroxyethylstärke (Hetastarch) (erhältlich von Du Pont Pharma, Wilmington, Delaware unter dem Handelsnamen HESPAN^®, 6 % Hetastarch in 0,9 Natriumchloridinjektion) bekannt. Von Albumin ist bekannt, dass es nach intravenöser Verabreichung an einen Patienten als Plasmavolumenexpander wirkt. HESPAN^® wurde auch an Patienten verabreicht, um einen Plasmavolumenexpansionseffekt zu erzielen, und in diesem Sinn kann intravenöses HESPAN^® als Ersatz für intravenöses Albumin angesehen werden.
Hetastarch ist ein künstliches Kolloid, abgeleitet aus einer wachsartigen Stärke, die fast ganz aus Amylopektin besteht. Hetastarch kann durch Einführen von Hydroxyethylethergruppen auf Glucoseeinheiten der Stärke erhalten werden, und das resultierende Material kann dann hydrolysiert werden, um ein Produkt mit einem Molekulargewicht zu liefern, das zur Verwendung als Plasmavolumenexpander geeignet ist. Hetastarch ist durch ihre molare Substitution und auch durch ihr Molekulargewicht gekennzeichnet. Die molare Substitution kann ungefähr 0,75 sein, was bedeutet, dass Hetastarch in dem Ausmaß verethert ist, dass es pro 100 Glucoseeinheiten von Hetastarch im Durchschnitt ungefähr 75 Hydroxyethylsubstituentengruppen gibt. Das massegemittelte Molekulargewicht von Hetastarch ist ungefähr 670 kD mit einem Bereich von 450 kD bis 800 kD und wobei zumindest 80 % der Polymereinheiten in den Bereich von 20 kD bis 2.500 kD fallen. Die Hydroxyethylgruppen sind durch Etherbindungen primär an C-2 der Glucoseeinheiten und in einem geringeren Ausmaß an C-3 und C-6 gebunden. Das Polymer ähnelt Glycogen, und die polymerisierten D-Glucoseeinheiten sind primär durch α-1,4-Bindungen mit gelegentlichen α-1,6-Abzweigungsbindungen polymerisiert. Der Grad der Verzweigung ist ungefähr 1:20, was bedeutet, dass es einen Durchschnitt von ungefähr einer α-1,6-Verzweifung pro 20 Glucosemonomereinheiten gibt. Hetastarch besteht aus mehr als 90 % Amylopektin.
Die durch HESPAN^® hervorgerufene Plasmavolumenexpansion kann an die durch Albumin erhaltene heranreichen. Hetastarchmoleküle unter 50 kD-Molekulargewicht werden schnell durch renale Ausscheidung eliminiert, und eine Einzeldosis von ungefähr 500 ml HESPAN^® (ungefähr 30 g) führt zur Entfernung von ungefähr 33 % des verabreichten HESPAN^® im Urin innerhalb von etwa 24 Stunden. Die Hydroxyethylgruppe von Hydroxyethylstärke wird in vivo nicht abgespalten, sondern bleibt intakt und an Glucoseeinheiten gebunden, wenn sie ausgeschieden wird. Signifikante Mengen an Glucose werden nicht hergestellt, da die Hydroxyethylierung vollständigen Metabolismus der kleineren Hydroxyethylstärkepolymere verhindert.
Cellulose kann genauso in eine Hydroxyethylcellulose umgewandelt werden. Das durchschnittliche Molekulargewicht von 2-Hydroxyethylcellulose (ein 2-Hydroxyethylether von Cellulose) ist etwa 90 kD. Unglücklicherweise ist Hydroxyethylcellulose, im Unterschied zu Hydroxyethylstärke, hoch reaktiv und daher zur Verwendung als Stabilisator eines Proteinwirkstoffs in einer pharmazeutischen Formulierung ungeeignet.
Was daher benötigt wird, ist ein geeigneter Ersatz für das aus Tier stammende Protein oder den Donorpool-Albuminstabilisator, der in Neurotoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet wird.
WO 96/11699 offenbart pharmazeutische Zusammensetzungen, die im wesentlichen reines Botulinumtoxintyp A, ein Stabilisierungsprotein, eine Polyhydroxyverbindung und Wasser umfassen. Die Polyhydroxyverbindung wird bevorzugt aus Trehalose, Maltotriose und verwandten Verbindungen ausgewählt (siehe auch Goodnough et al. in Applied and Environmental Microbiology (1992) 3426).
WO 97/35604 offenbart lyophilisierte pharmazeutische Zusammensetzungen, die Botulinumtoxin oder Botulinumneurotoxin und wirksame Mengen an Trehalose und Methionin enthalten.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis und stellt einen Ersatz für in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandenes Albumin durch eine Verbindung, die das in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandene Botulinumtoxin stabilisieren kann, bereit. Die Albuminersatzverbindung hat die Eigenschaft einer niedrigen und bevorzugt vernachlässigbaren immunauslösenden Wirkung, wenn sie in einen menschlichen Patienten injiziert wird. Zusätzlich hat der bevorzugte Albuminersatz eine schnelle Entfernungsgeschwindigkeit aus dem Körper nach Injektion der pharmazeutischen Zusammensetzung.
Definitionen
Wie hierin verwendet, haben die unten aufgelisteten Wörter oder Begriffe die folgenden Definitionen.
Das Wort "etwa" bedeutet, dass das so qualifizierte Element, der Parameter oder der Begriff einen Bereich von plus oder minus 10 % über- und unterhalb des Werts des angegebenen Elements, Parameters oder Begriffs umfasst.
Der Ausdruck "Aminosäure" schließt Polyaminosäuren ein.
Das Wort "Polysaccharid" meint ein Polymer von mehr als zwei Saccharidmolekülmonomeren, wobei die Monomere identisch oder unterschiedlich sein können.
