ES2368061T3 - Composiciones farmacéuticas de toxina botulínica. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende: (a) una toxina botulínica, y; (b) 2-hidroxietilalmidón.

Description

Composiciones farmacéuticas de toxina botulínica

ANTECEDENTES

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas. En particular, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una toxina botulínica y 2-hidroxietilalmidón y a métodos para fabricar las composiciones farmacéuticas.

Una composición farmacéutica es una formulación que contiene uno o más ingredientes activos así como uno o más excipientes, estabilizantes o agentes de carga, que es apropiada para la administración a un paciente humano para conseguir un resultado de diagnóstico o efecto terapéutico deseado.

Para su estabilidad en el almacenamiento y conveniencia de manejo, una composición farmacéutica se puede formular en forma de polvo liofilizado (es decir criodesecado) o secado a vacío que se puede reconstituir con disolución salina o agua previamente a la administración a un paciente. Alternativamente, la composición farmacéutica se puede formular en forma de una disolución acuosa. Una composición farmacéutica puede contener un ingrediente activo proteínico. Desgraciadamente, las proteínas pueden ser muy difíciles de estabilizar, dando como resultado la pérdida de proteína y/o la pérdida de actividad de la proteína durante la formulación, reconstitución (si se requiere) y durante el almacenamiento previamente al uso de una composición farmacéutica que contiene proteína. Los problemas de estabilidad pueden ocurrir debido a la desnaturalización, degradación, dimerización y/o polimerización de la proteína. Se han usado varios excipientes, tales como albúmina y gelatina con diferentes grados de éxito para tratar de estabilizar un ingrediente activo proteínico presente en una composición farmacéutica. Adicionalmente, se han usado crioprotectores tales como alcoholes para reducir la desnaturalización de la proteína en las condiciones de congelación de la liofilización.

Albúmina

Las albúminas son pequeñas y abundantes proteínas del plasma. La seroalbúmina humana tiene un peso molecular de alrededor de 69 kilodaltons (kD) y se ha usado como ingrediente no activo en una composición farmacéutica en la que puede servir como vehículo de carga y estabilizante de ciertos ingredientes activos proteínicos presentes en una composición farmacéutica.

La función de estabilización de la albúmina en una composición farmacéutica puede estar presente tanto durante la formulación multietapa de la composición farmacéutica como en la posterior reconstitución de la composición farmacéutica formulada. De este modo, se puede impartir estabilidad por medio de la albúmina a un ingrediente activo proteínico en una composición farmacéutica, por ejemplo, (1) reduciendo la adhesión (comúnmente denominada "adhesividad") del ingrediente activo proteínico a las superficies, tales como las superficies del material de vidrio de laboratorio, recipientes, al vial en el que se reconstituye la composición farmacéutica y a la superficie interior de una jeringuilla usada para inyectar la composición farmacéutica. La adhesión de un ingrediente activo proteínico a las superficies puede conducir a la pérdida de ingrediente activo y a la desnaturalización del ingrediente activo proteínico retenido restante, ambas reducen la actividad total del ingrediente activo presente en la composición farmacéutica, y ; (2) reduciendo la desnaturalización del ingrediente activo, que puede ocurrir al preparar una disolución de baja dilución del ingrediente activo.

Además de ser capaz de estabilizar un ingrediente activo proteínico en una composición farmacéutica, la albúmina tiene también la ventaja de la inmunogenicidad generalmente negligible cuando se inyecta en un paciente humano. Un compuesto con una inmunogenicidad apreciable puede provocar la producción de anticuerpos contra él, que puede conducir a una reacción anafiláctica y/o al desarrollo de resistencia al fármaco, convirtiéndose la enfermedad

o trastorno que se va a tratar en potencialmente refractario a la composición farmacéutica que tiene un componente inmunógeno.

Desgraciadamente, a pesar de su conocido efecto estabilizante, existen inconvenientes significativos al uso de albúmina en una composición farmacéutica. Por ejemplo, las albúminas son caras y cada vez más difíciles de obtener. Además, los productos de la sangre tales como la albúmina, cuando se administran a un paciente pueden someter al paciente a un riesgo potencial de recibir agentes patógenos o infecciosos transportados por la sangre. De este modo, se sabe que existe la posibilidad de que la presencia de albúmina en una composición farmacéutica puede dar como resultado la incorporación inadvertida de elementos infecciosos en la composición farmacéutica. Por ejemplo, se ha publicado que el uso de albúmina puede transmitir priones a una composición farmacéutica. Un prión es una partícula infecciosa proteínica que se hipotetiza que surge como una isoforma conformacional anormal de la misma secuencia de ácido nucleico que fabrica la proteína normal. Se ha hipotetizado adicionalmente que la infectividad reside en una "reacción de reclutamiento" de la proteína isoforma normal a la isoforma de proteína priónica a un nivel post-translacional. Aparentemente la proteína celular endógena normal es inducida a doblarse erróneamente en una conformación priónica patógena. Significativamente, se han retirado de la distribución varios lotes de seroalbúmina humana después de una determinación de que a un donante de sangre a un banco de sangre del que se preparó la albúmina le fue diagnosticada la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob.

La enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (a veces caracterizada como enfermedad de Alzheimer de avance rápido) es un raro trastorno neurodegenerativo de encefalopatía espongiforme humana transmisible, en la que el agente transmisible es aparentemente una isoforma anormal de una proteína priónica. Un individuo con la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob se puede deteriorar desde una aparente perfecta salud hasta un mutismo aquinético en seis meses. Se ha publicado la posible transmisión iatrogénica de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob por transfusión de albúmina y se ha especulado que no se proporciona suficiente protección contra la transmisión de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob por los métodos usuales de preparación de la albúmina, métodos que incluyen la retirada de los elementos celulares de la sangre y el calentamiento a 60 grados centígrados durante 10 horas. De este modo, puede existir un riesgo potencial de adquirir una enfermedad mediada por un prión, tal como la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, de la administración de una composición farmacéutica que contiene concentrados proteínicos de plasma humano, tal como seroalbúmina.

Se ha usado gelatina en algunas composiciones farmacéuticas de ingrediente activo proteínico como substituto de la albúmina. Notablemente, la gelatina es una proteína derivada de animales y por lo tanto supone el mismo riesgo de potencial infectividad que puede poseer la albúmina. Por consiguiente, es deseable encontrar un substituto para la albúmina que no sea una fracción sanguínea, y preferentemente el substituto de la albúmina no sea gelatina y no sea derivado de ninguna fuente animal.

Toxina botulínica

La bacteria anaeróbica gram positiva Clostridium botulinum produce una potente neurotoxina polipéptido, toxina tobulínica, que causa una enfermedad neuroparalítica en seres humanos y animales denominada botulismo. El Clostridium botulinum y sus esporas se encuentran comúnmente en el suelo y la bacteria puede crecer en recipientes de alimentos inapropiadamente esterilizados y sellados de envases domésticos, que son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo aparecen típicamente de 18 a 36 horas después de comer los alimentos infectados con un cultivo o esporas de Clostridium botulinum. La toxina botulínica puede pasar aparentemente atenuada a través de las paredes del intestino y atacar a las neuronas motoras periféricas. Los síntomas de la intoxicación por toxina botulínica pueden progresar desde dificultad para caminar, tragar, y hablar hasta la parálisis de los músculos respiratorios y la muerte.

La toxina botulínica del tipo A es el agente biológico natural más letal conocido por el hombre. Alrededor de 50 picogramos de toxina botulínica (complejo de neurotoxina purificada) de tipo A es una LD50 en ratones. Interesantemente, en base molar, la toxina botulínica de tipo A es 1,8 billones de veces más letal que la difteria, 600 millones de veces más letal que el cianuro de sodio, 30 millones de veces más letal que la cobrotoxina y 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh; Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, páginas 63-84 (capítulo 4) de Natural toxins II, editado por B.R. Singh et al., Plenum Press, New York (1976) (en el que la citada LD50 de la toxina botulínica de tipo A de 0,3 ng que es igual a 1U se corrige por el hecho de que alrededor de 0,05 ng de BOTOX es igual a 1 unidad). Una unidad (U) de toxina botulínica se define como la LD50 por inyección intraperitoneal en ratones hembra Swiss Webster que pesan 18-20 gramos cada uno. Se han caracterizado siete neurotoxinas botulínicas inmunológicamente distintas, siendo estas respectivamente los serotipos de toxina botulínica A, B, C1, D, E, F y G cada una de las cuales se distingue por la neutralización con un tipo específico de anticuerpos. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en la especie animal a la que afectan y en la severidad y duración de la parálisis que evocan. Por ejemplo, se ha determinado que la toxina botulínica de tipo A es 500 veces más potente, tal como se mide por la tasa de parálisis producida en la rata, que la toxina botulínica de tipo B. Adicionalmente, se ha determinado que la toxina botulínica de tipo B no es tóxica en primates a una dosis de 480 U/kg que es alrededor de 12 veces la LD50 de primate para la toxina botulínica de tipo A. Las toxinas botulínicas aparentemente se unen con alta afinidad a las neuronas motoras colinérgicas, se translocan dentro la neurona y bloquean el desprendimiento presináptico de acetilcolina.

