JPH0618778B2

JPH0618778B2 - 白血球減少症治療剤

Info

Publication number: JPH0618778B2
Application number: JP61125660A
Authority: JP
Inventors: 政彦田村; 有宏服部; 仁野村; 雅義尾野
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1986-06-02
Publication date: 1994-03-16
Anticipated expiration: 2009-03-16
Also published as: NO863918D0; DK471386A; ES2055684T3; AU596997C; FI863971A; NO863918L; JPS62174026A; KR960000394B1; FI863971A0; HK65693A; AU6312186A; EP0217404A3; EP0217404B1; DK471386D0; ES2055684T5; EP0217404B2; AU596997B2; EP0217404A2; DE3683430D1; ATE71662T1

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下ヒトＧ−Ｃ
ＳＦと略記する）を有効成分とする白血球減少症治療剤
に関する。

〔従来の技術〕

２層軟寒天培養法で、上層に標的細胞として骨髄細胞
を、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養すると、上層
の細胞の一部が増殖分化し、好中球系顆粒球（以下「顆
粒球（ granulocyte）」と称す。）や単球マクロファー
ジからなるコロニーが形成されることから、生体内にコ
ロニー形成を促進する因子が存在することが知られてい
た(PluznikとSach；Ｊ．Cell．Comp．Physiol ．，66巻
319頁(1965)，Bradley とMetcalf ；Aust．Ｊ． Exp．
Biol． Med． Sci．，44巻287 頁(1966))。

ＣＳＦと総称されるこの因子は、正常に広く生体内分布
する細胞、たとえば、Ｔ細胞、単球マクロファージ、繊
維芽細胞、内皮細胞などより産生されることが知られて
いる。ＣＳＦには顆粒球・単球マクロファージの幹細胞
に作用して、その増殖を刺激し分化を誘導して、軟寒天
中で顆粒球や単球マクロファージから成るコロニーを形
成させる作用をもつ顆粒球−単球マクロファージＣＳＦ
（ＧＭ−ＣＳＦと略記する。）、主として単球マクロフ
ァーイのコロニーを形成させる作用をもつ単球マクロフ
ァージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦと略記する。）、より未分化
な多能性幹細胞に作用する多能性ＣＳＦ（ｍｕｌｔｉ−
ＣＳＦと略記する。）、あるいは本発明の如き、主とし
て顆粒球系コロニーを形成させる作用をもつ顆粒球ＣＳ
Ｆ（Ｇ−ＣＳＦと略記する。）などのサブクラスが存在
し、それぞれのサブクラスによって標的細胞の分化段階
も異なることが考えられる様になってきた［Asano ；代謝−Metabolism and Disease，22巻 249頁
（1985），Yunis 等；“Growth and Maturation Factor
s”，edited by Guroff，John Wiley ＆Sons，NY，１
巻， 209頁(1983)］。

ヒトＧ−ＣＳＦに関してはこれまでヒト正常組織由来の
ＣＳＦやヒト腫瘍細胞由来のＣＳＦについて合数報告さ
れている（例えば、Stanley 等Fed.Proc.35 2272(197
5),Burgess等Blood 49 573(1977),Shah 等Blood 50 811
(1977),Fojo等Biochem,17 3109(1978),Okabe 等Cancer
Res 38 3910(1978),Asano等Blood 49 845(1977),Golde
等Blood 57 1321(1981),Wu等J.Biol.Chem 254 6226(197
9),Dipersio等Blood 56 717(1980)などを参照）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながらこれ等のヒトＣＳＦは完全に純化されたも
のではなく従ってヒトＣＳＦの医薬としての有用性また
は有効性については未だ不明のままであった。

ところで、末梢白血病球数は正常成人では１mm³当り400
0〜9000個存在している（滝川等，臨床検査，12巻12号9
06 〜910 頁，1968年を参照）が、種々の原因で末梢白
血球数が4000個以下に低下していることがあり、通常こ
のような状態を白血球減少症と称している。

白血球減少症は各種白血球が一様に減少した場合もある
が通常はいずれか一種の白血球減少に基づいており、減
少を示す白血球の種類によって好中球減少症（neutrope
nia）、好酸球減少症（eosinopenia）、リンパ球減少症
（Iymphopenia）のごとく規定される場合もある。

しかしながら、臨床的には、白血球減少症の大半が好中
球減少に基づいている。

好中球の減少は、1)骨髄における好中球生成の低下、2)
末梢での消費・破壊の亢進の二つの機序によって起こ
り、それをもたらす多くの原因疾患ないし病態（原因不
明の本能性のもの、放射線照射、種々の血液疾患に随伴
して認められるもの等、詳細は、診断と治療70巻７号24
〜31頁，1982年を参照）が知られているが、好中球減少
の大部分は種々の薬剤の投与に原因して発生しており、
特に好中球絶対数が150／ｍｍ^３以下の、所謂、無顆粒
球症（agranulocytsis）（例えば、小峰光博：血液病
学、227 頁，849 頁，1981年を参照）を惹起する可能性
を持つ薬剤起因性の好中球減少は臨床的に重要な問題と
なっている。

好中球減少をもたらす薬剤としては、サイクロフォスフ
ァミド等のアルキル化剤、シトシンアラビノシド等の代
謝拮抗剤、ダウノルビシン等の抗癌性抗生物質などの如
き汎血球減少症（pancytopenia）をもたらすタイプや、
サルファ剤、アミノピリンその他の解熱鎮痛鎮静剤、抗
痙れん剤、クロラムフェニコールなどの抗生物質、抗甲
状腺剤等の如き、いわゆる薬物過敏症による好中球減少
をもたらすタイプがある（詳細は診断と治療70巻７号24
〜31頁，1982年を参照）。

一方、好中球を増加させる薬物としてはセファランチ
ン、アデニン剤、Ｌ−シスチン、パロチン、リボ核酸分
解物などがあるが、これ等の薬剤は、効果が十分でない
か、或いは高頻度の副作用の発現等で有効ではない。

又、増加回復してくる好中球は、本来の機能を備えてい
る程度に十分成熟した形態のものでなければ、例えば貧
食機能の如き、生体の正常な維持に必要な防禦性能が果
たせなくなる可能性がある。

従って十分成熟した形態を有する好中球の増加作用を有
し、さらには副作用は少ない薬物の登場が望まれてい
た。

〔問題点を解決するための手段〕

このような状況に於いて本出願人は口腔底癌患者の腫瘍
細胞から極めて高いヒトＧ−ＣＳＦ産性能を有し、かつ
良好な増殖能を示す細胞ＣＨＵ−１を樹立しこの細胞株
の培養上清からヒト好中球のコロニー形成促進活性を示
す純粋なヒトＧ−ＣＳＦの単離に初めて成功した（特願
昭59−153273号）。次いで本出願人は同じくヒト口腔底
癌由来の細胞株ＣＨＵ−２を樹立した（C.N.C.M.受託番
号Ｉ−483 ）。

さらに本出願人は、これらの細胞培養法よりも好濃度な
Ｇ−ＣＳＦが得られ、かつ複雑な精製過程を必要としな
い組換えＤＮＡ技術によるＧ−ＣＳＦの製造方法につい
て鋭意研究を重ねた結果、ついにこの技術によって大量
均一なヒトＧ−ＣＳＦの取得に成功した。（特願昭60−
269455号，特願昭60−269456号，特願昭60−270838号，
特願昭60−270839）これらの成果をふまえて、本発明者等は正常動物および
好中球減少状態の動物モデルに上記のヒトＧ−ＣＳＦを
投与したところ、正常動物に於いては有意な好中球増加
作用が、また好中球減少状態の動物モデルに於いては有
意な好中球減少阻止作用が認められ、更には増加した好
中球は十分に成熟した形態を有していたことからヒトＧ
−ＣＳＦが白血球減少症治療薬として有効であることを
見出し、本発明を完成した。