Der Ausdruck "pharmazeutische Zusammensetzung" meint eine Formulierung, in der der Wirkstoff ein Neurotoxin, wie ein clostridiales Neurotoxin, ist. Das Wort "Formulierung" meint, dass es zumindest einen zusätzlichen Inhaltsstoff in der pharmazeutischen Zusammensetzung neben dem Neurotoxinwirkstoff gibt. Eine pharmazeutische Zusammensetzung ist daher eine Formulierung, die zur diagnostischen oder therapeutischen Verabreichung (d.h. durch intramuskuläre oder subkutane Injektion) an einen menschlichen Patienten geeignet ist. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann sein: in einem lyophilisierten oder vakuumgetrockneten Zustand; eine nach Rekonstituierung der lyophilisierten oder vakuumgetrockneten pharmazeutischen Zusammensetzung mit Kochsalzlösung oder Wasser gebildete Lösung; oder eine Lösung, die keine Rekonstituierung benötigt. Der Neurotoxinwirkstoff kann einen der Botulinumtoxin-Serotypen A, B, C₁, D, E, F oder G oder ein Tetanustoxin sein, die alle durch Clostridium-Bakterien hergestellt werden.
Der Ausdruck "therapeutische Formulierung" bedeutet, dass eine Formulierung verwendet werden kann, um eine Störung oder Krankheit, wie eine Störung oder Krankheit gekennzeichnet durch Hyperaktivität (d.h. Spastizität) eines peripheren Muskels, zu behandeln und dadurch zu lindern.
Die Wörter "stabilisierend", "stabilisiert" oder "Stabilisation" bedeuten, dass bei Rekonstituierung mit Kochsalzlösung oder Wasser, einer lyophilisierten oder vakuumgetrockneten Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei oder unter etwa –2°C zwischen 6 Monaten und 4 Jahren gelagert worden ist, oder bei einer Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzung als wässriger Lösung, die zwischen etwa 2° und etwa 8°C 6 Monate bis 4 Jahre gelagert worden ist, das in der rekonstituierten oder wässrigen Lösung der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandene Botulinumtoxin mehr als etwa 20 % und bis zu etwa 100 % der Toxizität hat, die das biologisch aktive Botulinumtoxin hatte, bevor es in die pharmazeutische Zusammensetzung eingeschlossen wurde.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung schließt ein Neurotoxin und ein Polysaccharid ein. Das Polysaccharid stabilisiert das Neurotoxin. Die hierin offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzungen können einen pH zwischen etwa 5 und 7,3 haben, wenn sie rekonstituiert werden oder bei Injektion. Das durchschnittliche Molekulargewicht der Disaccharideinheit des Polysaccharids ist bevorzugt zwischen etwa 345 D und etwa 2.000 D. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist das durchschnittliche Molekulargewicht der Disaccharideinheit des Polysaccharids zwischen etwa 350 kD und etwa 1.000 kD und in der bevorzugtesten Ausführungsform zwischen etwa 350 D und etwa 700 D. Zusätzlich kann das Polysaccharid zumindest etwa 70 % Amylopektin umfassen. Außerdem ist das massengemittelte Molekulargewicht des Polysaccharids selbst zwischen etwa 20 kD und etwa 2.500 kD.
Im wesentlichen alle der Dissaccharideinheiten des Polysaccharids umfassen etherverknüpfte Glucopyranosemoleküle. Im Durchschnitt sind etwa 4 bis etwa 10 der Hydroxylgruppen, die auf jeweils 10 der in dem Polysaccharid vorhandenen Glucopyranosen vorhanden sind, über eine Etherbrücke mit einer Verbindung der Formel (CH₂)_n-OH, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4 sein kann, substituiert. Bevorzugter ist n eine ganze Zahl zwischen 1 und 3.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind durchschnittlich etwa 6 bis etwa 9 der Hydroxylgruppen, die auf jeweils 10 der in dem Polysaccharid vorhandenen Glucopyranosen vorhanden sind, über eine Etherbrücke mit einer Verbindung der Formel (CH₂)_n-OH, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4 sein kann, substituiert, und in der bevorzugtesten Ausführungsform sind durchschnittlich etwa 7 bis etwa 8 der Hydroxylgruppen, die auf jeweils 10 der in dem Polysaccharid vorhandenen Glucopyranosen vorhanden sind, über eine Etherbrücke mit einer Verbindung der Formel (CH₂)_n-OH, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4 sein kann, substituiert.
Eine detaillierte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine zur Injektion in einen menschlichen Patienten geeignete, pharmazeutische Zusammensetzung sein, die ein Botulinumtoxin und ein Polysaccharid einschließt. Das Polysaccharid kann eine Mehrzahl an verknüpften Glucopyranoseeinheiten umfassen, wobei jede Glucopyranoseeinheit eine Mehrzahl an Hydroxylgruppen hat, worin durchschnittlich etwa 6 bis etwa 9 der Hydroxylgruppen, die auf jeweils 10 der in dem Polysaccharid vorhandenen Glucopyranosen vorhanden sind, über eine Etherbrücke mit einer Verbindung der Formel (CH₂)_n-OH, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4 sein kann, substituiert sind. Das Polysaccharid kann ein Ethylether-substituiertes Polysaccharid sein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung ist zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten geeignet, um einen therapeutischen Effekt zu erreichen, und das Neurotoxin kann eines der Botulinumtoxin-Serotpyen A, B, C₁, D, E, F und G sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ein Botulinumtoxin und eine Hydroxyethylstärke.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassen, die ein Botulinumtoxin, ein Polysaccharid und eine Aminosäure oder eine Polyaminosäure einschließt.
