CH671157A5 - Stabiles pharmazeutisches praeparat, enthaltend granulocytkolonie stimulierender faktor, und verfahren zur herstellung desselben. - Google Patents

Stabiles pharmazeutisches praeparat, enthaltend granulocytkolonie stimulierender faktor, und verfahren zur herstellung desselben. Download PDF

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CH671157A5
CH671157A5 CH2727/87A CH272787A CH671157A5 CH 671157 A5 CH671157 A5 CH 671157A5 CH 2727/87 A CH2727/87 A CH 2727/87A CH 272787 A CH272787 A CH 272787A CH 671157 A5 CH671157 A5 CH 671157A5
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Description

BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein stabiles pharmazeutisches Präparat, enthaltend einen Granulocytkolonie stimulierenden Faktor. Im speziellen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein stabilisiertes pharmazeutisches Präparat, enthaltend einen Granulocytkolonie stimulierenden Faktor, welcher geschützt ist gegenüber dem Verlust oder der Inaktivierung der aktiven Komponente (d.h. Granulocytkolonie stimulierender Faktor) bedingt durch die Adsorption an der Wand eines Behälters, in welchen das Präparat gegeben worden ist, oder bedingt durch die Assoziation, Polymerisation oder Oxidation der genannten Komponente.
Chemotherapie ist angewendet worden als ein Verfahren für die Behandlung einer Vielzahl von infektiösen Krankheiten, aber es ist kürzlich gefunden worden, dass Chemotherapie einige ernsthafte klinische Probleme verursacht, wie etwa die Erzeugung von arzneimittelresistenten Organismen, Veränderung der ursächlichen Organismen, und hohe Nebeneffekte. Um diese Probleme zu vermeiden, welche mit der Chemotherapie assoziiert sind, einschliesslich die Verwendung von therapeutischen Mitteln, wie etwa Antibiotika und Bakterizide, sind Anstrengungen unternommen worden, eine Substanz zu verwenden, welche die prophylaktischen Fähigkeiten des Wirtes gegenüber eines Infektion verursachenden Organismus aktiviert und dabei eine vollständige Lösung der oben erwähnten Probleme der Chemotherapie zur Verfügung stellt. Von der Vielzahl der prophylaktischen Fähigkeiten des Wirtes glaubt man, dass die phagocytisch bakterizide Wirkung von Leucocyten den stärksten Einfluss auf die anfängliche Periode von bakterieller Infektion verursacht, und es wurde daher angenommen, dass es wichtig ist, die Infektion schützenden Fähigkeiten des Wirtes zu begünstigen mittels Förderung des Wachstums von Neutrophilen und deren Differentiation im reifen Stadium. Der Granulocytkolonie stimulierender Faktor (G-CSF) ist eine der sehr brauchbaren Substanzen, welcher solche Wirkungen zeigt, und die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben vorgängig eine Patentanmeldung betreffend einem Infektion schützenden Mittel unter Verwendung von G-CFS eingereicht (Japanische Patentanmeldung Nr. 23 777/1985).
Wie weiter oben erwähnt, umfasst die Chemotherapie, wie sie gegenwärtig praktiziert wird, verschiedene unvermeidbare Probleme, und intensive Anstrengungen werden gemacht, um eine Arzneimittelsubstanz zu verwenden, wel5
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che fähig ist zur Aktivierung der prophylaktischen Funktionen des Wirtes oder der Person, welche infisziert worden ist.
Unnötig zu sagen, dass G-CSF selbst die Fähigkeit entfaltet, die prophylaktischen Funktionen des Wirtes zu aktivieren, und es ist auch gefunden worden, dass G-CSF grössere therapeutische Effekte bei klinischen Anwendungen zeigt, wenn er angewendet wird in Kombination mit einer Substanz, welche die prophylaktischen Fähigkeiten des Wirtes aktiviert.
G-CSF wird in einer sehr geringen Menge angewendet, und ein pharmazeutisches Präparat, enthaltend 0,1 —100 (ig (vorzugsweise 5 — 50 (ig) an G-CSF, wird normalerweise verabreicht bei einer Dosismenge von 1 — 7 mal pro Woche an eine erwachsene Person. Jedoch hat G-CSF eine Tendenz, an der Wand eines Behälters, wie etwa einer Ampulle für die Injektion oder eine Spritze, absorbiert zu werden. Wenn das Arzneimittel als eine Injektion in solch einer Form wie eine wässrige Lösung verwendet wird, wird sie daher an der Wand des Behälters, wie etwa eine Ampulle oder eine Spritze, adsorbiert. Dies resultiert daher entweder im Misslingen von G-CSF, seine Aktivität als ein pharmazeutisches Mittel voll zu entfalten, oder es macht die Inkorporation von G-CSF in einer mehr als notwendigen Menge nötig, wobei man dem möglichen Verlust, bedingt durch die Adsorption, Rechnung trägt.
Ferner ist G-CSF labil und stark empfindlich gegenüber Umweltfaktoren, wie etwa Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Sauerstoff und Ultraviolettstrahlen. Durch die Einwirkung von solchen Faktoren erfährt G-CSF physikalische oder chemische Veränderungen, wie etwa Assoziation, Polymerisation und Oxidation, und erleidet einen grossen Verlust an Aktivität. Diese Phänomene machen es schwierig, die vollständige Erfüllung eines therapeutischen Aktes mittels Verabfolgung einer sehr geringen Menge an G-CSF in einer sehr exakten Art sicherzustellen.
