DE60125986T3 - Pharmazeutische Zusammensetzungen mit Botulinum Toxin - Google Patents

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Description

  • Hintergrund
  • Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen wie in den Ansprüchen definiert. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend ein Botulinumtoxin und ein rekombinant hergestelltes Humanserumalbumin.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung ist eine Formulierung, enthaltend einen oder mehrere Wirkstoffe sowie einen oder mehrere Exzipienten, Träger, Stabilisatoren oder Füllmittel (bulking agents), die zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten, um ein gewünschtes diagnostisches Ergebnis oder eine therapeutische Wirkung zu erreichen, geeignet ist.
  • Für Lagerungsstabilität und Bequemlichkeit der Handhabung kann eine pharmazeutische Zusammensetzung als lyophilisiertes (d. h. gefriergetrocknetes) oder vakuumgetrocknetes Pulver formuliert werden, das vor der Verabreichung an den Patienten mit (physiologischer) Kochsalzlösung oder Wasser rekonstituiert werden kann. Alternativ kann die pharmazeutische Zusammensetzung als wässrige Lösung formuliert werden. Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann einen proteinförmigen Wirkstoff enthalten. Unglücklicherweise können Proteine sehr schwer zu stabilisieren sein, was zu einem Verlust an Protein und/oder Verlust der Proteinaktivität während der Formulierung, Rekonstituierung (falls benötigt) und während der Lagerung vor der Verwendung der proteinhaltigen pharmazeutischen Zusammensetzung führt. Stabilitätsprobleme können aufgrund von Proteindenaturierung, Abbau, Dimerisierung und/oder Polymerisierung auftreten. Verschiedene Exzipienten, wie Albumin und Gelatine, wurden mit unterschiedlichem Erfolg verwendet, um zu versuchen, einen Proteinwirkstoff, der in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden ist, zu stabilisieren. Zusätzlich wurden Kälteschutzmittel, wie Alkohole, verwendet, um die Proteindenaturierung unter den Gefrierbedingungen der Lyophilisierung zu reduzieren.
  • Albumin
  • Albumine sind kleine, reichlich vorhandene Plasmaproteine. Menschliches Serumalbumin (Humanserumalbumin) hat ein Molekulargewicht von etwa 69 Kilodalton (kD) und wurde als Nicht-Wirkstoff in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, wo es als Füllträger und Stabilisator von bestimmten, in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandenen Proteinwirkstoffen dienen kann.
  • Die Stabilisierungsfunktion von Albumin in einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann sowohl während der Mehrschrittformulierung der pharmazeutischen Zusammensetzung als auch bei der späteren Rekonstitution der formulierten pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden sein. Daher kann einem proteinförmigen Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung durch Albumin Stabilität durch z. B. (1) Reduktion der Adhäsion (häufig als ”Klebrigkeit” bezeichnet) des Proteinwirkstoffs an Oberflächen, wie den Oberflächen von Laborglasgegenständen, Gefäßen, an die Ampulle, in der die pharmazeutische Zusammensetzung rekonstituiert wird, und an die Innenoberfläche einer Spritze, die verwendet wird, um die pharmazeutische Zusammensetzung zu injizieren, verliehen werden. Adhäsion eines Proteinwirkstoffs an Oberflächen kann zu Verlust des Wirkstoffs und zur Denaturierung des restlichen, verbleibenden Proteinwirkstoffs führen, die beide die Gesamtaktivität des in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandenen Wirkstoffs reduzieren; und (2) Reduktion der Denaturierung des Wirkstoffs, die bei der Herstellung einer Lösung des Wirkstoffs mit niedriger Verdünnung auftreten kann.
  • Zusätzlich dazu, dass es in der Lage ist, einen Proteinwirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu stabilisieren, hat Albumin auch den Vorteil einer im allgemeinen vernachlässigbaren immunauslösenden Wirkung (eine Immunantwort auslösenden Wirkung), wenn es einem menschlichen Patienten injiziert wird. Eine Verbindung mit einer nennenswerten immunauslösenden Wirkung kann die Herstellung von Antikörpern gegen sie hervorrufen, was zu einer anaphylaktischen Reaktion und/oder zur Entwicklung einer Arzneimittelresistenz führen kann, wobei die zu behandelnde Krankheit oder Störung dadurch potenziell widerstandsfähig gegenüber der pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine immunogene Komponente besitzt, wird.
  • Trotz seines bekannten stabilisierenden Effekts gibt es unglücklicherweise signifikante Nachteile bei der Verwendung von Albumin in einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Zum Beispiel sind Albumine teuer und in zunehmendem Maße schwierig zu erhalten. Außerdem können Blutprodukte, wie Albumin, den Patienten dem potenziellen Risiko des Erhalts von aus Blut stammenden Pathogenen oder infektiösen Stoffen aussetzen, wenn sie dem Patienten verabreicht werden. Daher ist bekannt, dass die Möglichkeit besteht, dass die Gegenwart von Albumin in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum unabsichtlichen Einschluss von infektiösen Elementen in die pharmazeutische Zusammensetzung führen kann. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die Verwendung von Albumin Prionen in eine pharmazeutische Zusammensetzung übertragen kann. Ein Prion ist ein proteinförmiger, infektiöser Partikel, von dem vermutet wird, dass er als anormale, konformationelle Isoform aus der gleichen Nukleinsäuresequenz stammt, die das normale Protein bildet. Es wurde weiter vermutet, dass die Infektivität in einer ”Rekrutierungsreaktion” der normalen Isoform des Proteins in die Prionenproteinisoform auf einem posttranslationalen Niveau liegt. Offensichtlich wird das normale, endogene, zelluläre Protein dazu veranlasst, in eine pathogene Prionenkonformation umzufalten. Bedeutsamerweise wurden mehrere Chargen an menschlichem Serumalbumin aufgrund des Befunds, dass ein Blutspender in einem Pool, aus dem das Albumin hergestellt wurde, mit Creutzfeldt-Jacob-Krankheit diagnostiziert wurde, aus der Verteilung herausgenommen.
  • Die Creutzfeldt-Jacob-Krankheit (manchmal als Alzheimer-Erkrankung mit schnellem Fortschritt charakterisiert) ist eine seltene neurodegenerative Störung der menschlichen übertragbaren schwammartigen Encephalopathie, wo das Übertragungsmittel offensichtlich eine anormale Isoform eines Prionproteins ist. Bei einem Individuum mit Creutzfeldt-Jacob-Krankheit kann innerhalb von sechs Monaten eine Verschlechterung von offensichtlich perfekter Gesundheit zum akinetischen Mutismus auftreten.
  • Über eine mögliche iatrogene Übertragung von Creutzfeldt-Jacob-Krankheit durch Albumintransfusion wurde berichtet, und es wurde spekuliert, dass durch die gewöhnlichen Verfahren der Albuminherstellung kein ausreichender Schutz gegen die Übertragung der Creutzfeldt-Jacob-Krankheit bereitgestellt wird, wobei die Verfahren das Verwerfen von Blutzellelementen und Erwärmen auf 60°C für 10 Stunden einschließen. Daher kann ein potenzielles Risiko des Erwerbens einer Prion-mediierten Krankheit, wie der Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, durch die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Konzentrate von menschlichen Plasmaproteinen, wie Serumalbumin, enthalten, bestehen.
  • Gelatine wurde in einigen pharmazeutischen Zusammensetzungen mit Proteinwirkstoff als Albuminersatz verwendet. Beachtenswerter Weise ist Gelatine ein aus Tieren stammendes Protein und trägt daher das gleiche Risiko einer potenziellen Infektiosität, die Albumin besitzen kann. Daher ist es wünschenswert, einen Ersatz für Albumin zu finden, der keine Blutfraktion ist, und bevorzugt ist der Albuminersatz nicht Gelatine und stammt nicht aus einer Tierquelle.
  • Botulinumtoxin
  • Das anaerobe Gram-positive Bakterium Clostridium botulinum stellt ein potentes Polypeptid-Neurotoxin, Botulinumtoxin, her, das bei Menschen und Tieren eine neuroparalytische Krankheit hervorruft, die als Botulismus bezeichnet wird. Clostridium botulinum und seine Sporen werden häufig in Erde gefunden, und das Bakterium kann in unsachgemäß sterilisierten und verschlossenen Nahrungsmittelbehältern von heimbasierten Konservenfabriken wachsen, was die Ursache von vielen Fällen von Botulismus ist. Die Wirkungen von Botulismus erscheinen typischerweise 18 bis 36 Stunden nach dem Essen des mit einer Clostridium botulinum-Kultur oder -Sporen infizierten Nahrungsmittels. Das Botulinumtoxin kann scheinbar ungeschwächt durch die Auskleidung des Darms gehen und periphäre motorische Neuronen attackieren. Die Symptome der Botulinumtoxinvergiftung können von Schwierigkeiten beim Gehen, Schlucken und Sprechen bis zur Paralyse der Atmungsmuskeln und dem Tod fortschreiten.