Egal ob die pharmazeutische Zusammensetzung neben dem Neurotoxinwirkstoff nur einen Polysaccharidstabilisator oder sowohl Polysaccharid- als auch Aminosäurestabilisatoren umfasst, behält die
pharmazeutische Zusammensetzung ihre Stärke im wesentlichen unverändert für Zeiträume von 6 Monaten, 1 Jahr, 2 Jahren, 3 Jahren und/oder 4 Jahren, wenn sie bei einer Temperatur zwischen etwa –1°C und etwa –15°C gelagert wird. Zusätzlich können die angegebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen eine Stärke oder % Wiederherstellung von zwischen etwa 20 % und etwa 100 % nach Rekonstituierung haben. Alternativ oder zusätzlich kann die pharmazeutische Zusammensetzung eine Stärke von zwischen etwa 10 U/mg und etwa 30 U/mg nach Rekonstituierung, wie eine Stärke von etwa 20 U/mg nach Rekonstituierung, haben. Signifikanter Weise ist die pharmazeutische Zusammensetzung frei von jedem Albumin. Daher kann die pharmazeutische Zusammensetzung im wesentlichen frei von allen Nicht-Toxinkomplexproteinen sein. Bemerkenswerter Weise kann die Aminosäure in einer Menge von zwischen etwa 0,5 mg und etwa 1,5 mg Aminosäure pro 100 Einheiten Butolinumtoxin vorhanden sein.
Das Polysaccharid kann eine Stärke, wie eine Hydroxyethylstärke, sein, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung etwa 100 Einheiten des Botulinumtoxins umfasst, dann können zwischen etwa 500 μg und etwa 700 μg der Hydroxyethylstärke vorhanden sein. Bevorzugt ist das Botulinumtoxin Botulinumtoxintyp A, und die Aminosäure, wenn vorhanden, wird aus der Gruppe, bestehend aus Lysin, Glycin, Histidin und Arginin, ausgewählt.
Eine weitere, detaillierte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine stabile, hochwirksame, nicht-pyrogene, vakuumgetrocknete pharmazeutische Botulinumtoxintyp A-Zusammensetzung sein, die einen Botulinumtoxintyp A-Komplex, ein Polysaccharid und eine Aminosäure oder eine Polyaminosäure umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann albuminfrei sein, eine Lagerzeit von 1 Jahr bei –5°C mit etwa 90 % Stärke unmittelbar nach Rekonstituierung mit Kochsalzlösung oder Wasser und etwa 80 % Stärke 72 Stunden nach Rekonstituierung und Lagerung bei 2°C haben. Zusätzlich kann die pharmazeutische Zusammensetzung eine spezifische Toxizität von zumindest etwa 18 U/mg nach Rekonstituierung haben.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine lyophilisierte oder vakuumgetrocknete, pharmazeutische Zusammensetzung, die im wesentlichen aus einem Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht und einem Botulinumtoxin besteht, worin das Botulinumtoxin durch das Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht stabilisiert wird. Das Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht kann aus der Gruppe bestehen aus Hydroxymethylstärke, Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke, Hydroxybutylstärke und Hydroxypentylstärke ausgewählt sein, und das Botulinumtoxin kann aus der Gruppe bestehend aus den Botulinumtoxintypen A, B, C₁, D, E, F und G ausgewählt sein.
Das Polysaccharid kann in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer Menge von zwischen etwa 1 × 10^–9 mol Polysaccharid pro Einheit Botulinumtoxin bis etwa 2 × 10^–12 mol Polysaccharid pro Einheit des Botulinumtoxins vorhanden sein.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein: (a) ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das den Schritt der Herstellung einer Mischung eines Botulinumtoxins und eines Polysaccharids, bestehend aus kovalent verbundenen Wiederholungsmonomeren umfasst, worin das durchschnittliche Monomermolekulargewicht zwischen etwa 350 D und etwa 1.000 D ist, und (b) ein Verfahren zur Stabilisierung eines clostridialen Neurotoxins gegen Denaturierung oder Aggregation, wobei das Verfahren den Schritt des Inkontaktbringen eines clostridialen Neurotoxins mit einer stabilisierenden Zusammensetzung, umfassend ein Polysaccharid, umfasst. Der Schritt des Inkontaktbringens in dem letzteren Verfahren kann den Schritt der Zugabe einer wirksamen Menge des Polysaccharids zu einer wässrigen Lösung oder zu einem lyophilisierten oder vakuumgetrockneten Pulver, enthaltend ein clostridiales Neurotoxin, umfassen.
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass durch Einschluss eines Polysaccharids und/oder einer Aminosäure in die pharmazeutische Zusammensetzung eine stabile Neurotoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzung frei von jedem aus Tieren stammenden Protein oder Donorpoolalbumin formuliert werden kann. Insbesondere basiert die vorliegende Erfindung auf der Entdeckung, dass eine stabile Botulinumtoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzung geeignet zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten für eine therapeutische Wirkung durch Ersatz des in bekannten Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzungen vorhandenen Donorpoolalbumins durch ein Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht, abgeleitet von Stärke und/oder durch bestimmte reaktive Aminosäuren, hergestellt werden kann.
Überraschender Weise habe ich herausgefunden, dass ein geeigneter Ersatz für Albumin eine Verbindung ist, die weder ein anderes Protein noch eine Nicht-Proteinverbindung mit niedrigem Molekulargewicht ist. Daher habe ich entdeckt, dass bestimmte Polysaccharide mit hohem Molekulargewicht in einer pharmazeutischen Zusammensetzung als Neurotoxinstabilisatoren wirken können. Wie unten ausgeführt, kann eine Aminosäure auch oder alternativ zu der pharmazeutischen Zusammensetzung zugegeben werden, um die Stabilität und die nützliche Lagerungszeit der pharmazeutischen Zusammensetzung zu erhöhen.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Polysaccharid kann einem Neurotoxinwirkstoff, wie einem Botulinumtoxin, der in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden ist, Stabilität verleihen durch:

(1) Reduktion der Adhäsion (häufig als "Klebrigkeit" bezeichnet) des Botulinumtoxins an Oberflächen, wie den Oberflächen von Laborglasware, Gefäßen, der Ampulle, in der die pharmazeutische Zusammensetzung rekonstituiert wird, und der Innenoberfläche der Spritze, die verwendet wird, um die pharmazeutische Zusammensetzung zu injizieren. Adhäsion des Botulinumtoxins an Oberflächen kann zum Verlust von Botulinumtoxin und zur Denaturierung des restlichen Botulinumtoxins führen, die beide die Toxität des in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandenen Botulinumtoxins reduzieren.