Las toxinas botulínicas se han usado en establecimientos clínicos para el tratamiento de trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. La toxina botulínica de tipo A fue aprobada por la Food and Drug Administration de EE.UU. en 1989 para el tratamiento de blefarospasmo esencial, estrabismo y espasmo hemifacial en pacientes de alrededor de 12 años de edad. Los efectos clínicos de la toxina botulínica de tipo A se ven usualmente en una semana desde la inyección. La duración típica del alivio sintomático (es decir, parálisis de músculos flácidos) de una única inyección intramuscular de toxina botulínica de tipo A puede ser de alrededor de tres meses.

Aunque todos los serotipos de toxinas botulínicas aparentemente inhiben el desprendimiento del neurotransmisor acetilcolina en la unión neuromuscular, lo hacen afectando a diferentes proteínas neurosecretoras y/o escindiendo estas proteínas en diferentes sitios. La toxina botulínica A es una endopeptidasa de cinc que puede hidrolizar específicamente una unión peptídica de la proteína asociada a la vesícula intracelular SNAP-25. El botulinum del tipo E también escinde la proteína asociada sinaptosomal de 25 kiloDalton (kD) (SNAP-25), pero tiene como objetivo diferentes secuencias de aminoácido dentro de esta proteína, comparada con la toxina botulínica de tipo A. La toxina botulínica de los tipos B, D, F y G actúa sobre la proteína asociada a vesículas (VAMP, también denominada sinaptobrevina), escindiendo cada serotipo la proteína en un sitio diferente. Finalmente, se ha mostrado que la toxina botulínica de tipo C1 escinde tanto la sintaxina como la SNAP-25. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar a la potencia relativa y/o a la duración de la acción de varios serotipos de toxina botulínica.

El peso molecular de la molécula de toxina botulínica, para todos los siete serotipos de toxina botulínica conocidos, es de alrededor de 150 kD. Interesantemente, las toxinas botulínicas son desprendidas por la bacteria de Clostridio en forma de complejos que comprenden la molécula de proteína de toxina botulínica de 150 kD junto con proteínas no-toxina asociadas. De este modo, el complejo de tipo A de toxina botulínica puede ser producido por la bacteria de Clostridio en formas de 900 kD, 500 kD y 300 kD. La toxina botulínica de los tipos B y C1 se produce aparentemente solo como un complejo de 500 kD. La toxina botulínica del tipo D se produce en forma de complejos tanto de 300 kD como de 500 kD. Finalmente, las toxinas botulínicas de los tipos E y F se producen solo aproximadamente como complejos de 300 kD. Se cree que los complejos (es decir, de peso molecular mayor de alrededor de 150 kD) contienen una proteína hemaglutinina no-toxina y una no-toxina y proteína no-hemaglutinina no tóxica. Estas dos proteínas no-toxina (que junto con la molécula de toxina botulínica pueden comprender el complejo de neurotoxina relevante) pueden actuar para proporcionar estabilidad contra la desnaturalización de la molécula de toxina botulínica y protección frente a los ácidos digestivos cuando se ingiere la toxina. Adicionalmente, es posible que los mayores (mayores de alrededor de un peso molecular de 150 kD) complejos de toxina botulínica pueden dar como resultado una velocidad más lenta de difusión de la toxina botulínica lejos del lugar de la inyección intramuscular de un complejo de toxina botulínica. Los complejos de toxina se pueden disociar en proteína de toxina y proteínas de hemaglutinina tratando el complejo con células rojas sanguíneas a pH 7,3. La proteína de toxina tiene una notable inestabilidad al retirar la proteína de hemaglutinina.

Todos los serotipos de toxina botulínica fabricados por la bacteria Clostridium botulinum son proteínas de cadena única inactivas que deben ser escindidas o cortadas por proteasas para convertirse en neuroactivas. Las cepas bacterianas que fabrican las toxinas botulínicas de serotipos A y G poseen proteasas endógenas y los serotipos A y G se pueden recuperar por lo tanto de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. En contraste, las toxinas botulínicas de serotipos C1, D y E se sintetizan por cepas no proteolíticas y por lo tanto están típicamente inactivadas cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F se producen tanto por las cepas proteolíticas como no proteolíticas y por lo tanto se pueden retirar en la forma activa o inactiva. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, la toxina botulínica de serotipo de tipo B solo escinden una porción de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas cortadas a no cortadas depende de la duración de la incubación y de la temperatura del cultivo. Por lo tanto, cierto porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, toxina botulínica de tipo B es probable que sea inactivo, dando cuenta de la conocida significativamente más baja potencia de la toxina botulínica de tipo B comparada con la toxina botulínica de tipo A. La presencia de moléculas de toxina botulínica inactiva en una preparación clínica contribuirá a la carga proteínica total de la preparación, que se ha relacionado con la antigenicidad incrementada, sin contribuir a su eficacia clínica. Adicionalmente, se sabe que la toxina botulínica de tipo B tiene, al inyectarla intramuscularmente, una duración más corta de su actividad y también es menos potente que la toxina botulínica de tipo A con el mismo nivel de dosis.

Se puede producir toxina botulínica de tipo A cristalina de alta calidad a partir de la cepa Hall A de Clostridium botulinum con características de ≥3 x 107 U/mg, una A260/A278 de menos de 0,60 y un diagrama distinto de bandas en electroforesis de gel. Se puede usar el conocido procedimiento de Shantz para obtener toxina botulínica de tipo A cristalina, como se describe en Shantz, E.J. et al., Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56: 80:99 (1922). Generalmente, el complejo de toxina botulínica de tipo A se puede aislar y purificar de una fermentación anaeróbica cultivando Clostridium botulinum de tipo A en un medio apropiado. Se puede recoger toxina en bruto por precipitación con ácido sulfúrico y concentrar por ultramicrofiltración. La purificación se puede llevar a cabo disolviendo el precipitado ácido en cloruro de calcio. La toxina se puede precipitar a continuación con etanol frío. El precipitado se puede disolver en tampón de fosfato de sodio y centrifugar. Al secar se puede obtener a continuación aproximadamente complejo de toxina botulínica de tipo A cristalina de 900 kD con una potencia específica de 3 x 107 LD50 U/mg o mayor. Este procedimiento conocido se puede usar también, al separar las proteínas de no-toxina, para obtener toxinas botulínicas puras, tales como por ejemplo: toxina botulínica de tipo A purificada con un peso molecular de aproximadamente 150 kD con una potencia específica de 1-2 x 108 LD50 U/mg o mayor; toxina botulínica de tipo B purificada con un peso molecular de aproximadamente de 156 kD con una potencia específica de 1-2 x 108 LD50 U/mg o mayor, y; toxina botulínica de tipo F purificada con un peso molecular de aproximadamente de 155 kD con una potencia específica de 1-2 x 107 LD50 U/mg o mayor.

Las toxinas botulínicas ya preparadas y purificadas y los complejos de toxina apropiados para preparar formulaciones farmacéuticas se pueden obtener de List Biological Laboratoires, Inc. Campbell, California; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.; Wako (Osaka, Japan), así como de Sigma Chemicals de St Louis, Missouri.

La toxina botulínica pura es tan lábil que tiene utilidad práctica limitada para preparar una composición farmacéutica. Además, los complejos de toxina botulínica, tales como el complejo de toxina de tipo A son también extremadamente susceptibles a la desnaturalización debido a la desnaturalización por superficies, calor y condiciones alcalinas. La toxina inactivada forma proteínas toxoides que pueden ser inmunogénicas. Los anticuerpos resultantes pueden convertir a un paciente en refractario a la inyección de toxina.

Como con las enzimas generalmente, las actividades biológicas de las toxinas botulínicas (que son peptidasas intracelulares) dependen, por lo menos en parte, de su conformación tridimensional. De este modo, la toxina botulínica de tipo A se destoxifica por calor, ensanchamiento de la superficie con varios compuestos químicos y secado de la superficie. Adicionalmente, se sabe que la dilución del complejo de toxina obtenido del cultivo, fermentación y purificación conocidos a las mucho más bajas concentraciones usadas para la formulación de la composición farmacéutica da como resultado la rápida destoxificación de la toxina a menos que esté presente un apropiado agente estabilizante. La dilución de la toxina de cantidades de miligramos a una disolución que contiene nanogramos por mililitro presenta dificultades significativas debido a la rápida pérdida de toxicidad específica con tan gran dilución. Dado que la toxina se puede usar meses o años después de que se formule la composición farmacéutica que contiene la toxina, la toxina se debe estabilizar con un agente estabilizante. El único agente estabilizante con éxito para este propósito han sido las proteínas derivadas de animales albúmina y gelatina. Y como se indica, la presencia de proteínas derivadas de animales en la formulación final presenta problemas potenciales porque ciertos virus estables, priones y otros compuestos patógenos o infecciosos que transportaban los donantes pueden contaminar la toxina.