本発明は新規な白血球減少症治療剤の提供に係るもので
ある。

すなわち、本発明はヒトＧ−ＣＳＦを有効成分とする白
血球減少症治療剤である。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明の白血球減少症治療剤の有効成分であるヒトＧ−
ＣＳＦには、白血球減少症治療剤用の純度に精製された
ヒトＧ−ＣＳＦであれば全て使用できるが、ヒトＧ−Ｃ
ＳＦ産生細胞を培養して得られる培養上清から単離して
得られるもの及びヒトＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターで
宿主を形質転換して得られる形質転換体が産生するヒト
Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドまたは糖蛋白質が
好ましい。

具体的には、次の (1)及び (2)で示すヒトＧ−ＣＳＦが
特に好ましく用いられる。

(1) 次の理化学的性質を有するヒトＧ−ＣＳＦ。

分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による測定で約19,000±1,000 。

等電点：ｐＩ＝5.5±0.1，ｐＩ＝5.8±0.1，ｐＩ＝6.
1±0.1の三つの等電点のうち少なくとも１つを有する。

紫外部吸収：280ｎｍに極大吸収を有し、250ｎｍに極
少値をもつ。

Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如くで
ある。

H₂N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Lev-Pro-Gln-Se
r-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu-Glu-Val- (2) 下記のアミノ酸配列またはその一部で表わされるヒ
ト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチド又
はこれと糖鎖部を有する糖蛋白質を含有するヒトＧ−Ｃ
ＳＦ。

(Met)_n Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln
Ser Phe Leu Leu Lys Gys Leu Glu Gln Val Arg Lys I
le Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu (Va
l Ser Glu)_m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Gl
u Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro
Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gl
n Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Lev Gln Ala Leu Glu Gly Il
e Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Lev Gln
Leu Asp Val Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Me
t Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr
Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Ar
g Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln
Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg HiS Le
u Ala Gln Pro （但しm は０又は１を表わし、n は０又
は１を表わす）上記のヒトＧ−ＣＳＦは例えば後述する参考例に示す方
法によって製造することができる。即ち、上記 (1)のヒ
トＧ−ＣＳＦは参考例１〜２によって、又 (2)のヒトＧ
−ＣＳＦは参考例４〜11に示す方法により得ることがで
きる。

なおこれらの方法の詳細な製造条件については、本出願
人が先に出願した特願昭59−153273号，特願昭60−2694
55号，特願昭60−269456号，特願昭60−270838号，特願
昭60−270839の各明細書を参照されたい。

又、その他の方法としてＧ−ＣＳＦ産生細胞と自己増殖
能を有する悪性腫瘍細胞とを細胞融合して得られるハイ
ブリドーマをマイトジェンの存在または非存在下で培養
することによって得ることもできる。

これ等の方法で得たヒトＧ−ＣＳＦは全て本発明に含ま
れる。

得られたヒトＧ−ＣＳＦ含有液は必要により公知の手段
でさらに精製、濃縮した後凍結保存とするかまたは凍結
乾燥、真空乾燥などの手段により水分を除去して保存す
ることができる。

また所望によりヒトＧ−ＣＳＦを適当な緩衝液に溶解し
た後、ミリポアフィルター等で無菌濾過して注射剤とす
ることもできる。

さらに本発明の白血球減少症治療剤はヒトまたは動物医
薬用に適した医薬製剤としての形態をとるために必要な
製薬担体や賦形剤を、さらには安定化剤、吸着防止剤を
含むことができる。

本発明の白血球減少症治療剤に含まれるヒトＧ−ＣＳＦ
の投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して
決めることができるが、通常成人一人当たり0.1〜500μ
ｇ、好ましくは５〜100 μｇのヒトＧ−ＣＳＦを含有す
る製剤を１週間に、１〜７回投与することができる。し
かし本発明はヒトＧ−ＣＳＦの含有量によって限定され
るものではない。

〔実施例〕

以下、参考例、実施例をあげて本発明を説明するが、こ
れ等は本発明を限定するものではない。

参考例１：ＣＳＦ活性の測定方法本発明において用いられたＣＳＦ活性（以下ＣＳＡと略
す）の測定方法は次のとおりである。

「ＣＳＡの測定方法」 (a) ヒト骨髄細胞を用いる場合： Bradley Ｔ．Ｒ．，Metcalf Ｄ．等の方法（Aust.Ｊ．exp ．Biol．med ．Sci ．44巻 287〜300
頁，1966年）に準じて単層軟寒天培養法により行った。
すなわちウシ胎児血清0.2ml，被検検体0.1ml，ヒト骨髄
非付着生細胞浮遊液0.1ml（１〜２×10⁵ 有核細胞），
改変McCoy′s５Ａ培養液0.2ml，寒天を0.75％を含む改
変McCoy's５Ａ培養液0.4mlを混合して直径35mmの組織培
養プラスティックディッシュに入れて固まらせたのち、
37℃，５％炭酸ガス／95％空気，100 ％湿度の条件で培
養を行い、10日後に形成されたコロニー数（50個以上の
細胞からなる集落を１コロニーとする）を数え、１個の
コロニーを形成する活性を１単位（Ｕｎｉｔ）としてＣ
ＳＡを求めた。

(b) マウス骨髄細胞を用いる場合：ウマ血清0.4ml，被検検体0.1ml，Ｃ３Ｈ／He（メス）マ
ウスの骨髄細胞浮遊液0.1ml（0.5〜１×10⁵ 有核細
胞），寒天を0.75％含む改変McCoy′s５Ａ培養液0.4ml
を混合し直径35mmの組織培養用プラスティックディッシ
ュに入れて固まらせたのち、37℃，５％炭酸ガス／95％
空気、100 ％湿度の条件下にて５日間培養し、形成され
たコロニー数（50個以上の細胞からなる集落を１コロニ
ーとする）を数え、１個のコロニーを形成する活性を１
単位（Ｕｎｉｔ）としてＣＳＡを求めた。

尚、上記(a) ，(b) の方法において用いた「改変McCoy'
s５Ａ培養液および(a) で用いたヒト骨髄非付着性細胞
浮遊液は次の如くして作成した。

「改変McCoy′s５Ａ培養液（２倍濃度）」 McCoy′s５Ａ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）12ｇ，ＭＥＭア
ミノ酸ビタミン培地（日水製薬社製）2.55ｇ炭酸ナトリ
ウム2.18ｇ，ペニシリンＧカリウム50000単位を２回蒸
溜水500mlに溶解後、0.22μｍのミリポアフィルターに
濾過滅菌を行った。

「ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液」健常人胸骨せん刺により得た骨髄液をＲＰＭＩ1640培養
液にて５倍に希釈し、Ficol−Paque液（ファルマシア社
製）に重層し、400×ｇ，30分，25℃にて遠心を行い、
界面の細胞層（比重＜1.077）を回収する。この細胞を
洗浄後、20％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ1640培養液に
て５×10⁶ Cell／mlの濃度に調整し、25cm²の組織培養
用プラスチックフラスコに入れ、炭酸ガス培養器にて30
分間インキュベートしたのち、上清の非付着性細胞を回
収し、再度25cm²プラスチックフラスコに入れ、２時間3
0分インキュベートしたのち、上清の非付着清細胞を集
めて用いた。

参考例２：ヒトＧ−ＣＳＦの単離「ＣＨＵ−２」％の樹立著明な好中球の増多が認められた口腔底癌患者の腫瘍を
ｎｕ／ｎｕマウスに移植した。この腫瘍は移植約10日後
に著明な腫瘍の増大と好中球の増多が認められた。この
腫瘍を移植12日後に無菌的に摘出し、１〜２mm^３角に細
切し、これを以下の如く培養した。

上記細切した腫瘍塊10〜15片を50mlのプラスチック遠心
管に入れ、５mlのトリプシン溶液（トリプシン0.25％，
ＥＤＴＡ0.02％含む）を加え、37℃の温浴中で10分間振
とうしたのち上清を捨て、再度、同トリプシン溶液５ml
を加え、37℃で15分間撹拌しながらトリプシン消化を行
った。上清の細胞浮遊液を回収し、ウシ胎児血清を１ml
加えてトリプシンの作用を止めたのち氷中に保存した。