(2) Reduktion der Denaturierung des Botulinumtoxins und/oder der Dissoziation des Butolinumtoxins von anderen in dem Butolinumtoxinkomplex vorhandenen Nicht-Toxinproteinen, wobei die Denaturierungs- und/oder Dissoziationsaktivität aufgrund der niedrigen Verdünnung des in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandenen Butolinumtoxins (d.h. vor Lyophilisierung oder Vakuumtrocknung) und in der rekonstituierten pharmazeutischen Zusammensetzung auftreten kann.
(3) Reduktion des Verlusts von Botulinumtoxin (d.h. aufgrund von Denaturierung oder Dissoziation von Nicht-Toxinproteinen in dem Komplex) während dem beachtenswerten pH und der Konzentration, die während Herstellung, Verarbeitung und Rekonstituierung der pharmazeutischen Zusammensetzung auftreten.

Die drei Arten der Botulinumtoxinstabilisierung, die durch Polysaccharid bereitgestellt werden, konservieren und erhalten dem Botulinumtoxin seine natürliche Toxizität vor der Injektion der pharmazeutischen Zusammensetzung.
Ein bevorzugtes Polysaccharid zur Verwendung in der vorliegenden Zusammensetzung umfasst eine Mehrzahl von Glucosemonomeren (Molekulargewicht 180) mit einem oder mehreren Substituenten an der Mehrzahl der Glucosemonomeren, so dass das bevorzugte Polysaccharid einen Molekulargewichtsbereich von zwischen etwa 20 kD und etwa 800 kD hat. Überraschender Weise kann so ein Polysaccharid eine in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandene Neurotoxinkomponente stabilisieren. Die vorliegende Erfindung schließt aus ihrem Umfang Disaccharidoligosaccharide mit einem massengemittelten Molekulargewicht von weniger als etwa 20 kD aus. Die vorliegende Erfindung schließt auch aus ihrem Umfang cyclische Polymere, wie die Cyclodextrine, aus. Die letzteren zwei Klassen an Verbindungen sind aus dem Umfang der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen, da die gewünschten Stabilisationseigenschaften der bevorzugten Polysaccharide, obwohl sie eine Verbindung mit relativ hohem Molekulargewicht (d.h. Molekulargewicht höher als 20 kD) verlangen, die Eigenschaft der kleinen lipophilen Höhle der Cyclodextrine nicht verlangen und tatsächlich nicht verwenden können, da die lipophile Höhle des Cyclodextrins viel kleiner in Größe als die Größe der durch die bevorzugten Polysaccharide der vorliegenden Erfindung stabilisierten Neurotoxine ist. Zusätzlich sind die Cyclodextrine Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die nur etwa 6 bis 8 Glucosemonomere umfassen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Stabilisierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die ein clostridiales Toxin enthalten, mit einem Polysaccharid. Der stabilisierende Effekt wird durch Inkontaktbringen eines clostridialen Toxins mit dem Polysaccharid erreicht. Beispiele geeigneter Polysaccharide innerhalb des Umfangs meiner Erfindung schließen bestimmte Stärkederivate ein. Wie bemerkt, zeigt das Polysaccharid eine stabilisierende Wirkung auf das clostridiale Toxin. Außerdem kann die Wirkung des Polysaccharids, um ein clostridiales Toxin zu stabilisieren, durch die Zugabe einer Aminosäure gesteigert werden.
Überraschenderweise habe ich entdeckt, dass 2-Hydroxyethylstärke die einzigartige Fähigkeit zeigt, das in einer Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandene Botulinumtoxin zu stabilisieren, wodurch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt wird, die frei von dem Potential zum Beherbergen einer übertragbaren Krankheit ist, die aus menschlichem Blut oder Blutfraktionsdonorpools oder aus von Tieren stammenden Proteinen, wie Gelatine, stammt.
Daher habe ich entdeckt, dass das bestimmte Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht, Hydroxyethylstärke, das Toxin während Formulierung, Trocknung, Lagerung und Rekonstituierung stabilisieren kann. Um den Proteinwirkstoff weiter zu stabilisieren, ist bevorzugt auch eine Aminosäure in der Polysaccharid-haltigen Formulierung eingeschlossen.
Das Polysaccharid in der pharmazeutischen Zusammensetzung wird bevorzugt mit dem clostridialen Neurotoxin in einer Menge von etwa 1 μg Polysaccharid pro Einheit Botulinumtoxin bis etwa 10 μg Polysaccharid pro Einheit Botulinumtoxin gemischt. Bevorzugter wird das Polysaccharid in der pharmazeutischen Zusammensetzung mit dem clostridialen Neurotoxin in einer Menge von etwa 4 μg Polysaccharid pro Einheit Botulinumtoxin bis etwa 8 μg Polysaccharid pro Einheit Botulinumtoxin gemischt. In der bevorzugtesten Ausführungsform, wo das Polysaccharid eine Hydroxyethylstärke ist, wird die Hydroxyethylstärke in der pharmazeutischen Zusammensetzung bevorzugt mit einem Botulinumtoxintyp A-Komplex in einer Menge von etwa 5 μg Hydroxyethylstärke pro Einheit Botulinumtoxin bis etwa 7 μg Hydroxyethylstärke pro Einheit Botulinumtoxin gemischt. Am bevorzugtesten wird die Hydroxyethylstärke in der pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem Botulinumtoxintyp A-Komplex in einer Menge von etwa 6 μg Hydroxyethylstärke pro Einheit des Botulinumtoxins gemischt. Da BOTOX^® etwa 100 Einheiten Botulinumtoxintyp A-Komplex pro Ampulle enthält, und das durchschnittliche Molekulargewicht von Hydroxyethylstärke im allgemeinen als zwischen etwa 20 kD und etwa 2.500 kD liegend angesehen wird, ist die bevorzugteste Konzentration an Hydroxyethylstärke zwischen etwa 1 × 10^–9 mol pro Einheit Botulinumtoxin (M/U) bis etwa 2 × 10^–12 mol pro Einheit Botulinumtoxin. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind für eine pharmazeutische 100 U Botulinumtoxintyp A-Komplex-Zusammensetzung etwa 600 μg Hydroxyethylstärke und etwa 1 mg einer Aminosäure, wie Lysin, Glycin, Histidin oder Arginin, in der Formulierung eingeschlossen. Daher umfasst meine Erfindung beides, ein Polysaccharid und eine Aminosäure oder eine Polyaminosäure, um den Neurotoxinwirkstoff in der pharmazeutischen Zusammensetzung zu stabilisieren.
