JPH06102021B2 - 新規なポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なポリペプチド、特に主としてヒト顆粒球
系細胞のコロニー形成をさせるために必要な、特異的な
刺激因子、すなわちコロニー刺激的因子（以下「CSF」
と略記する）活性を有するポリペプチドに関し、且つ該
ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ組換えベ
クター並びに、これを含む形質転換体、及びそれから産
生されるCSF組成物に関する。

〔従来の技術〕

２層軟寒天培養法で、上層に標的細胞として骨髄細胞
を、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養すると、上層
の細胞の一部が増殖分化し、好中球系顆粒球（以下「顆
粒球（granulocyte）」と称す。）や単球マイクロファ
ージからなるコロニーが形成されることから、生体内に
コロニー形成を促進する因子が存在することが知られて
いた （PluznikとSach;J.Cell.Comp.Physiol.,66巻319頁（19
65）,BradleyとMetcalf;Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.,44
巻287頁（1966））。

CSFと総称されるこの因子は、正常に広く生体内分布す
る細胞、たとえば、Ｔ細胞、単球マクロファージ、繊維
芽細胞、内皮細胞などより産生されることが知られてい
る。CSFには顆粒球・単球マクロファージの幹細胞に作
用して、その増殖を刺激し分化を誘導して、軟寒天中で
顆粒球や単球マイクロファージから成るコロニーを形成
させる作用をもつ顆粒球−単球マイクロファージCSF（G
M−CSFと略記する。）、主として単球マクロファージの
コロニーを形成させる作用をもつ単球マクロファージCS
F（Ｍ−CSFと略記する。）、より未分化な多能性幹細胞
に作用する多能性CSF（multi−CSFと略記する。）、あ
るいは本発明の如き、主として顆粒球系コロニーを形成
させる作用をもつ顆粒球CSF（Ｇ−CSFと略記する。）な
どのサブクラスが存在し、それぞれのサブクラスによっ
て標的細胞の分化段階も異なることが考えられる様にな
ってきた 〔Asano;代謝−Metabolism and Disease,22巻249頁（19
85）,Yunis等；“Growth and Maturation Factors",edi
ted by Guroff,John Wiley＆Sons.NY,1巻,209頁（198
3）］。

従って個々のサブクラスを精製し、その化学的性状や生
物学的性状をより詳細に調べることは造血機構や種々の
血液学的疾患の病態の解析にきわめて重要なことであ
る。中でもＧ−CSFの生物学的作用として、骨髄性白血
病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進が注目されて
おり、特に白血病の治療と予防へのＧ−CSFの臨床的有
用性が大いに期待されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

Ｇ−CSFの単離精製のために従来行われてきた試みは、
細胞培養法を用いて、その培養上清からＧ−CSFを単離
する方法であるが、Ｇ−CSFが低濃度しか産生されない
こと、大量の培養液から微量のＧ−CSFを得るには複雑
な精製過程を必要とするなどの難点をかかえ未だ大量の
均一なＧ−CSFを得るには至っていない。従って、組換
えDNA技術を用いてＧ−CSFを大量に製造することが渇望
されていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は特許請求の範囲第１項に記載したアミノ酸配列
で表わされるヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
ポリペプチドを提供するものである。又該ポリペプチド
を産生するために用いられる組換えベクター、及びこれ
で宿主を形質転換体して得た形質転換体とそれから産生
されるＧ−CSF組成物も同時に提供するものである。

なお、本発明にとり特に重要な構成要件はヒトＧ−CSF
活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であっ
て、詳しくはショ糖密度勾配遠心法により15〜17S画分
として得られる。ヒトＧ−CSF活性を有するポリペプチ
ドをコードするメッセンジャーRNA（mRNA）に相補的なD
NA（cDNA）であり、より詳しくは図３（Ｂ）のポリペプ
チドＩ又はIIをコードする遺伝子あるいはその一部を有
するものであり、さらに詳細には図３（Ａ）の塩基配列
の５′−末端から32〜34ヌクレオチド位のATGから650〜
652ヌクレオチド位のCCCまでの配列、122〜124位のACC
から650〜652位のCCCまでの配列または図３（Ａ）に記
載された配列あるいはその一部を有するものである。

本発明の遺伝子は例えばＧ−CSF活性を有するポリペプ
チドを産生する能力を有する哺乳動物細胞等からＧ−CS
FをコードするmRNAを調製した後、既知の方法により２
本鎖cDNAに変換することによって得られる。