Es ist daher notwendig, ein stabiles pharmazeutisches Präparat von G-CSF zu entwickeln, welches vollständig geschützt ist gegenüber einem Abfall in der Aktivität seiner wirksamen Komponente. Dies ist das Hauptziel der vorliegenden Erfindung, welche ein stabiles pharmazeutisches Präparat von G-CSF zur Verfügung stellt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten intensive Studien durch, um die Stabilität eines G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates zu begünstigen, und sie fanden, dass dieses Ziel wirkungsvoll erreicht werden kann mittels der Hinzugabe eines pharmazeutisch annehmbaren Oberflächenmittels, Saccharides, Proteines oder hochmolekulargewichtigen Verbindung.
Demgemäss ist das stabile G-CSF enthaltende pharmazeutische Präparat der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass es sowohl G-CSF und wenigstens eine Substanz enthält, ausgewählt aus der Gruppe eines pharmazeutisch annehmbaren Oberflächenmittels, Saccharides, Proteins und hochmolekulargewichtigen Verbindung.
Der G-CSF, welcher im pharmazeutischen Präparat der vorliegenden Erfindung enthalten ist, kann erhalten werden 5 mittels irgend einem Verfahren, wie etwa jenen Verfahren, welche in den Beschreibungen der japanischen Patentanmeldungen Nrn. 153 273/1984,169 455/1985, 269 456/1985, 270 838/1985 und 270 839/1985 beschrieben sind. Zum Beispiel kann ein menschlicher G-CSF hergestellt werden ent-lo weder mittels Kultivierung eines Zellstammes (CNCM Hinterlegungs-Nummer 1-315 oder 1-483), gesammelt aus Tumorzellen von Patienten mit Mundhöhlenkrebs (oral cavity cancer) oder mittels Eingabe (expressing) einer rekombinierten DNA (welche hergestellt worden ist mittels Einwirkung i5 eines menschlichen G-CSF Chiffrierungsgenes [encoding gene]) in eine geeignete Wirtzelle (z.B. E. coli, C 127 Zelle oder Ovarienzellen eines chinesischen Hamsters).
Irgend ein menschlicher G-CSF. welcher in hohem Grad gereinigt worden ist, kann verwendet werden als G-CSF, um 20 im pharmazeutischen Präparat der vorliegenden Erfindung enthalten zu sein. Vorzugsweise sind die menschlichen G-CSFs solche, welche erhalten worden sind mittels Isolation aus dem auf der Oberfläche schwimmenden Teil der Kultur einer menschlichen G-CSF produzierenden Zelle, und ein 25 Polypeptid oder Glycoprotein, welches die menschliche G-CSF Aktivität hat, welches erhalten worden ist mittels Transformierung eines Wirtes mit einem rekombinierten Vector, welcher darin ein Gen inkorporiert hat, welches ein Polypeptid, das die menschliche G-CSF Aktivität hat, co-30 diert.
Zwei speziell bevorzugte Beispiele von menschlichen G-CSF werden im nachfolgenden gezeigt:
(1) Menschlicher G-CSF, welcher die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:
35 i) Molekulargewicht: etwa 19 000 ± 1000, gemessen mittels Elektrophorese mittels einem Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel;
ii) Isoelektrischer Punkt: mindestens einer der drei isoelektrischen Punkte habend: pl = 5.5 ± 0.1, pl = 5.8 ± 0.1,
40 undpl = 6.1 ± 0.1;
iii) Ultraviolettabsorption: eine maximale Absorption be 280 nm und eine minimale Absorption bei 250 nm habend;
iv) Aminosäuresequenz der 21 Reste von N-Enden: H2N — Thr—Pro — Leu — Gly—Pro—Ala—Ser—Ser—
45 Leu—Pro — Gin — Ser—Phe—Leu — Leu—Lys — Cys — Leu-Glu-Gin-Val-;
(2) Menschlicher G-CSF, enthaltend entweder ein Polypeptid, welches die menschliche Granulocytstimulierenden Faktor Aktivität hat, welches dargestellt wird durch die ge-
50 samte oder teilweise Aminosäuresequenz, die weiter unten gezeigt wird, oder ein Glycoprotein, welches sowohl das genannte Polypeptid als auch einen Zuckerketteteil hat:
(Met)n
Thr
Pro
Leu
Gly
Pro
Ala
Ser
Ser
Leu
Pro
Gin
Ser
Phe
Leu
Leu
Lys
Cys
Leu
Glu
Gin
Val
Arg
Lys
Ile
Gin
Gly
Asp
Gly
Ala
Ala
Leu
Gin
Glu
Lys
Leu
(Val
Ser
Glu)m
Cys
Ala
Thr
Tyr
Lys
Leu
Cys
His
Pro
Glu
Glu
Leu
Val
Leu
Leu
Gly
His
Ser
Leu
Gly
Ile
Pro
Trp
Ala
Pro
Leu
Ser
Ser
Cys
Pro
Ser
Gin
Ala
Leu
Gin
Leu
Ala
Gly
Cys
Leu
Ser
Gin
Leu
His
Ser
Gly
Leu
Phe
Leu
Tyr
Gin
Gly
Leu
Leu
Gin
Ala
Leu
Glu
Gly
Ile
Ser
Pro
Glu
Leu
Gly
Pro
Thr
Leu
Asp
Thr
Leu
Gin
Leu
Asp
Val
Ala
Asp
Phe
Ala
Thr
Thr
Ile
Trp
Gin
Gin
Met
Glu
Glu
Leu
Gly
Met
Ala
Pro
Ala
Leu
Gin
Pro
Thr
Gin
Gly
Ala
Met
Pro
Ala
Phe
Ala
Ser
Ala
Phe
Gin
Arg
Arg
Ala
Gly
Gly
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Val Glu Gin
Leu Val Pro
Val Ser
Ala Tyr
Ser Arg
His Val
Leu Leu
Gin Arg
Ser His
Phe Leu
Leu Ala
(worin m 0 oder 1 ist und n 0 oder 1 ist).