Zusätzlich umfasst meine Erfindung auch die Verwendung einer geeigneten Aminosäure in einer ausreichenden Menge, um den Proteinwirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Gegenwart des in der Formulierung vorhandenen Polysaccharids zu stabilisieren. Daher habe ich überraschend entdeckt, dass der Einschluss von bestimmten Aminosäuren in eine Neurotoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzungsformulierung die nützliche Lagerungsdauer einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung verlängern kann. Daher umfasst meine Erfindung eine Neurotoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Aminosäure einschließt und die Verwendung solch einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Ohne dass ich wünsche, durch die Theorie gebunden zu sein, kann ich, da ein Neurotoxin, wie ein Butolinumtoxin, aufgrund der Gegenwart von Disulfidbindungen in dem Toxinkomplex für Oxidation anfällig ist, postulieren, dass der Einschluss einer oxidierbaren Aminosäure wirken kann, um die Wahrscheinlichkeit zu reduzieren, dass Oxidationsmittel, wie Peroxide und freie Radikale, mit dem Neurotoxin reagieren werden. Daher kann die Wahrscheinlichkeit, dass die oxidierbaren Neurotoxindisulfidbindungen durch ein Oxidationsmittel, wie Peroxide und freie Radikale, oxidiert werden, bei Einschluss einer Aminosäure, die als eine Oxidationsmittelfalle, d.h. eine Falle für oxidierende Verbindungen, wirken kann, reduziert werden. Eine geeignete Aminosäure ist eine Aminosäure, die zu Oxidation neigt. Beispiele von bevorzugten Aminosäuren sind Methionin, Cystein, Tryptophan und Tyrosin. Eine besonders bevorzugte Aminosäure ist Methionin.
Eine bevorzugte Ausführungsform meiner Erfindung kann auch die Verwendung von zwei oder mehr Aminosäuren in Kombination mit einem Polysaccharid, um den Proteinwirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu stabilisieren, einschließen. Daher können für eine pharmazeutische 100 U Botulinumtoxintyp A-haltige Zusammensetzung etwa 0,5 mg Lysin und etwa 0,5 mg Glycin mit zwischen etwa 500 μg und etwa 700 μg Hetastarch verwendet werden.
Wie oben ausgeführt, umfasst meine Erfindung daher eine proteinhaltige pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polysaccharid einschließt. Das Polysaccharid wirkt, um den Proteinwirkstoff in der pharmazeutischen Zusammensetzung zu stabilisieren. Zusätzlich schließt meine Erfindung auch proteinhaltige pharmazeutische Zusammensetzungen ein, die ein Polysaccharid und eine Aminosäure einschließen. Überraschend habe ich entdeckt, dass der Einschluss von bestimmten Aminosäuren in eine Neurotoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzungsformulierung, die ein Kohlenhydrat einschließt, die nützliche Lagerungszeit solch einer pharmazeutischen Zusammensetzung verlängern kann. Daher umfasst meine Erfindung eine Neurotoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzung, die sowohl ein Polysaccharid als auch eine Aminosäure einschließt, und die Verwendung solch einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Es ist bekannt, dass proteinhaltige pharmazeutische Zusammensetzungen, die auch Zucker, Polysaccharide und/oder Kohlenhydrate (im folgenden als "reaktive Verbindungen" bezeichnet) enthalten, aufgrund der Tatsache, dass ein Protein und eine der drei angegebenen reaktiven Verbindungen die gut beschriebene Maillard-Reaktion durchlaufen können, inhärent instabil sind. Intensive, meist fruchtlose Forschung wurde durchgeführt, um das Auftreten oder das Überhandnehmen dieser (zum Beispiel) Protein-Polysaccharid-Maillard-Reaktion durch Reduktion der Feuchtigkeit oder durch die Verwendung von nicht-reduzierenden Zuckern in der Formulierung zu reduzieren. Meine Entdeckung basiert auf der Beobachtung, dass der Einschluss einer hohen Konzentration einer hoch reaktiven Aminosäure die Maillard-Reaktion dazu bringt, zwischen dem stabilisierenden Polysaccharid und der zugegebenen Aminosäure stattzufinden. Durch Bereitstellen einer reichlichen Aminquelle für das Kohlenhydrat, um damit zu reagieren, wird die Wahrscheinlichkeit dafür, dass das Proteinarzneimittel (d.h. der Botulinumtoxinwirkstoff) in die Maillard-Reaktion einbezogen wird, reduziert, wodurch dieser Abbauweg des Proteinwirkstoffs reduziert und auf diese Weise dadurch der Proteinwirkstoff in der pharmazeutischen Zusammensetzung stabilisiert wird.