  • Botulinumtoxintyp A ist das letalste natürliche biologische Mittel, das dem Menschen bekannt ist. Etwa 50 Picogramm Botulinumtoxin-(gereinigter Neurotoxinkomplex)Typ A ist der LD50 in Mäusen. Auf molarer Basis ist Botulinumtoxintyp A interessanter Weise 1,8 Milliarden Mal letaler als Diphtherie, 600 Millionen Mal letaler als Natriumcyanid, 30 Millionen Mal letaler als Cobrotoxin und 12 Millionen Mal letaler als Cholera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, Seiten 63–84 (Kapitel 4) von Natural Toxins II, hsg. von B. R. Singh et al., Plenum Press, New York (1976) (wo der genannte LD50 von Botulinumtoxintyp A von 0,3 ng gleich 1 U entspricht, wird aufgrund der Tatsache, dass etwa 0,05 ng BOTOX® 1 Einheit entspricht, korrigiert). Eine Einheit (U) an Botulinumtoxin ist als der LD50 nach intraperitonealer Injektion in weibliche Swiss Webster-Mäuse, die jede 18–20 g wiegen, definiert. Sieben immunologisch unterschiedliche Botulinumneurotoxine wurden charakterisiert, diese sind die Botulinumneurotoxin-Serotypen A, B, C1, D, E, F bzw. G, von denen sich jedes durch Neutralisation mit typspezifischen Antikörpern unterscheidet. Die unterschiedlichen Serotypen von Botulinumtoxin variieren in den Tierarten, die sie befallen, und in der Schwere und Dauer der Paralyse, die sie hervorrufen. Zum Beispiel wurde bestimmt, dass Botulinumtoxintyp A 500 Mal potenter, wie durch die Rate der in der Ratte hervorgerufenen Paralyse gemessen, als Botulinumtoxintyp B ist. Zusätzlich wurde von Botulinumtoxintyp B bestimmt, dass es in Primaten bei einer Dosis von 480 U/kg nicht toxisch ist, was etwa 12 Mal dem Primaten LD50 für Botulinumtoxintyp A entspricht. Die Botulinumtoxine binden offensichtlich mit hoher Affinität an die cholinergen motorischen Neuronen, werden in das Neuron transloziert und blockieren die presynaptische Freisetzung von Acetylcholin.
  • Botulinumtoxine wurden in klinischen Szenarien zur Behandlung von neuromuskulären Störungen verwendet, die durch hyperaktive Skelettmuskeln gekennzeichnet sind. Botulinumtoxintyp A wurde durch die U. S. Food and Drug Administration in 1989 zur Behandlung von wesentlichem Blepharospasmus, Strabismus und hemifazialen Spasmen bei Patienten mit einem Alter über 12 zugelassen. Die klinischen Wirkungen des peripheren intramuskulären Botulinumtoxintyp A werden gewöhnlich innerhalb von einer Woche nach Injektion gesehen. Die typische Dauer der Linderung der Symptome (d. h. der schlaffen Muskelparalyse) von einer einzelnen intramuskulären Injektion an Botulinumtoxintyp A kann etwa drei Monate betragen.
  • Obwohl alle Botulinumtoxin-Serotypen scheinbar die Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin an der neuromuskulären Kontaktstelle hemmen, tun sie dies durch Beeinflussung von unterschiedlichen neurosekretorischen Proteinen und/oder durch Spaltung dieser Proteine an unterschiedlichen Stellen. Botulinumtoxin A ist eine Zinkendopeptidase, die spezifisch eine Peptidbindung des intrazellulären, Vesikel-assoziierten Proteins SNAP-25 hydrolysieren kann. Botulinumtyp E spaltet auch das 25 Kilodalton (kD) synaptosomal assoziierte Protein (SNAP-25), aber zielt im Vergleich zu Botulinumtoxintyp A auf unterschiedliche Aminosäuresequenzen innerhalb dieses Proteins. Botulinumtoxintypen B, D, F und G wirken auf das Vesikelassoziierte Protein (VAMP, auch Synaptobrevin genannt), wobei jeder Serotyp das Protein an einer unterschiedlichen Stelle spaltet. Schließlich wurde von Botulinumtoxintyp C1 gezeigt, dass es sowohl Syntaxin als auch SNAP-25 spaltet. Diese Unterschiede im Wirkmechanismus können die relative Stärke und/oder Dauer der Wirkung der verschiedenen Botulinumtoxin-Serotypen beeinflussen.
  • Das Molekulargewicht des Botulinumtoxinproteinmoleküls ist für alle sieben der bekannten Botulinumtoxin-Serotypen etwa 150 kD. Interessanter Weise werden die Botulinumtoxine durch das Clostridium-Bakterium als Komplexe, umfassend das 150 kD Botulinumtoxinproteinmolekül zusammen mit assoziierten Nicht-Toxinproteinen freigesetzt. So kann der Botulinumtoxintyp A-Komplex durch das Clostridium-Bakterium als 900 kD-, 500 kD- und 300 kD-Formen erzeugt werden. Die Botulinumtoxintypen B und C1 werden scheinbar nur als ein 500 kD-Komplex erzeugt. Der Botulinumtoxintyp D wird sowohl als 300 kD- als auch als 500 kD-Komplex erzeugt. Schließlich werden die Botulinumtoxintypen E und F nur als ungefähr 300 kD-Komplexe erzeugt. Von den Komplexen (d. h. Molekulargewicht größer als etwa 150 kD) wird angenommen, dass sie ein Nicht-Toxinhämagglutininprotein und ein Nicht-Toxin und nicht-toxisches Nicht-Hämagglutininprotein enthalten. Diese zwei Nicht-Toxinproteine (die zusammen mit dem Botulinumtoxinmolekül den relevanten Neurotoxinkomplex bilden können) können wirken, um dem Botulinumtoxinmolekül Stabilität gegen Denaturierung und Schutz gegen Verdauungssäuren, wenn das Toxin aufgenommen wird, zu verleihen. Zusätzlich ist es möglich, dass die größeren (größer als etwa 150 kD Molekulargewicht) Botulinumtoxin-Komplexe zu einer langsameren Diffusionsgeschwindigkeit des Botulinumtoxins weg von der Stelle der intramuskulären Injektion eines Botulinumtoxin-Komplexes führen können. Die Toxinkomplexe können durch Behandlung des Komplexes mit roten Blutzellen bei pH 7,3 in Toxinprotein und Hämagglutininprotein dissoziiert werden. Das Toxinprotein hat nach Entfernung des Hämagglutininproteins eine bemerkenswerte Instabilität.
  • Alle Botulinumtoxin-Serotypen werden durch Clostridium botulinum Bakterien als inaktive Einzelkettenproteine erzeugt, die durch Proteasen gespalten oder eingeschnitten werden müssen, um neuroaktiv zu werden. Die Bakterienstämme, die die Botulinumtoxin-Serotypen A und G herstellen, besitzen endogene Proteasen, und die Serotypen A und G können deshalb aus Bakterienkulturen überwiegend in ihrer aktiven Form gewonnen werden. Im Gegensatz dazu werden die Botulinumtoxin-Serotypen C1, D und E durch nicht-proteolytische Stämme synthetisiert und sind deshalb typischerweise nicht aktiviert, wenn sie aus der Kultur gewonnen werden. Serotypen B und F werden sowohl durch proteolytische als auch nicht-proteolytische Stämme hergestellt und können deshalb entweder in der aktiven oder der inaktiven Form gewonnen werden. Sogar die proteolytischen Stämme, die z. B. Botulinumtoxintyp B-Serotyp herstellen, spalten jedoch nur einen Teil des hergestellten Toxins. Der exakte Anteil der eingeschnittenen zu den nicht eingeschnittenen Molekülen hängt von der Länge der Inkubation und der Temperatur der Kultur ab. Daher ist ein bestimmter Prozentsatz jedes Präparats von z. B. dem Botulinumtoxintyp B-Toxin wahrscheinlich inaktiv, was möglicherweise für die bekannte signifikante niedrigere Stärke von Botulinumtoxintyp B im Vergleich zum Botulinumtoxintyp A verantwortlich ist. Die Gegenwart von inaktiven Botulinumtoxinmolekülen in einem klinischen Präparat wird zur Gesamtproteinbeladung des Präparats beitragen, die mit der gesteigerten Antigenizität in Verbindung gebracht werden kann, ohne zu seiner klinischen Wirksamkeit beizutragen. Zusätzlich ist bekannt, dass Botulinumtoxintyp B nach intramuskulärer Injektion eine kürzere Wirkdauer hat und bei der gleichen Dosis auch weniger wirksam als Botulinumtoxintyp A ist.