Für Details für das Verfahren zur Herstellung dieser beiden Arten von G-CSF beachte man die Beschreibungen der Japanischen Patentanmeldungen Nrn. 153 273/1984, 269 455/1985, 269 456/1985, 270 838/1985 und 270 839/1985, welche alle durch die Anmelder der vorliegenden Erfindung eingereicht worden sind.
Ein weiteres Verfahren, welches verwendet werden kann, besteht in der Bewerkstellung der Fusion einer G-CSF produzierenden Zelle mit einer selbstwuchernden bösartigen Tumorzelle, und der Kultivierung des resultierenden Hybridomas in der Gegenwart oder Abwesenheit von Mytogen.
Die erhaltene Lösung, welche menschliches G-CSF enthält, kann in einem gefrorenen Stadium gelagert werden, nachdem sie weiter gereinigt und konzentriert worden ist, falls notwendig, und zwar mittels bekannten Techniken. Alternativ hierzu kann die Lösung gelagert werden, nachdem sie dehydratisiert worden ist, beispielsweise etwa mittels Gefriertrocknung.
Alle so hergestellten menschlichen G-CSFs können so verarbeitet werden, wie dies in der vorliegenden Erfindung angegeben ist, um stabile, G-CSF enthaltende pharmazeutische Präparate zu erhalten.
Typische Beispiele von Oberflächenmitteln, welche verwendet werden, um das stabile, G-CSF enthaltende pharmazeutische Präparat der vorliegenden Erfindung zu erhalten, werden im folgenden aufgelistet: Nichtionische Oberflächenmittel mit HLB von 6—18, wie etwa Sorbitan aliphatische Säureester (z.B. Sorbitan-monocaprylat, Sorbitan-monolau-rat und Sorbitan-monopalmitat), Glycerinaliphatische Säureester (z. B. Glycerin-monocaprylat, Glycerin-monomyri-stat und Glycerin-monostearat), Polyglycerinaliphatische Säureester (z.B. Decaglyceryl-monostearat, Decaglyceryldi-stearat und Decaglyceryl-monolinoleat), Polyoxyethylen sorbitanaliphatische Säureester (z.B. Polyoxyethylen-sorbi-tan-monolaurat, Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat, Poly-oxyethylen-sorbitan-monostearat, Polyoxyethylen-sorbitan-monopalmitat, Polyoxyethylen-sorbitan-trioleat und Poly-oxyethylen-sorbitan-tristearat), Polyoxyethylen-sorbitolali-phatische Säureester (z. .B. Polyoxyethylen-sorbitol-tetra-stearat und Polyoxyethylen-sorbitol-tetraoleat), Polyethy-len-glycerinaliphatische Säureester (z.B. Polyoxyethylen-glyceryl-monostearat), Polyethylen-glycolaliphatische Säureester (z.B. Polyethylen-glycol-distearat), Polyoxyethylen-alkylether (z.B. Polyoxyethylen-lauryl-ether), Polyoxyethy-len-polyoxypropylen-alkyl-ether (z.B. Polyoxyethylen-polyoxypropylen-glycol-ether, Polyoxyethylen-polyoxypro-pylen-propyl-ether, und Polyoxyethylen-polyoxypropylen-cetylether), Polyoxyethylen-alkylphenylether (z.B. Polyoxy-ethylen-nonylphenyl-ether), polyoxyethyliertes Rizinusöl (polyoxyethyliertes hydriertes Rizinusöl), polyoxyethylierte Bienenwachsderivate (z.B. polyoxyethylierter Sorbitolbie-nenwachs), polyoxyethylierte Lanolinderivate (z.B. Poly-oxyethylen-lanolin), und Polyoxyethylen-aliphatische Säure-amide (z. B. Polyethylen-stearinsäureamid); anionische Oberflächenmittel, wie etwa Alkylschwefelsäuresalze mit einer Cio—Ci8 Alkylgruppe (z.B. Natriumcetylsulfat; Natri-umlaurylsulfat und Natriumoleylsulfat), Polyoxyethylenal-kylether-Schwefelsäuresalze, worin die durchschnittliche molare Zahl an Ethylenoxidaddition 2—4 ist und die Alkylgruppe 10—18 Kohlenstoffatome hat, (z.B. Polyoxyethylen-Natrium-Laurylsulfat), Salze von Alkylsulfosuccinatestern, worin die Alkylgruppe 8 — 18 Kohlenstoffatome hat (z. B. Natriumlaurylsulfosuccinatester); und natürliche Oberflä-
5 chenmittel, wie etwa Lecithin, Glyerophospholipid, Sphin-gophospholipid (z.,B. Sphingomyelin), und Sucrose-alipha-tische Säureester, worin die aliphatische Säure 12—18 Kohlenstoffatome hat. Diese Oberflächenmittel können natürlich entweder unabhängig voneinander oder im Gemisch io miteinander verwendet werden.
Die weiter oben aufgeführten Oberflächenmittel werden vorzugsweise in Mengen von 1 — 10 000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil an G-CSF verwendet.
Das Saccharid, welches verwendet wird bei der Herstel-i5 lung des stabilen, G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates der vorliegenden Erfindung kann ausgewählt sein aus Monosacchariden, Oligosacchariden und Polysacchariden, wie auch aus Phosphatestern und Nucleotidderivaten davon, solange diese pharmazeutisch annehmbar sind. Typi-20 sehe Beispiele werden weiter unten angegeben: trivalente und höhere Zuckeralkohole, wie etwa Glycerin, Erythritol, Ara-bitol, Xylitol, Sorbitol, und Mannitol; saure Zucker, wie etwa Glucuronsäure, Iduronsäure, Neuraminsäure, Galactu-ronsäure, Gluconsäure, Mannuronsäure, Ketoglycolsäure, 25 Ketogalactonsäure und Ketogulonsäure; Hyaluronsäure und Salze davon, Chondroitinsulfat und Salze davon, Heparin, Inulin, Chitin und Derivate davon, Chitosan und Derivate davon, Dextrin, Dextran mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 5000—150 000, und Alginsäure und Sal-30 ze davon. Alle diese Saccharide können mit Vorteil entweder unabhängig voneinander oder im Gemisch miteinander verwendet werden.