Además, una cualquiera de las severas condiciones de pH, temperatura e intervalos de concentración requeridas para liofilizar (criodesecar) o secar a vacío una composición farmacéutica que contiene una toxina botulínica en un formato para transporte y almacenamiento de la toxina (lista para su uso o reconstitución por un médico) puede destoxificar la toxina. De este modo, se han usado con cierto éxito para estabilizar la toxina botulínica proteínas derivadas de animales o de un banco de donantes tales como gelatina y seroalbúmina.

Una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica comercialmente disponible se vende con el nombre comercial BOTOX (disponible de Allergan, Inc., de Irvine, California). BOTOX consiste en un complejo de toxina botulínica de tipo A, albúmina y cloruro de sodio envasado en forma estéril secada a vacío. La toxina botulínica de tipo A se fabrica de un cultivo de la cepa Hall de Clostridium botulinum cultivada en un medio que contiene NZ-amina y extracto de levadura. El complejo de toxina botulínica de tipo A se purifica de la disolución de cultivo por una serie de precipitaciones ácidas hasta un complejo cristalino que consiste en la proteína activa de toxina de alto peso molecular y una proteína de hemaglutinina asociada. El complejo cristalino se redisuelve en una disolución que contiene disolución salina y albúmina y se filtra estérilmente (0,2 micrómetros) previamente al secado a vacío. El BOTOX se puede reconstituir con disolución salina estéril no conservada previamente a la inyección intramuscular. Cada vial de BOTOX contiene alrededor de 100 unidades (U) de complejo de toxina de Clostridium botulinum de tipo A, 0,5 miligramos de seroalbúmina humana y 0,9 miligramos de cloruro de sodio en una forma estéril secada a vacío sin un conservante.

Para reconstituir BOTOX estéril normal salino sin un conservante; se usa una inyección de cloruro de sodio al 0,9% retirando la cantidad apropiada de diluyente en la jeringuilla de tamaño apropiado. Dado que el BOTOX se desnaturaliza por burbujeo o por agitación violenta similar, el diluyente se inyecta suavemente en el vial. El BOTOX se debe administrar en las cuatro horas siguientes después de la reconstitución. Durante este periodo de tiempo, el BOTOX reconstituido se almacena en un refrigerador (de 2º a 8ºC). El BOTOX reconstituido es transparente, incoloro y libre de materia en partículas. El producto secado a vacío se almacena en un frigorífico a o por debajo de 5ºC. El BOTOX se administra en las cuatro horas después de que se retira al vial del frigorífico y se reconstituye. Durante estas cuatro horas, el BOTOX reconstituido se puede almacenar en un refrigerador (de 2º a 8ºC).

Se ha publicado que una alternativa apropiada a la albúmina como estabilizador de la toxina botulínica puede ser otra proteína o alternativamente un compuesto (no proteínico) de bajo peso molecular. Carpender et al., Interactions of Stabilizing Additives with Proteins During Freeze-Thawing and Freeze-Drying, International Symposium on Biological Product freeze-Drying and Formulation, 24-26 October 1990; Karger (1992), 225-239.

Muchas substancias comúnmente usadas como vehículos y agentes de carga en composiciones farmacéuticas han mostrado ser inapropiadas como sustitutos de la albúmina en la composición farmacéutica que contiene la neurotoxina. Por ejemplo, se ha encontrado que el disacárido celobiosa es inapropiado como estabilizante de la toxina. De este modo, se sabe que el uso de celobiosa como excipiente junto con albúmina y cloruro de sodio da como resultado un nivel de toxicidad mucho más bajo (10% de recuperación) después de la liofilización de toxina botulínica cristalina de tipo A con estos excipientes, comparada con la toxicidad después de la liofilización solo con albúmina (de >75% a >90% de recuperación). Goodnough et al., Stabilization of Botulinum Toxin Type A During Lyophilization, App & Envir. Micro. 58 (10) 3426-3428 (1992).

Además, los sacáridos, incluyendo los polisacáridos, son en general pobres candidatos a servir como estabilizantes de proteínas. De este modo, se sabe que una composición farmacéutica que contiene un ingrediente activo proteínico es inherentemente inestable si la formulación de proteína comprende un sacárido (tal como glucosa o un polímero de glucosa) o carbohidratos porque las proteínas y la glucosa se sabe que interaccionan conjuntamente y sufren la bien conocida reacción de Maillard, debida, es decir, a la naturaleza reductora de la glucosa y polímeros de glucosa. Se ha dedicado mucho trabajo a intentos en su mayor parte sin éxito de prevenir esta reacción proteínasacárido, por ejemplo, por reducción de la humedad o uso de azúcares no reductores. Significativamente, el camino degradante de la reacción de Maillard puede dar como resultado una insuficiencia terapéutica del ingrediente activo proteínico. Una formulación farmacéutica que comprende proteína y un sacárido, carbohidrato o azúcar reductor, tal como un polímero de glucosa, es por lo tanto inherentemente inestable y no se puede almacenar durante un largo periodo de tiempo sin pérdida significativa de la actividad biológica deseada de la proteína ingrediente activo.

Notablemente, una de las razones de que la seroalbúmina humana pueda funcionar efectivamente como estabilizante de un ingrediente activo proteínico en una composición farmacéutica es porque la albúmina, siendo una proteína, no sufre la reacción de Maillard con el ingrediente activo proteínico en una composición farmacéutica. Por consiguiente, uno esperaría buscar y encontrar un substituto de la albúmina entre otras proteínas.

Encontrar un substituto apropiado para la albúmina como estabilizante de la toxina botulínica presente en una composición farmacéutica es difícil y problemático porque se cree que la albúmina funciona en una composición farmacéutica como más que un mero agente de carga. De este modo, la albúmina aparentemente puede interactuar con la toxina botulínica para incrementar la potencia de la neurotoxina. Por ejemplo, se sabe que la seroalbúmina bovina puede actuar como más que un mero excipiente estabilizante para la toxina botulínica de tipo A, dado que la seroalbúmina bovina aparentemente también acelera la velocidad de catálisis de substratos de péptido sintético, substratos que se parecen al substrato intraneuronal SNAP-25 para la toxina botulínica de tipo A, Schmidt et al., Endoproteinase Activity of Type A Botulinum Neurotoxin Substrate Requirements and Activation by Serum Albumin,

J. of Protein Chemistry, 16 (1), 19-26 (1997). De este modo, la albúmina puede tener un efecto potenciante, aparentemente afectando a las cinéticas de velocidad, en la acción proteolítica intracelular de una toxina botulínica en el substrato de la toxina. Este efecto potenciante puede ser debido a la albúmina que ha acompañado a la toxina botulínica en la endocitosis de la toxina en una neurona blanco o el efecto potenciador puede ser debido a la presencia pre-existente de albúmina citoplasmática dentro de la proteína de la neurona previamente a la endocitosis de la toxina botulínica.

El descubrimiento de la presencia de un efecto estimulante de la velocidad de la cinética por la seroalbúmina bovina en la actividad proteolítica de la toxina botulínica de tipo A convierte en especialmente problemática la búsqueda de un substituto apropiado para la albúmina en una formulación farmacéutica que contiene toxina botulínica. De este modo, un substituto de la albúmina con características deseables de estabilización de la toxina puede tener un efecto desconocido y posiblemente perjudicial en la velocidad de la catálisis del substrato por la toxina, dado que por lo menos con respecto a la seroalbúmina bovina las dos características (estabilización de la toxina y potenciación de la catálisis del substrato de toxina) son aparentemente inherentes al mismo excipiente de albúmina. Este efecto de potenciación de la albúmina muestra que la albúmina no actúa como un mero excipiente en la formulación y por lo tanto convierte en más difícil la búsqueda de un substituto apropiado de la albúmina.

Adicionalmente hay muchas características únicas de la toxina botulínica y su formulación en una composición farmacéutica apropiada que restringen e impiden y convierten en muy problemática la búsqueda de un substituto para la albúmina usada en las actuales formulaciones farmacéuticas que contiene toxina botulínica. A continuación siguen ejemplos de cuatro de estas características únicas. Primera, la toxina botulínica es una proteína relativamente grande para su incorporación en una formulación farmacéutica (el peso molecular de un complejo de toxina botulínica de tipo A es 900 kD) y por lo tanto es inherentemente frágil y lábil. El tamaño del complejo de toxina lo hace mucho más frágil y lábil que las proteínas más pequeñas menos complejas, por ello las dificultades de formulación y manejo de la formulación si se va a mantener la estabilidad de la toxina. Por consiguiente, un substituto de la albúmina debe ser capaz de interaccionar con la toxina de una manera que no desnaturalice, fragmente o de destoxifique de otro modo la molécula de toxina o provoque la disociación de las proteínas no-toxina presentes en el complejo de toxina. Segunda, como producto biológico conocido más letal, se exige excepcional seguridad, precisión y exactitud para todas las etapas de la formulación de una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica. De este modo, un potencial substituto preferido de la albúmina no debe ser él mismo tóxico o difícil de manejar para no exacerbar los requerimientos ya extremadamente exigentes de formulación de la composición farmacéutica que contiene toxina botulínica.

