DE60103940T2

DE60103940T2 - Stabilisierter Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor

Info

Publication number: DE60103940T2
Application number: DE60103940T
Authority: DE
Inventors: Josephine Nanette Groton Hay; Kathleen Brimelow Gales Ferry Williams
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2001-02-21
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2021-02-22
Also published as: EP1129720A2; US6497869B2; JP2001278898A; US20020002133A1; BR0100827A; PT1129720E; CA2337661A1; JP3544180B2; EP1129720A3; DK1129720T3; ATE269716T1; TR200401573T4; ES2220673T3; DE60103940D1; EP1129720B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf wässrige Zusammensetzungen von Granulocytenkolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF), insbesondere nicht-glykosiliertem G-CSF, mit einem pH-Wert von ca. 5,0 bis ca. 8,0, und einem Salz, das Sulfationen mit einer Konzentration von ca. 0,01 M bis ca. 1,0 M umfasst, gerichtet. Die Anwesenheit des Salzes, das Sulfationen umfasst, stabilisiert unerwarteterweise nicht-glykosilierten G-CSF in einer wässrigen Zusammensetzung mit einem pH-Wert von ungefähr 5,0 bis ungefähr 8,0.
Hintergrund der Erfindung
Kolonie-stimulierende Faktoren induzieren Proliferation, Entwicklung und Reifung spezifischer hämatopoietischer Zellen. G-CSF insbesondere führt zu erhöhten Spiegeln zirkulierender polymorphnukleärer Neutrophiler (PMN), welche kritische Rollen in der Zerstörung infektiöser Agenzien spielen. Humaner Granulocytenkolonie-stimulierender Faktor (hG-CSF) wird zum Beispiel verwendet, um Hämatopoiese zu stimulieren, um Patienten, die eine Knochenmark-subprimierende Chemotherapie durchmachen, gegen opportunistische Infektionen zu schützen.
G-CSF kann auch verwendet werden, um einen ähnlichen Schutz für domestizierte Tiere wie Vieh, Hunde und Katzen zu erreichen. Infektiöse Krankheiten beim Vieh und Milch-produzierenden Kühen, einschließlich Transportfieber bzw. Transport-Pasteurellose bzw. Bovina Mastitis, sind eine Ursache für signifikante und fortdauernde ökonomische Verluste.
Transportfieber umfasst eine Reihe respiratorischer Beschwerden, die Vieh heimsuchen, die oft bei gestressten Tieren innerhalb einer Population, die aus einer Anzahl von verschie denen Quellen zu einer Futtergruppe zusammengesetzt ist, festgestellt wird. Die anfänglichen Infektionen, die im Allgemeinen von Mycoplasmen, Chlamydien, Bakterien, Viren oder Gemischen daraus verursacht werden, sind hoch ansteckend und lassen das Tier, wenn auch für gewöhnlich nicht letal, in einem geschwächten Zustand zurück. Eine nachfolgende Infektion durch einen anderen opportunistischen Organismus, insbesondere Pasteurella haemolytica, ist oft die Ursache für die Mortalität unter diesen Umständen, und zwar eher als die anfängliche Infektion. Bovina Mastitis bezieht sich auf eine Infektion der Euter, die entweder durch Gram-negative oder Gram-positive Organismen verursacht werden kann. Diese Infektionen sind ebenfalls hoch infektiös und können zu einer signifikanten Reduktion der Milchproduktion bei der betroffenen Kuh führen, und dieser Verlust kann, wenn Narbenbildung auftritt, bleibend sein. Dementsprechend könnten Verfahren und Zusammensetzungen mit G-CSF, die eine erfolgreiche Behandlung domestizierter Arten erlauben, die Auswirkungen solcher infektiöser Erkrankungen bei solchen kommerziell wichtigen Tieren verhindern oder verbessern.
Reifer boviner Granulocytenkolonie-stimulierender Faktor, bG-CSF (GenBank Eingangsnummer AF0925333) besteht aus 174 Aminosäuren, von denen 82% identisch mit jenen in dem entsprechenden humanen Protein sind (GenBank Eingangsnummer M17706). Sowohl die humanen als auch die bovinen Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktoren sind hydrophobe Proteine, welche eine ungerade Anzahl (5) Cysteinreste umfassen. Dementsprechend stellt mindestens eine der Cystein-Seitenketten eine freie Thiolgruppierung bereit, die zur Bildung unpassender intramolekularer und intermolekularer Disulfid-Bindungen führen kann, was zur Akkumulation von unlöslichen, biologisch inaktiven, dimeren oder polymeren Strukturen führt. Diese Hypothese wurde als eine mögliche Erklärung für die Beobachtung vorgeschlagen, dass hG-CSF, bG-CSF und andere G-CSF-Moleküle, insbesondere rekombinante, nicht-glykosilierte Formen, die in prokaryontischen Wirten hergestellt wurden, schwierig als stabile, pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen zu formulieren sind.