Die weiter oben aufgeführten Saccharide werden vorzugsweise in Mengen von 1 — 10 000 Gew.-Teilen pro Gew.-35 Teil an G-CSF verwendet.
Typische Beispiele von Proteinen, welche verwendet werden bei der Herstellung des stabilen, G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates der vorliegenden Erfindung umfassen menschliches Serumalbumin, menschliches Se-40 rumglobulin, Gelatin, Säure-behandeltes Gelatin (durchschnittliches Molekulargewicht = 7000—100 100), Alkalibehandeltes Gelatin (durchschnittliches Molekulargewicht = 7000—100 000), und Collagen. Unnötig zu sagen, dass diese Proteine entweder unabhängig voneinander oder im 45 Gemisch miteinander verwendet werden können.
Die weiter oben angegebenen Proteine werden vorzugsweise in Mengen von 1 —20 000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil an G-CSF verwendet.
Typische Beispiele der hoch-molekulargewichtigen Verso bindung, welche verwendet wird bei der Herstellung des stabilen, G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates der vorliegenden Erfindung, umfassen: Natürliche Polymere, wie etwa Hydroxypropylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, und Hydroxyethylcellulo-55 se; und synthetische Polymere, wie etwa Polyethylenglycol (Molekulargewicht = 300—6000), Polyvinylalkohol (Molekulargewicht = 20 000 — 100 000), und Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht = 20 000—100 000). Unnötig zu sagen, dass diese höher-molekulargewichtigen Verbindungen ent-60 weder alleine oder in Kombination verwendet werden können.
Die hochmolekulargewichtigen Verbindungen, welche weiter oben angegeben worden sind, werden vorzugsweise in Mengen von 1 —20 000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil an G-65 CSF verwendet.
Zusätzlich zum Oberflächenmittel, dem Saccharid, dem Protein oder der höher-molekulargewichtigen Verbindung, welche alle weiter oben beschrieben worden sind, kann noch
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wenigstens ein Bestandteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Aminosäure, einem Schwefel-reduzieren-den Mittel und einem Antioxidationsmittel, bei der Herstellung des G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates der vorliegenden Erfindung inkorporiert werden. Illustrative Aminosäuren umfassen Glycin, Threonin, Tryptophan, Lysin, Hydroxylysin, Histidin, Arginin, Cystein, Cystin, und Methionin. Illustrative Schwefel-reduzierende Mittel umfassen: N-Acetylcystein, N-acetylhomocystein, Thioctinsäure, Thiodiglycol, Thioethanolamin, Thioglycerol, Thiosorbitol, Thioglycolsäure und Salze davon, Natriumthiosulfat, Natriumhydrogensulfit, Natriumpyrosulfit, Natriumsulfit, Thio-milchsäure, Dithiothreitol, Glutathion, und ein mildes Schwefel-reduzierendes Mittel, welches eine Sulfhydrylgrup-pe hat, wie etwa eine Ci — Cz-Thioalkansäure. Illustrative Antioxidationsmittel umfassen Erythorbinsäure, Dibutylhy-droxytoluol, Butylhydroxyanisol, dl-a-Tocopherol, Toco-pherol-acetat, L-Ascorbinsäure und Salze davon. L-Ascor-binsäure-palmitat, L-Ascorbinsäure-stearat, Triamyl-gallat, Propyl-gallat und Chelierungsmittel, wie etwa Dinatrium-ethylendiamintetraacetat (EDTA), Natriumpyrophosphat und Natriummetaphosphat.
Die weiter oben angegebenen Aminosäuren, Schwefelreduzierenden Mittel und Antioxidationsmittel oder Gemische davon werden vorzugsweise in Mengen von 1 — 10 000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil an G-CSF verwendet.
Für den Zweck der Formulierung des stabilen, G-CSF enthaltenden Präparates der vorliegenden Erfindung in eine geeignete Dosierungsform kann eines oder mehrere der folgenden Bestandteile inkorporiert werden: Ein Verdünnungsmittel, eine Löslichkeitshilfe, ein isotonisches Mittel, ein Arzneimittelträger, ein pH-Wertmodifikator, ein schmerzlinderndes Mittel, und ein Buffer.
Das stabilisierte G-CSF pharmazeutische Präparat der vorliegenden Erfindung kann entweder für die orale Verabfolgung oder für die parenterale Verabfolgung formuliert sein, wie etwa durch Injektion, angewendet in verschiedenen Wegen, und eine Vielzahl von Verabfolgungsformen kann verwendet werden, und zwar in Abhängigkeit von der spezifischen Art der Verabfolgung. Typische Dosierungsformen umfassen: Jene, welche für die orale Verabfolgung bestimmt sind, wie etwa Tabletten, Pillen, Kapseln, Granulate und Suspensionen; Lösungen, Suspensionen und gefriergetrocknete Präparate, hauptsächlich bestimmt für intravenöse Injektion, intramuskuläre Injektion, subkutane Injektion und intrakutane Injektion; und jene, welche für die transmukosa-le Verabfolgung bestimmt sind, wie etwa rektale Supposito-rien, nasale Arzneimittel, und vaginale Suppositorien.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird wenigstens eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Oberflächenmittel, einem Saccharid, einem Protein oder einer hochmolekulargewichtigen Verbindung zu einem G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparat hinzugegeben, so dass dieses daran gehindert wird, an der Wand seines Behälters oder einer Spritze absorbiert zu werden, währenddem es gleichzeitig stabil über eine verlängerte Zeitspanne bleibt.