Tercera, dado que la toxina botulínica fue la primera toxina microbiana en ser aprobada para inyección para el tratamiento de enfermedad humana, se tuvieron que desarrollar y aprobar protocolos específicos para el cultivo, producción en masa, formulación en un compuesto farmacéutico y uso de la toxina botulínica. Son consideraciones importantes la pureza de la toxina y la dosis para inyección. La producción por cultivo y la purificación se deben llevar a cabo de modo que la toxina no se exponga a ninguna substancia que pueda contaminar el producto final incluso en cantidades de trazas y provocar reacciones indebidas en el paciente. Estas restricciones requieren el cultivo en medio simplificado sin el uso de productos de carne animal y la purificación por procedimientos que no impliquen disolventes o resinas sintéticas. La preparación de la toxina usando enzimas, varios intercambiadores, tales como los presentes en columnas de cromatografía y disolventes sintéticos puede introducir contaminantes y son por lo tanto excluidos de las etapas de la formulación preferida. Además, la toxina botulínica de tipo A se desnaturaliza ya a temperaturas por encima de 40ºC, pierde toxicidad cuando se forman burbujas en la interfase aire/líquido, y se desnaturaliza en presencia de nitrógeno o dióxido de carbono.

Cuarta, existen dificultades particulares para estabilizar la toxina botulínica de tipo A, porque el tipo A consiste en una molécula de toxina de alrededor de 150 kD en asociación no covalente con proteínas no-toxina que pesan alrededor de 750 kD. Las proteínas no-toxina se cree que conservan o ayudan a estabilizar las estructuras secundaria y terciaria de las que depende la toxicidad. Los procedimientos o protocolos aplicables a la estabilización de no-proteínas o a proteínas relativamente más pequeñas no son aplicables a los problemas inherentes a la estabilización de los complejos de toxina botulínica, tales como el complejo de toxina botulínica de tipo A de 900 kD. De este modo, aunque de pH 3,5 a 6,8 la toxina de tipo A y las proteínas no-toxina están unidas conjuntamente no covalentemente, en condiciones ligeramente alcalinas (pH >7,1) la toxina muy lábil se desprende del complejo de toxina. Debido a su labilidad, la toxina pura no tiene o tiene utilidad limitada para la administración médica.

A la vista de la naturaleza única de la toxina botulínica y de los requerimientos descritos anteriormente, se debe ver que la probabilidad de encontrar un substituto apropiado de la albúmina para la albúmina usada en las actuales composiciones farmacéuticas de toxina botulínica en realidad se aproxima a cero. Previamente a la presente invención, se ha sabido que solo las proteínas derivadas de animales albúmina y gelatina tienen utilidad como estabilizantes apropiados de la toxina botulínica presente en una formulación farmacéutica. De este modo, se sabe que la albúmina, por si misma o con una o más substancias adicionales tales como fosfato de sodio o citrato de sodio, permite una alta recuperación de la toxicidad de la toxina botulínica de tipo A después de la liofilización. Desgraciadamente, como se describe ya, la albúmina, como producto de sangre mezclada, puede, por lo menos potencialmente, transportar elementos infecciosos o causantes de enfermedad cuando está presente en una composición farmacéutica. Ciertamente, cualquier producto o proteína animal tal como gelatina puede también contener potencialmente pirógenos u otras substancias que pueden causar reacciones adversas al inyectarla a un paciente.

La solicitud de patente china CN 1215084A discute una toxina botulínica de tipo A formulada con gelatina, una proteína derivada de un animal. Esta formulación por lo tanto no elimina el riesgo de transmitir un derivado de proteína animal o un elemento infeccioso que lo acompañe.

Hidroxietilalmidón

Un polisacárido puede estar formado de cientos o incluso miles de unidades de sacárido unidas conjuntamente por uniones glicósido (éter). Dos importantes polisacáridos son la celulosa y el almidón, La celulosa es el principal material estructural en las plantas, dando a las plantas su rigidez y forma. El almidón constituye el suministro de alimento de reserva de las plantas y se encuentra principalmente en varias semillas y tubérculos.

El almidón se presenta en forma de gránulos cuyo tamaño y forma son característicos de la planta de la que se obtiene el almidón. En general alrededor del 80% del almidón es una fracción insoluble en agua llamada amilopectina. La amilopectina está compuesta de cadenas de unidades de D-glucosa (como glucopiranosa), estando cada unidad unida por una unión alfa-glicósido al C-4 de la siguiente unidad de glucosa. Como el almidón, la celulosa también está formada de cadenas de unidades de D-glucosa, en la que cada unidad está unida por una unión glucósido al C-4 de la siguiente unidad. Sin embargo, al contrario que en el almidón, las uniones glicósido en la celulosa son uniones beta. El tratamiento de la celulosa con ácido sulfúrico y anhídrido acético da el disacárido celobiosa. Como se describe previamente, los intentos de estabilizar la toxina botulínica usando celobiosa no han tenido éxito.

Un derivado de almidón particular que se puede obtener tratando el almidón con piridina y etilenclorohidrina, 2hidroxietilalmidón, denominado también hetalmidón. La patente de EE.UU: No 4.457.916 describe una combinación de un tensioactivo no iónico e hidroxietilalmidón para estabilizar disoluciones acuosas de factor de necrosis tumoral (TNF). Adicionalmente, es conocida una disolución acuosa al 6% de 2-hidroxietilalmidón (hetalmidón) (disponible de Du Pont Pharma, Wilmington, Delaware con el nombre comercial HESPAN®, hetalmidón al 6% en inyección de cloruro de sodio al 0,9%). Se sabe que la albúmina actúa como expansor del volumen plasmático en la administración intravenosa a un paciente. También se ha administrado HESPAN a pacientes para conseguir un efecto de expansión del volumen plasmático y en ese sentido el HESPAN se puede considerar un substituto de la albúmina intravenosa.

El hetalmidón es un coloide artificial derivado de un almidón céreo compuesto casi completamente de amilopectina. El hetalmidón se puede obtener introduciendo grupos de éter hidroxietílico en unidades de glucosa del almidón, y el material resultante se puede hidrolizar a continuación para dar un producto con un peso molecular apropiado para su uso como un expansor del volumen plasmático. El hetalmidón está caracterizado por su substitución molar y también por su peso molecular. La substitución molar puede ser aproximadamente 0,75, queriendo decir que el hetalmidón está eterificado hasta el punto de que por cada 100 unidades de glucosa de hetalmidón hay, como promedio, aproximadamente 75 grupos hidroxietilo substituyentes. El peso molecular promedio en peso del hetalmidón es aproximadamente 670 kD con un intervalo de 450 kD a 800 kD y estando por lo menos el 80% de las unidades del polímero dentro del intervalo de 20 kD a 2.500 kD. Los grupos hidroxietilo están unidos por uniones éter principalmente en el C-2 de la unidad de glucosa y en menor grado en el C-3 y C-6. El polímero se parece al glicógeno, y las unidades de D-glucosa polimerizada están unidas principalmente por uniones α-1,4 con uniones de ramificación α-1,6 ocasionales. El grado de ramificación es aproximadamente 1:20, queriendo decir que hay un promedio de aproximadamente una ramificación α-1,6 por cada 20 unidades de monómero de glucosa. El hetalmidón comprende más de 90% de amilopectina.

La expansión de volumen plasmático producida por HESPAN se puede aproximar a la obtenida por la albúmina. Las moléculas de hetalmidón por debajo de 50 kD de peso molecular se eliminan rápidamente por excreción renal y una única dosis de aproximadamente 500 ml de HESPAN (aproximadamente 30 g) dan como resultado la eliminación en la orina de aproximadamente el 33% del HESPAN administrado en alrededor de 24 horas. El grupo hidroxietilo del hidroxietilalmidón no se escinde in vivo, sino que permanece intacto y unido a las unidades de glucosa cuando se excreta. No se producen cantidades significativas de glucosa ya que la hidroxietilación evita el metabolismo completo de los polímeros de hidroxietilalmidón más pequeños.

La celulosa se puede convertir similarmente en hidroxietilcelulosa. El peso molecular medio de 2-hidroxietil-celulosa (un éter 2-hidroxietílico de celulosa) es de alrededor de 90 kD. Desgraciadamente, la hidroxietilcelulosa, al contrario que el hidroxietilalmidón, es altamente reactiva y por lo tanto inapropiada para su uso como estabilizante de un ingrediente de proteína activa en una formulación farmacéutica.

Lo que se necesita por lo tanto es un substituto apropiado para la proteína derivada de animal o estabilizante de albúmina de banco de donantes usado en composiciones farmacéuticas que contienen neurotoxina.

SUMARIO

La presente invención cumple esta necesidad y proporciona la substitución de la albúmina presente en una composición farmacéutica por un compuesto que puede estabilizar la toxina botulínica presente en la composición farmacéutica. El compuesto de substitución de la albúmina tiene la característica de baja y preferiblemente negligible inmunogenicidad cuando se inyecta en un paciente humano. Adicionalmente, el substituto de la albúmina preferido tiene una rápida velocidad de aclaramiento del cuerpo después de la inyección de la composición farmacéutica.