Glykosiliertes hG-CSF wurde mit deglykosiliertem hG-CSF, das mittels enzymatischer in vitro Verdauung mit Neuraminidase und endo-α-N-acetylgalactosaminidase hergestellt wurde, im Hinblick auf seine Stabilität als Funktion des pH-Wertes und der Temperatur verglichen (Oh-eda et al., 1990, J. Biol. Chem. 265 (20): 11432–35). Das deglykolisierte hG-CSF, das bei einer Konzentration von 1 μg/ml in 20 mM Phosphatpuffer, der 0,2 M NaCl und 0,01% Tween 20 enthielt, gelöst war, wurde innerhalb des pH-Bereichs von ungefähr pH 7 bis ungefähr pH 8 nach einer zweitägigen Inkubation bei 37°C schnell inaktiviert. Im Gegensatz dazu behielt glykosiliertes hG-CSF unter denselben Bedingungen mehr als 80% seiner Aktivität. Weiterhin zeigte die Untersuchung der Wärmestabilität beider Formen von hG-CSF, gemessen mittels biologischer Assays und kalorimetrischer Analyse, dass deglykolisiertes hG-CSF weniger wärmestabil war als die native Form von hG-CSF.
Eine Reihe von Versuchen wurde unternommen, um stabile, pharmazeutisch annehmbare G-CSF-Zusammensetzungen bereitzustellen. Ein Ansatz zur Verbesserung der Zusammensetzungsstabilität von G-CSF umfasst die Synthese von Derivaten des Proteins. US-Patent 5,665,863 von Yeh (das "'863-Patent") offenbart die Bildung von rekombinanten chimeren Proteinen, die G-CSF gekoppelt mit Albumin umfassen, welche pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen. Das US-Patent 5,824,784 von Kinstler et al. (das "'784-Patent") und das US-Patent 5,320,840 von Camble et al., (das "'840-Patent") offenbaren das chemische Anhängen von wasserlöslichen Polymeren an Proteine, um die Stabilität zu verbessern und einen Schutz gegen proteolytischen Abbau zu bieten. Spezifischer offenbart das '784-Patent N-terminale modifizierte G-CSF Moleküle, die chemisch angehängte Polymere tragen, einschließlich Polyethylenglykol.
Ein alternativer Ansatz, um die Stabilität von G-CSF in einer Zusammensetzung zu erhöhen, umfasst die Veränderung der Aminosäuresequenz des Proteins. Das US-Patent 5,416,195 von Camble et al. (das "'195-Patent") offenbart genetisch veränderte Analoga von G-CSF mit verbesserter Stabilität in einer Zusammensetzung, wobei der Cysteinrest, der normalerweise an Position 17 der reifen Polypeptidkette zu finden ist, der Aspartatrest, der sich an Position 27 befindet, und mindestens einer der Tandem-Prolinreste, die sich an Positionen 65 und 66 befinden, alle mit einem Serinrest ersetzt werden. Weiterhin offenbart das US-Patent 5,773,581 von Camble et al. (das "'581-Patent") die genetisch veränderten G-CSF-Analoga des '195-Patentes, die kovalent mit einem wasserlöslichen Polymer verknüpft wurden.
Andere Ansätze, um die Zusammensetzungsstabilität von G-CSF-Molekülen in einer Zusammensetzung zu verbessern, betrafen die Modifikation des Lösungsmittels, in dem G-CSF gelöst ist. US-Patent 5,104,651 von Boone et al. (das "'651-Patent") offenbart verbesserte Stabilität von G-CSF unter Bedingungen mit niedrigem pH und minimaler Ionenstärke. Das '651-Patent offenbart eine stabilisierte pharmazeutisch-annehmbare Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus einer pharmazeutisch-annehmbaren Menge G-CSF und Säure besteht, wobei die Zusammensetzung einen pH-Wert von 3,0 bis 3,7 und eine Leitfähigkeit von weniger als 1000 μmhos/cm besitzt. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist kein anderes Salz als Spurenreste, die von dem Reinigungsprozess herrühren, in der Zusammensetzung enthalten.
US-Patent 5,874,075 von Collins et al. (das "'075-Patent") offenbart stabile Zusammensetzungen von Proteinen, ein schließlich G-CSF, die ein Liposomen-Vesikel umfassen, das sich aus negativ geladenen Phospholipiden zusammensetzt, wobei nur ein Teil des Proteins in den Lipidteil des Vesikels eingelagert ist. Das '075-Patent offenbart auch Zusammensetzungen, die Liposomen-Vesikel umfassen, die mit G-CSF, das kovalent mit Polyethylenglykol verbunden wurde, kombiniert sind.
Eine stabile G-CSF-enthaltende Zusammensetzung ist in der GB 2193631 A (der "'631-Anmeldung") offenbart, welche mindestens eine Substanz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus einem pharmazeutisch-annehmbaren Oberflächen-aktiven Mittel, Saccharid, Protein und einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht ausgewählt ist. Geeignete Verbindungen mit hohem Molekulargewicht umfassen Hydroxypropylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Proteine, die für in den Zusammensetzungen der '631-Anmeldung nützlich gehalten werden, umfassen humanes Serumalbumin, humanes Serumglobulin, Gelatine, Säure-behandelte Gelatine und Alkali-behandelte Gelatine.