Der detaillierte Mechanismus, mit welchem die weiter oben erwähnten Substanzen den G-CSF stabilisieren oder ihn daran hindern, absorbiert zu werden, muss noch geklärt werden. In der Gegenwart eines Oberflächenmittels würde die Oberfläche vom G-CSF, welcher ein hydrophobes Protein ist, mit dem Oberflächenmittel bedeckt, um solubilisiert zu werden, so dass der G-CSF, welcher in einer Spurenmenge vorhanden ist, wirksam daran gehindert wird, an der Wand seines Behälters oder einer Spritze absorbiert zu werden. Ein Saccharid oder eine hydrophile hoch-molekularge-wichtige Verbindung würde eine hydratisierte Schicht zwischen G-CSF und der adsorptiven Oberfläche der Wand des Behälters oder einer Spritze bilden, wobei die Adsorption von G-CSF in einer wirksamen Art verhindert wird. Ein Protein würde mit dem G-CSF bezüglich der Adsoption an der Wand seines Behälters oder einer Spritze konkurrieren, wobei die Adsorption von G-CSF wirksam verhindert wird.
Neben der Verhinderung der G-CSF Adsorption tragen die oben erwähnten Substanzen auch zur Verhinderung der Assoziation oder Polymerisation der G-CSF Moleküle bei. In der Gegenwart eines Oberflächenmittels, Saccharides, Proteines oder hoch-molekulargewichtigen Verbindung werden die einzelnen Moleküle von G-CSF in diesen Substanzen dispergiert, und die Interaktion zwischen den G-CSF-Mole-külen wird genügend reduziert, um eine signifikante Abnahme der Wahrscheinlichkeit ihrer Assoziation oder Polymerisation zu bewirken. Zusätzlich verzögern diese Substanzen die Autoxidation von G-CSF, welche bei hohen Temperaturen oder Luftfeuchtigkeit beschleunigt wird, oder sie hindern G-CSF daran, assoziiert oder polymerisiert zu werden, als ein Resultat der Autoxidation. Diese Effekte der Verzögerung der Autoxidation von G-CSF oder der Verhinderung der Assoziation oder Polymerisation werden weiter begünstigt durch die Hinzugabe einer Aminosäure, eines Schwefelreduzierenden Mittels oder eines Antioxidationsmittels.
Die weiter oben beschriebenen Probleme treten speziell in Lösungen für Injektionen und in Suspensionen auf, aber sie treten auch während des Verfahrens der Formulierung von G-CSF in anderen Dosierungsformen, wie etwa Tabletten, auf. Die Hinzugabe von Oberflächenmitteln, Sacchari-den, Proteinen oder hoch-molekulargewichtigen Verbindungen ist auch in diesem letzteren Fall wirksam.
Durch die Hinzugabe wenigstens einer Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Oberflächenmittel, Saccharid, Protein und einer hoch-molekulargewichtigen Verbindung, wird G-CSF stark stabilisiert und behält seine Aktivität für eine verlängerte Zeitspanne, wie dies in den folgenden Beispielen gezeigt wird. Zur Erzielung dieser Resultate ist die Menge von jeder dieser Substanzen, im speziellen deren untere Grenze, kritisch, und die folgenden Bereiche sind wünschbar: 1 — 10 000 Gew.-Teile an Oberflächemnittel, 1 — 10 000 Gew.-Teile an Saccharid, 1 — 20 000 Gew.-Teile an Protein, und 1—20 000 Gew.-Teile an hoch-molekulargewichtiger Verbindung, pro 1 Gew.-Teil an G-CSF.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein Oberflächenmittel, ein Saccharid, ein Protein und/oder eine hochmolekulargewichtige Verbindung in einer spezifizierten Konzentration verwendet, und dies ist nicht nur wirksam bei der Verhinderung von G-CSF, an der Wand seines Behälters oder einer Spritze absorbiert zu werden, sondern auch bei der Begünstigung der Stabilität eines G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparates. Als ein Resultat davon wird es möglich, die Verabfolgung einer kleinen aber hochpräzisen Dosis an G-CSF an Patienten sicherzustellen. Weil G-CSF teuer ist, führt seine effiziente Verwendung zu niedrigen Kosten bei der Herstellung von G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparaten.
Die folgenden Beispiele dienen dem Zwecke der weiteren Illustration der vorliegenden Erfindung, und sie sollen in keinem Sinn als begrenzend betrachtet werden. In diesen Beispielen wurde die übrigbleibende Aktivität an G-CSF bestimmt mittels einem der folgenden Verfahren.
(a) Weiche Agar-Methode unter Verwendung von Mäuseknochenmarkzellen:
Ein Pferdeserum (0,4 ml), 0,1 ml der Probe, 0,1 ml einer C3H/He (weiblichen) Mäuseknochenmarkzellensuspension (0,5 — 1 x 105 nukleare Zellen), und 0,4 ml einer modifizierten McCoy's 5A Kulturlösung, enthaltend 0,75% an Agar,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
671157
6
wurden miteinander vermischt, in ein Kunststoffgefäss für Gewebekulturen (35 mm0), geleert, coaguliert, und während 5 Tagen bei einer Temperatur von 37 °C in 5% C02/95% Luft und einer 100%igen Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die Anzahl an gebildeten Kolonien wurde gezählt (eine Kolonie bestand aus wenigstens 50 Zellen), und die Aktivität wurde bestimmt mit einer Einheit, welche die Aktivität ist für die Bildung einer Kolonie.
Die modifizierte McCoy's 5A Kulturlösung, welche in der Methode (a) verwendet wurde, wurde durch die folgenden Verfahren hergestellt.