以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収し、前回の分と
合わせて 1,500r.p.m.10分間の遠心により細胞ペレット
を得た。

この細胞ペレットをウシ胎児血清を10％含むＦ−10にて
２回洗浄したのち、25cm²のプラスチック培養フラスコ
に細胞濃度５×10⁶ 個／フラスコになになるようにして
植え込んだ。ウシ胎児血清を10％含有するＦ−10培養液
を用い、炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度５
％，湿度 100％）中にて一晩インキュベートしたのち、
上清を非付着細胞と共に除去し、新しい培養液を加えて
培養を継続した。培養開始後６日目に細胞がいっぱいに
増殖したので、この時点で培養液を新しいものに替え
た。翌日、この培養液を捨て、ＲＰＭＩ1640で５倍希釈
した抗マウス赤血球抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）２mlと同
じくＲＰＭＩ1640で 2.5倍希釈したモルモット補体（極
東製薬社製）２mlを加え37℃，20分間インキュベートし
た。

インキュベーション終了後ウシ胎児血清を10％含Ｆ−10
にて２回洗浄しｎｕ／ｎｕマウス由来のフィブロブラス
トを除去し引き続きウシ胎児血清を10％含むＦ−10培養
液を加えて、さらに２日間培養を行った後細胞の一部を
取り出し、限界希釈法によりクローニングを行った。

ヒトＧ−ＣＳＦの単離上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増殖した 1
50cm²の培養フラスコ２本より細胞を回収し、これをウ
シ胎児血清を10％含有するＦ−10培養液500mlに浮遊し
たのち、1580cm²のガラス製ローラーボトル（Ｂｅｌｃ
ｏ社製）に移し、0.5r.p.m.の速度で回転培養を行っ
た。

細胞がローラーボルトの内壁に完全に密に増殖した時点
で培養液を血清を含まないＲＰＭＩ1640に交換し、４日
間培養したのち培養上清を回収し、ウシ胎児血清を10％
含有するＦ−10を加えて培養を続行する。３日間培養し
たのち再び血清を含まないＲＰＭＩ1640に液潜を行い、
４日後に培養上清を回収した。

以下同様の操作を繰り返すことにより、毎週１ボルトよ
り500mlずつの血清を含まない培養上清が得られ、しか
もこの方法によりかなり長期間にわたって細胞を維持
し、培養上清を回収することが可能であった。

得られた培養上清５を１バッチとし、これに0.01％ツ
ィーン20を添加御Hollo Fiber ＤＣ−４およびAmicon
ＰＭ−10（アミコン社製）を用いた限界濾過法により約
1000倍に濃縮したのち、これを下記の順序で精製した。

(i) 直径4.6cm，長さ90cmのUltrogel AcA54カラム（Ｌ
ＫＢ社製）を用い、0.15ＭNcClおよび0.01％ツィーン20
（半井化学社製）を含む0.01Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
7.4）を用いて前記濃縮した培養上清５mlを流速約50ml
／時間でゲル濾過した。尚カラムはあらかじめウシ血清
アルブミン（分子量67,000），オボアルブミン（分子量
45,000），チトクロームＣ（分子量12,400）にてキャリ
ブレーションを行った。ゲル濾過終了後各フラクション
より0.1mlずつ採取し、10倍に希釈した後、前述した
「ＣＳＡの測定方法(b)」により活性を示す画分を調べ
た。この結果、生ずVe＝400〜700mlの画分がマクロファ
ージ優位のＣＳＡを示し、Ve＝800〜1200mlの画分が顆
粒球優位のＣＳＡを示すことがわかったので、後者の画
分を集めＰＭ−10（アミコン社製）を用いる限界濾過器
によって約５mlに濃縮した。

(ii) 上記濃縮画分にｎ−プロパノール（東京化成社
製，アミノ酸配列決定用）を30％含む0.1％トリフルオ
ロ酢酸水溶液を添加し、氷中に15分程度放置したのち、
15,000r.p.m.10分の遠心により沈澱を除去した。次いで
先のｎ−プロパノールおよびトリフルオロ酢酸を含む水
溶液で平衡化したμ Bondpak Ｃ18カラム（Ｗａｔｅｒ
ｓ社製、セミ分取用，８mm×30cm）に吸着後、30〜60％
の直線濃度勾配のｎ−プロパノールを含む0.1％トリフ
ルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速液体クロマト装
置は日立685−50型を、検出は日立638−41型検出器（い
ずれも日立製作所製）を用い、220nmと280nmの吸収を同
時に測定した。溶出後、各画分より10μを分取100倍
希釈したのち、前述の「CASの測定法(b)」により活性を
示す画分を調べた。この結果、ｎ−プロパノール40％に
て溶出されるピークに活性が認められたので、このピー
クを集め再度同じ条件で再クロマトを行い上記と同様に
してＣＳＡを調べたところ、やはりｎ−プロパノール40
％の位置のピークに活性が認められたので、このピーク
を集め（４フラクション＝４ml）凍結乾燥した。

(iii) 上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパノールを40％含
む0.1％トリフルオロ酢酸水溶液200μに溶解し、ＴＳ
Ｋ−Ｇ3000ＳＷカラム（東洋曹達社製，7.5mm×60cm）
を用いた高速液体ククロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にか
けた。溶出は同水溶液により0.4ml／分の流速で行い、
フラクションコレクターＦＲＡＣ−100（ファルマシア
社製）により0.4mlずつ分取した。分取した各画分につ
いてＣＳＡを前記と同様にして調べた結果、保持時間が
37〜38分の画分（分子量約２万に相当）に活性が認めら
れたので、この画分を回収して、更に分析用μ Bandapa
k Ｃ18カラム（4.6mm×30cm）による精製を施したの
ち、メインピークを回収し凍結乾燥した。得られた標品
について前述の「ＣＳＡの測定方法(a)」によって検定
したところヒトＧ−ＣＳＦ活性を有することを認めた。

参考例３：理化学的性質の確認上記のようにして得られたヒトＧ−ＣＳＦの理化学的性
質を以下の方法によって確認した。

(i)分子量ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により行った。

電気泳動装置はＰＲＯＴＥＡＮ^TM16cm（バイオラッド社
製）、ゲルはＴ＝15％、Ｃ＝2.6％のポリアクリルアミ
ドスラブゲル（140mm×160mm×1.5mm）及び濃縮ゲル
（Ｔ＝3％、Ｃ＝20％）を用いた。試料はあらかじめ0.6
4Ｍ２−メルカプトエタノールにドデシル硫酸ナトリウ
ムを濃度が２％になるように加えた溶液中で３分煮沸し
変性させておいたものを４μｇ用いた。

30mA定電流で４時間電気泳動した後、ゲルを取り出し、
次いで、0.25％マークシーブリリアントブルーＲ２５
０（シグマ社製）による染色にてバンドを検出した。分
子量マーカーとしてホスポリラーゼＢ（Phosphorylase
Ｂ；分子量92,500）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，6
7,000）、オボアルブミン（ＯＶＡ，45,000）、カルボ
ニックアンヒドラーゼ（Carbonic Anhydrs,31,000）、
ソイビーントリプシンインヒビター（Soybean Tryphs
in Inhibitor.21,500）、リゾチーム（Lysoyme,14,40
0）を同様に処理して用いた。この結果、分子量19,000
の単一バンドが認められた。

これらの結果から本発明のヒトＧ−ＣＳＦの分子量は1
9,000±1,000であると考えられる。

(ii) 等電点フラットベッド型等電点電気泳動装置ＦＢＥ−3000（フ
ァルマシア社製）を用いた。

ph4〜6.5のPharmalyte（ファルマシア社製）を含むポリ
アクリルアミドゲル（Ｔ＝５％，Ｃ＝３％，115mm×230
mm）にて、30Ｗ定電力（最大電圧2000Ｖ）で２時間泳動
を行った後、30％メタノール／10％トリクロール酢酸／
35％スルホサリチル酸により固定し、次いでマークシー
ブリリアントブルーＲ−250染色を行った。