Definiciones

Tal como se usan aquí, las palabras o términos descritos a continuación tienen las siguientes definiciones.

La palabra "alrededor" quiere decir que el objeto, parámetro o término así calificado incluye un intervalo de más o menos diez por ciento por encima y por debajo del valor del objeto, parámetro o término citado.

La palabra "aminoácido" incluye poliaminoácidos.

La palabra "polisacárido" quiere decir un polímero de más de dos monómeros de molécula de sacárido, monómeros que pueden ser idénticos o diferentes.

La frase "composición farmacéutica" quiere decir una formulación en la que un ingrediente activo es una neurotoxina, tal como una neurotoxina de Clostridio. La palabra "formulación" quiere decir que hay por lo menos un ingrediente adicional en la composición farmacéutica además del ingrediente activo de neurotoxina. Una composición farmacéutica es por lo tanto una formulación que es apropiada para el diagnóstico o administración terapéutica (es decir, por inyección intramuscular o subcutánea) a un paciente humano. La composición farmacéutica puede estar: en un estado liofilizado o secado a vacío; una disolución formada después de la reconstitución de la composición farmacéutica liofilizada o secada a vacío con disolución salina o agua, o; en forma de una disolución que no requiere reconstitución. El ingrediente activo de neurotoxina puede ser uno de los serotipos de toxina botulínica A, B, C1, D, E, F o G o una toxina tetánica, todas las cuales son fabricadas por bacterias de Clostridio.

La frase "formulación terapéutica" quiere decir una formulación que se puede usar para tratar y por ello aliviar un trastorno o enfermedad, tal como un trastorno o enfermedad caracterizada por la hiperactividad (es decir, espasticidad) de un músculo periférico.

Las palabras "que estabiliza", "estabiliza" o "estabilización" quieren decir que al reconstituir con disolución salina o agua una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica liofilizada, o secada a vacío que se ha almacenado a por debajo de alrededor de -2 grados centígrados durante entre seis meses y cuatro años, o para una disolución acuosa de composición farmacéutica que contiene toxina botulínica que se ha almacenado a entre alrededor de 2 grados y alrededor de 8 grados centígrados durante de seis meses a cuatro años, la toxina botulínica presente en la composición farmacéutica reconstituida o en disolución acuosa tiene más de alrededor del 20% y hasta alrededor del 100% de la toxicidad que tenía la toxina botulínica biológicamente activa previamente a ser incorporada en la composición farmacéutica.

Una composición farmacéutica dentro del alcance de la presente invención comprende una toxina botulínica y 2hidroxietilalmidón. El 2-hidroxietilalmidón estabiliza la toxina botulínica. Las composiciones farmacéuticas descritas aquí pueden tener un pH entre alrededor de entre alrededor de 5 y 7,3 cuando se reconstituyen o al inyectarlas. El peso molecular medio de una unidad de disacárido del 2-hidroxietilalmidón está preferentemente entre alrededor de 345 D y alrededor de 2.000 D. En una realización más preferida, el peso molecular promedio de una unidad de disacárido del 2-hidroxietilalmidón está entre alrededor de 350 kD y alrededor de 1.000 kD y en la realización más preferida entre alrededor de 375 D y alrededor de 700 D. Adicionalmente, el 2-hidroxietilalmidón puede comprender por lo menos alrededor del 70% de amilopectina. Además, el peso molecular promedio en peso del 2hidroxietilalmidón mismo está entre alrededor de 20 kD y alrededor de 2.500 kD.

Preferiblemente, sustancialmente todas las unidades de disacárido del 2-hidroxietilalmidón comprenden moléculas de glucopiranosa unidas por éter. Un promedio de alrededor de 4 a alrededor de 10 de los grupos hidroxilo presentes en cada 10 de las glucopiranosas presentes en el polisacárido están substituidos, por medio de una unión éter, con un compuesto de la fórmula (CH2)n-OH, en la que n puede ser un número entero de 1 a 10. Más preferentemente, n es un número entero entre 1 y 3.

En una realización particularmente preferida, un promedio de alrededor de 6 a alrededor de 9 de los grupos hidroxilo presentes en cada 10 de las glucopiranosas presentes en el 2-hidroxietilalmidón están substituidos, por medio de una unión éter, con un compuesto de la fórmula (CH2)n-OH, en la que n puede ser un número entero de 1 a 10. Y en una realización la más preferida, un promedio de alrededor de 7 a alrededor de 8 de los grupos hidroxilo presentes en cada 10 de las glucopiranosas presentes en el 2-hidroxietilalmidón están substituidos, por medio de una unión éter, con un compuesto de fórmula (CH2)n-OH, en la que n puede ser un número entero de 1 a 10.

Una realización detallada de la presente invención puede ser una composición farmacéutica apropiada para inyección a un paciente humano, que incluye una toxina botulínica, y 2-hidroxietilalmidón. El polisacárido puede comprender una pluralidad de unidades de glucopiranosa unidas, teniendo cada unidad de glucopiranosa una pluralidad de grupos hidroxilo, en el que un promedio de alrededor de 6 a alrededor de 9 de los grupos hidroxilo presentes en cada 10 de las glucopiranosas presentes en el 2-hidroxietilalmidón están substituidos, por medio de una unión éter, con un compuesto de la fórmula (CH2)n-OH, en la que n puede ser un número entero de 1 a 4. El 2hidroxietilalmidón puede ser un polisacárido substituido con éter etílico.

La composición farmacéutica es apropiada para la administración a un paciente humano para conseguir un efecto terapéutico, y la neurotoxina puede ser uno de los serotipos de toxina botulínica A, B, C1, D, E, F y G. En una realización preferida de la presente invención, la composición farmacéutica comprende una toxina botulínica y 2hidroxietilalmidón.

Otra realización de la presente invención puede incluir una composición farmacéutica que incluye una toxina botulínica, un 2-hidroxietilalmidón, y un aminoácido o un poliaminoácido.

Si la composición farmacéutica comprende, además del ingrediente activo de toxina botulínica, solo un estabilizante de 2-hidroxietilalmidón o tanto 2-hidroxietilalmidón como un estabilizante de aminoácido, la composición farmacéutica retiene su potencia sustancialmente sin cambiar durante periodos de seis meses, un año, dos años, tres años y/o cuatro años cuando se almacena a una temperatura entre alrededor de -1ºC y alrededor de -15ºC. Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas indicadas pueden tener una potencia o % de recuperación entre alrededor de 20% y alrededor de 100% al reconstituirlas. Alternativamente o además, la composición farmacéutica puede tener una potencia de entre alrededor de 10 U/mg y alrededor de 30 U/mg al reconstituirla, tal como una potencia de alrededor de 20 U/mg al reconstituirla. Significativamente, la composición farmacéutica está desprovista de cualquier albúmina. De este modo, la composición farmacéutica puede estar sustancialmente libre de cualquier proteína de complejo de no-toxina. Notablemente, el aminoácido puede estar presente en una cantidad de entre alrededor de 0,5 mg y alrededor de 1,5 mg de aminoácido por 100 unidades de toxina botulínica.

Cuando la composición farmacéutica comprende alrededor de 100 unidades de toxina botulínica, puede haber entre alrededor de 500 µg y alrededor de 700 µg del 2-hidroxietilalmidón presente. Preferentemente, la toxina botulínica es toxina botulínica de tipo A, y el aminoácido, cuando está presente, se selecciona del grupo que consiste en lisina, glicina, histidina y arginina.

Una realización detallada adicionalmente de la presente invención puede ser una composición farmacéutica de toxina botulínica de tipo A estable, de alta potencia, no pirógena, secada a vacío, que comprende un complejo de toxina botulínica de tipo A, un 2-hidroxietilalmidón, y un aminoácido o un poliaminoácido. La composición farmacéutica puede estar libre de albúmina, tener una vida de almacenamiento de 1 año a -5ºC con alrededor de 90% de potencia inmediatamente después de la reconstitución con disolución salina o agua y alrededor de 80% de potencia 72 horas después de la reconstitución y almacenamiento a 2ºC. Adicionalmente, la composición farmacéutica puede tener una toxicidad específica por lo menos de alrededor de 18 U/mg al reconstituirla.

La presente invención incluye también una composición farmacéutica liofilizada o secada a vacío que consiste esencialmente en un 2-hidroxietilalmidón de alto peso molecular y una toxina botulínica, en la que la toxina botulínica está estabilizada por el 2-hidroxietilalmidón de alto peso molecular. La toxina botulínica se puede seleccionar del grupo que consiste en toxina botulínica de tipos A, B, C1, D, E, F y G.

El 2-hidroxietilalmidón puede estar presente en la composición farmacéutica en una cantidad de entre alrededor de 1 x 10-9 moles de polisacárido por unidad de toxina botulínica a alrededor de 2 x 10-12 moles de 2-hidroxietilalmidón por unidad de toxina botulínica.