前記、mRNAの供給源となる哺乳動物細胞は本発明におい
ては、ヒト口腔底癌由来の細胞株CHU−２（Collection
Nationale De Cultures De Microorganismes （C.N.C.
M）寄託番号Ｉ−483）であるが、腫瘍細胞株にかぎら
ず、哺乳動物から分離できる細胞、あるいは樹立した他
の細胞株でもよい。又、mRNAの調製はすでに他のいくつ
かの生理活性タンパクの遺伝子をクローン化する際、用
いられた方法、例えば、バナジウム複合体等のリボヌク
レアーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、フェノ
ール処理を行う（BergerとBirkenmeier;Biochemistry18
巻5143頁（1979）を参照）か、グアニジンチオシアナー
ト処理後、CsCl密度勾配遠心を行う（Chirgwin等;Bioch
emistry18巻5294頁（1979）を参照）ことによって、全R
NAを得た後、オリゴ（dT）−セルロースやセファロース
2Bを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィ
ニティ−カラム法あるいはバッチ法によりポリ（A⁺）RN
A（mRNA）を得ることができる。またショ糖密度勾配遠
心法等によりポリ（A⁺）RNAを更に分画することもでき
る。上記の如くして得られたmRNAが、Ｇ−CSF活性をも
つポリペプチドをコードするものであることを確認する
ためには、mRNAをタンパク質に翻訳させ、生理活性を調
べるか、抗Ｇ−CSF抗体を用いてそのタンパクを同定す
る等の方法を行えばよい。例えば、アフリカツメガエル
（Xenopus laevis）の卵母細胞にmRNAを注入して翻訳さ
せたり（Gurdon等;Nature,233巻 177頁（1972）を参
照）、あるいはウサギ網状赤血球（Reticulocyte）系や
小麦胚芽（wheatgerm）系を利用した翻訳反応が行われ
ている（SchleifとWensink;“Practical Methods in Mo
lecular Biology",Springer−Verlag,NY,（1981））。
Ｇ−CSF活性の検定は骨髄細胞を用いた軟寒天培養法を
適用して実施できる。それらの手法については総説があ
る（Metcalf;“He mopoietic Colonies",Springer−Ver
lag,Berl in,Heidelberg,NY（1977））。

前述の如き方法で得たmRNAを鋳型にして１本鎖cDNAを合
成した後、この１本鎖cDNAから１本鎖cDNAを合成し、適
当なベクターDNAとの組換えプラスミドを作成する。こ
れを大腸菌（Escherichia coli）などを形質転換して、
形質転換株のDNA群（以下、cDNAライブラリーと称す
る。）を得る。

mRNAから２本鎖cDNAを得るには、例えばmRNAの３′−末
端にあるポリＡ−鎖に相補的なオリゴ（dT）をプライマ
ーとして逆転写酵素で処理するか、またはＧ−CSFタン
パクのアミノ酸配列の一部に相応するオリゴヌクレオチ
ドを合成し、これをプライマーとして逆転写酵素で処理
してmRNAに相補的なcDNAを合成する。２本鎖cDNAは、ア
ルカリ処理でmRNAを分解・除去した後、得られた１本鎖
cDNAを逆転写酵素又はDNAポリメラーゼ（例えばKlenow
断片等）処理後Slヌクレアーゼ等で処理して得るか、あ
るいは、直接RNase HおよびDNAポリメラーゼ（例えば、
大腸菌のDNAポリメラーゼＩ等）等で処理することによ
っても得ることができる（例えば、Maniatis等;Molecul
ar cloing,Cold Spring HarborLaboratory（1982）およ
びGublerとHoffman;Gene25巻263頁（1983）を参
照。）。

このようにして得られた２本鎖cDNAを適当なベクター、
例えば、pSC101,pDF41,ColE1,pMB9,pBR322,pBR327,pACY
C1などに代表されるEK型プラスミドベクターや、λgt.
λc,λgt10,λgtWESなどに代表されるファージベクター
などに組み込んだ後、大腸菌（X1776;HB101;DH1,C600株
など）等を形質転換してcDNAライブラリーを得ることが
できる（例えば、前出“Molecular cloning"を参照）。

２本鎖cDNAをベクターと連結させるには、DNA末端に連
結可能な末端をつけるべく、適当な化学合成DNA断片を
追加し、予め制限酵素を用いて開裂させたベクターDNA
とATP存在下にT4ファージDNAリガーゼで処理することに
より行うことができる。あるいは、予め制限酵素を用い
て開裂させたベクターDNAと２本鎖cDNAのそれぞれにdG,
dC−鎖（あるいはdA,dT−鎖）を付加した後、例えば両D
NAを含む溶液を徐冷することによっても行うことができ
る（前記Molecular cloningを参照）。

こうして得られた組換えDNA体による宿主細胞の形質転
換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合Hanahanが詳細に
記述している如き方法（J.Mol.Biol.;166巻557頁（198
3））、すなわち、CaCl₂やMgCl₂又はRbClを共存させて
調製したコンピテント細胞に該組換えDNA体を加えるこ
とにより実施することができる。

目的とする遺伝子を保有する細胞を検索するには、イン
ターフェロンcDNAのクローン化で用いられたプラス−マ
イナス法（Taniguchi等;Proc.Jpn.Acad.55巻Ser.B,464
頁（1979））や、ハイブリダイゼーション−トランスレ
ーションアッセイ法（Nagata等;Nature284巻316頁（198
0））など、又は該タンパク質のアミノ酸配列をもとに
して化学合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いた
コロニーあるいはプラークハイブリダイゼーション法
（Wallace等;Nucleic Acids Res.,9巻879頁（1981））
などを用いればよい。

