JP5769379B2

JP5769379B2 - Ｄａｎｃｅタンパク質溶液

Info

Publication number: JP5769379B2
Application number: JP2010061468A
Authority: JP
Inventors: 鈴木　茂彦; 茂彦鈴木; 素子内藤; 智之中邨; 悠紀坂元; 松田　晶二郎; 晶二郎松田
Original assignee: KANSAI MEDICAL UNIVERSITY EDUCATIONAL CORPORATION; Gunze Ltd; Kyoto University
Current assignee: KANSAI MEDICAL UNIVERSITY EDUCATIONAL CORPORATION; Gunze Ltd; Kyoto University
Priority date: 2010-03-17
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2030-03-17
Also published as: JP2011195475A

Description

本発明は、安定性に優れるＤＡＮＣＥタンパク質溶液に関する。また、本発明はＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法に関する。

ヒトの生体組織の中でも肺や血管、皮膚等の組織は、弾性、伸縮性に富んだ組織であるが、加齢とともに血管が硬くなる、あるいは皮膚がたるむといった生体組織の弾性が失われていく加齢現象が生じる。これは、生体組織に存在する弾性線維という、ゴムのような柔軟性と弾力を有する線維組織が劣化してしまうためであると考えられている。この弾性線維は、劣化・分解しても再生されることはないとされており、このような弾性線維の再生についての研究が数多くなされている。

近年、弾性線維の形成能を有する細胞の無血清培養において、ＤＡＮＣＥ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌａｒｔｅｒｉｅｓａｎｄｎｅｕｒａｌｃｒｅｓｔｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）−ｌｉｋｅ；ｆｉｂｕｌｉｎ−５ともいう）という分泌蛋白質を加えることにより効率よく弾性線維を再生できることが見出された（例えば、特許文献１参照）。

しかしながら、このＤＡＮＣＥタンパク質を溶液にすると、経時的に活性が低下するという問題があった。

国際公開第２００６／０８２７６３パンフレット

本発明は、安定性に優れるＤＡＮＣＥタンパク質溶液を提供することを目的とする。また、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、特定の物質が存在することでＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定性が優れることを見いだした。かかる知見に基づき、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は下記のＤＡＮＣＥタンパク質溶液及びＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法を提供する。
項１．ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物及びＤＡＮＣＥタンパク質を含む、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液。
項２．ゼラチンが、アルカリ処理ゼラチンである上記項１に記載のＤＡＮＣＥタンパク質溶液。
項３．ＤＡＮＣＥタンパク質溶液のｐＨが、５〜１４である上記項１又は２に記載のＤＡＮＣＥタンパク質溶液。
項４．ＤＡＮＣＥタンパク質を含む溶液に、ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物を添加することを特徴とする、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法。

本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液は、安定性が良好で、ある一定時間経過後においても、ＤＡＮＣＥタンパク質の活性を維持することができる。また、凍結融解を繰り返してもＤＡＮＣＥタンパク質の活性を維持することができるものである。

１．ＤＡＮＣＥタンパク質溶液
「ＤＡＮＣＥタンパク質」とは、ｆｉｂｕｌｉｎ−５とも呼ばれる分泌蛋白質であり、弾性線維を構成する分子であることが知られている。

本発明で用いるＤＡＮＣＥタンパク質は、ヒト由来のヒトＤＡＮＣＥタンパク質、又は、そのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）を含む。

ＤＡＮＣＥタンパク質のオルソログは特に限定されず、例えば任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来するものであり得る。哺乳動物としては、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス等が挙げられる。

ＤＡＮＣＥタンパク質については、例えば、国際公開第２００６／０８２７６３パンフレット等に記載されている。

本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液におけるＤＡＮＣＥタンパク質濃度は、特に限定されるものではなく、所望の濃度にすることができるが、例えば、１〜１０μｇ／ｍＬ程度であることが好ましく、９〜１０μｇ／ｍＬ程度であることがより好ましい。ＤＡＮＣＥタンパク質濃度が前記範囲内にあることで、希釈しすぎることによって生じるＤＡＮＣＥタンパク質の変性や、活性再現性の低下を防ぐことができるため好ましい。

本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液は、ＤＡＮＣＥタンパク質以外に、ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物を含むものである。

ゼラチンは、酸性、塩基性両アミノ酸を含む両性電解質であり、等電点４〜６程度のアルカリ処理ゼラチンであることが、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定性の点から好ましい。より好ましいゼラチンの等電点は、５〜６程度である。