Das US-Patent 5,503,827 von Woog et al. (das "'827-Patent") offenbart pharmazeutische Präparationen von G-CSF, die mindestens ein bakterizides Schutzmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlorbutanol, Benzylalkohol, Benzalkoniumchlorid und Gemischen daraus umfassen. Pharmazeutische Präparationen des '827-Patents können auch Hilfssubstanzen umfassen, Beispiele dafür sind stabilisierende Mittel und organische hydrophile Polymere. Plötzliche Stabilisatoren, die vom '827-Patent offenbart werden, umfassen Oligosaccharide wie Saccharose, Lactose und Dextrane mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10.000 bis 2.000.000. Nützliche organische hydrophile Polymere umfassen Polyethylenglykol und Polyvinyl-pyrrolidon.
Das US-Patent 5,919,757 von Michaelis et al. (das "'757-Patent") offenbart wässrige pharmazeutische Präparationen von G-CSF, die bei der Lagerung stabil sind, welche einen Puffer umfassen, der aus der Gruppe bestehend aus Citrat, Maleat, einem Gemisch aus Citrat und Phosphat, Arginin und Arginin Salzen, ausgewählt ist, und mindestens ein Oberflächenaktives Mittel, wobei der pH-Wert der Zusammensetzung von ungefähr pH 7 bis pH 8 liegt. Das '757-Patent offenbart, dass besondere pH-Bereiche der flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung, in einem Gemisch mit einem besonderen Puffer, zu besonders stabilen Zusammensetzungen führen. Weiterhin offenbart das '757-Patent, dass es nicht vorteilhaft ist, Salze hinzuzufügen, da hohe Konzentrationen von Salzen oder Ionen die Bildung von G-CSF-Aggregaten fördern. Das '757-Patent offenbart auch, dass dementsprechend Pufferkonzentrationen so berechnet sind, dass die pH-stabilisierende Wirkung erreicht ist, aber die Ionenstärke so niedrig wie möglich gehalten wird, und zwar mit Pufferkonzentrationen bevorzugt im Bereich bis zu 80 mM und besonders bevorzugt weniger als 30 mM.
Das US-Patent 5,919,443 von Michaelis et al. (das "'443-Patent") offenbart lyophilisierte und wiedergelöste pharmazeutische Präparationen, die G-CSF, ein stabilisierendes Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Maltose, Cellubiose, Gentibiose, Isomaltose und Saccharose, und ein Oberflächen-aktives Mittel, das in einer Menge vorhanden ist, die nicht größer als die in der Zusammensetzung vorhandene G-CSF-Menge ist, enthalten. Die Präparationen des '443-Patents haben einen pH-Wert im Bereich von pH 7 bis pH 8, und sie sind frei von humanem Serumalbumin und Polymeren. Das '443-Patent offenbart auch, dass es angebracht sein kann, Hilfssubstanzen hinzuzufügen, welche hauptsächlich nicht ionisiert sind, um eine isotomische pharmazeutische Präparation bereit zu stellen. Das '443-Patent deutet weiterhin an, dass es nicht vor teilhaft ist, Salze hinzuzufügen, um die Isotonizität einzustellen, da hohe Konzentrationen von Salzen oder Ionen die Bildung von G-CSF-Aggregaten fördern und dementsprechend sind Salze in geringen Mengen hinzugefügt.
Die internationale PCT-Veröffentlichung WO 95/03034 (die "'034-Veröffentlichung") offenbart stabilisierte wässrige Zusammensetzungen von G-CSF, die als Aerosole zu verabreichen sind, die eine polare organische Verbindung, welche die Oberflächenspannung von Wasser auf nicht größer als ungefähr 65 Dyne/cm vermindert, oder ein Oberflächen-aktives Mittel, welches die Oberflächenspannung von Wasser auf nicht größer als ungefähr 40 Dyne/cm vermindern, umfassen. Die '034-Veröffentlichung offenbart bevorzugte polare organische Lösungsmittel, die Polyethylenglykol und Methylpentandiol umfassen, und ein bevorzugtes Oberflächen-aktives Mittel Tween 80. Zusammensetzungen, die in der '034-Veröffentlichung offenbart sind, können einen Puffer oder, ganz einfach, wässrige Chlorwasserstoffsäure, umfassen, so dass der pH so eingestellt ist, dass er in den Bereich von pH 2,5 bis pH 5,5 fällt.
Das US-Patent 5,554,150 von Bousseau et al. (das "'150-Patent") offenbart Zusammensetzungen, die zur subkutanen kontinuierlichen Verabreichung von G-CSF geeignet sind. Die G-CSF Zusammensetzungen des '150-Patents umfassen Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor, Serumalbumin, ein nicht-ionisches Oberflächen-aktives Mittel, ein Saccharid, Dinatriumphosphat, Mononatriumphosphat und Natriumchlorid.
Die kanadische Patentanmeldung 2,280,449 offenbart stabilisierte Proteinzusammensetzungen, die therapeutisch wirksame Mengen von G-CSF enthalten, wie z. B. bovines G-CSF, und zwar in Kombination mit einem stabilisierenden Puffer wie HEPES, TES oder TRICINE, zur Behandlung und Verhinderung von Infek tionen, einschließlich Mastitis, bei Vieh. Während die offenbarten Zusammensetzungen bevorzugt einen physiologischen pH-Wert besitzen, wird die Verwendung oder Zugabe von Sulfationen-Salzen nicht vorgeschlagen.