このようにしてクローン化されたヒトＧ−CSF活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子を含む断片は適当
なベクターDNAに再び組み込むことにより、他の原核生
物または真核生物の宿主細胞を形質転換させることがで
きる。更にこれらのベクターに適当なプロモーター及び
形質発現に係る配列を導入することにより、それぞれの
宿主細胞に於いて遺伝子を発現させることが可能であ
る。

原核生物宿主細胞としては、例えばEscheric hia coli,
Bacillus subtills,Bacillus therm ophilus等が挙げら
れる。目的の遺伝子をこれ等の宿主細胞内で形質発現さ
せるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコン、すな
わち複製起源および調節配列を含んでいるプラスミドベ
クターで宿主細胞を形質転換させればよい。またベクタ
ーは形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与
することができる配列をもつものが望ましい。

例えば、E.coliは、それを宿主とするベクターであるpB
R322を用いて形質転換することができる（Boliver等;Ge
ne2巻95頁（1975）を参照）。pBR322はアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、どち
らかの耐性を利用することによって形質転換細胞を同定
することができる。原核生物宿主の遺伝子発現に必要な
プロモーターとしては、β−ラクタマーゼ遺伝子のプロ
モーター（Chang等;Nature275巻615頁（1978），やラク
トースプロモーター（Goeddel等;Nature281巻544頁（19
79）を参照。）およびトリプトファンプロモーター（Go
eddel等;Nucleic Acid Res.）8巻4057頁（1980）を参
照）等があげられ、どのプロモーターも本発明のヒトＧ
−CSF活性をもつポリペプチドの産生に使用することが
できる。

以上の如き宿主−ベクター系を用いてヒトＧ−CSF活性
を有するポリペプチドを得るには、上記ベクターの適当
な部位に該遺伝子を組み込んだ組換えDNA体により宿主
細胞を形質転換させた後、得られた形質転換体を培養す
ればよい。さらに細胞内または培養液から該ポリペプチ
ドを分離・精製するには、公知の手段を用いて行うこと
ができる。

一般に真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子
等で知られるように、多形現象（polymorphysm）を示す
と考えられ（例えばNishi等;J.Biochem.97巻153頁（198
5）を参照）、この多形現象によって１個またはそれ以
上のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変
化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。

また図３（Ｂ）アミノ酸配列の中の１個またはそれ以上
のアミノ酸を欠くか又は付加されたポリペプチド、ある
いは１個またはそれ以上のアミノ酸が１個またはそれ以
上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでもＧ−CSF活
性を有することがある。例えば、ヒトインターロイキン
２（IL−２）遺伝子のシステインに相当する塩基配列を
セリンに相当する塩基配列に変換して得られたポリペプ
チドがインターロイキン２活性を保持することもすでに
公知となっている。（Wang等;Science,224巻1431頁（19
84））。それゆえ、それ等天然に存在するかあるいは人
工合成されたポリペプチドがヒトＧ−CSF活性を有する
限りそれ等のポリペプチドをコードする遺伝子は全て本
発明に含まれる。

本発明のヒト−Ｇ−CSF活性をもつポリペプチド、及び
これをコードする遺伝子を有する組換えベクター及びこ
れを有する形質転換体、さらにはその発現ヒト−Ｇ−CS
F組成物を得る方法について簡単に説明すると以下の通
りである。

（１）プローブの調製 腫瘍細胞株CHU−２の培養上清から精製して得られた均
一ヒトCSF・タンパクについてＮ末端よりアミノ酸配列
を決定し、さらにブロムシアン分解、トリプシン処理な
どにより断片化した後その断片についてもアミノ酸配列
を決定した。

［実施例３（ｉ），（ii），（iii）］ そのアミノ酸配列中から図１に示される配列に対応する
２種類のヌクレオチドプローブ（Ａ），およびプローブ
（IWQ）を合成した。（実施例４）プローブ（Ａ）は連
続した14個のヌクレオチドからなる混合型プローブであ
る。

プローブ（IWQ）は、ヒトコレシストキニン遺伝子のク
ローン化で用いられた如き（Takahashi等;Proc.Natl.Ac
ad.Sci.,USA,82巻1931頁（1985））デオキシイノシンを
使用した30個の連続したヌクレオチドである。

ヌクレオチドの化学合成は改良型ホスホトリエステル法
を固相法に適用して行うことができ、Narangの総説に記
述されている（Tetrahedron39巻３−22頁（1983））。