このようなアルカリ処理ゼラチンとしては、市販のものを好適に用いることができ、例えば、ゼラチン粉末（♯２５０、新田ゼラチン（株）製、等電点：５）、ニワトリゼラチン（ニッポンハム（株）製）等を挙げることができる。

本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液のｐＨは特に限定はされないが、５〜１４の弱酸性〜アルカリ性であることが好ましく、６〜１１がより好ましい。ｐＨがこの範囲にあることで、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定性に優れるため好ましい。

アルブミンは、卵白アルブミン、乳中のラクトアルブミン、血清アルブミン等を挙げることができるが、これらの中でも、血清アルブミンが好ましい。

また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質の由来は特に限定されるものではなく、牛、豚、魚、植物および遺伝子組み換え体のいずれも用いることができる。

ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物の濃度としては特に限定されるものではないが、例えば、０．０５〜１０重量％程度であることが好ましく、０．１〜５重量％程度であることがより好ましい。

また、本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、水（蒸留水）、ＰＢＳ、Ｃａｒｍｏｄｙ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等を挙げることができる。これらの中でも、不純物が混入していない点から水（蒸留水）が好ましい。

２．ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の製造方法
本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液の製造方法は特に限定されるものではなく、ＤＡＮＣＥタンパク質、ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物、及び溶媒を所定量混合することで製造することができる。

本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液を作製するにあたり、ＤＡＮＣＥタンパク質を粉末のまま用いてもよいが、一旦溶媒等に溶かしてＤＡＮＣＥタンパク質を溶液とした後、本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液とすることができる。

その際に用いる溶媒としては、特に限定されるものではなく、例えば、水（蒸留水）、ＰＢＳ、Ｃａｒｍｏｄｙ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等を挙げることができる。これらの中でも、不純物が混入していない点から水（蒸留水）が好ましい。

その場合の濃度は、特に限定されるものではないが、１〜３０μｇ／ｍＬ程度が好ましく、１〜２０μｇ／ｍＬ程度が好ましい。濃度をこの範囲にすることで、ＤＡＮＣＥタンパク質の活性を低下させることなく本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液とするための希釈をすることができるため好ましい。

３．ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法
本発明は、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定化方法に関する。

本発明の安定化方法は、ＤＡＮＣＥタンパク質を含む溶液に、ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物を添加するという極めて簡単な方法により、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液を安定に保存することができるものである。

ＤＡＮＣＥタンパク質や、ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物、又は溶媒等の種類や添加量等については、前述の通りである。

以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

製造例１（ＤＡＮＣＥ水溶液の調整方法）
凍結乾燥されたＤＡＮＣＥタンパク質（ヒト由来）の粉末４μｇを蒸留水で溶解し、１０μｇ／ｍＬのＤＡＮＣＥタンパク質の水溶液Ａを作製した。

実施例１
等電点が５（ｐＩ５）のゼラチン粉末（♯２５０、新田ゼラチン（株）製）を蒸留水で溶解して、０．３重量％ゼラチン水溶液（ｐＨ７）を作製した。

前記ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）３ｍＬ中に、製造例１で調整したＤＡＮＣＥタンパク質の水溶液Ａ３０μＬを添加し、３７℃のインキュベーターで静置した。

実施例２
アルブミン（商品名：アルブミン牛血清製、コーンフラクションV、ｐＨ７．０、和光純薬工業（株）製）を蒸留水で溶解して、０．３重量％アルブミン水溶液を作製した。

ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、前記アルブミン水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。

実施例３
ヒドロキシエチルスターチ（ＳＩＧＭＡ製）の粉末を蒸留水に溶解して、０．３重量％ヒドロキシエチルスターチ水溶液を作製した。

ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、前記ヒドロキシエチルスターチ水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。

実施例４
等電点が５（ｐＩ５）のゼラチン粉末（♯２５０、新田ゼラチン（株）製）を蒸留水で溶解して、０．３重量％ゼラチン水溶液（ｐＨ７）を作製した。

前記ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）１ｍＬ中に、製造例１で調製したＤＡＮＣＥタンパク質の水溶液Ａ１０μＬを添加した。この溶液を−２０℃で０．５時間凍結し、その後３７℃で融解させ、この操作を１０回繰り返した。

比較例１
０．３重量％コラーゲン水溶液（ＣｅｌｌｍａｔｒｉｘＴｙｐｅＩ−Ｐ、新田ゼラチン（株）製）を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。