La presente invención incluye también (a) un método para fabricar una composición farmacéutica, que comprende la etapa de preparar una mezcla de una toxina botulínica y un 2-hidroxietilalmidón que comprende monómeros que se repiten covalentemente unidos, en el que el peso molecular promedio del monómero está entre alrededor de 350 D y alrededor de 1.000 D, y (b) un método para estabilizar una toxina botulínica frente a la desnaturalización o agregación, comprendiendo el método la etapa de poner en contacto una toxina botulínica con una composición estabilizante que comprende un 2-hidroxietilalmidón. La etapa de contacto en este último método puede comprender la etapa de añadir a una disolución acuosa o a un polvo liofilizado o secado a vacío que contiene una toxina botulínica una cantidad efectiva del 2-hidroxietilalmidón.

DESCRIPCION

La presente invención está basada en el descubrimiento de que una composición farmacéutica que contiene una toxina botulínica estable se puede formular libre de cualquier proteína derivada de animal o albúmina de banco de donantes incorporando un 2-hidroxietilalmidón y opcionalmente un aminoácido a la composición farmacéutica. En particular, la presente invención está basada en el descubrimiento de que una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica estable para la administración a un paciente humano para un efecto terapéutico se puede hacer reemplazando la albúmina de banco de donantes presente en las composiciones conocidas que contienen toxina botulínica con un 2-hidroxietilalmidón y opcionalmente con ciertos aminoácidos reactivos.

Sorprendentemente, se ha encontrado que un substituto apropiado para la albúmina es un compuesto que no es ni otra proteína ni un compuesto no proteínico de bajo peso molecular. De este modo, se ha descubierto que el 2hidroxietilalmidón puede funcionar como estabilizantes de la neurotoxina en una composición farmacéutica. Tal como se describe a continuación un aminoácido se puede añadir también, a la composición farmacéutica para incrementar la estabilidad y la vida útil de almacenamiento de la composición farmacéutica.

El 2-hidroxietilalmidón usado en la presente invención puede impartir estabilidad a un ingrediente activo de neurotoxina, tal como una toxina botulínica, presente en la composición farmacéutica por: (1) reducción de la adhesión (comúnmente denominada "adhesividad") de la toxina botulínica a las superficies, tales como las superficies de material de vidrio de laboratorio, recipientes, el vial en el que se reconstituye la composición farmacéutica y la superficie interior de la jeringuilla usada para inyectar la composición farmacéutica. La adhesión de la toxina botulínica a las superficies puede conducir a la pérdida de toxina botulínica y a la desnaturalización de la toxina botulínica retenida, ambas reducen la toxicidad de la toxina botulínica presente en la composición farmacéutica. (2) la reducción de la desnaturalización de la toxina botulínica y/o la disociación de la toxina botulínica de otras proteínas no-toxina presentes en el complejo de toxina botulínica, tales actividades de desnaturalización y/o disociación pueden ocurrir debido a la baja dilución de la toxina botulínica presente en la composición farmacéutica (es decir, previamente a la liofilización o secado a vacío) y en la composición farmacéutica reconstituida. (3) la reducción de la pérdida de toxina botulínica (es decir, debido a la desnaturalización o disociación de las proteínas no-toxina en el complejo) durante el considerable pH y concentración que tienen lugar durante la preparación, procesado y reconstitución de la composición farmacéutica.

Los tres tipos de estabilizaciones de toxina botulínica proporcionadas por el 2-hidroxietilalmidón conservan y preservan la toxina botulínica con su toxicidad nativa previamente a la inyección de la composición farmacéutica.

Un 2-hidroxietilalmidón preferido para uso en la presente composición comprende una pluralidad de monómeros de glucosa (peso molecular 180) con uno o más substituyentes en una mayoría de los monómeros de glucosa, de modo que el polisacárido preferido tiene un intervalo de peso molecular entre alrededor de 20 kD y alrededor de 800 kD. Sorprendentemente, tal polisacárido puede estabilizar un componente de neurotoxina presente en una composición farmacéutica.

Inesperadamente, se ha descubierto que el 2-hidroxietilalmidón (también conocido como hetalmidón) demuestra una capacidad única para estabilizar la toxina botulínica presente en una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica, proporcionando por ello una composición farmacéutica que está desprovista del potencial para contener una enfermedad transmisible derivada de sangre humana o de bancos de donantes de fracciones de sangre o de proteínas derivadas de animales como gelatina.

De este modo, se ha descubierto que el polisacárido de peso molecular particularmente alto, 2-hidroxietilalmidón, puede estabilizar la toxina durante la formulación, secado, almacenamiento y reconstitución. Preferentemente, para estabilizar adicionalmente el ingrediente activo proteínico, se incluye también un aminoácido en la formulación que contiene polisacárido.

El 2-hidroxietilalmidón en la composición farmacéutica está mezclado preferentemente con la toxina botulínica en una cantidad de alrededor de 1 µg de 2-hidroxietilalmidón por unidad de toxina botulínica a alrededor de 10 µg de 2hidroxietilalmidón por unidad de toxina botulínica. Más preferentemente el 2-hidroxietilalmidón en la composición farmacéutica está mezclado con la toxina botulínica en una cantidad de alrededor de 4 µg de 2-hidroxietilalmidón por unidad de toxina botulínica a alrededor de 8 µg de polisacárido por unidad de toxina botulínica. En una realización más preferida, el 2-hidroxietilalmidón en la composición farmacéutica está preferentemente mezclado con un complejo de toxina botulínica de tipo A en una cantidad de alrededor de 5 µg de 2-hidroxietilalmidón por unidad de toxina botulínica a alrededor de 7 µg de 2-hidroxietilalmidón por unidad de toxina botulínica. Lo más preferentemente, el 2-hidroxietilalmidón en la composición farmacéutica está mezclado con un complejo de toxina botulínica de tipo A en una cantidad de alrededor de 6 µg de 2-hidroxietilalmidón por unidad de toxina botulínica. Dado que el BOTOX contiene de alrededor de 100 unidades de complejo de toxina botulínica de tipo A por vial y el peso molecular promedio del 2-hidroxietilalmidón se considera generalmente que está entre alrededor de 20 kD y alrededor de 2.500 kD, la concentración más preferida de 2-hidroxietilalmidón está entre 1 x 10-9 moles por unidad de toxina botulínica (M/U) y alrededor de 2 x 10-12 moles por unidad de toxina botulínica. En otra realización preferida, para unas 100 U de composición farmacéutica de complejo de toxina botulínica de tipo A, se incluye en la formulación alrededor de 600 µg del 2-hidroxietilalmidón y alrededor de 1 mg de un aminoácido, tal como lisina, glicina, histidina o arginina. De este modo, la invención incluye el uso tanto de 2-hidroxietilalmidón como un aminoácido o un poliaminoácido para estabilizar el ingrediente activo de neurotoxina en la composición farmacéutica.

En las presentes composiciones se puede usar un aminoácido apropiado en una cantidad suficiente para estabilizar el ingrediente activo proteínico en una composición farmacéutica en presencia del 2-hidroxietilalmidón presente en la formulación. De este modo, se ha descubierto sorprendentemente que la inclusión de ciertos aminoácidos en una formulación de composición farmacéutica que contiene toxina botulínica puede extender la vida de almacenamiento útil de tal composición farmacéutica. No deseando estar vinculado a la teoría, se puede postular que dado que una toxina botulínica, es susceptible de oxidación, debido a la presencia de uniones disulfuro en el complejo de toxina, la inclusión de un aminoácido oxidable puede actuar para reducir la probabilidad de que oxidantes, tales como peróxidos y radicales libres, reaccionarán con la toxina botulínica. De este modo, la posibilidad de que la unión disulfuro de la toxina botulínica oxidable sea oxidada por un oxidante, tal como peróxidos y radicales libres, se puede reducir con la inclusión de un aminoácido que puede actuar como un sumidero oxidativo, que es un eliminador de compuestos oxidantes. Un aminoácido apropiado es un aminoácido que está sometido a oxidación. Los ejemplos de aminoácidos preferidos son metionina, cisteína, triptófano y tirosina. Un aminoácido particularmente preferido es metionina.

Una realización preferida de la invención puede incluir también el uso de dos o más aminoácidos en combinación con 2-hidroxietilalmidón para la toxina botulínica en una composición farmacéutica. De este modo, para una composición farmacéutica que contiene 100 U de toxina botulínica de tipo A, se puede usar alrededor de 0,5 mg de lisina y alrededor de 0,5 mg de glicina, con entre alrededor de 500 µg y alrededor de 700 µg de hetalmidón.

De este modo, como se describe anteriormente, la invención incluye una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica, que incluye 2-hidroxietilalmidón. El 2-hidroxietilalmidón actúa para estabilizar el ingrediente activo proteínico en la composición farmacéutica. Adicionalmente, la invención incluye también una composición farmacéutica que incluye toxina botulínica, que incluye 2-hidroxietilalmidón y un aminoácido. Sorprendentemente, se ha descubierto que la inclusión de ciertos aminoácidos en una formulación de composición farmacéutica que contiene toxina botulínica, que incluye 2-hidroxietilalmidón puede extender la vida de almacenamiento útil de tal composición farmacéutica. De este modo, la invención incluye una composición farmacéutica que contiene toxina botulínica, que incluye tanto 2-hidroxietilalmidón como un aminoácido y el uso de tal composición farmacéutica.