等電点マーカーとしてLow pI Kit pH2.5〜6.5（ファル
マシア社製）を用いた。

pH4〜6.5の間で分離を検討したところｐＩ＝5.52,5.80,
6.13の３本のバンドが認められた。このうちｐＩ＝5.52
および5.80の２本のバンドが主たる成分であった。別途
同様にして当該ＣＳＦの等電点を５回測定した結果、そ
の値はｐＩ＝5.5±0.1，5.8±0.1，6.1±0.1であった。

(iii) 紫外部吸収試料をｎ−プロパノールを40％含む0.1％トリフルオロ
酢酸をレファレンス（reference）とし、分光光度計を
用いて紫外部吸収を調べた結果、280ｎｍに極大吸収、2
50ｎｍに極小値を示した。

(iv) アミノ酸配列の決定Ｎ端末アミノ酸配列の決定試料を気相式シークエンサー（アプライドバイオシステ
ム社製）を用いてエンドマン（Ｅｄｍａｎ）分解し、得
られたＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー装
置（ベックマン・インストルメンツ社製）およびUltras
phere−ＯＤＳカラム（ベックマン・インストルメンツ
社製）を用いて常法により分析した。カラム（５μｍ，
直径4.6mm，長さ250mm）を開始緩衝液（15ｍＭ酢酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ4.5,40％アセトニトリルを含む水溶
液）にて平衡化したのち、検体（20μの開始緩衝液に
て溶解）を注入して開始緩衝液によるイソクラティック
溶出により分離を行った。流速は1.4ml／分、カラム温
度は40℃に保持した。PTHアミノ酸の検出は269ｎｍと32
0ｎｍの紫外部吸収を利用した。あらかじめ標準ＰＴＨ
アミノ酸（シグマ社製）約２ｎmolを同一の系で分離し
て保持時間を決定し、被検検体の保持時間から同定を行
った。

この結果、Ｎ末端から40残基目までのアミノ酸配列は次
の如く決定された。

Ｈ_２Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｕｙ− Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ− Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ− Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ− Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ− Ｇｌｎ−Ｖｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ− Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ− Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ− Ｌｙｓ− ブロムシアン分解試料を70％ギ酸に溶かし、昇華精製したブロムシアン20
0当量を加えて、37℃で一夜反応させた。次に反応物を
凍結乾燥後、ＴＳＫＧ3000ＳＷカラム（東洋曹達社
製）を用いたＨＰＬＣで画分し４つのピークを得た。ピ
ーク分子量の大きい順にＣＮ−１，ＣＮ−２，ＣＮ−
３，ＣＮ−４と命名し、収率のよいをＣＮ−１，ＣＮ−
２についてアミノ酸配列を自動気相式シークエンサー
（アプライドバイオシステム社製）を用いてと同様の
条件で分析した。

その結果、ＣＮ−１はＧ−ＣＳＦタンパクのＮ末端から
のペプチドであることがわかった。さらにＣＮ−２は以
下のアミノ酸配列を有していた。

Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ− Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ− Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ− Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ− Ｇｌｎ− トリプシン分解試料を８Ｍ尿素を含む0.1Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.
4）に溶かし、0.1％２−メルカプトエタノールを含む0.
1Ｍトリス塩酸緩衝液（ph 7.4）を加えて最終的に２Ｍ
の尿素となるように調整した。次いで試料と酸素が50：
１となるようにTPCK処理トリプシン（シグマ社製商品
名）を加え、25℃で４時間反応させた後、さらに同量の
ＴＰＣＫ処理トリプシンを加えて、再度25℃で１６時間
反応させた。反応後、反応物をＣ８カラム（山村化学社
製）を用いた高速逆相カラムクロマトグラフィーに付し
た。溶出は0.1％ＴＦＡを含むｎ−プロパノールを用
い、ｎ−プロパノール濃度を５％〜60％に直線的に上げ
て行った。280ｎｍの紫外部吸収を測定して得られたピ
ークのうち、メインピークについてと同条件下に自動
気相式シークエンサー（アプライドバイオシステム社
製）を用いてアミノ酸配列を分析した。その結果、メン
インピークはのＣＮ−２断片の一部を含む以下の配列
を有するペプチドであることがわかった。

Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ− Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ− Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ− Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ− Ａｌａ−ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ− Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ− Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ− Ｓｅｒ− (V)蛋白質部分のアミノ酸組成試料を常法により加水分解し、その蛋白部分のアミノ酸
組成を日立835アミノ酸自動分析装置（日立製作所製）
を用いて特種アミノ酸分析法により分析した。この結果
を表１に示した。尚、加水分解条件は次の如くである。

６ＮＨＣｌ 110℃ 24時間真空中４Ｎメタンスルホン酸＋0.2％３−（２−アミノエチ
ル）インドール，110℃ 24時間，48時間，72時間，真
空中試料は、40％ｎ−プロパノールと0.1％トリフルオロ酢
酸を含む溶液（1.5ml）に溶かした後、各々0.1mlをと
り、乾燥窒素ガスにより乾燥させた後、又はの試薬
を加えて真空封管し、加水分解に供した。

表中、実測値はの24時間値との24，48，72時間値の
合計４回の平均値である。但し、Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，１／
２Ｃｙｓ，Ｍｅｔ，Ｖａｌ，ＩｌｅおよびＴｒｐは以下
の方法で算出した。（生化学実験講座、タンパク質化学
II（東京化学同人出版）を参照）・Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，１／２Ｃｙｓ，Ｍｅｔはの24，4
8，72時間値の経時変化をとり、零時間の補外。

・Ｖａｌ，Ｉｌｅはの72時間値。

・Ｔｒｐはの24，48，72時間値の平均値表中のアミノ
酸残基数はＬｅｕを33個と仮定して算出した予測値であ
る。一般に上記の如き補正が必要なアミノ酸は加水分解
に、一部又はかなりの部分が破壊されるか、あるいは、
加水分解を受け難いものであり、さらにＰｒｏは発色率
が低い等のことから、それ等のアミノ酸の実測値（ｎ
ｍｏｌ）、従ってそれから算出される残基数は実際より
も低い値を示す傾向がある（例えば前述の生化学実験講
座を参照）。

参考例４：プローブの調製参考例３の(iv)によって決定したアミノ酸配列中から図
１に示される配列に対応する３種類のヌクレオチドプロ
ーブ(A)，プローブ（ＬＣ）およびプローブ（ＩＷＱ）
を合成した。プローブ(A)は連続した14個のヌクレオチ
ドからなる混合型プローブである。

プローブ（IWQ）は、ヒトコレシストキニン遺伝子のク
ローン化で用いられた如き（Takahashi等；Proc．Nat
l．Acad．Sci．，USA．，82巻1931頁（1985））デオキ
シイノシンを使用した30個の連続したヌクレオチドであ
る。プローブ（ＬＣ）は参考例(iv)−に示したアミノ
酸配列のＮ末端から32〜39番に相当する部分を、図２に
示した塩基配列を基にして合成した24個のヌクレオチド
からなるプローブである。

ヌクレオチドの化学合成は改良型ホスホトリエステル法
を固相法に適用して行うことができ、Narangの総説に記
述されている（Tetrahedron 39巻３−22頁（1983））。

使用するプローブは、本発明で用いたプローブ以外の位
置のアミノ酸配列に基づくものであってもよい。

参考例５：ｃＤＮＡライブイリーの構築ＣＨＵ−２細胞にグアニジンチオシアナート溶液を加え
てホモジナイズし、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法により全Ｒ
ＮＡを得る。

この全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによ
りポリ（Ａ^＋）ＲＮＡを選別した後、逆転写酵素により
１本鎖ｃＤＮＡを合成し、RNaseＨおよびＥ．coliＤＮ
ＡポリメラーゼＩを加えて、２本鎖ｃＤＮＡを得た。得
られた２本鎖のｃＤＮＡにｄＣ鎖を付加し、Pst Ｉ切
断部位にｄＧ鎖を付加したｐＢＲ322ベクターとつなぎ
合せて、大腸菌Ｘ1776株を形質転換させ、ｐＢＲ322形c
DNAライブラリーを構築した。