比較例２
０．３重量％コラーゲン水溶液（ＣｅｌｌｍａｔｒｉｘＴｙｐｅＩ−Ｐ、新田ゼラチン（株）製）を蒸留水で希釈し、０．０３重量％コラーゲン水溶液を作製した。

ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、０．０３重量％コラーゲン水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。

比較例３
デキストラン２００，０００（和光純薬工業（株）製：平均分子量１８０，０００〜２１０，０００）の粉末を蒸留水に溶解して、０．３重量％デキストラン水溶液を作製した。

ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、０．３重量％デキストラン水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。

比較例４
鶏冠由来ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）を蒸留水に溶解して、０．３重量％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液を作製した。

ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、０．３重量％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。

比較例５
ヘパリン（和光純薬工業（株）製：１００，０００ｕｎｉｔｓ）の粉末を蒸留水に溶解して、０．３重量％ヘパリン水溶液を作製した。

ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、０．３重量％ヘパリン水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。

比較例６
コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（和光純薬工業（株）製）の粉末を蒸留水に溶解して、０．３重量％コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム水溶液を作製した。

ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、０．３重量％コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。

比較例７〜９
ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、蒸留水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ（−））、血清を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製した。

比較例１０
ｐＩ５ゼラチン水溶液（ｐＨ７）に代えて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ（−））を用いた以外は、実施例１と同様にしてＤＡＣＮＥタンパク質溶液を作製し、実施例４と同様に凍結、融解させた。また、実施例４と同様にこの操作を１０回繰り返した。

試験方法
実施例１〜３、比較例１〜９で得られたＤＡＮＣＥタンパク質溶液について、ＤＡＮＣＥタンパク質添加０時間、１日、３日、７日後に溶液を５００μＬずつ採取し、下記方法によりＤＡＮＣＥタンパク質濃度を測定した。

また、参考実験として、上記実施例、比較例で用いた各種溶液について、ＤＡＮＣＥタンパク質なしのブランク試料についても、同様の測定をした。

実施例４および比較例１０で得られたＤＡＮＣＥタンパク質溶液について、溶液を５００μＬずつ採取し、下記方法によりＤＡＮＣＥタンパク質濃度を測定した。
（測定方法）
抗体は、マウス抗ＤＡＮＣＥタンパク質ＩｇＧを用いた。測定キット（製造元：エヌビィ健康研究所）を用い、実施例１〜４、比較例１〜１０のＤＡＮＣＥタンパク質溶液のＤＡＮＣＥタンパク質濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。
（測定結果１）
実施例１〜３および比較例１〜９の測定結果を表１に示す。

（測定結果２）
実施例４で得られた溶液中のＤＡＮＣＥタンパク質の濃度は、凍結と融解を１回ずつ行った場合には２２．４ｎｇ／ｍｌ、１０回繰り返した場合には１６．７ｎｇ／ｍｌであった。これに対して比較例１０で得られた溶液中のＤＡＮＣＥタンパク質の濃度は、凍結と融解を１回ずつ行った場合には２．６ｎｇ／ｍｌ、１０回繰り返した場合には０．０ｎｇ／ｍｌであった。

実施例１〜３より、本発明のＤＡＮＣＥタンパク質溶液は、ＤＡＮＣＥ添加後７日を経過しても、充分なＤＡＮＣＥタンパク質濃度を有しており、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液の安定性が非常に高いことがわかる。

一方、比較例１〜８では、いずれもＤＡＮＣＥタンパク質濃度が１０ｎｇ／ｍＬ以下にまで減少しており、ＤＡＮＣＥタンパク質の活性が経時的に低下していることがわかる。

また、比較例９の血清については、そのブランク試験結果からも明らかなように、もともと血清中にＤＡＮＣＥタンパク質が存在するため、このような結果になったと考えられる。

実施例４と比較例１０から、ゼラチン溶液中にＤＡＮＣＥタンパク質を保持することによって、凍結、融解の繰り返しに対しても安定的に保存できることがわかった。

Claims

ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物、並びにＤＡＮＣＥタンパク質を含む、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液であって、
前記ＤＡＮＣＥタンパク質濃度が、１〜１０μｇ／ｍＬであり、前記ゼラチン、アルブミン及びヒドロキシエチルスターチからなる群から選択される１種以上の化合物の濃度が、０．０５〜１０重量％である、ＤＡＮＣＥタンパク質溶液。
ゼラチンが、アルカリ処理ゼラチンである請求項１に記載のＤＡＮＣＥタンパク質溶液。
ＤＡＮＣＥタンパク質溶液のｐＨが、５〜１４である請求項１又は２に記載のＤＡＮＣＥタンパク質溶液。