使用するプローブは、本発明で用いたプローブ以外の位
置のアミノ酸配列に基づくものであってもよい。

（２）cDNAライブイリーの構築 CHU−２細胞にグアニジンチオシアナート溶液を加えて
ホモジナイズし、CsCl密度勾配遠心法により全RNAを得
る。

この全RNAからオリゴ（dT）セルロースカラムによりポ
リ（Ａ^＋）RNAを選別した後、逆転写酵素により１本鎖c
DNAを合成し、RNase HおよびE.coliDNAポリメラーゼＩ
を加えて、２本鎖cDNAを得た。得られた２本鎖cDNAにdC
鎖を付加し、PstI切断部位にdG鎖を付加したpBR322ベク
ターとつなぎ合せて、大腸菌X1776株を形質転換させ、p
BR322系cDNAライブラリーを構築した。（実施例5,6） 同様に、EcoRIリンカーを用いて、２本鎖cDNAをλgt10
ベクターと連結し、λファージcDNAライブラリーを構築
した。（実施例７） （３）スクリーニング pBR322系cDNAライブラリー由来の組換え体をワットマン
541濾紙に固定し、³²Ｐで放射標識したプローブ（IWQ）
を用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行った結
果、１個のクローンが選別できた。このクローンを、サ
ザンブロッティング法（Southern;J.Mol.Biol.98巻503
頁（1975））を用いて更に詳細に検討したところ、プロ
ーブ（Ａ）ともハイブリダイズした。

このクローンの塩基配列をジデオキシ法 （Sanger;Science214巻1205頁（1981））によって決定
した。

得られたcDNAインサートの塩基配列を図２に示す。図２
に示される如く、このcDNAインサートはプローブ（IW
Q）およびプローブ（Ａ）を含む308塩基対からなり、実
施例３（iii）に示したアミノ酸配列を含む83個のアミ
ノ酸をコードするオープンリーディングフレームを有し
ていることがわかった。

この308塩基対を含むpBR322由来のプラスミドを以下pHC
S−１と略記する。（実施例８） pHCS−１から得られる308塩基対を含むDNA断片をニック
トランスレーション法（前出、Molecular Cloningを参
照）にて放射標識し、これをプローブとしてλgt10由来
のcDNAライブラリーをプラークハイブリダイゼーション
（BentonとDavis;Science196180頁（1977）によりスク
リーニングして５個のクローンを得、cDNAを含むと思わ
れるクローンについてその塩基配列を前述と同様の方法
で決定した。（図３（Ａ）） 図３（Ａ）に示される如く、このcDNAインサートは一つ
の大きなオープンリーディングフレームを有する。

このcDNAによってコードされるアミノ酸配列は図３
（Ａ）に示された如く演えきできる。

実施例３（ｉ）に示されているＧ−CSFタンパクのＮ末
端アミノ酸配列との比較により、本cDNAは５′−末端か
ら32〜34ヌクレオチド位のATG配列から始まり、119〜12
1位のGCC配列で終わる90塩基対によってコードされるシ
グナルペプチドおよび122〜124位のACC配列から始まり6
50〜652位のCCC配列で終わる531塩基対によってコード
される成熟Ｇ−CSFポリペプチドに相当する塩基配列を
含んでいることがわかった。従って図３（Ｂ）に示され
たアミノ酸配列Ｉのポリペプチドは207個のアミノ酸か
らなり、その分子量は22292.67ダルトンと計算された。
同様にアミノ酸配列IIのポリペプチドは18986.74ダルト
ンであった。（実施例９） 但しタンパク質の開始部位に関しては、32〜34位あるい
は68〜70位のATGも同様に考え得る。EcoR1切断部位にこ
のcDNAを挿入した、pBR322を保持するエシエリヒア・コ
リ（E.coli）X1776株は、工業技術院微生物工業技術技
術研究所に寄託されている（FERM BP−954）。

図４には、得られた遺伝子の制限酵素切断部位を示し
た。

（４）組換えベクターの構築 かくして得られたpBRV2プラスミド（実施例９）からＧ
−CSFポリペプチドのcDNA断片を制限酵素により切り出
して来て、これと tacプロモーターを含有するpKK223−３（ファルマ
シア社製）から調製した断片とアニーリングした合成リ
ンカーを連結（ライゲーション）し組換えベクターを構
築するか（実施例10） Ｐ_Ｌプロモーターを含むpPL−lambda（ファルマシ
ア社製）から調製した３種の断片とアニーリングした合
成リンカーを連結し、再調整して組換えベクターを構築
するか（実施例11） あるいはtrpプロモーター含有pOYIプラスミドから調製
した断片とアニーリングした合成リンカーを連結して組
換えベクターを構築する。（実施例12） （５）形質転換体の調製と培養、発現。

次に上記３種の組換えベクターを用いて前出のMolecula
r Cloningに記載されている塩化カルシウム法又は塩化
ルビジウム法で、夫々E.coliDH1株,E.coli N4830株或い
はE.coliJM105株を形質転換した。（実施例10,11,12）
得られた形質転換株をアンピシリン含有ルリア（Luri
a）培地でまず培養し次いで必要に応じて、適宜誘導を
かけ、培養を行い形質発現せしめた。（実施例13） （６）大腸菌からのＧ−CSFポリペプチドの回収精製と
アミノ酸分析 形質転換株の培養液を遠心にかけ集菌した後リゾチーム
処理をし、凍結−融解をくりかえし溶菌させる。次いで
塩酸グアニジン処理後遠心で上澄液を得る。