Se sabe que las composiciones farmacéuticas que contienen proteína, que también contienen azúcares, polisacáridos y/o carbohidratos (denominados de aquí en adelante “compuestos reactivos”) son inherentemente estables debido al hecho de que una proteína y uno de los tres compuestos reactivos indicados pueden sufrir la bien descrita reacción de Maillard. Se ha llevado a cabo una extensa investigación, en su mayor parte infructuosa, para tratar de reducir la incidencia o prevalencia de esta (por ejemplo) reacción de Maillard de proteína-polisacárido, reduciendo la humedad o por el uso de azúcares no reductores en la formulación. Este descubrimiento está basado en el observación de que la inclusión de una alta concentración de un aminoácido altamente reactivo fomenta que tenga lugar la reacción de Maillard entre el polisacárido estabilizante y el aminoácido añadido. Proporcionando una fuente de amina abundante para que reaccione con el carbohidrato, la probabilidad de que el fármaco proteínico (es decir, el ingrediente activo de toxina botulínica) se vea implicado en la reacción de Maillard es reducida, reduciendo por ello este camino de degradación del ingrediente activo proteínico y de esta manera estabilizando por ello el ingrediente activo proteínico en la composición farmacéutica.

Preferentemente, se puede usar para este propósito cualquier compuesto que contiene una amina primaria o secundaria. Los más preferidos son los aminoácidos, tales como lisina, glicina, arginina. También son apropiados poliaminoácidos, tales como polilisina. Los aminoácidos catiónicos tales como lisina pueden sufrir atracción iónica, uniéndose a proteínas ácidas (por ejemplo, toxinas botulínicas) y proteger la proteína activa del contacto con azúcares. La polilisina, además de ser más grande y por lo tanto más probable que actúe como protección, proporciona la ventaja adicional de ser antibacteriana.

También se contempla hacer reaccionar previamente los componentes de 2-hidroxietilalmidón y aminoácido para agotar el potencial de la reacción de Maillard antes de añadir la toxina botulínica a los ingredientes de formulación azúcar y aminoácido, limitando por ello sustancialmente la exposición de la toxina botulínica a las reacciones de Maillard.

De este modo, se pueden usar aminoácidos y poliaminoácidos como inhibidores de la reacción de Maillard en formulaciones de fármaco de toxina botulínica que contienen 2-hidroxietilalmidón y su uso.

La invención realiza formulaciones de toxina botulínica en combinación con 2-hidroxietilalmidón y un aminoácido tal como lisina.

Significativamente, se ha descubierto que el 2-hidroxietilalmidón no sufre o sufre reacciones de Maillard en una tasa

o nivel mucho más atenuado con una toxina botulínica, cuando se compara 2-hidroxietilalmidón con otros polisacáridos o carbohidrato. Adicionalmente, se ha descubierto que la inclusión de un aminoácido mejora el efecto de conservación del 2-hidroxietilalmidón, posiblemente actuando como inhibidor competitivo, esto es compitiendo con la toxina por los azúcares reactivos de la reacción de Maillard. Para este propósito, los aminoácidos tales como lisina, glicina, arginina e histidina son los aminoácidos preferidos. También se pueden usar poliaminoácidos, tales como polilisina, que exhiben el deseado comportamiento de inhibición competitiva. Notablemente, el aminoácido y poliaminoácidos especificados pueden exhibir también propiedades antimicrobianas, proporcionando por lo tanto el beneficio añadido de reducir la contaminación bacteriana en la composición farmacéutica.

Los azúcares reductores, tales como glucosa y polímeros de glucosa, sufren la reacción de Maillard con proteínas. Pueden reaccionar incluso los alcoholes de azúcares tales como manitol, aunque a veces a través de contaminantes

o productos de degradación. Por lo tanto, un polisacárido puede estabilizar la toxina solo durante un periodo de tiempo para reaccionar químicamente después, provocando por ello una estabilidad de almacenamiento reducida. Es obvio que la elección de polisacárido es crítica. Se ha descubierto que la tasa de participación del 2hidroxietilalmidón en la reacción de Maillard es muy baja. Adicionalmente, se ha encontrado que la hidroxietilcelulosa, aunque estructuralmente muy similar al hidroxietilalmidón, no es apropiada para su uso como estabilizante, dado que se ha encontrado que la hidrixietilcelulosa puede reaccionar rápidamente en un sistema modelo con lisina. Esto no solo significa que el 2-hidroxietilalmidón tiene una ventaja obvia sobre otros estabilizantes de azúcares (es decir, polisacárido), sino que incluso excipientes similares al 2-hidroxietilalmidón, tales como hidroxietilcelulosa, pueden ser inapropiados para su uso como estabilizantes de un ingrediente activo proteínico en una formulación farmacéutica.

Como se advierte, el 2-hidroxietilalmidón, puede participar por lo menos hasta cierto punto, en reacciones de Maillard. De este modo, y como se describe anteriormente, un polisacárido solo puede no ser suficiente para proporcionar la estabilización óptima de la toxina botulínica. De este modo, descubrí las ventajas de la inclusión de un aminoácido para actuar como inhibidor competitivo. No deseando estar vinculado a la teoría, la hipótesis es que proporcionando otra fuente de amina, en altas concentraciones comparadas con la toxina, se reduce la probabilidad de que ocurra la reacción de Maillard con la toxina, estabilizando por ello la toxina. Se puede usar cualquier aminoácido, siendo sin embargo la lisina altamente reactiva y es un aminoácido preferido.

También se contempla la adición una fuente de ion cinc a la presente formulación farmacéutica que contiene toxina botulínica. Los metales, especialmente los cationes divalentes, se dice que influyen enormemente en el éxito de una formulación liofilizada debido a varias criopropiedades incluyendo las estructuras de red de los hielos formados. Los metales extraños tales como especies de cobre y hierro se prestan ellos mismos a oxidaciones radicales y se deben evitar generalmente. Más específicamente, la toxina botulínica de tipo A depende del cinc unido para su actividad. Muchos de los excipientes propuestos o productos de reacción con los excipientes quelarán metales. Esto podría conducir a la formación de hielos inestables y/o toxina inactivada. Suministrando cinc abundante en la formulación se asegura la presencia de cationes divalentes deseables, la probabilidad de la pérdida de cinc por la toxina se reduce, y se mejora la estabilidad. Esto se puede conseguir por la adición de ZnSO4 a una composición farmacéutica de toxina botulínica.

También se contempla la adición de un conservante, bien en el diluyente o en la propia presente formulación, para permitir el almacenamiento prolongado. Un conservante preferido es disolución salina conservada que contiene alcohol bencílico.

Una formulación líquida puede ser ventajosa. Una presentación de una sola etapa (p. ej., jeringa cargada previamente) o una configuración de producto que el usuario percibe como si fuera una presentación de una sola etapa (p. ej., una jeringa con dos compartimentos) sería cómoda, eliminando la etapa de reconstitución. La criodesecación es un proceso complicado, caro y difícil. A menudo es más fácil y más barato producir formulaciones líquidas. Por otro lado, las formulaciones líquidas son sistemas dinámicos y por tanto son más susceptibles a la interacción de excipientes, reacciones rápidas, crecimiento bacteriano y oxidación, que las formulaciones criodesecadas. Se puede necesitar un conservante compatible. Los antioxidantes tales como metionina también pueden ser útiles como depuradores, especialmente si se usan tensioactivos, para reducir la adsorción pues muchos de estos compuestos contienen o producen peróxidos. Cualquiera de los excipientes estabilizantes que se pueden usar en una formulación criodesecada (p.ej., hidroxietil-almidón o un aminoácido tal como lisina) se puede adaptar para usarlo en una formulación líquida para ayudar a reducir la adsorción y estabilizar la toxina. Las suspensiones similares a las desarrolladas para insulina también son buenas candidatas. Adicionalmente, la estabilización de toxina botulínica en un vehículo líquido puede requerir un vehículo de pH bajo, pues está recogido que la toxina es lábil por encima de pH 7. Esta acidez podría producir quemaduras y ardor tras la inyección. Se podría emplear una jeringa binaria. La inclusión de un tampón co-dispensador, suficiente para elevar el pH hasta el fisiológico, aliviaría la incomodidad de la inyección de pH bajo a la vez que mantendría la toxina a un pH bajo durante el almacenamiento. Otra opción de jeringa de dos compartimentos incluiría diluyente y material liofilizado segregado en un compartimento distinto, mezclándose solamente tras el uso. Esta opción proporciona las ventajas de una formulación líquida sin el tiempo y recursos adicionales.