  • Kristallines Botulinumtoxintyp A mit hoher Qualität kann aus dem Hall A-Stamm von Clostridium botulinum mit Eigenschaften von ≥ 3 × 107 U/mg, einem A260/A278 von weniger als 0,60 und einem bestimmten Muster an Bändern in der Gelelektrophorese hergestellt werden. Das bekannte Shantz-Verfahren kann verwendet werden, um kristallines Botulinumtoxintyp A zu erhalten, wie in E. J. Shantz et al., Properties and Use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol. Rev., 56: 80–99 (1992) ausgeführt ist. Im allgemeinen kann der Botulinumtoxintyp A-Komplex aus einer anaeroben Fermentation durch Kultivieren von Clostridium Botulinum Typ A in einem geeigneten Medium isoliert und gereinigt werden. Rohes Toxin kann durch Ausfällen mit Schwefelsäure geerntet und durch Ultramikrofiltration konzentriert werden. Die Reinigung kann durch Lösen des Säurepräzipitats in Calciumchlorid durchgeführt werden. Das Toxin kann dann mit kaltem Ethanol ausgefällt werden. Das Präzipitat kann in Natriumphosphatpuffer gelöst und zentrifugiert werden. Nach Trocknen kann dann ein ungefähr 900 kD kristalliner Botulinumtoxintyp A-Komplex mit einer spezifischen Stärke von 3 × 107 LD50 U/mg oder größer erhalten werden. Dieses bekannte Verfahren kann auch verwendet werden, um nach Abtrennung der Nicht-Toxinproteine reine Botulinumtoxine zu erhalten, wie z. B.: gereinigtes Botulinumtoxintyp A mit ungefähr 150 kD Molekulargewicht mit einer spezifischen Stärke von 1–2 × 108 LD50 U/mg oder größer; gereinigtes Botulinumtoxintyp B mit ungefähr 156 kD Molekulargewicht mit einer spezifischen Stärke von 1–2 × 108 LD50 U/mg oder größer, und gereinigtes Botulinumtoxintyp F mit ungefähr 155 kD Molekulargewicht mit einer spezifischen Stärke von 1–2 × 107 LD50 U/mg oder größer.
  • Bereits hergestellte und gereinigte Botulinumtoxine und Toxinkomplexe, die zur Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen geeignet sind, können von List Biological Laboratories, Inc., Campbell, Kalifornien; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, GB; Wako (Osaka, Japan) sowie von Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, erhalten werden.
  • Reines Botulinumtoxin ist so unbeständig, dass es eine beschränkte praktische Verwendbarkeit zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung hat. Außerdem sind die Botulinumtoxin-Komplexe, wie der Toxintyp A-Komplex, auch extrem anfällig für Denaturierung aufgrund von Oberflächendenaturierung, Wärme und alkalischen Bedingungen. Inaktiviertes Toxin bildet Toxoidproteine, die immunogen sein können. Die resultierenden Antikörper können einen Patient unempfänglich gegenüber Toxininjektion machen.
  • So wie bei Enzymen im allgemeinen, sind die biologischen Aktivitäten von Botulinumtoxinen (die intrazelluläre Peptidasen sind) zumindest teilweise von ihrer dreidimensionalen Konformation abhängig. Daher wird Botulinumtoxintyp A durch Wärme, verschiedene Chemikalien, Oberflächenstrecken und Oberflächentrocknung enttoxifiziert. Zusätzlich ist bekannt, dass eine Verdünnung des durch das bekannte Kultivieren, Fermentieren und Reinigen erhaltenen Toxinkomplexes auf die viel viel niedrigeren Toxinkonzentrationen, die zur Formulierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, zu einer schnellen Enttoxifizierung des Toxins führt, außer ein geeignetes Stabilisierungsmittel ist zugegen. Die Verdünnung des Toxins von Milligrammmengen zu einer Lösung, enthaltend Nanogramm pro Milliliter bringt aufgrund des schnellen Verlusts der spezifischen Toxizität bei einer so großen Verdünnung signifikante Schwierigkeiten mit sich. Da das Toxin Monate oder Jahre, nachdem die toxinhaltige pharmazeutische Zusammensetzung formuliert wurde, verwendet werden kann, muss das Toxin mit einem Stabilisierungsmittel stabilisiert werden. Die einzigen erfolgreichen Stabilisierungsmittel zu diesem Zweck waren die aus Tieren stammenden Proteine Albumin und Gelatine. Und wie angegeben, bringt die Gegenwart von aus Tieren stammenden Proteinen in der Endformulierung potenzielle Probleme mit sich, da bestimmte stabile Viren, Prione oder andere infektiöse oder pathogene Verbindungen, die aus den Donoren durchgetragen wurden, das Toxin kontaminieren können.
  • Außerdem kann jede der harschen Bedingungen des pH-, Temperatur- und Konzentrationsbereichs, die benötigt werden, um eine Botulinumtoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzung in ein Toxinversand- und -lagerungsformat (fertig zur Verwendung oder Rekonstitution durch einen Arzt) zu lyophilisieren (gefrierzutrocknen) oder vakuumzutrocknen, das Toxin enttoxifizieren. Daher wurden aus Tieren stammende oder Donorpoolproteine, wie Gelatine und Serumalbumin, mit einigem Erfolg verwendet, um Botulinumtoxin zu stabilisieren.
  • Eine kommerziell erhältliche Botulinumtoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzung wird unter der Marke BOTOX® (erhältlich von Allergan, Inc., Irvine, Kalifornien) verkauft. BOTOX® besteht aus einem gereinigten Botulinumtoxintyp A-Komplex, Albumin und Natriumchlorid, verpackt in steriler, vakuumgetrockneter Form. Das Botulinumtoxintyp A wird aus einer Kultur des Hall-Stamms von Clostridium botulinum hergestellt, die in einem Medium, enthaltend N-Z-Amin und Hefeextrakt, gezogen wurde. Der Botulinumtoxintyp A-Komplex wird aus der Kulturlösung durch eine Serie von Säurepräzipitationen zu einem kristallinen Komplex aufgereinigt, der aus dem aktiven Toxinprotein mit hohem Molekulargewicht und einem assoziierten Hämagglutininprotein besteht. Der kristalline Komplex wird in einer Lösung, enthaltend Kochsalzlösung und Albumin, wieder gelöst und vor der Vakuumtrocknung steril filtriert (0,2 μm). BOTOX® kann vor der intramuskulären Injektion mit steriler, nicht-konzentrierter Kochsalzlösung rekonstituiert werden. Jede Ampulle BOTOX® enthält etwa 100 Einheiten (U) Clostridium-Botulinumtoxin Typ A-Komplex, 0,5 mg menschliches Serumalbumin und 0,9 mg Natriumchlorid in einer sterilen, vakuumgetrockneten Form ohne Konservierungsmittel.
  • Um vakuumgetrocknete BOTOX®-sterile normale Kochsalzlösung ohne Konservierungsmittel zu rekonstituieren, wird 0,9% Natriumchlorid-Injektion durch Aufziehen der richtigen Menge an Verdünnungsmittel in einer Spritze mit zweckmäßiger Größe verwendet. Da BOTOX® durch Blasenbildung oder ähnliche heftige Bewegung denaturiert wird, wird das Verdünnungsmittel sanft in die Ampulle injiziert. BOTOX® soll innerhalb 4 Stunden nach Rekonstituierung verabreicht werden. Während dieser Zeitspanne wird rekonstituiertes BOTOX® in einem Kühlschrank (2 bis 8°C) gelagert. Rekonstituiertes BOTOX® ist klar, farblos und frei von partikulärer Materie. Das vakuumgetrocknete Produkt wird in einem Gefrierschrank bei oder unter –5°C gelagert. BOTOX® wird innerhalb von 4 h, nachdem die Ampulle aus dem Gefrierschrank entnommen und rekonstituiert wurde, verabreicht. Während diesen 4 Stunden kann rekonstituiertes BOTOX® in einem Kühlschrank (2 bis 8°C) gelagert werden.