これをUltrogel ACA54カラム（LKB社製）でゲル濾過
し、活性画分を限外濾過器で濃縮した。

次に、ｎプロパノールを含むトリフルオロ酢酸水溶液を
添加し、氷中放置、遠心分離し、逆相C18カラムに吸
着、溶出操作を施す。溶出後各画分の活性を調べ、活性
ピークを集め凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末を溶解し
高速液体クロマトグラフィにかけ、再度上記と同様の精
製操作を行い取得したポリペプチドをSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけ目的とするＧ−CSFポリペ
プチドを示す単一のバンドを確認した。（実施例14）こ
の様にして得られたポリペプチドはヒトＧ−CSF活性を
示した。（実施例15）更に、得られたＧ−CSFポリペプ
チドのアミノ酸分析はアミノ酸組成を日立835アミノ酸
自動分析装置（日立製作所製）を使用し、特殊アミノ酸
分析法によって分析した。又、Ｎ末端アミノ酸分析は気
相式シークエンサーを用いてエドマン分解し、高速液体
クロマトグラフィー及び、Ultrasphere−ODSカラムを用
いて行った。（実施例16） 〔実施例〕 以下実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、その前
にCSF活性の測定法について参考例で説明しておく。

＜参考例＞CSF活性の測定方法 本発明において用いられたCSF活性（以下CSAと略す）の
測定方法は次のとおりである。

「CSAの測定方法」 （ａ）ヒト骨髄細胞を用いる場合： Bradley T.R.,Metcalf D.等の方法 （Aust.J.exp.Biol.med.Sci.44巻287〜300頁,1966年）
に準じて単層軟寒天培養法により行った。すなわちウシ
胎児血清0.2ml,被検検体0.1ml,ヒト骨髄非付着性細胞浮
遊液0.1ml（１〜２×10⁵有核細胞），改変McCoy′s5A培
養液0.2ml,寒天を0.75％含む改変 McCoy′s5A培養液0.4mlを混合して直径35mmの組織培養
プラスティックディッシュに入れて固まらせたのち、37
℃,5％炭酸ガス/95％空気,100％湿度の条件で培養を行
い、10日後に形成されたコロニー数（50個以上の細胞か
らなる集落を１コロニーとする）を数え、１個のコロニ
ーを形成する活性を１単位（Unit）としてCSAを求め
た。

（ｂ）マウス骨髄細胞を用いる場合： ウマ血清0.4ml,被検検体0.1ml,C3H/He（メス）マウスの
骨髄細胞浮遊液0.1ml（0.5〜１×10⁵有核細胞），寒天
を0.75％含む改変McCoy′s5A培養液0.4mlを混合し直径3
5mmの組織培養用プラスティックディッシュに入れて固
まらせたのち、37℃,5％炭酸ガス/95％空気、100％湿度
の条件下にて５日間培養し、形成されたコロニー数（50
個以上の細胞からなる集落を１コロニーとする）を数
え、１個のコロニーを形成する活性を１単位（Unit）と
してCSAを求めた。

尚、上記（ａ），（ｂ）の方法において用いた「改変Mc
Coy′s5A培養液および（ａ）で用いたヒト骨髄非付着性
細胞浮遊液は次の如くして作成した。

「改変McCoy′s5A培養液（２倍濃度）」McCoy′s5A培養
液（GIBCO社製）12g,MEMアミノ酸ビタミン培地（日水製
薬社製）2.55g重炭酸ナトリウム2.18g、ペニシリンＧカ
リウム50000単位を２回蒸溜水500mlに溶解後、0.22μｍ
のミリポアフィルターにて濾過滅菌を行った。

「ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液」 健常人胸骨せん刺により得た骨髄液をRPMI1640培養液に
て５倍に希釈し、Ficol−Paque液（ファルマシア社製）
に重層し、400×g,30分,25℃にて遠心を行い、界面の細
胞層（比重＜1.077）を回収する。この細胞を洗浄後、2
0％ウシ胎児血清を含むRPMI1640培養液にて５×10⁶Cell
/mlの濃度に調製し、25cm²の組織培養用プラスチックフ
ラスコに入れ、炭酸ガス培養器にて30分間インキュベー
トしたのち、上清の非付着性細胞を回収し、再度25cm²
プラスチックフラスコに入れ、２時間30分インキュベー
トしたのち、上清の非付着性細胞を集めて用いた。

実施例1.「CHU−２〕の樹立 著明な好中球の増多が認められた口腔底癌患者の腫瘍を
nu/nuマウスに移植した。この腫瘍は移植約10日後に著
明な腫瘍の増大と好中球の増多が認められた。この腫瘍
を移植12日後に無菌的に摘出し、１〜２mm³角に細切
し、これを以下の如く培養した。