Die Faltung von Proteinen in Lösung wird durch die Anwesenheit von einem Salz oder mehreren Salzen beeinflusst, welche sowohl mit dem Protein als auch mit dem Lösungsmittel wechselwirken können. Ionische Komponenten von Salzen können direkt mit den geladenen Aminosäure-Seitenketten oder dipolaren Peptidbindungen des Proteins wechselwirken, und sie können auch die Struktur des Lösungsmittels beeinflussen, und dabei die Wechselwirkung zwischen dem gelösten Protein und dem Lösungsmittel beeinflussen. Die Natur dieser Wechselwirkungen wird durch das spezifische Protein, seine Konzentration, die Temperatur und den pH-Wert der Lösung, das besondere verwendete Salz und die Konzentration dieses Salzes beeinflusst. Diese Eigenschaften können zum Beispiel verwertet werden, um die selektive Präzipitation von Polypeptiden als Teil eines Proteinreinigungsprozesses zu ermöglichen. Hydrophobe Proteine, welche schon an sich weniger wasserlöslich sind, sind besonders empfänglich für Aggregation und Präzipitation in Gegenwart von Salzen, und daher, wie beispielhaft mit den '443-, '757- und '651-Patenten dargestellt, haben G-CSF-Zusammensetzungen des Standes der Technik ganz bewusst die Zugabe von Salz vermieden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf stabilisierte wässrige Zusammensetzungen von G-CSF gerichtet. Die Erfindung stellt unerwarteterweise stabile wässrige Zusammensetzungen zur Verfügung, die G-CSF, insbesondere nicht-glykolisiertes G-CSF, mit einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0, einen Puffer und ein Salz, das ein Sulfation umfasst, umfassen, wobei der Puffer mit ei ner Konzentration von 1 mM bis 100 mM vorliegt und das Salz mit einer Konzentration von 0,01 M bis weniger als 1,0 M vorliegt. Die Konzentration von G-CSF, insbesondere nicht-glykolysiertem G-CSF, ist bevorzugt mindestens ungefähr 0,01 mg/ml, bevorzugte Konzentrationen sind mindestens ungefähr 0,01 mg/ml G-CSF, bevorzugter mindestens ungefähr 1 mg/ml nicht-glykosyliertes G-CSF, und mindestens 0,1 M des Salzes, das Sulfationen umfasst. Ein bevorzugter pH-Wert für jede der hierin beschriebenen Zusammensetzungen ist ungefähr 6,0 bis ungefähr 7,5, bevorzugt 7,0.
In einer Ausführungsform von jeder der hierin beschriebenen Zusammensetzungen ist der Granulocytenkolonie-stimulierende Faktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus bovinem Granulocytenkolonie-stimulierendem Faktor, Hunde-Granulocytenkolonie-stimulierendem Faktor, Katzen-Granulocytenkolonie-stimulierendem Faktor und humanem Granulocytenkolonie-stimulierendem Faktor.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit bei einem Säugetier gerichtet, das es umfasst, einem Säugetier, das eine solche Behandlung benötigt, eine therapeutisch wirksame Dosis Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor in einer wässrigen Zusammensetzung zu verabreichen, die einen pH-Wert von 5,0 bis 8,0 besitzt, wobei die wässrige Zusammensetzung einen Puffer und ein Salz, das Sulfationen umfasst, umfasst, wobei der Puffer mit einer Konzentration von 1 mM bis 100 mM vorliegt und das Salz mit einer Konzentration von 0,01 M bis weniger als 1,0 M vorliegt. In anderen Ausführungsformen umfasst die wässrige Zusammensetzung jede der oben beschriebenen Zusammensetzungen. In einer Ausführungsform des Verfahrens ist das Säugetier ein hundeartiges Säugetier. In einer anderen Ausführungsform ist das Säugetier ein katzenartiges Säugetier. In einer anderen Ausführung des Verfahrens ist das Säugetier ein Mensch. Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit oder von Zuständen, die durch Stimulation der Hämatopoiese gemildert werden, gerichtet. In einer Ausführungsform wird das Verfahren verwendet, um die Auswirkungen von Knochenmark-subpressiver Therapie, wie bei Krebsbehandlungen, zu mildern. In einer Ausführungsform des Verfahrens ist die Erkrankung Granulocytopenie. In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens ist die Erkrankung eine infektiöse Erkrankung. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das Säugetier ein bovines Säugetier. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist die infektiöse Erkrankung Transportfieber bzw. Transport-Pasteurellose oder Bovina Mastitis, und das Säugetier ist ein bovines Säugetier. Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung einer wässrigen Zusammensetzung, wie sie hierin bereitgestellt wird, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung bei einem Säugetier, bevorzugt einem bovinen Säugetier oder einem Menschen, und zwar von einer Erkrankung wie Granulocytopenie oder einer infektiösen Erkrankung, wie hierin weiter beschrieben.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf einen Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor in einer wässrigen Zusammensetzung mit einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0 gerichtet, wobei die wässrige Zusammensetzung einen Puffer und ein Salz, das Sulfationen umfasst, umfasst, wobei der Puffer mit einer Konzentration von 1 mM bis 100 mM und das Salz mit einer Konzentration von 0,01 M bis weniger als 1,0 M vorliegen, zur Verwendung als Pharmazeutikum. Die vorliegende Erfindung kann vollständiger durch die Bezugnahme auf die detaillierte Beschreibung und die veranschaulichenden Beispiele verstanden werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf wässrige Zusammensetzungen gerichtet, die nicht-glykosilierten G-CSF umfassen, die ungefähr 0,01 M bis ungefähr 1,0 M eines Salzes umfassen, das Sulfationen umfasst, und die einen pH-Wert von ungefähr 5 bis ungefähr 8 besitzen. Solche wässrigen Zusammensetzungen zeigen unerwartet verbesserte Stabilität.