Modifizierte McCoy's 5A Kulturlösung (doppelte Konzentration)
12 g an McCoy's 5a Kulturlösung (Gibco), 2,55 g an MEM Ammosäure-Vitaminmedium (Nissui Seiyaku Co., Ltd.), 2,18 g an Natriumbicarbonat und 50 000 Einheiten an Kalium-Penicillin G wurden zweimal in 500 ml destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wurde aseptisch durch einen Milliporefilter (0,22 um) filtriert.
(b) «Reverse-phase» HPLC (high-performance liquid chromatography:
Unter Verwendung einer «reverse-phase» C8 Säule (4,6 mm x 300 mm; 5 (xm) und einem n-Propanol/Trifhiores-sigsäure-Gemisch als mobile Phase wurde die übrigbleibende Aktivität von G-SCF (injiziert in einer Menge équivalent zu 1 ng) bestimmt unter den folgenden Gradientbedingungen.
Zeit (Sek.)
0 15 25
Lösungsmittel Lösungsmittel Gradient (A) (B)
100% 0% 100%
0% 100% 0%
) linear | linear
Lösungsmittel (A): 30% n-Propanol und 0,1% Trifhioressig-säure
Lösungsmittel (B): 60% n-Propanol und 0,1% Trifluoressig-
saure
Der Nachweis wurde ausgeführt bei einer Wellenlänge von 210 nm, und der prozentmässige Anteil der übrigbleibenden G-CSF Aktivität wurde mittels der folgenden Formel berechnet:
Übrigbleibende G-CSF Aktivität (0/
übrigbleibende Menge an G-CSF nach dem Ablauf einer gegebenen Zeit anfängliche Menge an G-CSF
x 100
Die übrigbleibende Menge an G-CSF, bestimmt mittels diesem Verfahren, korrelierte sehr gut mit dem Resultat, io welches erhalten wurde bei der Messung mit der weichen Agarmethode (a) unter Verwendung von Mäuseknochen-markzellen.
Beispiel 1
15 Zu 5 p.g an G-CSF wurde eines der Stabilisierungsmittel, welche in Tabelle 1 aufgelistet sind, hinzugegeben, und das Gemisch wurde aseptisch gelöst in einer 20 mM Bufferlösung (enthaltend 100 mM Natriumchlorid; pH 7,4), um ein pharmazeutisches Präparat herzustellen, enthaltend 5 \xg G-20 CSF pro ml, welches anschliessend gefriergetrocknet wurde. Die zeitabhängige Veränderung der G-CSF Aktivität wurde mittels der Methode (a) gemessen, und die Resultate werden in der Tabelle 1 gezeigt. Der Ausdruck «Aktivität (%)» in der Tabelle stellt die übrigbleibende Aktivität an G-CSF dar, 25 relativ zur anfänglichen Einheit, und wird definiert durch die folgende Formel:
Aktivität (%) =
30
Aktivitäteinheit nach dem Ablauf einer gegebenen Zeit anfängliche Aktivitätseinheit x 100
Die Gefriertrocknung wurde durch die folgenden Verfahren ausgeführt:
Die G-CSF-Lösung, enthaltend ein Stabilisierungsmittel, wurde in ein steriles, sulfa-behandelndes Glasfläschchen ge-35 geben, auf eine Temperatur von —40 °C oder darunter während 4 Stunden gefroren, dann einem ersten Trocknen mittels Erwärmung von —40 °C auf 0 °C während einer Zeitspanne von 48 Stunden unter einem Druck, welcher von 0,03 auf 0,1 Torr erhöht wurde, dann einem zweiten Trocknen 40 mittels Erwärmung von 0 °C auf 20 °C während einer Zeitspanne von 12 Stunden unter einem Druck, welcher von 0,03 auf 0,08 Torr erhöht wurde, unterworfen, wonach das Innere des Glasfläschchens mit einem sterilen trockenen Stickstoffgas gefüllt wurde, um einen atmosphärischen Druck zu 45 erhalten, und das Glasfläschchen wurde mit einem Gefriertrocknungsgummistopfen verschlossen und anschliessend mit einer Aluminiumkappe abgedichtet.
Tabelle 1
Stabilisierungsmittel Menge (Gew.- Aktivität (%)
Teile)
Nach Lagerung Nach Lagerung bei bei 4 °C während 37 CC während 6 Monaten 1 Monat
Xylitol Mannitol Glucuronsäure Hyaluronsäure
Dextran (Molekulargewicht 40 000)
Heparin
Chitosan
Alginsäure menschliches Serum-albumin menschliches Serum-globulin säurebehandeltes Gelatin alkali-behandeltes Gelatin Collagen
10,000
92
86
10,000
91
85
10,000
86
82
2,000
92
89
2,000
95
90
5,000
85
80
2,000
93
91
2,000
90
90
1,000
98
99
1,000
98
95
2,000
97
95
1,000
99
96
2,000
95
90
7
Tabelle 1 (Fortsetzung)
671157
Stabilisierungsmittel Menge (Gew.- Aktivität (%)
Teile)
Nach Lagerung Nach Lagerung bei bei 4 C während 37 C während 6 Monaten 1 Monat
Polyethylenglycol (Molekulargewicht 4 000) Hydroxypropyl-cellulose Natrium-carboxymethylcellulose Hydroxymethyl-cellulose Polyvinyl-alkohol (Molekulargewicht 50 000) Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht 50 000)
menschliches Serum-albumin
Mannitol
Cystein menschliches Serum-albumin
Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat
Mannitol menschliches Serum-albumin Hydroxypropyl-cellulose Dextran (Molekulargwicht 40 000) Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat Sorbitol
Polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl Dextran (Molekulargewicht 40 000)
nichts hinzugegeben
Beispiel 2
Zu 10 Hg an G-CSF wurde eines der Stabilisierungsmittel, welche in Tabelle 2 aufgelistet sind, hinzugegeben, und das Gemisch wurde aseptisch gelöst in einer 20 mM Phosphatbufferlösung (enthaltend 100 mM Natriumchlorid; pH 7,4), um ein pharmazeutisches Präparat herzustellen, enthaltend 10 (ig an G-CSF pro ml. Das Präparat wurde aseptisch
94 90
98 94
88 80
92 90
96 95
2,000 95 94
2,000
2,000 100 97
100 2,000
100 99 96
2,000 2,000
500 98 92
2,000 100
2,000 98 96
100
2,000 94 92
74 58
30 in ein sulfa-behandeltes Glasfläschchen gegeben und abgedichtet, um eine G-CSF-Lösung herzustellen. Die zeitabhängige Veränderung in der Aktivität an G-CSF in dieser Lösung wurde mittels dem gleichen Verfahren gemessen, wie in Beispiel 1 verwendet, und die Resultate sind in der Tabelle 2 35 angegeben.