同様に、ＥｃｏＲＩリンカーを用いて、２本鎖ｃＤＮＡ
をλｇｔ10ベクターと連結し、λファージ系ｃＤＮＡラ
イブラリーを構築した。

参考例６：スクリーニングｐＢＲ322系ｃＤＮＡライブラリー由来の組換え体をワ
ットマン541濾紙に固定し、³²Ｐで放射標識したプロー
ブ（ＩＷＱ）を用いて、コロニーハイブリダイゼーショ
ンを行った結果、１個のクローンが選別できた。このク
ローンを、サザンブロッティング法（Southrn：Ｊ．Mo
l．Biol．98巻503頁(1975)）を用いて更に詳細に検討し
たところ、プローブ(A)ともハイブリダイズした。

このクローンの塩基配列をジデオキシ法（Sanger；Scie
nce 214巻1205頁(1981)）によって決定した。

得られたｃＤＮＡインサートはプローブ（ＩＷＱ）およ
びプローブ(A)を含む308塩基対からなり、参考例３(iv)
−に示したアミノ酸配列を含む83個のアミノ酸をコー
ドするオープンリーディングフレームを有していること
がわかった。

この308塩基対を含むｐＢＲ322由来のプラスミドを以下
ｐＨＣＳ−１と略記する。

ｐＨＣＳ−１から得られる308塩基対を含むＤＮＡ断片
をニックトランスレーション法（前出、Molecular Clon
ingを参照）にて放射標識し、これをプローブとしてλ
ｇｔ10由来のｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリ
ダゼーション（BentonとDavis；Science 196巻180頁（1
977）によりスクリーニングして５個のクローンを得、
ｃＤＮＡを含むと思われるクローンについてその塩基配
列を前述と同様の方法で決定した。（図２）図２に示される如く、このｃＤＮＡインサートは一つの
大きなオープンリーディングフレームを有する。

このｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列は図２
に示された如く演えきできる。

参考例３(iv)−に示されているＧ−ＣＳＦタンパクの
Ｎ末端アミノ酸配列との比較により、本ｃＤＮＡは５′
−末端から32〜３４ヌクレオチド位のＡＴＧ配列から始
まり、119〜121位のＧＣＣ配列で終わる90塩基対によっ
てコードされるシグナルペプチドおよび122〜124位のＡ
ＣＣ配列から始まり、650〜652位のＣＣＣ配列で終わる
531塩基対によってコードされる成熟Ｇ−ＣＳＦポリペ
プチドに相当する塩基配列を含んでいることがわかっ
た。ポリペプチドは207個のアミノ酸からなり、その分
子量は22292.67ダルトンと計算された。同様に後者のポ
リペプチドは177個のアミノ酸からなり、その分子量は1
8986.74ダルトンであった。

但しタンパク質の開始部位に関しては、32〜34位あるい
は68〜70位のＡＴＧも同様に考え得る。ＥｃｏＲ１切断
部位にこのｃＤＮＡ（＋ＶＳＥ）を挿入した、ｐＢＲ32
2を保持するエシエリヒア・コリ（Ｅ．coli）Ｘ1776Ｒ
−１株は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている（ＦＥＲＭ BP−954）。

また、このｃＤＮＡをｐＢＲ327［Soberon等；Gene９関
287頁(1980)］とEcoRI部位で結合したプラスミドをｐＢ
ＲＧ４と称する。

このようにして得られたｐＢＲＧ４を、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで処理して得られる約1500塩基対のｃＤＮＡを含む
ＤＮＡ断片をニックトランスレーション法（前述のMole
cular Cloningを参照）にて放射標識し、これをプロー
ブとしてλｇｔ10由来のｃＤＮＡライブラリーをプラー
クハイブリダゼーション（前出BentonとDavisの文献参
照）によりスクリーニングした。この際、同時にλファ
ージＤＮＡを固定したニトロセルロース濾紙を２枚作成
しておき、先に述べたプローブ(LC)にて同様のプラーク
ハイブリダイゼーションを行い、両プローブでポジティ
ブとなるファージを選別した。完全長と行われるクロー
ンを選別し、ジデオキシ法を用いてｃＤＮＡインサート
の塩基配列を決定したところ図３に示される如くであっ
た。

このｃＤＮＡは一つの大きなオープンリーディングフレ
ームを有し、コードされるアミノ酸配列は図３に示され
た如く演えできる。

参考例３(iv)−に示されているＧ−ＣＳＦタンパクの
Ｎ末端アミノ酸配列との比較により、本ｃＤＮＡは５′
−末端から31〜33ヌクレオチド位のＡＴＧ配列から始ま
り、118〜120位のＧＣＣ配列で終わる90塩基対によって
コードされるシグナルペプチドおよび121〜123位のＡＣ
Ｃ配列から始まり640〜642位のＣＣＣ配列で終わる522
塩基対によってコードされる成熟Ｇ−ＣＳＦポリペプチ
ドに相当する塩基配列を含んでいることがわかった。前
者のポリペプチドは204個のアミノ酸からなり、その分
子量は21977.35ダルトンと計算された。同様に後者のポ
リペプチドは174個のアミノ酸からなり、その分子量は1
8671.42ダルトンであった。

但しタンパク質の開始部位に関しては、31〜33位あるい
は58〜60位あるいは67〜69のＡＴＧも同様に考え得る。

ＥｃｏＲ１切断部位にこのｃＤＮＡ（−ＶＳＥ）を挿入
したｐＢＲ327を保持するエシェリヒア・コリ（Ｅ．col
i）Ｘ1776Ｒ−２株は工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている（ＦＥＲＭ BP−955）。

また、このｃＤＮＡをｐＢＲ327とＥｃｏＲＩ部位で結
合したプラスミドをｐＢＲＶ２と称する。

参考例７：大腸菌用組換えベクターの構築 (A)＋ＶＳＥ系組換えベクターかくして得られたｐＢＲＧ４プラスミドからＧ−ＣＳＦ
ポリペプチドのｃＤＮＡ断片を制限酵素により切り出し
て来て、これとｔａｃプロモーターを含有するｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア社製）から調製した断片とアニーリング
した合成リンカーを連結（ライゲーション）し組換えベ
クターを構築するか、Ｐ_Ｌプロモーターを含むｐＰＬ−lambda（ファルマ
シア社製）から調製した３種の断片とアニーリングした
合成リンカーを連結し、再調整して組換えベクターを構
築するか、あるいはｔｒｐプロモーター含有ｐＯＹＩプラスミドから調
整した断片とアニーリングした合成リンカーを連結して
組換えベクターを構築する。

(B)−ＶＳＥ系組換えベクターｐＢＲＶ２プラスミドを用いて同様に３種の組換えベク
ターを構築する。

参考例８：大腸菌を宿主とする形真転換体の調製と培
養、発現。

次に上記＋ＶＳＥ形及び−ＶＳＥ形についての各々３種
の組換えベクターを用いて前出のMolecular Cloningに
記載されている塩化カルシウム法又は塩化ルビジウム法
で、夫々Ｅ．coli ＤＨ１株，Ｅ．coli Ｎ4830株或い
はＥ．coli ＪＭ105株を形質転換した。

得られた形質転換株をアンピシリン含有ルリア（luri
a）培地でまず培養し次いで必要に応じて、適宜誘導を
かけ、培養を行い形質発現せしめたた。

参考例９：大腸菌からのＧ−ＣＳＦポリペプチドの回収
精製とアミノ酸分析形質転換株の培養液を遠心にかけ集菌した後リゾチーム
処理をし、凍結−溶解をくりかえし溶菌させて上清を得
るか塩酸グアニジン処理後遠心で上澄液を得る。