Wie hier verwendet bezieht sich "G-CSF" auf ein Protein, das die Sequenz eines natürlich vorkommenden Säuger-Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktors besitzt. Die Herstellung von rekombinantem nicht-glykosiliertem bG-CSF ist in dem US-Patent 5,849,883 beschrieben. Die Produktion von nicht-glykosiliertem humanem G-CSF ("hG-CSF") ist in dem US-Patent 4,810,643 beschrieben, und die Produktion von nicht-glykosiliertem Hunde-G-CSF ist in dem US-Patent 5,606,024 beschrieben. Das G-CSF anderer Säugetierspezies kann unter Verwendung der Verfahren, die in den oben genannten Patenten in Bezug auf bovines und Hunde-G-CSF ausgeführt sind, kloniert und exprimiert werden. Wie hier verwendet, umfasst G-CSF strukturelle Analoga dieses Proteins, die eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen aufweisen. Ebenso werden durch den Begriff G-CSF, wie hier verwendet, Teile oder Fragmente des reifen Proteins in Erwägung gezogen, welche mindestens eine der biologischen Aktivitäten des intakten Moleküls behalten, ob sie nun alleine oder als Teil eines chimeren Proteins verwendet werden, das wie auch immer konstruiert ist. Weiterhin umfasst G-CSF, wie es hier verwendet wird, Derivate ("Muteine") von G-CSF, wobei mindestens ein Rest mit einer anderen Aminosäure ersetzt wurde. Eingeschlossen sind Derivate, bei welchen mindestens eine der folgenden Aminosäuresubstitutionen vorgenommen wurde (die Aminosäurenummerierung wird in Bezug auf das reife Protein gegeben; daher wird einem N-terminalen Methionin, wenn es vorhanden ist, die Position –1 oder 0 handen ist, die Position –1 oder 0 zugeteilt): Cys¹⁷ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ser¹⁷-Rest, Asp²⁷ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ser²⁷-Rest, Leu¹⁵ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Glu¹⁵-Rest, Lys²³ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Arg²³-Rest, Gly²⁸ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ala²⁸-Rest, Lys⁴⁰ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Arg⁴⁰-Rest, Pro⁴⁴ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ala⁴⁴-Rest, Leu⁴⁹ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Lys⁴⁹-Rest, Gly⁵⁵ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ala⁵⁵-Rest, Cys⁶⁰ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ser⁶⁰-Rest, Pro¹¹¹ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Glu¹¹¹-Rest, Thr¹¹⁵ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ser¹¹⁵-Rest, und Tyr¹⁶⁵ der nativen Sequenz ersetzt durch einen Arg¹⁶⁵-Rest. Solche Derivate sind in dem US-Patent 5,416,195 beschrieben.
Geeignete Salze, die Sulfationen umfassen, welche bevorzugt anorganische Sulfatsalze sind, umfassen Sulfationen und mindestens ein geeignetes Kation, was aus der Gruppe bestehend aus Alkalimetallionen, Erdalkalimetallionen und Ammoniumionen ausgewählt sein kann. Bevorzugte Salze, die Sulfationen umfassen, sind aus der Gruppe bestehend aus Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat und Gemischen daraus ausgewählt. Das am meisten bevorzugte Salz, das Sulfationen umfasst, ist Ammoniumsulfat. Geeignete Konzentrationen in den wässrigen Zusammensetzungen für das Salz, das Sulfationen umfasst, reichen von ungefähr 0,01 M bis ungefähr 1,0 M, bevorzugt von ungefähr 0,025 M bis ungefähr 0,5 M, bevorzugter von ungefähr 0,05 M bis ungefähr 0,25 M, und insbesondere größer als 0,1 M aber weniger als ungefähr 1,0 M. Salze, die Sulfationen umfassen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen jene Salze, ob sie nun wasserfrei oder hydriert sind, die ausreichend wasserlöslich sind, wässrige Zusammensetzungen bereit zu stellen, die eine Konzentration von mindestens 0,1 M bei 20°C bei neutralem pH-Wert aufweisen.
G-CSF kann in den vorliegenden wässrigen Zusammensetzungen gelöst sein, um eine therapeutisch wirksame Dosis bereit zu stellen, wenn ein pharmazeutisch annehmbares Volumen an das Tier verabreicht wird. Die Konzentration von nicht-glykosiliertem G-CSF, insbesondere nicht-glykosiliertem G-CSF, in den vorliegenden Zusammensetzungen reicht geeigneterweise von ungefähr 0,01 mg/ml bis ungefähr 10 mg/ml, bevorzugt von ungefähr 0,1 mg/ml bis ungefähr 7,5 mg/ml, und bevorzugter von ungefähr 1 mg/ml bis ungefähr 5 mg/ml.