  • Es wurde berichtet, dass eine geeignete Alternative zu Albumin als Botulinumtoxinstabilisator ein anderes Protein oder alternativ eine Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht (kein Protein) sein kann. Carpender et al., Interactions of Stabilizing Additives with Proteins During Freeze-Thawing and Freeze-Drying, International Symposium an Biological Produkt Freeze-Drying and Formulation, 24.–26. Oktober 1990; Karger (1992), 225–239.
  • Viele häufig als Träger und Füllmittel in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendete Substanzen haben sich als ungeeignet als Albuminersatz in einer neurotoxinhaltigen pharmazeutischen Zusammensetzung herausgestellt. Zum Beispiel wurde von dem Disaccharid Cellobiose herausgefunden, dass es als Toxinstabilisator ungeeignet ist. Daher ist bekannt, dass die Verwendung von Cellobiose als Exzipient in Verbindung mit Albumin und Natriumchlorid in einem viel niedrigeren Grad an Toxizität (10% Wiederfindung) nach Lyophilisierung des kristallinen Botulinumtoxintyps A mit diesen Exzipienten im Vergleich zu der Toxizität nach Lyophilisierung nur mit Albumin (75 bis 90% Wiederfindung) resultiert. Goodnough et al., Stabilization of Botulinum Toxin Type A During Lyophilization, App. & Envir. Micro. 58 (10) 3426–3428 (1992).
  • Außerdem sind Saccharide, einschließlich Polysaccharide, im allgemeinen schlechte Kandidaten, um als Proteinstabilisatoren zu dienen. Daher ist bekannt, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Proteinwirkstoff, inhärent instabil ist, wenn die Proteinformulierung ein Saccharid (wie Glucose oder ein Polymer von Glucose) oder Kohlenhydrate umfasst, da von Proteinen und Glucose bekannt ist, dass sie miteinander wechselwirken und aufgrund der reduzierenden Natur von Glucose und Glucosepolymeren die gut beschriebene Maillard-Reaktion eingehen. Viel Arbeit wurde auch für die meist nicht erfolgreichen Versuche aufgewandt, diese Protein-Saccharid-Reaktion durch z. B. Reduktion von Feuchtigkeit oder Verwendung von nicht reduzierenden Zuckern zu verhindern. Signifikanter Weise kann der abbauende Weg der Maillard-Reaktion zu einer therapeutischen Unzulänglichkeit des Proteinwirkstoffs führen. Eine pharmazeutische Formulierung, umfassend Protein und ein reduzierendes Saccharid, Kohlenhydrat oder einen Zucker, wie ein Glucosepolymer, ist daher inhärent instabil und kann nicht ohne signifikanten Verlust der gewünschten biologischen Aktivität des Wirkstoffproteins über eine lange Zeitspanne gelagert werden.
  • Bemerkenswerter Weise ist einer der Gründe, dass menschliches Serumalbumin effektiv als Stabilisator eines Proteinwirkstoffs in einer pharmazeutischen Zusammensetzung wirken kann, der, dass Albumin, das ein Protein ist, nicht mit dem Proteinwirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung die Maillard-Reaktion eingehen kann. Daher würde man erwarten, einen Ersatz für Albumin unter anderen Proteinen zu finden und zu suchen.
  • Das Auffinden eines geeigneten Ersatzes für Albumin als Stabilisator des in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandenen Botulinumtoxins ist schwierig und problematisch, da von Albumin angenommen wird, dass es in einer pharmazeutischen Zusammensetzung als mehr als ein einfaches Füllmittel wirkt. So kann Albumin offensichtlich mit Botulinumtoxin Wechselwirken, so dass die Stärke des Neurotoxins erhöht wird. Zum Beispiel ist bekannt, dass Rinderserumalbumin als mehr als ein bloßer stabilisierender Exzipient für Botulinumtoxintyp A wirken kann, da Rinderserumalbumin offensichtlich auch die Geschwindigkeit der Katalyse von synthetischen Peptidsubstraten, die dem SNAP-25-intraneuronalen Substrat für Botulinumtoxintyp A ähneln, steigern kann, Schmidt et al., Endoproteinase Activität of Type A Botulinum Neurotoxin Substrate Requirements and Activation by Serum Albumin, J. of Protein Chemistry, 16(1), 19–26 (1997). So kann Albumin einen potenzierenden Effekt haben, offensichtlich durch Beeinflussung der Geschwindigkeitskinetik bei der intrazellulären proteolytischen Wirkung eines Botulinumtoxins auf das Substrat des Toxins. Diese potenzierende Wirkung kann durch Albumin, das das Botulinumtoxin bei der Endozytose des Toxins in einer Zielnervenzelle begleitet hat, verursacht sein, oder die potenzierende Wirkung kann durch die vorherige Gegenwart von zytoplasmischem Albumin innerhalb des Neuronproteins vor der Endozytose des Botulinumtoxins verursacht sein.
  • Die Entdeckung des Vorhandenseins einer die kinetische Geschwindigkeit stimulierenden Wirkung durch Rinderserumalbumin auf die proteolytische Aktivität von Botulinumtoxintyp A macht die Suche nach einem geeigneten Ersatz für Albumin in einer Butulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Formulierung besonders problematisch. Daher kann ein Albuminersatz mit gewünschten Toxin-stabilisierenden Eigenschaften einen unbekannten und möglicherweise schädlichen Effekt auf die Geschwindigkeit der Substratkatalyse durch das Toxin haben, da zumindest mit Bezug auf Rinderserumalbumin die beiden Eigenschaften (Toxinstabilisierung und Toxinsubstratkatalysepotenzierung) offensichtlich dem gleichen Albuminexzipienten inhärent sind. Diese potenzierende Wirkung von Albumin zeigt, dass Albumin nicht als bloßer Exzipient in der Formulierung wirkt und macht daher die Suche nach einem geeigneten Ersatz für Albumin schwieriger.
  • Zusätzlich gibt es viele einzigartige Eigenschaften von Botulinumtoxin und seiner Formulierung in eine geeignete pharmazeutische Zusammensetzung, die die Suche nach einem Ersatz für das Albumin, das in den derzeitigen Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Formulierungen verwendet wird, beschränken und behindern und sehr problematisch machen. Beispiele von vier dieser einzigartigen Eigenschaften folgen. Zuerst ist Botulinumtoxin ein relativ großes Protein zum Einschluss in eine pharmazeutische Formulierung (das Molekulargewicht des Botulinumtoxintyp A-Komplexes ist 900 kD) und ist daher inhärent fragil und labil. Die Größe des Toxinkomplexes macht es viel anfälliger und labiler als kleinere, weniger komplexe Proteine, wodurch die Formulierungs- und Handhabungsschwierigkeiten verschlimmert werden, wenn die Toxinstabilität erhalten werden soll. Ein Albuminersatz muss daher in der Lage sein, mit dem Toxin auf eine Weise wechselzuwirken, die das Toxinmolekül nicht denaturiert, fragmentiert oder anders enttoxifiziert oder eine Disassoziierung der in dem Toxinkomplex vorhandenen Nicht-Toxinproteine hervorruft. Als das letalste bekannte biologische Produkt erfordert es zweitens außergewöhnliche Sicherheit, Präzision und Exaktheit bei allen Schritten der Formulierung einer Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzung. Daher sollte ein bevorzugter potenzieller Albuminersatz nicht selbst toxisch oder schwierig handzuhaben sein, so dass die bereits extrem stringenten Formulierungsanforderungen für Botulinumtoxinhaltige pharmazeutische Zusammensetzungen nicht erschwert werden.