上記細切した腫瘍塊10〜15片を50mlのプラスチック遠心
管に入れ、5mlのトリプシン溶液（トリプシン0.25％,ED
TA0.02％含む）を加え、37℃の温浴中で10分間振とうし
たのち上清を捨て、再度、同トリプシン溶液5mlを加
え、37℃で15分間攪拌しながらトリプシン消化を行っ
た。上清の細胞浮遊液を回収し、ウシ胎児血清を1ml加
えてトリプシンの作用を止めたのち氷中に保存した。

以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収し、前回の分と
合わせて1,500r.p.m.10分間の遠心により細胞ペレット
を得た。この細胞ペレットをウシ胎児血清を10％含むＦ
−10にて２回洗浄したのち、25cm²のプラスチック培養
フラスコに細胞濃度５×10⁶個／フラスコになるように
して植え込んだ。ウシ胎児血清を10％含有するＦ−10培
養液を用い、炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度
５％，湿度100％）中にて一晩インキュベートしたの
ち、上清を非付着細胞と共に除去し、新しい培養液を加
えて培養を継続した。培養開始後６日目に細胞がいっぱ
いに増殖したので、この時点で培養液を新しいものに替
えた。翌日、この培養液を捨て、RPMI1640で５倍希釈し
た抗マウス赤血球抗体（Cappel社製）2mlと同じくRPMI1
640で2.5倍希釈したモルモット補体（極東製薬社製）2m
lを加え37℃,20分間インキュベートした。インキュベー
ション終了後ウシ胎児血清を10％含むＦ−10にて２回洗
浄しnu/nuマウス由来のフィブロブラストを除去し、引
き続きウシ胎児血清を10％含むＦ−10培養液を加えて、
さらに２日間培養を行った後細胞の一部を取り出し、限
界希釈法によりクローニングを行った。

得られた11コのクローンについてCSF活性を調べたとこ
ろ、他のものよりも約10倍高い活性を示すクローン（CH
U−２）が得られた。

実施例2.CSFの単離 上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増殖した15
0cm²の培養フラスコ２本より細胞を回収し、これをウシ
胎児血清を10％含有するＦ−10培養液500mlに浮遊した
のち、1580cm²のガラス製ローラーボトル（Belco社製）
に移し、0.5r.p.m.の速度で回転培養を行った。細胞が
ローラーボトルの内壁に完全に密に増殖した時点で培養
液を血清を含まないRPMI1640に交換し、４日間培養した
のち培養上清を回収し、ウシ胎児血清を10％含有するＦ
−10を加えて培養を続行する。３日間培養したのち再び
血清を含まないRPMI1640に液替を行い、４日後に培養上
清を回収した。以下同様の操作をくり返すことにより、
毎週１ボトルより500mlずつの血清を含まない培養上清
が得られ、しかもこの方法によりかなり長時間にわたっ
て細胞を維持し、培養上清を回収することが可能であっ
た。

得られた培養上清5lを１バッチとし、これに0.01％ツィ
ーン20を添加後Hollow Fiber DC−４およびAmicon PM−
10（アコン社製）を用いた限外濾過法により約1000倍に
濃縮したのち、これを以下の順序で精製した。

（ｉ）直径4.6cm,長さ90cmのUltrogel ACA54カラム（LK
B社製）を用い、0.15M NaClおよび0.01％ツィーン20
（半井化学社製）を含む0.01Mトリス塩酸緩衝液（pH7.
4）を用いて前記濃縮した培養上清5mlを流速約50ml/時
間でゲル濾過した。尚カラムはあらかじめウシ血清アル
ブミン（分子量67,000），オボアルブミン（分子量45,0
00），チトクロームＣ（分子量12,400）にてキャリブレ
ーションシを行った。ゲル濾過終了後各フラクションよ
り0.1mlずつを採取し、10倍に希釈した後、前述した「C
SAの測定方法（ｂ）」により活性を示す画分を調べた。
この結果、先ずVe＝400〜700mlの画分がマクロファージ
優位のCSAを示し、Ve＝800〜1200mlの画分が顆粒球優位
のCSAを示すことがわかったので、後者の画分を集めPM
−10（アミコン社製）を用いる限外濾過器によって約5m
lに濃縮した。