10,000 1,000 1,000 5,000 2,000
Tabelle 2
Stabilisierungsmittel Menge (Gew.-
Teile)
Aktivität (%)
Nach Lagerung bei Nach Lagerung bei Nach Lagerung bei
4 =C während 4 :C während Raumtemperatur
7 Tagen 2 Monaten während 1 Monat
Mannitol
5,000
91
87
82
Hyaluronsäure
2,000 '
93
87
70
Dextran (Molekulargewicht 40 000)
2,000
96
95
85
Glycerin
10,000
90
90
88
Neuraminsäure
5,000
93
91
84
Chitin
2,000
95
92
86
Dextrin
2,00
90
92
87
menschliches Serum-albumin
1,000
99
95
92
menschliches Serum-globulin
1,000
98
94
90
säurebehandeltes Gelatin
2,000
97
96
87
alkalibehandeltes Gelatin
500
99
95
92
Collagen
2,000
99
94
88
Polyethylenglycol (Molekulargewicht 40 000)
10,000
94
89
90
Hydroxypropyl-cellulose
2,000
98
95
92
Natrium-carboxymethyl-cellulose
2,000
92
91
80
Hydroxyethyl-cellulose
4,000
92
94
90
Polyvinyl-alkohol (Molekulargewicht 50 000)
4,000
97
93
90
Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht 50 000)
4,000
95
95
92
Sorbitan-monolaurat
400
97
96
95
Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat
400
100
96
94
Polyoxyethylen-sorbitan-monostearat
400
98
97
94
Polyoxyethylen
Polyoxypropylen
400
100
94
93
Glycolether
671157
8
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Stabilisierungsmittel Menge (Gew.-
Teile)
Aktivität (%)
Nach Lagerung bei Nach Lagerung bei Nach Lagerung bei
4 C während 4 C während Raumtemperatur
7 Tagen 2 Monaten während 1 Monat
Polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl
400
99
98
90
Natrium-lauryl-sulfat
2,000
97
93
87
Lecithin
2,000
97
94
90
menschliches Serum-albumin
2,000
Mannitol
2,000
100
99
97
Cystein
100
menschliches Serum-albumin
2,000
Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat
100
99
97
95
Mannitol
2,000
menschliches Serum-albumin
1,000
Hydroxypropyl-cellulose
500
99
97
95
Dextran (Molekulargewicht 40 000)
2,000
Polyoxyethylen-sorbitan-monopalmitat
100
96
96
93
Sorbitol
2,000
Polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl
100
95
92
92
Dextran (Molekulargewicht 40 000)
2,000 -
nichts hinzugegeben
-
72
61
47
Beispiel 3
Zu 10 |ig G-CSF wurde eines der Stabilisierungsmittel, welche in Tabelle 3 aufgelistet sind, hinzugegeben, und das Gemisch wurde in einer 20 mM Phosphatbufferlösung (enthaltend 100 mM Natriumchlorid; pH 7,4) gelöst, um ein pharmazeutisches Präparat herzustellen, enthaltend 10 jag an G-CSF pro ml. Ein Milliliter des Präparates wurde in ein sulfa-behandeltes, Silikon-beschichtetes Glasfläschchen gegeben und bei einer Temperatur von 4 CC gelassen. Die Wirksamkeit von jenem Stabilisierungsmittel bei der Verhinderung der G-CSF Adsorption wurde evaluiert mittels Mes-30 sung der übrigbleibenden Aktivität an G-CSF in der Lösung nach 0,5, 2 und 24 Stunden. Die Messung wurde gemäss Methode (b) ausgeführt unter Verwendung von «reverse-phase» HPLC (high-performance liquid chromatography). Die Resultate sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Stabilisierungsmittel
Menge (Gew.-Teile)
Übrigbleibende Aktivität (%) anfänglich 0,5 h 2 h
24 h
Mannitol
5,000
100
93
90
91
Hyaluronsäure
2,000
100
97
92
92
Dextran (Molekulargewicht 40 000)
2,000
100
98
95
96
Glycerin
10,000
100
94
91
90
Heparin
2,000
100
92
90
90
Glucuronsäure
5,000
100
96
90
91
Ketoglycolsäure
5,000
100
92
88
90
menschliches Serum-albumin
1,000
100
100
101
99
menschliches Serum-globulin
1,000
100
98
100
98
alkali-behandeltes Gelatin
500
100
99
98
99
säurebehandeltes Gelatin
2,000
100
99
97
97
Collagen
2,000
100
100
98
99
Polyethylenglycol (Molekulargewicht 4 000)
10,000
100
100
100
99
Hydroxypropyl-cellulose
2,000
100
100
100
99
Natriumcarboxymethyl-cellulose
2,000
100
98
96
95
Hydroxyethyl-cellulose
4,000
100
96
93
92
Polyvinylalkohol (Molekulargewicht 50 000)
4,000
100
99
100
98
Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht
50 000)
4,000
100
98
98
96
Sorbitan-monocaprylat
400
100
100
100
98
Polyoxyethylen-sorbitan-monstearat
400
100
100
98
100
Polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl
400
100
99
101
99
Natriumlaurylsulfat
2,000
100
100
99
97
Lecithin
2,000
100
99
100
98
menschliches Serum-albumin
2,000
Mannitol
2,000
100
100
100
101
Cystein
100
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Stabilisierungsmittel
Menge (Gew.-
Übrigbleibende Aktivität (%)
Teile)
anfänglich
0,5 h
2h
24 h menschliches Serum-albumin
2,000
Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat
100
100
100
98
99
Mannitol
2,000
menschliches Serum-albumin
1,000
Hydroxypropyl-cellulose
500
100
101
99
100
Dextran (Molekulargewicht 40 000)
2,000
Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat
100
100
100
99
99
Sorbitol
2,000
Polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl
100
100
100
98
97
Dextran (Molekulargewicht 40 000)
2,000
nichts hinzugegeben
-
100
91
72
73
20
25