  • Da Botulinumtoxin das erste mikrobielle Toxin war, das zur Injektion für die Behandlung von menschlichen Krankheiten zugelassen wurde, mussten drittens spezielle Protokolle entwickelt und für die Kultivierung, Rohmaterialproduktion, Formulierung in ein Pharmazeutikum und Verwendung des Botulinumtoxins zugelassen werden. Wichtige Erwägungen sind die Toxinreinheit und Dosis zur Injektion. Die Herstellung durch Kultivierung und die Reinigung müssen so durchgeführt werden, dass das Toxin nicht mal in Spurenmengen einer Substanz ausgesetzt wird, die das Endprodukt kontaminieren könnte und unzulässige Reaktionen im Patienten hervorrufen könnte. Diese Limitierungen verlangen das Kultivieren in vereinfachtem Medium ohne die Verwendung von Tierfleischprodukten und die Reinigung durch Vorgehensweisen, die keine synthetischen Lösungsmittel oder Harze mit sich bringen. Die Herstellung von Toxin unter Verwendung von Enzymen, verschiedenen Austauschern, wie den in Chromatographiesäulen vorhandenen, und synthetischen Lösungsmitteln, kann Verunreinigungen einführen und ist daher von den bevorzugten Formulierungsschritten ausgeschlossen. Außerdem wird Botulinumtoxintyp A leicht bei Temperaturen über 40°C denaturiert, verliert Toxizität, wenn sich Blasen an der Luft/Flüssigkeitsgrenzfläche bilden, und denaturiert in Gegenwart von Stickstoff oder Kohlendioxid.
  • Viertens existieren besondere Schwierigkeiten, um Botulinumtoxintyp A zu stabilisieren, da Typ A aus einem Toxinmolekül von etwa 150 kD in nichtkovalenter Assoziierung mit Nicht-Toxinproteinen, die etwa 750 kD wiegen, besteht. Von den Nicht-Toxinproteinen wird angenommen, dass sie die Sekundär- und Tertiärstrukturen, von denen die Toxizität abhängt, konservieren oder stabilisieren helfen. Vorgehensweisen oder Protokolle, die für die Stabilisierung von Nicht-Proteinen oder relativ kleineren Proteinen anwendbar sind, sind für die Probleme, die der Stabilisierung des Botulinumtoxin-Komplexes, wie dem 900 kD Botulinumtoxintyp A-Komplex, inhärent sind, nicht anwendbar. Während von pH 3,5 bis 6,8 das Typ A Toxin und die Nicht-Toxinproteine nichtkovalent miteinander verbunden sind, wird so unter leicht alkalischen Bedingungen (pH > 7,1) das sehr labile Toxin aus den Toxinkomplex freigesetzt. Aufgrund seiner Labilität hat das reine Toxin keinen oder beschränkten Nutzen zur medizinischen Verabreichung.
  • Im Licht der einzigartigen Natur des Botulinumtoxins und den oben ausgeführten Anforderungen muss die Wahrscheinlichkeit des Findens eines geeigneten Albuminersatzes für das in derzeitigen Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendete Albumin realistisch als gegen Null strebend angesehen werden. Vor der vorliegenden Erfindung war nur von den aus Tieren stammenden Proteinen Albumin und Gelatine bekannt, dass sie als geeignete Stabilisatoren für das in einer pharmazeutischen Formulierung vorhandene Botulinumtoxin nützlich sind. So ist von Albumin allein oder mit einer oder zusätzlichen Substanz(en), wie Natriumphosphat oder Natriumcitrat, bekannt, dass es eine hohe Wiederfindung der Toxizität von Botulinumtoxintyp A nach Lyophilisierung ermöglicht. Wie bereits ausgeführt, kann Albumin als Produkt aus gesammeltem Blut unglücklicherweise zumindest potenziell infektiöse oder Krankheiten hervorrufende Elemente tragen, wenn es in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden ist. Tatsächlich kann jedes Tierprodukt oder Protein, wie Gelatine, auch potenziell pyrogene Stoffe oder andere Substanzen, die negative Reaktionen in einem Patienten hervorrufen können, enthalten.
  • Die chinesische Patentanmeldung CN 1215084 A diskutiert ein albuminfreies Botulinumtoxintyp A, das mit Gelatine, einem aus Tieren stammenden Protein, formuliert ist. Diese Formulierung beseitigt daher das Risiko der Übertragung eines aus einem Tierprotein stammenden oder begleitenden infektiösen Elements nicht.
  • Hydroxyethylstärke
  • Ein Polysaccharid kann aus Hunderten oder sogar Tausenden von Polyssacharid-Einheiten aufgebaut sein, die durch Glycosid(ether)bindungen zusammengehalten werden. Zwei wichtige Polysaccharide sind Cellulose und Stärke. Cellulose ist das Hauptstrukturmaterial in Pflanzen, das den Pflanzen ihre Festigkeit und Form verleiht. Stärke bildet den Reservenahrungsvorrat von Pflanzen und wird hauptsächlich in verschiedenen Samen und Knollen gefunden.
  • Stärke tritt als Körnchen auf, deren Größe und Form für die Pflanze, aus der die Stärke erhalten wird, charakteristisch sind. Im allgemeinen ist etwa 80% der Stärke eine wasserunlösliche Fraktion, genannt Amylopektin.
  • Amylopektin ist aus Ketten von D-Glucose-(als Glucopyranose)Einheiten aufgebaut, wobei jede Einheit durch eine α-glycosidische Bindung an C-4 der nächsten Glucoseeinheit gebunden ist. Wie Stärke ist auch Cellulose aus Ketten von D-Glucoseeinheiten aufgebaut, wobei jede Einheit durch eine Glucosidbindung an das C-4 der nächsten Einheit gebunden ist. Im Unterschied zu Stärke sind die Glycosidbindungen in Cellulose jedoch β-Bindungen. Die Behandlung von Cellulose mit Schwefelsäure und Essigsäureanhydrid liefert das Disaccharid Cellobiose. Wie zuvor ausgeführt, waren Versuche, Botulinumtoxin unter Verwendung von Cellobiose zu stabilisieren, nicht erfolgreich.
  • Ein besonderes Stärkederivat, das durch Behandlung von Stärke mit Pyridin und Ethylenchlorhydrin erhalten werden kann, ist 2-Hydroxyethylstärke, auch Hetastarch, genannt. US-Patent 4,457,916 offenbart eine Kombination von einem nicht-ionischen Tensid und Hydroxyethylstärke, um wässrige Lösungen des Tumornecrosefaktors (TNF) zu stabilisieren. Zusätzlich ist eine 6%ige wässrige Lösung von 2-Hydroxyethylstärke (Hetastarch) (erhältlich von Du Pont Pharma, Wilmington, Delaware unter dem Handelsnamen HESPAN®, 6% Hetastarch in 0,9% Natriumchloridinjektion) bekannt. Von Albumin ist bekannt, dass es nach intravenöser Verabreichung an einen Patienten als Plasmavolumenexpander wirkt. HESPAN® wurde auch an Patienten verabreicht, um einen Plasmavolumenexpansionseffekt zu erzielen, und in diesem Sinn kann intravenöses HESPAN® als Ersatz für intravenöses Albumin angesehen werden.
  • Hetastarch ist ein künstliches Kolloid, abgeleitet aus einer wachsartigen Stärke, die fast ganz aus Amylopektin besteht. Hetastarch kann durch Einführen von Hydroxyethylethergruppen auf Glucoseeinheiten der Stärke erhalten werden, und das resultierende Material kann dann hydrolysiert werden, um ein Produkt mit einem Molekulargewicht zu liefern, das zur Verwendung als Plasmavolumenexpander geeignet ist. Hetastarch ist durch ihre molare Substitution und auch durch ihr Molekulargewicht gekennzeichnet. Die molare Substitution kann ungefähr 0,75 sein, was bedeutet, dass Hetastarch in dem Ausmaß verethert ist, dass es pro 100 Glucoseeinheiten von Hetastarch im Durchschnitt ungefähr 75 Hydroxyethylsubstituentengruppen gibt. Das massegemittelte Molekulargewicht von Hetastarch ist ungefähr 670 kD mit einem Bereich von 450 kD bis 800 kD und wobei zumindest 80% der Polymereinheiten in den Bereich von 20 kD bis 2.500 kD fallen. Die Hydroxyethylgruppen sind durch Etherbindungen primär an C-2 der Glucoseeinheiten und in einem geringeren Ausmaß an C-3 und C-6 gebunden. Das Polymer ähnelt Glycogen, und die polymerisierten D-Glucoseeinheiten sind primär durch α-1,4-Bindungen mit gelegentlichen α-1,6-Verzweigungsbindungen polymerisiert. Der Grad der Verzweigung ist ungefähr 1:20, was bedeutet, dass es einen Durchschnitt von ungefähr einer α-1,6-Verzweigung pro 20 Glucosemonomereinheiten gibt. Hetastarch besteht aus mehr als 90% Amylopektin.