Así, la toxina botulínica se puede preparar a pH bajo para ser dispensado conjuntamente con un tampón que eleva el pH hasta o próximo al pH fisiológico en el momento de la administración. La jeringa binaria o con dos compartimentos puede tener en el primer compartimento (próximo al émbolo) una formulación líquida de una toxina botulínica con un pH entre 3 a 6 (es decir, a pH 4,0). El segundo compartimiento (próximo a la punta de la aguja) puede contener un tampón adecuado, tal como disolución salina tamponada de fosfato a un pH superior (es decir, pH 7,0). Alternativamente, el primer compartimiento puede contener un diluyente salino y el segundo compartimiento puede contener una formulación de neurotoxina criodesecada o liofilizada. Los dos compartimentos se pueden unir de tal modo, y los componentes tamponantes seleccionados de tal modo que las disoluciones se mezclan en o cerca de la aguja, llevando así la disolución final a un pH fisiológico. Jeringas de dos compartimentos adecuadas para usar como jeringas cargadas previamente para los fines indicados en esta memoria, se pueden obtener en Vetter Pharma-Fertigung de Yardley, Pennsylvania.

Hay distintas ventajas para formular toxina botulínica a un pH bajo. La toxina tiene un punto isoleléctrico (pI) bajo y formular proteínas cerca de sus pI es un modo conocido para estabilizar una proteína. Adicionalmente, la toxina se usa a una concentración muy baja, haciendo que la adsorción superficial sea un problema. El uso de una disolución de pH bajo puede suprimir la ionización de los sitios de la toxina que pueden interaccionar con las superficies. Los materiales de la jeringa y del émbolo son materiales que reducen la adsorción superficial por la toxina. Tales materiales adecuados son polipropileno.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 (referencia)

Composición farmacéutica de toxina botulínica

Como se describe previamente, el complejo de toxina botulínica de tipo A se puede obtener de un cultivo de la cepa Hall de Clostridium botulinum cultivado en un medio que contiene NZ-amina y extracto de levadura. El complejo de toxina botulínica de tipo A se purifica de la disolución de cultivo por una serie de precipitaciones ácidas hasta un complejo cristalino que consiste en la proteína de toxina activa de alto peso molecular y una proteína de hemaglutinina asociada. El complejo cristalino se redisuelve a continuación en una disolución que contiene disolución salina y albúmina y se filtra estérilmente (0,2 micrómetros) previamente al secado a vacío. El BOTOX se reconstituye a continuación con disolución salina estéril no conservada previamente a la inyección intramuscular. Cada vial de BOTOX contenía alrededor de 100 (U) de complejo de toxina de Clostridium botulinum de tipo A, 0,5 miligramos de seroalbúmina humana y 0,9 miligramos de cloruro de sodio en forma estéril secada a vacío sin un conservante. Alternativamente, la seroalbúmina humana se puede reemplazar por una albúmina fabricada recombinantemente.

Ejemplo 2

Composición farmacéutica de toxina botulínica que contiene 2-hidroxieltil-almidón

Se prepararon formulaciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina de toxina botulínica de tipo A purificada de la misma manera descrita en el Ejemplo 1 anterior, excepto que se reemplazaron los 0,5 miligramos de albúmina por 500 µg o 600 µg de hetalmidón. Se determinó que se mantenía la potencia total con la preparación de las formulaciones que contienen hetalmidón. De este modo, con ambas formulaciones que contienen hetalmidón, la potencia de la composición que contiene hetalmidón, libre de albúmina, tal como se mide en el momento de la reconstitución del complejo de toxina butulínica de tipo A de 100 U (±20 U) liofilizado, era de 96 a 128 unidades. Tres composiciones farmacéuticas diferentes de complejo de toxina botulínica de tipo A con hetalmidón tenían medidas de potencia, en el momento de la reconstitución, de 105, 111 y 128 unidades respectivamente. La potencia se midió usando el ensayo de potencia de toxina por administración estándar a ratones.

Ejemplo 3

Composición farmacéutica de toxina botulínica que contiene glicina

Se prepararon formulaciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina de toxina botulínica de tipo A purificada de la misma manera descrita en el Ejemplo 1 anterior, excepto que se reemplazaron los 0,5 miligramos de albúmina por 500 µg o 600 µg de hetalmidón. Además se añadió 1 mg de glicina a la formulación. Una composición farmacéutica liofilizada de complejo de toxina botulínica de tipo A de 100 U, libre de albúmina, con hetalmidón más glicina se almacenó a continuación durante siete meses a –5ºC. Al final de este periodo de siete meses se determinó que la potencia de esta formulación de toxina con hetalmidón más glicina, usando el ensayo de administración a ratones, estaba esencialmente sin cambios (es decir, la potencia difería en menos del 5% de la potencia original).

Ejemplo 4

Composición farmacéutica de toxina botulínica que contiene lisina

Se prepararon formulaciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina de toxina botulínica de tipo A purificada de 100 U de la misma manera descrita en el Ejemplo 1 anterior, excepto que se reemplazaron los 0,5 miligramos de albúmina por 600 µg de hetalmidón. Además se añadió 1 mg de lisina a la formulación. Una composición farmacéutica liofilizada de complejo de toxina botulínica de tipo A de 100 U, libre de albúmina, con hetalmidón más lisina se almacenó a continuación durante un año a –5ºC Al final de este periodo de un año se determinó que la potencia de esta formulación de toxina con hetalmidón más glicina, usando el ensayo de administración a ratones, estaba esencialmente sin cambios (es decir, la potencia difería en menos del 5% de la potencia original).

Ejemplo 5

Composición farmacéutica de toxina botulínica que contiene histidina

Se preparan formulaciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina purificada de toxina botulínica de tipo A de 100 U de la misma manera descrita en el Ejemplo 1 anterior, excepto que se reemplazaron los 0,5 miligramos de albúmina por 600 µg de hetalmidón. Además se añadió 1 mg de histidina a la formulación. Una composición farmacéutica liofilizada de complejo de toxina botulínica de tipo A de 100 U, libre de albúmina, con hetalmidón más histidina se almacenó a continuación durante un año a –5ºC. Al final de este periodo de un año se determinó que la potencia de esta formulación de toxina con hetalmidón más histidina, usando el ensayo de administración a ratones, estaba esencialmente sin cambios (es decir, la potencia difería en menos del 5% de la potencia original).

Ejemplo 6

Composición farmacéutica de toxina botulínica que contiene arginina

Se prepararon formulaciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina purificada de toxina botulínica de tipo A de 100 U de la misma manera descrita en el Ejemplo 1 anterior, excepto que se reemplazaron los 0,5 miligramos de albúmina por 600 µg de hetalmidón. Además se añadió 1 mg de arginina a la formulación. Una composición farmacéutica liofilizada de complejo de toxina botulínica de tipo A de 100 U, libre de albúmina, con hetalmidón más arginina se almacenó a continuación durante un año a –5ºC. Al final de este periodo de un año se determinó que la potencia de esta formulación de toxina con hetalmidón más glicina, usando el ensayo de administración a ratones, estaba esencialmente sin cambios (es decir, la potencia difería en menos del 5% de la potencia original).

Ejemplo 7 (referencia)

Composición farmacéutica de toxina botulínica que contiene un aminoácido

Se pueden preparar formulaciones farmacéuticas de complejo de neurotoxina purificada de toxina botulínica de tipo A de la misma manera descrita en el Ejemplo 1 anterior, excepto que los 0,5 miligramos de albúmina se pueden reemplazar por aproximadamente 1 mg de un aminoácido tal como lisina, glicina, histidina o arginina. Una composición farmacéutica liofilizada de complejo de toxina botulínica de tipo A de 100 U, libre de polisacárido, libre de albúmina, más glicina se puede almacenar durante al menos un año a –5ºC, y al final de este periodo se puede tener una potencia esencialmente sin cambios (es decir, la potencia puede diferir en menos del 5% de la potencia original).

Ejemplo 8

Uso de una composición farmacéutica de toxina botulínica

A un varón de 48 años de edad se le diagnostica un estado de músculo espástico, tal como distonía cervical. Se inyecta intramuscularmente al paciente entre alrededor de 1 x 10-3 U/kg y 35 U/kg de una composición farmacéutica de toxina botulínica de tipo A que contiene 600 µg de hetalmidón y 1 mg de un aminoácido tal como lisina. En 1-7 días los síntomas del estado de músculo espástico se alivian y el alivio de los síntomas persiste durante por lo menos durante de alrededor de 2 meses a alrededor de 6 meses.

Una composición farmacéutica según la invención descrita aquí tiene muchas ventajas, que incluyen las siguientes:

1.

La composición farmacéutica se puede preparar libre de cualquier otro producto de la sangre, tal como albúmina y por lo tanto libre de cualquier elemento infeccioso producto de la sangre tal como un prión.

2.

La composición farmacéutica tiene estabilidad y alto % de recuperación de la potencia de la toxina, comparable o superior a la conseguida con las composiciones farmacéuticas actualmente disponibles.

Aunque la presente invención se ha descrito con detalle con respecto a ciertos métodos preferidos, son posibles otras realizaciones, versiones y modificaciones dentro del alcance de la presente invención.

Por consiguiente, el alcance de las siguientes reivindicaciones no debe estar limitado a las descripciones de las realizaciones preferidas descritas anteriormente.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición farmacéutica que comprende:

   (a)

   una toxina botulínica, y;

   (b)

   2-hidroxietilalmidón.