30
35
40
45
50
55

Claims (10)

  1. 671157
    2
    PATENTANSPRÜCHE
    1. Ein stabiles, Granulocytkolonie stimulierender Faktor enthaltendes pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich zum Granulocytkolonie stimulierenden Faktor, welcher als der effektive Bestandteil vorhanden ist, wenigstens eine Substanz enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem pharmazeutisch annehmbaren Oberflächemnittel, einem Saccharid, einem Protein und einer höher molekulargewichtigen Verbindung.
  2. 2. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es das Oberflächenmittel in einer Menge von 1 — 10 000 Gew.-Teile pro Gewichtsteil an Granulocytkolonie stimulierendem Faktor enthält.
  3. 3. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Oberflächenmit-tel wenigstens ein Bestandteil ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem nichtionischen Oberflächemnittel, einem anionischen Oberflächemnittel und einem natürlichen Oberflächenmittel, wobei das nichtionische Oberflächemnittel ein Sorbitan aliphatischer Säureester, ein glycerinaliphati-scher Säureester, ein polyglycerinaliphatischer Säureester, ein polyoxyethylensorbitanaliphatischer Säureester, ein polyoxyethylensorbitolaliphatischer Säureester, ein polyoxy-ethylenglycerinaliphatischer Säureester, ein polyethylengly-colaliphatischer Säureester, ein Polyoxyethylenalkylether, ein Polyoxyethylenpolyoxypropylenalkylether, ein Poly-oxyethyenalkylphenylether, ein polyoxyethyliertes, gehärtetes Rhizinusöl, ein polyoxyethyliertes Bienenwachsderivat, ein Polyoxyethylenlanolinderivat, oder ein polyoxyethylen-aliphatisches Säureamid ist, und wobei das anionische Oberflächenmittel ein Alkylsulfatsalz, ein Polyoxyethylenalkyl-ethersulfatsalz, oder ein Alkylsulfosuccinatestersalz ist, und wobei das natürliche Oberflächenmittel Lecithin, Glycero-phospholipid, Sphingophospholipid, oder ein sucrosealipha-tischer Säureester ist.
  4. 4. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es das Saccharid in einer Menge von
    1 — 10 000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil an Granulocytkolonie stimulierendem Faktor enthält.
  5. 5. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Saccharid wenigstens ein Bestandteil ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glycerin, Erythritol, Arabitol, Xylitol, Sorbitol, Mannitol, Glycuronsäure, Iduronsäure, Galacturonsäure, Neuramin-säure, Glyconsäure, Mannuronsäure, Ketoglycolsäure, Ke-togalactonsäure, Ketogulonsäure, Hyaluronsäure und Salze davon, Chondroitinsulfat und Salze davon, Heparin, Inulin, Chitin und Derivate davon, Chitosan und Derivate davon, Dextrin, Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5000—150 000, und Alginsäure Und Salze davon.
  6. 6. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es das Protein in einer Menge von 1—20 000 Gew.-Teilen pro Gewichtsteil an Granulocytkolonie stimulierendem Faktor enthält.
  7. 7. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Protein wenigstens ein Bestandteil ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus menschlichem Serumalbumin, menschlichem Serumglobulin, Gelatin, Säure- oder Alkali-behandeltem Gela-tin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 7000—100 00, und Collagen.
  8. 8. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die höher molekulargewichtige Verbindung in einer Menge von 1—20 000 Gew.-Teilen pro Gewichtsteil an Granulocytkolonie stimulierendem Faktor enthält.
  9. 9. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte höher molekulargewichtige Verbindung wenigstens ein Bestandteil ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxypropylcellu-lose, Hydroxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellu-lose, Hydroxyethylcellulose, Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 300 — 6000, Poly vinylalkohol mit einem Molekulargewicht von 20 000—100 000, und Polyvinyl-pyrrolidon mit einem Molekulargewicht von
    20 000-100 000.
  10. 10. Ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen, Granulocytkolonie stimulierenden Faktor enthaltenden pharmazeutisches Präparats nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Granulocytkolonie stimulierende Faktor mit wenigstens einer Substanz vermischt wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem pharmazeutisch annehmbaren Oberflächenmittel, einem Saccharid, einem Protein und einer höher molekulargewichtigen Verbindung.
CH2727/87A 1986-07-18 1987-07-16 Stabiles pharmazeutisches praeparat, enthaltend granulocytkolonie stimulierender faktor, und verfahren zur herstellung desselben. CH671157A5 (de)

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JP16948686 1986-07-18

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