  • Die durch HESPAN® hervorgerufene Plasmavolumenexpansion kann an die durch Albumin erhaltene heranreichen. Hetastarchmoleküle unter 50 kD Molekulargewicht werden schnell durch renale Ausscheidung eliminiert, und eine Einzeldosis von ungefähr 500 ml HESPAN® (ungefähr 30 g) führt zur Entfernung von ungefähr 33% des verabreichten HESPAN® im Urin innerhalb von etwa 24 Stunden. Die Hydroxyethylgruppe von Hydroxyethylstärke wird in vivo nicht abgespalten, sondern bleibt intakt und an Glucoseeinheiten gebunden, wenn sie ausgeschieden wird. Signifikante Mengen an Glucose werden nicht erzeugt, da die Hydroxyethylierung einen vollständigen Metabolismus der kleineren Hydroxyethylstärkepolymere verhindert.
  • Cellulose kann genauso in eine Hydroxyethylcellulose umgewandelt werden. Das durchschnittliche Molekulargewicht von 2-Hydroxyethylcellulose (ein 2-Hydroxyethylether von Cellulose) ist etwa 90 kD. Unglücklicherweise ist Hydroxyethylcellulose, im Unterschied zu Hydroxyethylstärke, hoch reaktiv und daher zur Verwendung als Stabilisator eines Proteinwirkstoffs in einer pharmazeutischen Formulierung ungeeignet.
  • Was daher benötigt wird, ist ein geeigneter Ersatz für das aus Tier stammende Protein oder den Donorpool-Albuminstabilisator, der in Neurotoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet wird.
  • Die Patentanmeldungen WO 96/11699 und WO 97/35604 sowie die Dokumente M. C. Goodnough et al., Appl. Environ. Microbiol., 58, 1992, 3426–3428 und J. D. Rollnik et al., Eur. Neurol. 2000, 43: 9–12 beschreiben pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend Botulinumneurotoxin und natives Albumin. Nichtsdestotrotz beschreibt keines dieser Dokumente die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Botulinumtoxin und ein rekombinant hergestelltes Albumin umfasst, oder schlägt diese vor. Außerdem offenbart die Patentanmeldung WO 00/15245 , die nach dem Prioritätstag der vorliegenden Erfindung veröffentlicht wurde, flüssige Formulierungen von Botulinumtoxin, die zusätzlich ein Exzipientenprotein, wie Serumalbumin, das dem Präparat keine zusätzliche signifikante biologische Aktivität verleiht, einschließen.
  • Zusammenfassung
  • Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis und stellt einen Ersatz für in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandenes Albumin durch eine Verbindung, die das in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandene Botulinumtoxin stabilisieren kann, bereit. Die Albuminersatzverbindung hat die Eigenschaft einer niedrigen und bevorzugt vernachlässigbaren immunauslösenden Wirkung, wenn sie einem menschlichen Patienten injiziert wird. Zusätzlich hat der bevorzugte Albuminersatz eine schnelle Entfernungsgeschwindigkeit aus dem Körper nach Injektion der pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Definitionen
  • Wie hierin verwendet, haben die unten aufgelisteten Wörter oder Begriffe die folgenden Definitionen.
  • Das Wort ”etwa” bedeutet, dass das so qualifizierte Element, der Parameter oder der Begriff einen Bereich von plus oder minus 10% über- und unterhalb des Werts des angegebenen Elements, Parameters oder Begriffs umfasst.
  • Der Ausdruck ”Aminosäure” schließt Polyaminosäuren ein.
  • Das Wort ”Polysaccharid” meint ein Polymer von mehr als zwei Saccharidmolekülmonomeren, wobei die Monomere identisch oder unterschiedlich sein können.
  • Der Ausdruck ”pharmazeutische Zusammensetzung” meint eine Formulierung, in der der Wirkstoff ein Neurotoxin, wie ein clostridiales Neurotoxin, ist. Das Wort ”Formulierung” meint, dass es zumindest einen zusätzlichen Inhaltsstoff in der pharmazeutischen Zusammensetzung neben dem Neurotoxinwirkstoff gibt. Eine pharmazeutische Zusammensetzung ist daher eine Formulierung, die zur diagnostischen oder therapeutischen Verabreichung (d. h. durch intramuskuläre oder subkutane Injektion) an einen menschlichen Patienten geeignet ist. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann vorliegen: in einem lyophilisierten oder vakuumgetrockneten Zustand; als eine nach Rekonstitution der lyophilisierten oder vakuumgetrockneten pharmazeutischen Zusammensetzung mit Kochsalzlösung oder Wasser gebildete Lösung; oder als eine Lösung, die keine Rekonstitution benötigt. Der Neurotoxinwirkstoff kann einer der Botulinumtoxin-Serotypen A, B, C1, D, E, F oder G oder ein Tetanustoxin sein, die alle durch Clostridium-Bakterien hergestellt werden.
  • Der Ausdruck ”therapeutische Formulierung” bedeutet, dass eine Formulierung verwendet werden kann, um eine Störung oder Krankheit, wie eine Störung oder Krankheit gekennzeichnet durch Hyperaktivität (d. h. Spastizität) eines peripheren Muskels, zu behandeln und dadurch zu lindern.
  • Die Wörter ”stabilisierend”, ”stabilisiert” oder ”Stabilisation” bedeuten, dass bei Rekonstitution mit Kochsalzlösung oder Wasser, einer lyophilisierten oder vakuumgetrockneten Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei oder unter etwa –2°C zwischen 6 Monaten und 4 Jahren gelagert worden ist, oder bei einer Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Zusammensetzung als wässriger Lösung, die zwischen etwa 2 und etwa 8°C 6 Monate bis 4 Jahre gelagert worden ist, das in der rekonstituierten oder wässrigen Lösung der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhandene Botulinumtoxin mehr als etwa 20% und bis zu etwa 100% der Toxizität hat, die das biologisch aktive Botulinumtoxin hatte, bevor es in die pharmazeutische Zusammensetzung eingeschlossen wurde.
  • Der erfindungsgemäße Aspekt ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Botulinumtoxin und ein rekombinant hergestelltes Humanserumalbumin in einem lyophilisierten oder vakuumgetrockneten Zustand in einer Form zur Rekonstitution umfasst. Diese Zusammensetzung schließt bevorzugt auch ein Acetyltryptophanat oder Salze oder Derivate davon ein.
  • Meine Erfindung umfasst auch die Zugabe einer Zinkionenquelle zu einer Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Formulierung. Von Metallen, insbesondere zweiwertigen Kationen, wird berichtet, dass sie den Erfolg einer gefriergetrockneten Formulierung aufgrund von verschiedenen Cryo-Eigenschaften, einschließlich der Gitterstruktur des gebildetes Gefrorenen, stark beeinflussen. Fremdmetalle, wie Kupfer- und Eisenspezies, bieten sich für Radikaloxidationen an und sollten im allgemeinen vermieden werden. Spezifischer ist Botulinumtoxintyp A für die Aktivität von gebundenem Zink abhängig. Viele der vorgeschlagenen Exzipienten oder Reaktionsprodukte der Exzipienten werden mit Metallen Chelatkomplexe bilden. Dies könnte zur Bildung von instabilem Gefrorenen und/oder inaktiviertem Toxin führen. Durch Bereitstellen von ausreichend Zink in der Formulierung wird die Gegenwart der gewünschten zweiwertigen Kationen sichergestellt, die Wahrscheinlichkeit von Zinkverlust durch das Toxin wird reduziert, und die Stabilität gesteigert. Dies kann durch die Zugabe von ZnSO4 zu einer pharmazeutischen Botulinumtoxinzusammensetzung bewerkstelligt werden.