（ii）上記濃縮画分にｎ−プロパノール（東京化成社
製，アミノ酸配列決定用）を30％含む0.1％トリフルオ
ロ酢酸水溶液を添加し、氷中に15分程度放置したのち、
15,000r.p.m.10分の遠心により沈澱を除去した。次いで
先のｎ−プロパノールおよびトリフルオロ酢酸を含む水
溶液で平衡化したμ Bondapak C18カラム（Waters社
製、セミ分取用,8mm×30cm）に吸着後、30〜60％の直線
濃度勾配のｎ−プロパノールを含む0.1％トリフルオロ
酢酸水溶液で順次溶出した。高速液体クロマト装置は日
立685−50型を、検出は日立638−41型検出器（いずれも
日立製作所製）を用い、220nmと280nmの吸収を同時に測
定した。溶出後、各画分より10μｌを分取100倍希釈し
たたのち、前述の「CSAの測定法（ｂ）」により活性を
示す画分を調べた。この結果、ｎ−プロパノール40％に
て溶出されるピークに活性が認められたので、このピー
クを集め再度同じ条件で再クロマトを行い上記と同様に
してCSAを調べたところ、やはりｎ−プロパノール40％
の位置のピークに活性が認められたので、このピークを
集め（４フラクション＝4ml）凍結乾燥した。

（iii）上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパノールを40％含
む0.1％トリフルオロ酢酸水溶液200μｌに溶解し、TSK
−G3000SWカラム（東洋曹達社製.7.5mm×60cm）を用い
た高速液体クロマトグラフィ（HPLC）にかけた。溶出は
同水溶液により0.4ml/分の流速で行い、フラクションコ
レクターFRAC−100（ファルマシア社製）により0.4mlず
つ分取した。分取した各画分についてCSAを前記と同様
にして調べた結果、保持時間が37〜38分の画分（分子量
約２万に相当）に活性が認められたので、この画分を回
収し、更に分析用μ Bondapak C18カラム（4.6mm×30c
m）による精製を施したのち、メインピークを回収し凍
結乾燥した。得られた標品について前述の「CSAの測定
方法（ａ）」によって検定したところヒトＧ−CSF活性
を有することを認めた。

実施例3.アミノ酸配列の決定 （ｉ）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 試料を気相式シークエンサー（アプライドバイオシステ
ム社製）を用いてエドマン（Edman）分解し、得られたP
THアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー装置（ベック
マン・インストルメンツ社製）およびUltrasphere−ODS
カラム（ベックマン・インストルメンツ社製）を用いて
常法により分析した。カラム（５μm,直径4.6mm,長さ25
0mm）を開始緩衝液（15mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5,4
0％アセトニトリルを含む水溶液）にて平衡化したの
ち、検体（20μｌの開始緩衝液にて溶解）を注入して開
始緩衝液によるイソクラティック溶出により分離を行っ
た。流速は1.4ml/分、カラム温度は40℃に保持した。PT
Hアミノ酸の検出は269nmと320nmの紫外部吸収を利用し
た。あらかじめ標準PTHアミノ酸（シグマ社製）各2n mo
lを同一の系で分離して保持時間を決定し、被検検体の
保持時間から同定を行った。この結果、Ｎ末端から21残
基目までのアミノ酸配列は次の如く決定された。

（iii）ブロムシアン分解 飼料を70％ギ酸に溶かし、昇華精製したブロムシアン20
0当量を加えて、37℃で一夜反応させた。次に反応物を
凍結乾燥後、TSK G3000SWカラム（東洋曹達社製）を用
いたHPLCで画分し４つのピークを得た。ピークを分子量
の大きい順にCN−1,CN−2,CN−3,CN−４と命名し、収率
のよいCN−1,CN−２についてアミノ酸配列を自動気相式
シークエンサー（アプライドバイオシステム社製）を用
いて（ｉ）と同様の条件で分析した。

その結果、CN−１はＧ−CSFタンパクのＮ末端からのペ
プチドであることがわかった。さらにCN−２は以下のア
ミノ酸配列を有していた。

Pro−Ala−Phe−Ala−Ser−Ala−Phe−Gln−Arg−Arg−
Ala−Gly−Gly−Val−Leu−Val−Ala−Ser−His−Leu−
Gln− （iii）トリプシン分解 試料を8M尿素を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.4）に
溶かし、0.1％２−メルカプトエタノールを含む0.1Mト
リス塩酸緩衝液（pH7.4）を加えて最終的に2Mの尿素と
なるように調製した。次いで試料と酵素が50:1となるよ
うにTPCK処理トリプシン（シグマ社製商品名）を加え、
25℃で４時間反応させた後、さらに同量のTPCK処理トリ
プシンを加えて、再度25℃で16時間反応させた。反応
後、反応物をC8カラム（山村化学社製）を用いた高速逆
相カラムクロマトグラフィーに付した。溶出は0.1％TFA
を含むｎ−プロパノールを用い、ｎ−プロパノール濃度
を５％〜60％に直線的に上げて行った。280nmの紫外部
吸収を測定して得られたピークのうち、メインピークに
ついて（ｉ）と同条件下に自動気相式シークエンサー
（アプライドバイオシステム社製）を用いてアミノ酸配
列を分析しした。その結果、メインピークは（ii）のCN
−２断片の一部を含む以下の配列を有するペプチドであ
ることがわかった。