これをUltrogel ＡＣＡ54カラム（ＬＫＢ社製）でゲル
濾過し、活性画分を限界濾過器で濃縮した。

次に、ｎプロパノールを含むトリフルオロ酢酸水溶液を
添加し、氷中放置、遠心分離し、逆相Ｃ18カラムに吸
着、溶出操作を施す。溶出後各画分の活性を調べ、活性
ピークを集め再度同様の精製操作を行った後凍結乾燥し
た。この凍結乾燥粉末を溶解し、高速分子ふるいクロマ
トグラフィにかけることにより取得したポリペプチドを
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ目的と
するＧ−ＣＳＦポリペプチドを示す単一のバンドを確認
した。

この様にして得られたポリペプチドはヒトＧ−ＣＳＦ活
性を示した。更に、得られたＧ−ＣＳＦポリペプチドの
アミノ酸分析はアミノ酸組成を日立835アミノ酸自動分
析装置（日立製作所製）を使用し、特殊アミノ酸分析法
によって分析した。又、Ｎ末端アミノ酸分析は気相式シ
ークエンサーを用いてエドマン分解し、高速液体クロマ
トグラフィー及び、Ultrasphere−ＯＤＳカラムを用い
て行った。

参考例10：動物細胞用組換えベクターの構築宿主細胞としてＣ１２７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用
する場合の組換えベクター（ＢＰＶ由来）およびＣＨＯ
細胞を使用する場合の組換えベクター（ｄｈｆｒ由来）
の構築を＋ＶＳＥ系、−ＶＳＥ系について各々行った。
ここではＣ１２７細胞およびＣＨＯ細胞用組換えベクタ
ーの構築について記載するが詳しくは特願昭60−269456
号，特願昭60−270839号を参照されたい。

(A)＋ＶＳＥ系組換えベクターの構築上記参考例６で得られたｃＤＮＡ（＋ＶＳＥ）断片をベ
クターｐｄＫＣＲに組み込みｐＨＧＡ４１０プラスミド
とした後これをＥｃｏＲＩで部分消化し、末端をブラン
トエンド(blunt end)にする。このＤＮＡにＨｉｎｄIII
リンカーを付加し、次いでＨｉｎｄIII処理をしＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ処理した後これで塩化ルジジウム法（全出
Molecular Cloning参照）を用いＥ．coli ＤＨＩ株を
形質転換した。得られたプラスミドをｐＨＧＡ４１０
(H)と命名する（図４）。

ｐＨＧＡ４１０(H)をＳａｌＩで処理し、次いで末端を
ブラントエンド化した後再びＨｉｎｄIII処理しＨｉｎ
ｄIII−ＳａｌＩ断片を回収する一方、ウシ乳頭腫ウィ
ルスの形質転換断片を有するｐｄＢＰＶ−１プラスミド
をＨｉｎｄIII、ｐｖｕIIで処理し大きいほうのＤＮＡ
断片を分離し、これと先のＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ断片
を結合する。これを用いてＥ．coli ＤＨＩ株を形質転
換しｐＨＧＶ２由来のＣＳＦ−ｃＤＮＡを有するプラス
ミド、ｐＴＮ−Ｇ４を得る。（図４）。

一方、ｐＨＧＡ４１０プラスミドかｐＨＧＡ４１０(H)
プラスミドとｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラスミドを用いて
ＣＨＯ細胞用組換えベクター（＋ＶＳＥ）であるｐＨＧ
Ｇ４−ｄｈｆｒを構築した（図５）。

(B)−ＶＳＥ系組換えベクターの構築上記参考例６で得られたｃＤＮＡ（−ＶＳＥ）断片をベ
クターｐｄＫＣＲに組み込みｐＨＧＶ２プラスミドとし
た後これをＥｃｏＲＩで部分消化し、末端をブラントエ
ンド(blunt end)にする。このＤＮＡにＨｉｎｄIIIリン
カーを付加し、次いでＨｉｎｄIII処理をしＴ４ＤＮＡ
リガーゼ処理した後、これで塩化ルビジウム法（全出Mo
lecular Cloning参照）を用い、Ｅ．coli ＤＨＩ株を
形質転換した。得られたプラスミドをｐＨＧＶ２(H)と
命名する（図６）。

ｐＨＧＶ２(H)をＳａｌＩで処理し、次いで末端をブラ
ントエンド化した後再びＨｉｎｄIII処理しＨｉｎｄIII
−ＳａｌＩ断片を回収する一方、ウシ乳頭腫ウィルスの
形質転換断片を有するｐｄＢＰＶ−１プラスミドをＨｉ
ｎｄIII、ｐｖｕIIで処理し大きい法のＤＮＡ断片を分
離し、これと先のＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ断片を結合す
る。これを用いてＥ．coli ＤＨＩ株を形質転換しｐＨ
ＧＶ２由来のＣＳＦ−ｃＤＮＡを有するプラスミド、ｐ
ＴＮ−Ｖ２を得る。（図６）。

＋ＶＳＥと同様にｐＨＧＶ２プラスミドかｐＨＧＶ２
(H)プラスミドとｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラスミドを用
いてＣＨＯ細胞用組換えベクター（−ＶＳＥ）であるｐ
ＨＧＶ２−ｄｈｆｒを構築した（図７）。

参考例11：動物細胞による形質発現ここではＣ１２７細胞による＋ＶＳＥ系、及びＣＨ
Ｏ細胞による−ＶＳＥ系の形質発現を例にして説明す
る。

Ｃ１２７細胞による＋ＶＳＥ系の形質発現：参考例10
(A)で得たｐＴＨ−Ｇ４をマウスＣ１２７細胞に形質転
換する前に制限酵素ＢａｍＨＩで処理する。即ちＰＴＮ
−Ｇ４プラスミド２０μｇを１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０），７mM ＭｇＣｌ_２，１００mM ＮａＣ
ｌ，２mM２−メルカプトエタノール，0.01％ＢＳＡ１０
０μに溶解せしめＢａｍＨＩ（宝酒造社製）２０単位
で処理し、フェノール処理、エーテル処理、エタノール
沈澱を行った。

マウスＣ１２７細胞は１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）
を含むDulbecco′s minimal essentialal培地中で増殖
させる。径５cmのプレートに増殖したＣ１２７細胞に、
プレート当たり上記調製ＤＮＡを１０μｇの割り合いで
リン酸−カルシウム法（Haynes,J＆Weissmann,C(1983)N
ucleic Acid Res 11巻687−706参照）にて形質転換を行
い、グリセロール処理の後、12時間37℃でインキュベー
トした。

次ぎに、この細胞を３枚の新しい径５cmプレートに移
し、１週間２回の割り合いで培地交換をした。１６日目
にＦｏｃｉ（集塊）を形成した部分をそれぞれ新しいプ
レートに移し、上述の培地で継代培養し、Ｇ−ＣＳＦ生
産能の高いクローンを選別した。その結果〜１mg／の
レベルのＧ−ＣＳＦ生産がみられた。

ＣＨＯ細胞による−ＶＳＥ系の形質発現：ＣＨＯ細胞（dhfr^-株、コロンビア大学Dr.L.Chasinより
入手）を９cm径のプレート（Nunc社製）中１０％仔牛血
清を含むα最小必須培地（α−ＭＥＭ，アデノシン、デ
オキシアデノシン、チミジン添加）で培養増殖し、これ
をリン酸−カルシウム法（Wigler等、Cell14巻725頁(19
78)）によって形質転換した。

即ち参考例10(B)で調製したｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒプラ
スミド１μｇにキヤリアーＤＮＡ（子牛胸線ＤＮＡ）を
適量加えて、ＴＥ溶液３７５μに溶解し１ＭＣａＣ
ｌ_２１２５μを加える。３〜５分氷上で冷やし５００
μの２×ＨＢＳ（５０mM Ｈｅｐｅｓ、２８０mM Ｎ
ａＣｌ、１．５mMリン酸緩衝液）を加え再び氷冷後、上
記のＣＨＯ細胞培養液１mlと混合しプレートに移し、Ｃ
Ｏ_２インキュベーター中で９時間培養した。以下洗浄、
２０％グリセロール含有ＴＢＳ（Tris-buffered salin
e）添加、再び洗浄とした後非選別培地（前出α−ＭＥ
Ｍ培地、ヌクレオシド添加）を添加して２日間インキュ
ベートし選択培地で１：１０に細胞を分割した。次いで
２日毎に選択培地（ヌクレオチド無添加）にて培地交換
を行いながら培養を続行し生じた集塊（ｆｏｃｉ）を選
別して新しいプレートに移した。