Geeignete pH-Werte für die erfindungsgemäßen wässrigen Zusammensetzungen reichen von ungefähr pH 5 bis ungefähr pH 8, und bevorzugt von ungefähr pH 6 bis ungefähr pH 7,5. Geeignete Puffermittel, die vorteilhaft verwendet werden, um den pH-Wert der vorliegenden wässrigen Zusammensetzungen aufrecht zu erhalten, umfassen Acetat, Citrat und Phosphat. Alternativ umfassen Puffermittel Puffer, die Sulfonatgruppierungen enthalten, wie HEPES, BES, TAPS, EPPS, TES, und Gemische daraus. Im Allgemeinen besitzt das ausgewählte Puffermittel einen pK_a innerhalb 1 pH-Einheit und bevorzugt innerhalb 0,5 pH-Einheiten, des pH-Wertes, der für die wässrige G-CSF-Zusammensetzung ausgewählt ist. In einigen Beispielen können Puffermittel mit einer Konzentration von bis zu ungefähr 1 M verwendet werden, obwohl die hierin verwendeten Puffermittel im Allgemeinen in den vorliegenden Zusammensetzungen mit einer Konzentration innerhalb des Bereichs von ungefähr 1 mM bis ungefähr 100 mM, bevorzugt von ungefähr 5 mM bis 50 mM, und insbesondere ungefähr 10 mM, verwendet werden. Das Herstellungsverfahren der vorliegenden wässrigen Zusammensetzungen ist nicht entscheidend. Zum Beispiel können wässrige Zusammensetzungen hergestellt werden, indem G-CSF, welches zum Beispiel als ein lyophilisiertes Pulver bereitgestellt wird, in Wasser gelöst wird gefolgt von der Zugabe von Aliquots konzentrierter Stammzusammensetzungen oder fester Reagenzien, der Einstellung des pH-Wertes, wie es notwendig ist, mit einer Säure oder Base, und der Zugabe von Wasser, um die wässrige Zusammensetzung auf ein geeignetes Endvolumen zu bringen. Alternativ dazu kann das G-CSF in einer zuvor vorbereiteten wässrigen Zusammensetzung gelöst werden, welche ein geeignetes Puffermittel und ein Salz, das Sulfationen umfasst, umfassen kann. Die vorliegenden wässrigen Zusammensetzungen können auch durch Zugabe von Aliquots konzentrierter Stammlösungen oder fester Reagenzien zu einer wässrigen Zusammensetzung aus G-CSF hergestellt werden, um eine stabilisierte G-CSF-Zusammensetzung bereit zu stellen. Andere Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen wässrigen Zusammensetzungen umfassen die Dialyse oder Ultrafiltration von G-CSF-Zusammensetzungen gegen eine wässrige Zusammensetzung, welche erfindungsgemäß ein oder mehrere Puffermittel und ein oder mehrere Salze, die Sulfationen umfassen, umfasst.
Die erfindungsgemäßen wässrigen Zusammensetzungen können auch andere pharmazeutisch annehmbare gelöste Substanzen einschließlich Additiven oder anderen therapeutischen Agenzien enthalten, je nachdem wie es geeignet ist. Geeignete Additive sind jene, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Antioxidantien, antibakterielle Mittel, Oberflächen-aktive Mittel, Chelatoren, Zucker und Konservierungsmittel.
Die vorliegenden wässrigen Zusammensetzungen können lyophilisiert werden und als Pulver oder Lyophilisate gelagert werden bis sie gebraucht werden und dann in einem wässrigen Medium zurückgelöst werden.
Die wässrigen Zusammensetzungen der Erfindung können durch Injektionen verabreicht werden, welche intramuskulär, intravenös oder bevorzugt subkutan sein kann. Eine Dosis von ungefähr 0,5 μg/kg/Tag bis 10 μg/kg/Tag, bevorzugt von ungefähr 1 μg/kg/Tag bis 5 μg/kg/Tag, kann verwendet werden, um Granulocytose und reverse Granulocytopenie zu indizieren. Im Allgemeinen sind die Dosis und die Art der Verabreichung der erfindungsgemäßen wässrigen Zusammensetzung dieselben wie bei konventionellen bG-CSF-Zusammensetzungen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Beispiele
In jedem der folgenden Beispiele wurde lyophilisiertes, von Grenzflächen-aktiven Mitteln freies bG-CSF in Wasser oder in einer wässrigen Zusammensetzung, die ein Puffermittel und ein Salz enthielt, wie angegeben, gelöst. Der bovine Granulocytenkolonie-stimulierende Faktor, der in jedem Beispiel verwendet wurde, wurde in einem rekombinanten DNA-Prozess unter Verwendung eines E. coli Expressionssystems hergestellt, und unter Verwendung von Standardmaterialien und -verfahren gereinigt. Wo sie verwendet wurden lagen Phosphat- und Citrat-Puffer in der Natriumform vor.