Bevorzugt kann jede Verbindung, die ein primäres oder sekundäres Amin enthält, für diesen Zweck verwendet werden. Am bevorzugtesten sind Aminosäuren, wie Lysin, Glycin, Arginin. Polyaminosäuren, wie Polylysin, sind auch geeignet. Kationische Aminosäuren, wie Lysin, können ionischer Anziehung ausgesetzt sein, was saure Proteine (z.B. Botulinumtoxine) bindet und das aktive Protein von Kontakt mit Zuckern abschirmt. Zusätzlich dazu, dass es größer ist und daher wahrscheinlicher als Abschirmung wirkt, liefert Polylysin den zusätzlichen Vorteil, dass es antibakteriell ist.
Ein anderer Aspekt meiner Erfindung ist es, die Zucker- und Aminosäurekomponenten vorzureagieren, um das Maillard-Reaktionspotential vor Zugabe der aktiven Proteinkomponente (Botulinumtoxin) zu den Zucker- und Aminosäureformulierungsinhaltsstoffen zu erschöpfen, wodurch die Aussetzung des aktiven Proteins gegenüber der Maillard-Reaktion wesentlich verringert wird.
Daher umfasst meine Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend und die Verwendung von Aminosäuren und Polyaminosäuren als Maillard-Reaktionsinhibitoren in Protein- (d.h. Botulinumtoxin) Arzneimittelformulierungen, die Polysacchride enthalten.
Die Erfindung verkörpert Formulierungen von aktiven Proteinen (d.h. Botulinumtoxin) in Kombination mit einem stabilisierenden Polysaccharid oder in Kombination von diesen und einer Aminosäure, wie Lysin.
Signifikanter Weise habe ich entdeckt, dass Hydroxyethylstärke mit einem Protein, wie Botulinumtoxin, keine Maillard-Reaktion durchläuft oder sie in einer/einem sehr abgeschwächten Rate oder Ausmaß durchläuft, wenn Hydroxyethylstärke mit anderen Polysacchariden oder Kohlenhydraten verglichen wird. Zusätzlich habe ich entdeckt, dass der Einschluss einer Aminosäure die Konservierungswirkung von Hydroxyethylstärke steigert, möglicherweise dadurch, dass sie als kompetitiver Inhibitor wirkt, d.h. durch Konkurrenz mit dem Toxin um in der Maillard-Reaktion reaktive Zucker. Zu diesem Zweck sind Aminosäuren, wie Lysin, Glycin, Arginin und Histidin, bevorzugte Aminosäuren. Polyaminosäuren, wie Polylysin, die das gewünschte kompetitive Hemmungsverhalten zeigen, können auch verwendet werden. Bemerkenswerter Weise können die spezifizierten Amino- und Polyaminosäuren auch antimikrobielle Eigenschaften zeigen, wodurch sie den zusätzlichen Vorteil der Reduktion von bakterieller Kontamination in der pharmazeutischen Zusammensetzung bereitstellen.
Reduzierende Zucker, wie Glucose und Glucosepolymere, durchlaufen mit Proteinen die Maillard-Reaktion. Sogar Zuckeralkohole, wie Mannit, können reagieren, allerdings manchmal durch Verunreinigungen oder Abbauprodukte. Daher kann ein Polysaccharid das Toxin für eine Zeitspanne stabilisieren, nur um später zu reagieren, wodurch reduzierte Lagerungsstabilität hervorgerufen wird. Es ist offensichtlich, dass die Auswahl des Polysaccharids kritisch ist. Ich habe entdeckt, dass der Anteil der Teilnahme von Hydroxyethylstärke an der Maillard-Reaktion sehr niedrig ist. Zusätzlich habe ich herausgefunden, dass Hydroxyethylcellulose, obwohl sie strukturell sehr ähnlich zu Hydroxyethylstärke ist, zur Verwendung als Stabilisator ungeeignet ist, da ich herausgefunden habe, dass Hydroxyethylcellulose in einem Modellsystem mit Lysin schnell reagieren kann. Das bedeutet nicht nur, dass Hydroxyethylstärke einen offensichtlichen Vorteil gegenüber anderen Zucker- (d.h. Polysaccharid) Stabilisatoren hat, sondern dass sogar zu Hydroxyethylstärke ähnliche Exzipienten, wie Hydroxyethylcellulose, zur Verwendung als Stabilisator für einen Proteinwirkstoff in einer pharmazeutischen Formulierung ungeeignet sein können.
Wie bemerkt, kann Hydroxyethylstärke zumindest in einigem Ausmaß an Maillard-Reaktionen teilnehmen. Daher und wie zuvor dargestellt, kann ein Polysaccharid allein nicht ausreichend sein, um eine optimale Stabilisierung des Toxins bereitzustellen. Daher entdeckte ich die Vorteile des Einschlusses einer Aminosäure, um als kompetitiver Inhibitor zu wirken. Ohne durch die Theorie gebunden sein zu wollen, ist die Hypothese, dass durch Bereitstellen einer anderen Aminquelle, im Vergleich zu dem Toxin in hohen Konzentrationen, die Wahrscheinlichkeit, dass die Maillard-Reaktion mit dem Toxin auftritt, reduziert wird, wodurch das Toxin stabilisiert wird. Jede Aminosäure kann verwendet werden, jedoch ist Lysin hochreaktiv und ist eine bevorzugte Aminosäure.
Meine Erfindung umfasst auch die Zugabe einer Zinkionenquelle zu einer Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Formulierung. Von Metallen, insbesondere zweiwertigen Kationen, wird berichtet, dass sie den Erfolg einer gefriergetrockneten Formulierung aufgrund von verschiedenen Cryo-Eigenschaften, einschließlich der Gitterstruktur des gebildetes Gefrorenen, stark beeinflussen. Fremdmetalle, wie Kupfer- und Eisenspezies, bieten sich für Radikaloxidationen an und sollten im allgemeinen vermieden werden. Spezifischer ist Botulinumtoxintyp A für die Aktivität von gebundenem Zink abhängig. Viele der vorgeschlagenen Exzipienten oder Reaktionsprodukte der Exzipienten werden mit Metallen Chelatkomplexe bilden. Dies könnte zur Bildung von instabilem Gefrorenen und/oder inaktivierten Toxinen führen. Durch Bereitstellen von ausreichend Zink in der Formulierung wird die Gegenwart der gewünschten zweiwertigen Kationen sichergestellt, die Wahrscheinlichkeit von Zinkverlust durch das Toxin wird reduziert, und die Stabilität gesteigert. Dies kann durch die Zugabe von ZnSO₄ zu einer pharmazeutischen Botulinumtoxinzusammensetzung bewerkstelligt werden.