新しいプレートでは０．０２μＭメトトレキセート（Ｍ
ＴＸ）存在下で増殖し再び０．１μＭＭＴＸ存在下で
増殖させてクローニングを行った。

なおＣＨＯ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対しｐＨＧＶ
２とｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡを同時形質転換（Cotransfor
mation）することによっても行うことができる。（Scah
ill等．Proc.Nati.Acad.Sci.USA80巻4654−458(1983)参
照）又、いわゆるポリシストロニック遺伝子を用いる方法で
組換えベクターを構築し、これを用いてＣＨＯ細胞を形
質転換することができる。例えばｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ
をＰｓｔＩ処理し、２つの断片を回収しこれらとｐＢＲ
Ｖ２由来のＣＳＦｃＤＮＡ断片を結合することによ
り、アデノウィルスプロモーター、ＣＳＦｃＤＮＡ、Ｄ
ＨＦＲ、ＳＶ４０のポリＡ部位の順序に配列した組換え
ベクターを構築しＣＨＯ細胞にいれて実施した。

参考例12：発現物質のＧ−ＣＳＦ活性の検定（＋ＶＳＦ
及び−ＶＳＥ）上記参考例で得られたＣ１２７細胞（＋ＶＳＥ）及びＣ
ＨＯ細胞（−ＶＳＥ）の培養上清を１Ｎ酢酸によりｐＨ
４に調製し、等容量のｎ−プロパノールを加えた後、生
じた沈澱を遠心除去し、Ｃ８逆相系単体（山村化学社
製）を充填したオープンラカラム（１φ×２cm）に通
し、５０％ｎ−プロパノールで溶出させた。溶出液を水
で２倍に希釈した後、ＹＭＣ−８Ｃカラム（山村化学社
製）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにて０．
１％ＴＦＡを含む３０〜６０％の直線濃度勾配のｎ−プ
ロパノール溶出させた。ｎ−プロパノール濃度が４０％
付近の位置で溶出される画分を分取した後、凍結乾燥
し、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９）に溶解せしめ
た。このような過程を経ることによって、ヒトＧ−ＣＳ
ＦはＣ１２７細胞及びＣＨＯ細胞上清から約２０倍に濃
縮された。

コントロールとして、前述の方法に従ってヒトＧ−ＣＳ
ＦｃＤＮＡを含まないプラスミドで細胞を形質転換し
た後その培養上清を濃縮した。得られた標品について参
考例１に記載された「ヒトＧ−ＣＳＦの測定方法(a)」
に基づいた方法にてヒトＧ−ＣＳＦ活性を検定した。
尚、発現効率が十分に高い場合には培養上清を直接検定
に供してもよい。ここでは濃縮した例について結果を示
した。その結果は表−２の通りであった。

参考例13：アミノ酸分析および糖分析（＋ＶＳＥ及び−
ＶＳＥ） 1) アミノ酸組成の分社参考例12で得た粗ＣＳＦ資料を更に参考例２− −(iii)の方法にしたがって精製し、参考例２−−
(V)の方法によって分析した。この結果を表−３−−
（＋ＶＳＥ）及び表−３−（−ＶＳＥ）に示した。
尚、加水分解条件他、全て参考例２−−(V)と同一条
件で行った。

2)糖組成分析上記アミノ酸組成分析で用いた精製ＣＳＦ試料200ｎｇ
に内部標準としてイノシトール25n molを加えた後、1.
5ＮＨＣｌを含むメタノール溶液（500μ）を加えて窒
素ガス置換した封管中、90℃で４時間反応させた。開管
後炭酸銀（Ａｇ_２ＣＯ_３）を加えて中和した後、無水酢
酸50μを加え振とう後、室温にて暗所に一晩放置し
た。

上層をサンプルチューブにとり、窒素ガスにて乾燥し
た。沈澱にメタノールを加え洗浄後軽く遠沈し、上層を
同じサンプルチューブに加え乾燥した。これに50μの
ＴＭＳ化試薬（ピリジン：ヘキサメチルジシラザン：ト
リメチルクロロシラン＝５：１：１に混合したもの）を
加え40℃で20分反応させた後、Deep Freezerに保存し
た。尚、スタンダードとしてガラクトース（Ｇａｌ）、
Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シア
ル酸などを各50ｎｍｏｌ及びイノシトール25ｎｍｏ
ｌを合わせ同様の操作を行った。

このサンプルについて以下に示す条件でガスクロマト分
析を行った。

（分析条件）カラム：２％ＯＶ−１７Vinport ＨＰ60〜80メッシ
ュ，３ｍ，ガラス温度：110℃〜250℃まで４℃／分の昇温キャリヤーガス：最初は1.2〜1.6kg／cm² （窒素圧）終了時は２〜2.5kg／cm² 感度：１０^３ＭΩレンジ0.1〜0.4Ｖ圧：水素ガス0.8kg／cm² 空気 0.8kg／cm² サンプル量：2.5〜3.0μ 分析の結果、本発明のＣＳＦからガラクトース、Ｎ−ア
セチルガラクトサミンおよびシアル酸が確認された。

3) 糖含有分析アミノ酸分析に用いたＣＳＦ試料をエルソン−モルガン
法によるアミノ糖定量、オルシノール流酸法による中性
糖の定量あるいはチオバルビツール法によるシアル酸の
定量をそれぞれ実施した。定量方法は生化学実験講座第
４巻「糖質の化学（下巻）」（東京化学同人）の13章に
記載されている。各定量値から重量％を換算した結果、
宿主細胞、発現ベクター及び培養条件等の違いにより、
得られたＧ−ＣＳＦの当含量は１〜20（重量％）の範囲
に分布していた。

参考例14：本発明のヒトＧ−ＣＳＦによる好中球増加作
用８週令の雄性Ｃ57ＢＬ／６Ｎ系マウス40匹を20匹ずつ２
群に分け、一方の群（コトロール群）には最終濃度１％
のｎ−プロパノールおよび最終濃度10％の同系マウス血
清を含む生理食塩水溶液0.1mlを、またもう一方の群
（ＣＳＦ投与群）には最終濃度１％のｎ−プロパノー
ル、最終濃度10％の同系マウス血清および参考例２で得
たヒトＧ−ＣＳＦ2.5μｇを含む生理食塩水溶液0.1mlを
採血するまで１日１回投与した。

投与開始後２，５，８，11，14，日目にそれぞれの群よ
りマウスを４匹ずつ無作為抽出し、眼窩静脈より採血し
てミクロセルカウンターＣＣ180型（東亜社製商品名）
にて白血球数をカウントするとともに血液の塗沫標本を
作成し、ギムザ染色法にて染色した後、顕微鏡下で白血
球200子中の好中球の割合を測定した。

各群の好中球数は次の計算式により算出した。

１mm^３当りの白血球数×白血球中の好中球の割合＝１mm
^３中の好中球数また、無処理の同系マウス（４匹）について同様に処理
し、０日の値とした。結果を表４に示す。尚、ヒトＧ−
ＣＳＦを参考例13（Ｃ１２７細胞由来の＋ＶＳＥ及びＣ
ＨＯ細胞由来−ＶＳＥ）で用いたアミノ酸分析用精製試
料にかえて、上記と同じ試験を行ったたころ、同じ結果
が得らることが確認された。