Die Proteinstabilität wurde nach der Inkubation von Proben der zu testenden wässrigen Zusammensetzung von bG-CSF bei 40°C ermittelt. Am Ende der angegebenen Zeitspanne wurden Aliquots der Proben abgenommen, fünffach mit MilliQ^®-Wasser auf eine Konzentration von 0,10 mg/ml verdünnt und durch einen 0,22 μm Membranfilter filtriert, wobei, wie die Anmelder glauben, unlösliche aggregierte Formen von bG-CSF entfernt wurden, bevor in Reversphasen-HPLC-Säulen injiziert wurde. Gefilterte Aliquots der Proben wurden mittels Reversphasen-HLPC wie folgt analysiert: 100 μl-Proben wurden auf eine Phenomenex Jupiter^® C₄-Reversphasensäule (5 μm, 4,6 × 250 mm) injiziert, mit einem Gradienten der mobilen Phase von 70% A: 30% B bis 30% A: 70% B betrieben, mit einer Fließgeschwin digkeit von 1 ml/Min. betrieben, wobei A gleich 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser und B gleich 0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril ist. Die Proben wurden durch UV-Absorption bei 220 nm überwacht und die Quantifizierung relativ zu G-CSF-Standards, die mit Konzentrationen von 0,05 bis 0,15 mg/ml formuliert waren, festgelegt.
Die Proben wurden auch mittels dynamischer differenzieller Kalorimetrie ("Differential Scanning Calorimetry", "DSC") unter Verwendung eines MicroCal VP-DSC-Mikrokalorimeters analysiert. Die Proben wurden mittels DSC zwischen der Starttemperatur 20°C und 90°C unter Verwendung einer Frequenz von 60°C/Std. untersucht. Der Thermostat für nach der Untersuchung wurde auf 25°C gesetzt, welche über eine Zeitspanne von 15 Min. beibehalten wurde. Die Proben wurden mit einer Temperatur von 20°C bis 25°C eingefüllt, wobei der Thermostat vor der Untersuchung auf 20°C eingestellt war, was über eine Dauer von 5 Minuten aufrecht erhalten wurde. Die Filterzeit betrug 16 Sekunden, der Feedback-Modus war auf "niedrig" eingestellt und einzelne Untersuchungen wurden für jede untersuchte Probe durchgeführt.
Beispiel 1
Ein wesentlicher Verlust von bG-CSF wurde beobachtet, wenn dieses Protein in ungepuffertem Wasser gelöst wurde und bei einer Temperatur von 40°C inkubiert wurde. Die Stabilität wurde signifikant erhöht, wenn die wässrige Zusammensetzung auf einen niedrigen pH-Wert gepuffert war, zum Beispiel auf pH 4 unter Verwendung von 10 mM Natriumcitrat als Puffermittel. Im Gegensatz dazu war bG-CSF merklich instabil wenn es in einem wässrigen Medium bei einem neutralen pH-Wert unter Verwendung von z. B. 10 mM Natriumphosphat als Puffermittel bei pH 7 formuliert war. Unerwarteterweise wurde entdeckt, dass eine wässrige Zusammensetzung von bG-CSF, die einen 10 mM Natriumphosphat-Puffer bei pH 7 enthielt, bemerkenswert stabil war, wenn dieser mit 0,1 M Ammoniumsulfat versetzt war, wie in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 zeigt die Wirkung von Salzen auf die Stabilität von bG-CSF in den angegebenen wässrigen Zusammensetzungen, die Ergebnisse in Reihe 1 bis 3 und 5 bis 9 sind Vergleichsbeispiele. Die Daten sind als prozentualer Anteil der anfänglichen Konzentration von bG-CSF (0,5 mg/ml bG-CSF) angegeben, die als Funktion der Zeit bei 40°C übrig bleiben. Die angegebenen Werte sind im Allgemeinen ein Durchschnitt von mindestens 2 Bestimmungen.
Tabelle 1
Die Ergebnisse zeigen, dass die Stabilität von bG-CSF bei pH 7,0 in 0,1 M (NH₄)₂SO₄ unerwarteterweise mit der Stabilität von bG-CSF in einem Citratpuffer bei pH 4,0 vergleichbar ist.
Beispiel 2
Dynamische differenzielle Kalorimetrie ("Differential Scanning Calorimetry", "DSC") erlaubt die Detektion konformationeller Veränderungen (z. B. Entfalten, Sekundärstrukturkonversion, oder intramolekuläre Bindung) in dem Protein, in dem die Veränderung der Hitzekapazität der Probe als Funktion der Temperatur gemessen wird. Dies stellt Informationen nicht nur über die strukturellen Veränderungen zur Verfügung, die als Funktion der Temperatur unter verschiedenen Bedingungen durchgemacht werden, sondern auch über die relative thermale Stabilität des Proteins als Funktion der Formulierungsbedingungen, und zwar durch einen Vergleich der Entfaltungstemperaturen. Dementsprechend kann daher die thermale Proteinstabilität in einer bestimmten Zusammensetzung untersucht werden, indem die T_m des Proteins unter jenen Bedingungen bestimmt wird. Wenn eine Proteinzusammensetzung allmählich erhitzt wird, verändert sich die Hitzekapazität, da das gelöste Polypeptid sich entfaltet. Diese Veränderung in der Hitzekapazität, aufgetragen als Funktion der Temperatur, führt zu einer Kurve, und die Temperatur, bei der halbmaximaler Anstieg der ultravioletten Absorption beobachtet wird, wird T_m genannt. Dementsprechend ist der Wert der beobachteten T_m eine Reflexion der thermalen Stabilität des Proteins, wie es in der Zusammensetzung formuliert ist. Wie in Tabelle 2 gezeigt war der T_m von bG-CSF 4,8°C höher, wenn es in einem Natriumcitratpuffer bei pH 4 gelöst war als wenn es in ungepuffertem Wasser gelöst war. Wie unten in Tabelle 2 gezeigt, wurde ein vergleichbarer Anstieg in der T_m beobachtet für eine wässrige Zusammensetzung, die bG-CSF, 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7 und 0,1 M Ammoniumsulfat umfasste.