Beispiele
Beispiel 1 (Vergleich)
Pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung
Wie zuvor ausgeführt, kann Botulinumtoxintyp A-Komplex aus einer Kultur des Hall-Stammes von Clostridium botulinum erhalten werden, der in einem Medium, enthaltend N-Z-Amin und Hefeextrakt, gezogen wurde. Der Botulinumtoxintyp A-Komplex wird aus der Kulturlösung durch eine Serie von Säurepräzipitationen zu einem kristallinen Komplex gereinigt, der aus dem aktiven Toxinprotein mit hohem Molekulargewicht und einem assoziierten Hämagglutininprotein besteht. Der kristalline Komplex wird dann in einer Lösung, enthaltend Kochsalzlösung und Albumin, wieder gelöst und steril filtriert (0,2 μm) vor Vakuumtrocknung. BOTOX^® wird dann mit steriler, nicht-konservierter Kochsalzlösung vor der intramuskulären Injektion rekonstituiert. Jede Ampulle BOTOX^® enthielt etwa 100 Einheiten (U) Clostridium botulinum-Toxin Typ A-Komplex, 0,5 mg menschliches Serumalbumin und 0,9 mg Natriumchlorid in einer sterilen, vakuumgetrockneten Form ohne Konservierungsmittel. Alternativ kann das menschliche Serumalbumin durch ein rekombinant hergestelltes Albumin ersetzt werden.
Beispiel 2
Pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung, enthaltend 2-Hydroxyethylstärke
Pharmazeutische Formulierungen mit gereinigtem Botulinumtoxintyp A-Neurotoxinkomplex wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 oben ausgeführt, hergestellt, außer dass 0,5 mg Albumin entweder durch 500 μg oder 600 μg Hetastarch ersetzt wurden. Es wurde bestimmt, dass volle Stärke bei Herstellung der Hetastarch-haltigen Formulierungen beibehalten wurde. Mit beiden Hetastarch-haltigen Formulierungen war daher die Stärke der albuminfreien Hetastarch-haltigen Zusammensetzungen, wie zur Zeit der Rekonstituierung des lyophilisierten, 100 U (+ 20 U) Botuliniumtoxintyp A-Komplexes gemessen, von 96 bis 128 Einheiten. Drei getrennte pharmazeutische Hetastarch, Botulinumtoxintyp A-Komplex-Zusammensetzungen hatten Stärkemessungen zur Zeit der Rekonstituierung von 105, 111 bzw. 128 Einheiten. Die Stärke wurde unter Verwendung der Standard-Toxinstärkeassays durch Verabreichung an Mäuse gemessen.
Beispiel 3
Glyinhaltige pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung Pharmazeutische Formulierungen mit gereinigtem Botulinumtoxintyp A-Neurotoxinkomplex wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 oben ausgeführt, hergestellt, außer dass 0,5 mg Albumin entweder durch 500 μg oder 600 μg Hetastarch ersetzt wurden. Zusätzlich wurde 1 mg Glycin zu der Formulierung gegeben. Die lyophilisierte, Hetastarch plus Glycin, albuminfreie, 100 U Botulinumtoxintyp A-Komplex, pharmazeutische Zusammensetzung wurde dann 7 Monate bei –5°C gelagert. Am Ende dieser 7-Monatsspanne wurde von der Stärke dieser Hetastarch plus Glycin-Toxinformulierung unter Verwendung des Tests durch Verabreichung an Mäuse bestimmt, dass sie im wesentlichen unverändert ist (d.h. die Stärke unterscheidet sich um weniger als 5 % von der ursprünglichen Stärke).
Beispiel 4
Lysinhaltige pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung
100 U pharmazeutische Formulierungen mit gereinigtem Botulinumtoxintyp A-Neurotoxinkomplex wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 oben ausgeführt, hergestellt, außer dass 0,5 mg Albumin durch 600 μg Hetastarch ersetzt wurden. Zusätzlich wurde 1 mg Lysin zu der Formulierung gegeben. Die lyophilisierte, Hetastarch plus Lysin, albuminfreie, 100 U Botulinumtoxintyp A-Komplex, pharmazeutische Zusammensetzung wurde dann 1 Jahr bei –5°C gelagert. Am Ende dieser 1- Jahresspanne wurde von der Stärke dieser Hetastarch plus Lysin-Toxinformulierung unter Verwendung des Tests durch Verabreichung an Mäuse bestimmt, dass sie im wesentlichen unverändert ist (d.h. die Stärke unterscheidet sich um weniger als 5 % von der ursprünglichen Stärke).
Beispiel 5
Histidinhaltige pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung
100 U pharmazeutische Formulierungen mit gereinigtem Botulinumtoxintyp A-Neurotoxinkomplex wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 oben ausgeführt, hergestellt, außer dass 0,5 mg Albumin durch 600 μg Hetastarch ersetzt wurden. Zusätzlich wurde 1 mg Histidin zu der Formulierung gegeben. Die lyophilisierte, Hetastarch plus Histidin, albuminfreie, 100 U Botulinumtoxintyp A-Komplex, pharmazeutische Zusammensetzung wurde dann 1 Jahr bei –5°C gelagert. Am Ende dieser 1-Jahresspanne wurde von der Stärke dieser Hetastarch plus Histidin-Toxinformulierung unter Verwendung des Tests durch Verabreichung an Mäuse bestimmt, dass sie im wesentlichen unverändert ist (d.h. die Stärke unterscheidet sich um weniger als 5 % von der ursprünglichen Stärke).