参考例15：本発明のヒトＧ−ＣＳＦによる白血球減少阻
止効果８週令の雄性ＩＣＲ系マウス32匹にサイクロフォスファ
ミド（以下ＣＰと略す）を１匹当り200mg／kgの割合い
で腹腔内投与した後、１６匹ずつ２群に分け、一方の群
（コントロール群）には、最終濃度１％のｎ−プロパノ
ールおよび最終濃度10％の同系マウス血清を含む生理食
塩水溶液0.1mlを、またもう一方の群（ＣＳＦ投与群）
には最終濃度１％のｎ−プロパノール、最終濃度10％の
同系マウス血清及び参考例２で得たヒトＧ−ＣＳＦ2.5
μｇを含む生理食塩水溶液0.1mlをそれぞれ次の日から
１日１回投与した。

ＣＰ投与後２，４，５，７日目にそれぞれの群より４匹
ずつマウスを無作為抽出し、眼窩静脈より採血してミク
ロセルカウンターＣＣ180型（東亜社製商品名）にて白
血球数をカウントするとともに血液の塗沫標本を作成
し、ギムザ染色法にて染色した後、顕微鏡下で白血球20
0子中の好中球の割合を測定した。

各群の好中球数は次の計算式により算出した。

１mm^３当りの白血球数×白血球中の好中球の割合＝１mm
^３中の好中球数また同時に染色された好中球を形態学的に分類し、最も
成熟した好中球である分葉核球の占める比率を求めた。

ＣＰ無処理の同系マウス（４匹）について同様に処理
し、ＣＰ投与前の値とした。結果を表５に示す。又、参
考例13の（Ｃ１２７細胞由来の＋ＶＳＥ及びＣＨＯ細胞
由来の−ＶＳＥ）アミノ酸分析に用いた精製ヒトＧ−Ｃ
ＳＦ試料を用いて上記と同一の試験を行ってみたが、本
試験と同様の結果が得られることが確認された。

表４に示される如く、正常動物に於いては、コントロー
ル群では好中球数の増加が認められないのに対し、ＣＳ
Ｆ投与群ではＣＳＦ投与開始後２日目から有意な好中球
の増加が認められ、この好中球の増加はＣＳＦを投与す
る限り漸増的に続いた。また、好中球減少状態モデルに
おいては、表５に示されるごとく、コントロール群では
ＣＰ投与後５日目まで好中球減少の状態が続くのに対
し、ＳＣＦ投与群ではＣＰ投与後の７日目の好中球数は
ＣＰ投与前の値と同等かそれ以上の値を示した。

また末梢好中球の絶対数ばかりでなく、その成熟度につ
いてもヒトＧ−ＣＳＦ投与により改善がみられた。同様
に末梢白血球数についても減少の程度が緩和された。

参考例16：ヒトＧ−ＣＳＦによる白血球減少症モデルに
対する効果 36匹のＣ57ＢＬ／６Ｎマウス（オス、８週令）に200mg
／kgの割合でサイクロフォスファミド（ＣＰ）を腹腔内
投与した。４日後、４匹を無作為選出し、眼窩静脈より
採血し、末梢白血球数および末梢好中球数が充分減少し
ていることを確認後、残りのマウスを２群に分け、翌日
より一方の群（コントロール群）には、最終濃度１％の
ｎ−プロパノールおよび最終濃度10％の同系マウス血清
を含む生理食塩水溶液0.1mlを、もう一方の群（ＳＦ投
与群）には最終濃度１％のｎ−プロパノール、最終濃度
10％の同系マウス血清及び参考例２で得たヒトＧ−ＣＳ
Ｆ2.5μｇを含む生理食塩水溶液0.1mlをそれぞれ１日１
回２日間、皮下投与した。所定の日に各群より４匹のマ
ウスを無作為選出し、眼窩静脈より採血し、末梢白血球
数および末梢好中球数を求めた。この実験において、投
与はすべて午前９時に、採血は午後３時に行った。採血
した血液中の白血球数の計測、白血球の膨類、末梢好中
球数の算出は参考例15と同様にして行った。

ＣＰ無処理の同系マウス（４匹）について同様に処理
し、ＣＰ投与前の値とした。

この実験においてマウスからの採血は一度限りとした。

本実験結果を表−６に示す。また参考例13（Ｃ１２７細
胞由来の＋ＶＳＥ及びＣＨＯ細胞由来の−ＶＳＥ）にお
けるアミノ酸分析に用いた精製ヒトＧ−ＣＳＦ試料を用
いて上記と同一の試験を行ったところ本試験と同様の結
果が得られた。

以上のようにヒトＧ−ＣＳＦを投与することにより、白
血球数及び好中球数の減少状態からの回復が明らかに速
められた。

尚、上述のとおり、以上の結果はヒトＧ−ＣＳＦがその
産生細胞の培養上清から得られたものの場合だけでな
く、本出願人が取得に成功したその遺伝子を含有する形
質転換体から産生されたヒトＧ−ＣＳＦであっても、同
じ結果になるということが確認されている。

これ等の結果から、本発明のヒトＧ−ＣＳＦは白血球減
少症の治療薬として有効であることが示唆された。

またこの実験条件下において毒性は認められなかった。

実施例１参考例２の方法によって得られたヒトＧ−ＣＳＦ含有フ
ラクションを無菌処理した後−20℃で凍結された凍結物
を用いて注射剤とした。

実施例２参考例12で得たＣ１２７細胞由来の＋ＶＳＥ系ヒトＧ−
ＣＳＦを更に参考例２−−(iii)の精製方法によって
精製し、これを無菌操作で10mlバイアル瓶に５ml充填し
−20℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍結乾燥物を用
いて注射剤とした。

実施例３参考例12で得たＣＨＯ細胞由来の−ＶＳＥ系ヒトＧ−Ｃ
ＳＦを更に参考例２−−(iii)の精製方法によって精
製し、これを無菌操作で10mlバイアル瓶に５ml充填し−
20℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍結乾燥物を用い
て注射剤とした。

〔発明の効果〕

上述の通り、本発明は従前入手が極めて困難であったヒ
トＧ−ＣＳＦを大量且つ高品質で取得可能にしたという
成果を基にしてなされたものであって、充分に成熟した
形態を有する好中球の増加作用、及び好中球減少阻止作
用を有し、副作用も少ない白血球減少症治療剤として有
用なものである。

【図面の簡単な説明】

図１はプローブ（ＩＷＱ）、プローブ（Ａ）およびプロ
ーブ（ＬＣ）の配列を示す。図２はｐＢＲＧ４のｃＤＮＡインサートの塩基配列を示
す。図３はｐＢＲＶ２のｃＤＮＡインサートの塩基配列を示
す。図４は発現用組換えベクターｐＴＮ−Ｇ４の構築プロセ
スを示す。図５はｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒの構築プロセスを示す。図６は発現用組換えベクターｐＴＮ−Ｖ２の構築プロセ
スを示す。図７は発現用組換えベクターｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒの構
築プロセスを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者尾野雅義東京都豊島区高田３丁目41番８号中外製薬株式会社内 (56)参考文献特開昭56−18591（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−114525（ＪＰ，Ａ) 特開昭53−121916（ＪＰ，Ａ) 特開昭54−140707（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−81781（ＪＰ，Ａ) 特表昭63−500636（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有するヒト顆粒球コ
ロニー刺激因子を有効成分とする白血球減少症治療剤。「理化学的性質」分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による測定で19,000±1,000 。等電点：ｐＩ＝5.5±0.1，ｐＩ＝5.8±0.1，ｐＩ＝6.
1±0.1の三つの等電点のうち少なくとも１つを有する。紫外部吸収：280ｎｍに極大吸収を有し、250ｎｍに極
少値をもつ。
【請求項２】ヒト顆粒球コロニー刺激因子が下記のアミ
ノ酸配列またはその一部で表わされるポリペプチドを有
するものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
に記載の白血球減少症治療剤。 (Met)_n Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln
Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys I
le Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu (Va
l Ser Glu)_m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Gl
u Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro
Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gl
n Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Il
e Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln
Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gl
n Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro
Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gl
n Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu
Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg Hi
s Leu Ala Gln Pro （但しm は０又は１を表わし、n は
０又は１を表わす）