Tabelle 2 zeigt die Wirkung unterschiedlicher Salze auf die thermale Stabilität von bG-CSF in den angegebenen wässrigen Zusammensetzungen, wobei die Ergebnisse in den Reihen 2 bis 8 Vergleichsbeispiele sind. Die Daten sind als Denaturierungstemperatur des in jeder Zusammensetzung gelösten Proteins angegeben (je höher die T_m, um so größer der Grad der Stabilisierung). Die wässrigen Zusammensetzungen wurden mit 0,5 mg/ml bG-CSF formuliert.
Tabelle 2
Die Ergebnisse bestätigen, dass die Stabilität von G-CSF bei pH 7 in 0,1 M (NH₄)₂SO₄ vergleichbar mit der Stabilität von G-CSF bei pH 4,0 in Citratpuffer ist.
Beispiel 3
Die Daten in Tabelle 3 zeigen die stabilisierende Wirkung von Salzen, die Sulfationen umfassen, auf bG-CSF-Zusammensetzungen als Funktion des pH-Wertes.
Tabelle 3 zeigt die Wirkungen des pH-Wertes auf die Stabilität von bG-CSF in Anwesenheit und Abwesenheit von Ammoniumsulfat (100 mM) und Natriumbromid (100 mM), wobei die Ergebnisse in den Reihen 1 bis 4 und 7 Vergleichsbeispiele sind. Das Puffermittel, das in jeder wässrigen Zusammensetzung verwendet wurde, war 10 mM Natriumcitrat. Aliquots von jeder Probe wurden mittels RP-HPLC untersucht, wobei die Daten als anfänglicher Konzentration von bG-CSF als Funktion der Zeit bei 40°C angegeben sind. Die wässrigen Zusammensetzungen waren mit 0,5 mg/ml bG-CSF formuliert.
Tabelle 3
Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Wirkung von 100 mM NH₄SO₄ auf die Stabilität von bG-CSF in Lösung zunimmt, wenn der pH-Wert angehoben wird.

Claims

Wässrige Zusammensetzung mit einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0, umfassend Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor, einen Puffer und ein Salz, das Sulfationen umfasst, wobei der Puffer mit einer Konzentration von 1 mM bis 100 mM vorliegt und das Salz mit einer Konzentration von 0,01 M bis weniger als 1,0 M vorliegt.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Granulocytenkolonie-stimulierende Faktor ein nicht-glykosilierter Granulocytenkolonie-stimulierender Faktor ist.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Puffer ein Sulfonatpuffer, ein Phosphatpuffer, ein Citratpuffer, ein Acetatpuffer und Gemische daraus ist.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der Sulfonatpuffer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HEPES, BES, TAPS, EPPS und Gemischen daraus.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der pH-Wert von 6,0 bis 7,5 reicht.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der pH-Wert ungefähr 7,0 ist.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Puffer mit einer Konzentration von 5 mM bis 50 mM vorliegt.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Salz, das Sulfationen umfasst, mit einer Konzentration von 0,025 M bis 0,5 M vorliegt.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Salz, das Sulfationen umfasst, mit einer Konzentration von 0,05 M bis 0,25 M vorliegt.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat und Gemischen daraus.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Salz Ammoniumsulfat ist.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktors mindestens 0,01 mg/ml ist.
Wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Konzentration des Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktors mindestens 1 mg/ml ist.
Lyophilisat oder Pulver, das aus der wässrigen Zusammensetzung nach Anspruch 1 hergestellt wurde.
Wässrige Zusammensetzung, die Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor umfasst, mit einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0, wobei die wässrige Zusammensetzung einen Puffer und ein Salz, das Sulfationen umfasst, umfasst, wobei der Puffer mit einer Konzentration von 1 mM bis 100 mM vorliegt und das Salz mit einer Konzentration von 0,01 M bis weniger als 1,0 M vorliegt, zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung einer wässrigen Zusammensetzung, die Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor umfasst, mit einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0, wobei die wässrige Zusammensetzung einen Puffer und ein Salz, das Sulfationen umfasst, umfasst, wobei der Puffer mit einer Konzentration von 1 mM bis 100 mM vorliegt und das Salz mit einer Konzentration von 0,01 M bis weniger als 1,0 M vorliegt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Granulocytopenie.
Verwendung einer wässrigen Zusammensetzung, die Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor umfasst, mit einem pH von 5,0 bis 8,0, wobei die wässrige Zusammensetzung einen Puffer und ein Salz, das Sulfationen umfasst, umfasst, wobei der Puffer mit einer Konzentration von 1 mM bis 100 mM vorliegt und das Salz mit einer Konzentration von 0,01 M bis weniger als 1,0 M vorliegt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer infektiösen Krankheit bei einem Säugetier.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Säugetier ein bovines Säugetier und die infektiöse Erkrankung Transportfieber bzw. eine Transport-Pasteurellose oder bovine Mastitis ist.