Beispiel 6
Argininhaltige pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung
100 U pharmazeutische Formulierungen mit gereinigtem Botulinumtoxintyp A-Neurotoxinkomplex wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 oben ausgeführt, hergestellt, außer dass 0,5 mg Albumin durch 600 μg Hetastarch ersetzt wurden. Zusätzlich wurde 1 mg Arginin zu der Formulierung gegeben. Die lyophilisierte, Hetastarch plus Arginin, albuminfreie, 100 U Botulinumtoxintyp A-Komplex, pharmazeutische Zusammensetzung wurde dann 1 Jahr bei –5°C gelagert. Am Ende dieser 1-Jahresspanne wurde von der Stärke dieser Hetastarch plus Arginin-Toxinformulierung unter Verwendung des Tests durch Verabreichung an Mäuse bestimmt, dass sie im wesentlichen unverändert ist (d.h. die Stärke unterscheidet sich um weniger als 5 % von der ursprünglichen Stärke).
Beispiel 7
Verwendung einer pharmazeutischen Botulinumtoxinzusammensetzung
Ein 48 Jahre alter Mann wird mit einer spastischen Muskelstörung, wie zervikaler Dystonie, diagnostiziert. Zwischen etwa 10^–3 U/kg und etwa 35 U/kg einer pharmazeutischen Botulinumtoxintyp A-Zusammensetzung, enthaltend 600 μg Hetastarch und 1 mg einer Aminosäure, wie Lysin, wird dem Patienten intramuskulär injiziert. Innerhalb von 1 bis 7 Tagen werden die Symptome der spastischen Muskelstörung gelindert, und die Linderung der Symptome bleibt für zumindest von etwa 2 Monaten bis etwa 6 Monaten bestehen.
Eine erfindungsgemäße, hierin offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung hat viele Vorteile, einschließlich der folgenden:

1. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann frei von jedem Blutprodukt, wie Albumin, und daher frei von jedem infektiösen Element aus Blutprodukten, wie einem Prion, hergestellt werden.
2. Die pharmazeutische Zusammensetzung hat Stabilität und hohe prozentuale Wiedergewinnung der Toxinstärke, vergleichbar zu oder überlegen der, die mit der derzeit erhältlichen pharmazeutischen Zusammensetzungen erreicht wird.

Obwohl die vorliegende Erfindung im Detail mit Bezug auf bestimmte bevorzugte Verfahren beschrieben wurde, sind andere Ausführungsformen, Versionen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung möglich.
Zum Beispiel sind eine breite Vielfalt von stabilisierenden Polysacchariden und Aminosäuren innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Folglich soll der Umfang der folgenden Ansprüche nicht auf die Beschreibung der oben ausgeführten bevorzugten Ausführungsformen beschränkt sein.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Injektion bei einem menschlichen Patienten geeignet ist und die folgendes umfasst: (a) ein Botulinumtoxin; und (b) ein Polysaccharid, das eine Mehrzahl daran gebundener Glucopyranoseeinheiten umfasst, jede Glucopyranoseeinheit weist mehrere Hydroxylgruppen auf, worin durchschnittlich etwa 4–10 der Hydroxylgruppen, die auf jeweils 10 der Glucopyranosen in dem Polysaccharid vorhanden sind, über eine Etherbrücke mit einer Verbindung der Formel (CH₂)_n-OH, worin n eine ganze Zahl von 1–4 sein kann, substituiert sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin das durchschnittliche Molekulargewicht einer Disaccharideinheit des Polysaccharids zwischen etwa 345 und 1.000 D liegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin das Polysaccharid ein ethylethersubstituiertes Polysaccharid ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung geeignet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin das Botulinumtoxin ausgewählt ist aus den Botulinumtoxintypen A, B, C₁, D, E, F und G.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, die eine Hydroxyethylstärke umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, die zusätzlich (c) eine Aminosäure oder eine Polyaminosäure umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin die pharmazeutische Zusammensetzung ihre Stärke im wesentlichen unverändert beibehält, wenn sie für 1 Jahr bei einer Temperatur zwischen etwa –1 und –15°C gelagert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin die pharmazeutische Zusammensetzung ihre Stärke im wesentlichen unverändert beibehält, wenn sie für 2 Jahre bei einer Temperatur zwischen etwa –1 und –15°C gelagert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin die pharmazeutische Zusammensetzung ihre Stärke im wesentlichen unverändert beibehält, wenn sie für 3 Jahre bei einer Temperatur zwischen etwa –1 und –15°C gelagert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin die pharmazeutische Zusammensetzung ihre Stärke im wesentlichen unverändert beibehält, wenn sie für 4 Jahre bei einer Temperatur zwischen etwa –1 und –15°C gelagert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin die pharmazeutische Zusammensetzung nach Rekonstituierung eine Stärke oder prozentuale Wiederherstellung zwischen etwa 20 und 100 % aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin die pharmazeutische Zusammensetzung nach Rekonstituierung eine Stärke zwischen etwa 10 und etwa 30 U/mg aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin die pharmazeutische Zusammensetzung nach Rekonstituierung eine Stärke von etwa 20 U/mg aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin die pharmazeutische Zusammensetzung von jeglichem Albumin frei ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin die pharmazeutische Zusammensetzung von jeglichen Nichttoxin-Komplexproteinen weitgehend frei ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin das Polysaccharid eine Stärke ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin das Polysaccharid eine Hydroxyethylstärke ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 18, worin die pharmazeutische Zusammensetzung etwa 100 Einheiten des Botulinumtoxins und zwischen etwa 500 und 700 μg Hydroxyethylstärke umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 19, die ferner zwischen etwa 0,5 und 1,5 mg der Aminosäure umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin das Botulinumtoxin Botulinumtoxin A ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 7, worin die Aminosäure ausgewählt ist aus Lysin, Glycin, Histidin und Arginin.