  • Es ist bekannt, die Herstellung von rekombinanten menschlichem Serumalbumin (rHSA) unter Verwendung eines Expressionsstammes der methylotrophischen Hefe Pichia pastoris mit hoher Produktivität durchzuführen. Botulinumtoxin-haltige pharmazeutische Formulierungen können hergestellt werden, indem sie stabilisierendes rHSA enthalten. Obwohl es dieselbe primäre Aminosäuresequenz hat, unterscheidet sich durch genetisch veränderte Hefegastzellen exprimiertes rHSA in anderen Aspekten von aus Plasma stammendem HSA. Obwohl sie eukaryontisch ist, fehlt es der Hefe an vielen intrazellulären Prozessen, die bei Säugern gefunden werden. Zusätzlich wird pHSA (aus Plasma stammendes menschliches Serumalbumin) in nicht glykosylierter Form erzeugt und durchläuft eine extrazelluläre, nicht enzymatische Addition von Glucose. Daher unterscheiden sich die Kohlenhydrateinheiten von pHSA und rHSA. Außerdem ist bekannt, dass die Mengen von Palmitinsäure und Stearinsäure, die in rHSA vorhanden sind, viel niedriger sind als diejenigen in pHSA. Von diesen Unterschieden kann angenommen werden, dass sie zu Unterschieden unter anderem bei der Ligandbindung, der Konformationsstabilität und der Molekülladung zwischen rHSA und pHSA führen. Es war daher überraschend, zu entdecken, dass rHSA verwendet werden kann, um Botulinumtoxin zu stabilisieren, insbesondere im Lichte des bekannten Effekts von pHSA auf die kinetische Geschwindigkeit bei Botulinumtoxin. Ein Vorteil von rHSA ist der, dass es frei von aus Blut stammenden Pathogenen ist. Daher umfasst ein anderer Aspekt meiner Erfindung den Ersatz des aus Blut stammenden menschlichen Serumalbumins in einer pharmazeutischen Zusammensetzung durch rHSA. Bevorzugt ist das rHSA in der Botulinumtoxin-haltigen pharmazeutischen Formulierung mit Acetyltryptophanat vorhanden, wie unten ausgeführt.
  • Kommerziell erhältliches menschliches Serumalbumin wird bei 60°C zehn Stunden erhitzt als Auflage, um potenziell infektiöse Mittel, die aus dem menschlichen Blutpool stammen, zu entfernen. Um schwerwiegende Denaturierung während dieses Prozesses zu verhindern, werden zwei Stabilisatoren zugegeben: Natriumacetyltryptophanat und Natriumcaprylat. Mit rHSA gibt es kein Erfordernis, diese Inhaltsstoffe zuzusetzen, da kein Krankheitsrisiko existiert und kein Erwärmungsschritt benötigt wird. Ich habe entdeckt, dass der Zusatz von Natriumacetyltryptophanat zu rHSA die thermische Stabilität über diejenige steigert, die bei Verwendung von Natriumcaprylat allein gezeigt wird, sogar wenn die Konzentration von Natriumcaprylat verdoppelt wird. Ohne zu wünschen, an die Theorie gebunden zu sein, nehme ich an, dass dies an der Caprylatbindung an nur eine Stelle liegt, wogegen Natriumacetyltryptophanat zwei Stellen bindet. Die Bindung dieser zweiten Stelle scheint die Beständigkeit gegenüber einem thermischen Störeinfluß zu erhöhen. Ich kann ferner postulieren, dass die Zugabe von Natriumacetyltryptophanat in bestimmter Weise die Stabilität von Botulinumtoxin-Formulierungen erhöhen kann, möglicherweise durch Beibehalten einer thermodynamisch vorteilhaften Konformation in dem Molekül, Bindung des Toxins oder durch Verhinderung der Denaturierung des menschlichen Serumalbumins selbst.
  • Meine Erfindung umfasst auch die Zugabe eines Konservierungsmittels, entweder in dem Verdünnungsmittel oder der Formulierung selbst, um eine verlängerte Lagerung zu ermöglichen. Ein bevorzugten Konservierungsmittel ist eine konservierte Kochsalzlösung enthaltend Benzylalkohol.
  • Eine flüssige Formulierung kann vorteilhaft sein. Eine Aufmachung für einen Schritt (z. B. eine vorbefüllte Spritze) oder ein Produktkonfiguration, die der Verwender als Einzelschrittaufmachung ansieht (z. B. eine Zweikammerspritze) würde Bequemlichkeit durch Eliminierung des Rekonstitutionsschrittes bereitstellen. Gefriertrocknung ist ein komplizierter, teurer, und schwieriger Vorgang. Flüssige Formulierungen sind oft einfacher und billiger herzustellen. Andererseits sind flüssige Formulierungen dynamische Systeme und daher anfälliger gegenüber Wechselwirkungen der Exzipienten, schnellen Reaktionen, Bakterienwachstum und Oxidation als gefriergetrocknete Formulierungen. Ein kompatibles Konservierungsmittel kann benötigt werden. Antioxidantien, wie Methionin, könnten auch als Fänger nützlich sein, insbesondere wenn Tenside verwendet werden, um die Adsorption zu reduzieren, da viele dieser Verbindungen Peroxide enthalten oder erzeugen. Jeder der stabilisierenden Exzipienten, der in einer gefriergetrockneten Formulierung verwendet werden kann (z. B. Hydroxyethylstärke oder eine Aminosäure, wie Lysin) kann an die Verwendung in einer flüssigen Formulierung angepaßt werden, um die Reduktion der Adsorption zu unterstützten und das Toxin zu stabilisieren. Suspensionen, die den für Insulin entwickelten ähnlich sind, sind auch gute Kandidaten. Zusätzlich kann das Stabilisieren von Botulinumtoxin in einem flüssigen Vehikel ein Vehikel mit niedrigem pH verlangen, da von dem Toxin berichtet wird, dass es überhalb pH 7 labil ist. Diese Azidität könnten Brennen und Stechen bei der Injektion hervorrufen. Eine binäre Spritze könnte ein gesetzt werden. Der Einschluß eines mitabgegebenen Puffers, der ausreicht, um den pH auf einen physiologischen anzuheben, würde die Injektionsbeschwerden eines niedrigen pHs lindern, während das Toxin während der Lagerung bei einem niedrigen pH gehalten wird. Eine andere Spritzenoption mit zwei Kammern würde Verdünnungsmittel und lyophilisiertes Material getrennt in separaten Kammern einschließen, wobei nur beim Gebrauch gemischt wird. Diese Option stellt die Vorteile einer flüssigen Formulierung ohne die zusätzlichen Ressourcen und Zeit bereit.
  • Daher kann das Botulinumtoxin bei niedrigem pH hergestellt werden, um zusammen mit einem Puffer abgegeben zu werden, der den pH bis oder nahe eines physiologischen pHs zur Zeit der Verabreichung anhebt. Die Zweikammer- oder binäre Spritze kann in der ersten Kammer (nahe dem Stempel) eine flüssige Formulierung eines Botulinumtoxins mit einem pH zwischen 3 bis 6 (d. h. bei pH 4,0) enthalten. Die zweite Kammer (nahe der Nadelspitze) kann einen geeigneten Puffer, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit einem höheren pH (d. h. pH 7,0) enthalten. Alternativ kann die erste Kammer ein Kochsalzverdünnungsmittel und die zweite Kammer eine gefriergetrocknete oder lyophilisierte Neurotoxin-Formulierung enthalten. Die zwei Kammern können auf so eine Weise verbunden und die puffernden Komponenten auf so eine Weise ausgewählt werden, dass sich die Lösungen bei oder nahe der Nadel mischen, wodurch die endgültige Lösung mit einem physiologischen pH abgegeben wird. Geeignete Zweikammerspritzen für die Verwendung als vorbefüllte Spritzen für die hier ausgeführten Zwecke können von Vetter Pharma-Fertigung aus Yardley, Pennsylvania, erhalten werden.
  • Es gibt deutliche Vorteile für das Formulieren von Botulinumtoxin bei einem niedrigen pH. Das Toxin hat einen niedrigen isoelektrischen Punkt (pI) und das Formulieren von Proteinen nahe ihrem pI ist ein bekannter Weg, um ein Protein zu stabilisieren. Zusätzlich wird das Toxin bei einer sehr niedrigen Konzentration verwendet, was die Oberflächenadsorption zu einem Problem macht. Die Verwendung einer Lösung mit niedrigem pH kann die Ionisierung von Toxinstellen unterdrücken, die voraussichtlich mit Oberflächen Wechselwirken. Die Spritzen und Kolbenmaterialien sind Materialien, die die Oberflächenadsorption durch das Toxin reduzieren. Solche geeigneten Materialien sind Polypropylen.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung
  • Wie zuvor ausgeführt, kann Botulinumtoxintyp A-Komplex aus einer Kultur des Hall-Stammes von Clostridium botulinum erhalten werden, der in einem Medium, enthaltend N-Z-Amin und Hefeextrakt, gezogen wurde. Der Botulinumtoxintyp A-Komplex, wird aus der Kulturlösung durch eine Serie von Säurepräzipitationen zu einem kristallinen Komplex gereinigt, der aus dem aktiven Toxinprotein mit hohem Molekulargewicht und einem assoziierten Hämagglutininprotein besteht. Der kristalline Komplex wird dann wieder in einer Lösung, enthaltend Kochsalzlösung und Albumin, gelöst und steril filtriert (0,2 μm), bevor er vakuumgetrocknet wird. BOTOX® wird dann mit steriler, nicht-konservierter Kochsalzlösung vor der intramuskulären Injektion rekonstituiert. Jede Ampulle BOTOX® enthielt etwa 100 Einheiten (U) Clostridium botulinum-Toxin Typ A-Komplex, 0,5 mg menschliches Serumalbumin und 0,9 mg Natriumchlorid in einer sterilen, vakuumgetrockneten Form ohne Konservierungsmittel. Erfindungsgemäß wird das menschliche Serumalbumin durch ein rekombinant hergestelltes Albumin ersetzt.
  • Referenzbeispiel 2
  • Pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung, enthaltend 2-Hydroxyethylstärke
  • Pharmazeutische Formulierungen mit gereinigtem Botulinumtoxintyp A-Neurotoxinkomplex wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 oben ausgeführt, hergestellt, außer dass die 0,5 mg Albumin entweder durch 500 μg oder 600 μg Hetastarch ersetzt wurden. Es wurde bestimmt, dass volle Stärke bei Herstellung der Hetastarch-haltigen Formulierungen beibehalten wurde. Mit beiden Hetastarch-haltigen Formulierungen war daher die Stärke der albuminfreien Hetastarch-haltigen Zusammensetzungen, wie zur Zeit der Rekonstitution des lyophilisierten, 100 U (±20 U) Botuliniumtoxintyp A-Komplexes gemessen, von 96 bis 128 Einheiten. Drei getrennte pharmazeutische Hetastarch, Botulinumtoxintyp A-Komplex-Zusammensetzungen hatten Stärkemessungen zur Zeit der Rekonstitution von 105, 111 bzw. 128 Einheiten. Die Stärke wurde unter Verwendung der Standard-Toxinstärkeassays durch Verabreichung an Mäuse gemessen.
  • Referenzbeispiel 3
  • Glyinhaltige pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung Pharmazeutische Formulierungen mit gereinigtem Botulinumtoxintyp A-Neurotoxinkomplex wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 oben ausgeführt, hergestellt, außer dass die 0,5 mg Albumin entweder durch 500 μg oder 600 μg Hetastarch ersetzt wurden. Zusätzlich wurde 1 mg Glycin zu der Formulierung gegeben. Die lyophilisierte, Hetastarch plus Glycin, albuminfreie, 100 U Botulinumtoxintyp A-Komplex, pharmazeutische Zusammensetzung wurde dann 7 Monate bei –5°C gelagert. Am Ende dieser 7-Monatsspanne wurde von der Stärke dieser Hetastarch plus Glycin-Toxinformulierung unter Verwendung des Tests durch Verabreichung an Mäuse bestimmt, dass sie im wesentlichen unverändert ist (d. h. die Stärke unterscheidet sich um weniger als 5% von der ursprünglichen Stärke).
  • Referenzbeispiel 4
  • Lysinhaltige pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung
  • 100 U pharmazeutische Formulierungen mit gereinigtem Botulinumtoxintyp R-Neurotoxinkomplex wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 oben ausgeführt, hergestellt, außer dass die 0,5 mg Albumin durch 600 μg Hetastarch ersetzt wurden. Zusätzlich wurde 1 mg Lysin zu der Formulierung gegeben. Die lyophilisierte, Hetastarch plus Lysin, albuminfreie, 100 U Botulinumtoxintyp A-Komplex, pharmazeutische Zusammensetzung wurde dann 1 Jahr bei –5°C gelagert. Am Ende dieser 1-Jahresspanne wurde von der Stärke dieser Hetastarch plus Lysin-Toxinformulierung unter Verwendung des Tests durch Verabreichung an Mäuse bestimmt, dass sie im wesentlichen unverändert ist (d. h. die Stärke unterscheidet sich um weniger als 5% von der ursprünglichen Stärke).
  • Referenzbeispiel 5
  • Histidinhaltige pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung
  • 100 U pharmazeutische Formulierungen mit gereinigtem Botulinumtoxintyp A-Neurotoxinkomplex wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 oben ausgeführt, hergestellt, außer dass die 0,5 mg Albumin durch 600 μg Hetastarch ersetzt wurden. Zusätzlich wurde 1 mg Histidin zu der Formulierung gegeben. Die lyophilisierte, Hetastarch plus Histidin, albuminfreie, 100 U Botulinumtoxintyp A-Komplex, pharmazeutische Zusammensetzung wurde dann 1 Jahr bei –5°C gelagert. Am Ende dieser -Jahresspanne wurde von der Stärke dieser Hetastarch plus Histidin-Toxinformulierung unter Verwendung des Tests durch Verabreichung an Mäuse bestimmt, dass sie im wesentlichen unverändert ist (d. h. die Stärke unterscheidet sich um weniger als 5% von der ursprünglichen Stärke).
  • Referenzbeispiel 6
  • Argininhaltige pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung
  • 100 U pharmazeutische Formulierungen mit gereinigtem Botulinumtoxintyp A-Neurotoxinkomplex wurden auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 oben ausgeführt, hergestellt, außer dass die 0,5 mg Albumin durch 600 μg Hetastarch ersetzt wurden. Zusätzlich wurde 1 mg Arginin zu der Formulierung gegeben. Die lyophilisierte, Hetastarch plus Arginin, albuminfreie, 100 U Botulinumtoxintyp A-Komplex, pharmazeutische Zusammensetzung wurde dann 1 Jahr bei –5°C gelagert. Am Ende dieser 1-Jahresspanne wurde von der Stärke dieser Hetastarch plus Arginin-Toxinformulierung unter Verwendung des Tests durch Verabreichung an Mäuse bestimmt, dass sie im wesentlichen unverändert ist (d. h. die Stärke unterscheidet sich um weniger als 5% von der ursprünglichen Stärke).
  • Referenzbeispiel 7
  • Aminosäure-haltige pharmazeutische Botulinumtoxinzusammensetzung
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen mit gereinigtem Botulinumtoxintyp A-Neurotoxinkomplex können auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 oben ausgeführt, hergestellt werden, außer dass die 0,5 mg Albumin durch etwa 1 mg einer Aminosäure, wie Lysin, Glycin, Histidin oder Arginin, ersetzt werden können. Eine lyophilisierte, polysaccharidfreie, albuminfreie plus Glycin, albuminfreie, 100 U Botulinumtoxintyp A-Komplex pharmazeutische Zusammensetzung kann zumindest 1 Jahr bei –5°C gelagert werden, und kann am Ende dieser Zeitspanne eine Stärke haben, die im wesentlichen unverändert ist (d. h. die Stärke unterscheidet sich um weniger als 5 & von der ursprünglichen Stärke).
  • Referenzbeispiel 8
  • Verwendung einer pharmazeutischen Botulinumtoxinzusammensetzung
  • Ein 48 Jahre alter Mann wird mit einer spastischen Muskelstörung, wie zervikaler Dystonie, diagnostiziert. Zwischen etwa 10–3 U/kg und etwa 35 U/kg einer pharmazeutischen Botulinumtoxintyp A-Zusammensetzung, enthaltend 600 μg Hetastarch und 1 mg einer Aminosäure, wie Lysin, wird dem Patienten intramuskulär injiziert. Innerhalb von 1 bis 7 Tagen werden die Symptome der spastischen Muskelstörung gelindert, und die Linderung der Symptome bleibt zumindest etwa 2 Monate bis etwa 6 Monate bestehen.
  • Eine erfindungsgemäße, hierin offenbarte pharmazeutische Zusammensetzung hat viele Vorteile, einschließlich der folgenden:
    • 1. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann frei von jedem Blutprodukt, wie Albumin, und daher frei von jedem infektiösen Element aus Blutprodukten, wie einem Prion, hergestellt werden.
    • 2. Die pharmazeutische Zusammensetzung hat eine Stabilität und eine hohe prozentuale Wiedergewinnung der Toxinstärke, die denen, die mit derzeit erhältlichen pharmazeutischen Zusammensetzungen erreicht werden, vergleichbar oder überlegen sind.

Claims (4)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend: (a) ein Butolinumtoxin und (b) rekombinantes Humanserumalbumin, wobei die pharmazeutisches Zusammensetzung in einem lyophilisierten oder vakuumgetrockneten Zustand zur Rekonstitution vorliegt.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die ferner Acetyltryptophanat oder Salze oder Derivate davon umfasst.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das rekombinante Humanserumalbumin in Hefezellen exprimiert wurde.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Botulinumtoxin Botulinumtoxin-Typ A ist.
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