Gln−Leu−Asp−Val−Ala−Asp−Phe−Ala−Thr−Thr−
Ile−Trp−Gln−Gln−Met−Glu−Glu−Leu−Gly−Met−
Ala−Pro−Ala−Leu−Gln−Pro−Thr−Gln−Gly−Ala−
Met−Pro−Ala−Phe−Ala−Ser− 実施例4.DNAプローブの作成 （ｉ）プローブ（IWQ）の合成 実施例3.（iii）で得られたアミノ酸配列の中からIle−
Trp−Gln−Gln−Met−Glu−Glu−Leu−Gly−Metで示さ
れる10個のアミノ酸の配列に基づいて、30個の連続する
ヌクレオチドを得た（図１）。図１の配列に於いて、例
えば５′−末端から９位のヌクレオチドはdAおよびdGを
等量含む混合物であることを示す。原料のヌクレオチド
は主にダイマーを使用し、必要に応じて随時モノヌクレ
オチドも使用した。グラスフィルター付きカラムに出発
原料のヌクレオチド樹脂Ap−ｄ（Ｇ）（ヤマサ醤油社
製）20mgを入れ塩化メチレンにて洗浄を繰り返した後、
３％トリクロロ酢酸を含む塩化メチレン溶液にて、4,
4′−ジメトキシトリチル基を脱離せしめ、次いで1mlの
塩化メチレンでカラムを数回洗浄した。無水ピリジンで
洗浄して溶媒を置換したのちヌクレオチドダイマー（DM
Tr） ApTp（NHR₃）（日本ゼオン社製；NHR₃はトリエチルアン
モニウム,DMTrはジメトキシトリチルを示す）20mgと0.2
mlのピリジンを加えて真空ポンプにてカラム内を真空乾
燥した。次いで、2,4,6−トリメチルベンゼンスルホニ
ル−３−ニトロトリアゾリド（MSNT,和光純薬社製）20m
gと無水ピリジン0.2mlを加えた後、カラム内を窒素ガス
で置換して、室温下に45分間時々振とうさせることによ
ってヌクレオチド樹脂とダイマーを縮合させた。反応終
了後、ピリジンにてカラムを洗浄し、次いで未反応のOH
基を過過剰の無水酢酸−４−ジメチルアミノピリジンに
てアセチル化した後、再びカラムをピリジンで洗浄し
た。以下同様に、（DMTr）Ip（NHR₃），（DMTr）GpGp
（NHR₃），（DMTr）IP（NHR₃），（DMTr）CpTp（NHR₃）
と（DMTr）TpTp（NHR₃）の等量混合物，（DMTr）ApAp
（NHR₃）と（DMTr）ApGp（NHR₃）の等量混合物，（DMT
r）ApGp（NHR₃）と（DMTr）GpGp（NHR₃）の等量混合
物，（DMTr）GpAp（NHR₃），（DMTr）TpGp（NHR₃），
（DMTr）ApAp（NHR₃），と（DMTr）GpAp（NHR₃）の等量
混合物，（DMTr）CpAp（NHR₃），（DMTr）ApAp（NHR₃）
と（DMTr）ApGp（NHR₃）との等量混合物，（DMTr）GpCp
（NHR₃），（DMTr）TpGp（NHR₃），（DMTr）Ip（NH
R₃），（DMTr）ApTp（NHR₃）［（DMTr）IP（NHR₃）はヤ
マサ醤油社製，その他は全て日本ゼオン社製］の順で、
前述の操作を繰り返すことによって縮合させた。最終段
階の反応終了後、アセチル化することなしに、ピリジ
ン，塩化メチレン，エーテルの順で樹脂を洗浄した後，
乾燥させた。乾燥させた樹脂を1Mテトラメチルグアニジ
ンおよび1Mα−ピコリンアルドキシムを含むジオキサン
1ml,ピリジン0.5ml,水0.2mlの混合液1.7mlに懸濁した
後、一夜室温にて放置した後、100〜200μｌまで減圧濃
縮した。この濃縮液に少量（２〜３滴）のピリジンを加
えた後、濃アンモニア水２〜3mlを加え55℃で６時間加
温した。次いで酢酸エチルを加えて抽出分離し、得られ
た水層を減圧濃縮した後、50mMトリエチルアンモニウム
酢酸溶液（pH7.0）に溶解せしめてＣ−18カラム（1.0×
15cm,Waters社製）を用いたカラムクロマトグラフィー
に付した。溶出は、50mMトリエチルアンモニウム酢酸溶
液（pH7.0）中10％〜30％の直線濃度勾配のアセトニト
リルで行い、アセトニトリル濃度が25％付近の位置で溶
出されるピーク画分を減圧濃縮した。

この濃縮液に80％酢酸を加えて室温下に30分間放置した
後、酢酸エチルを加えて抽出・分離し得られた水層を減
圧下に濃縮した。得られた濃縮液は、C18カラム（セン
シュー科学社製,SSC−ODS−272,6φ×200mm）を用いた
高速液体クロマトグラフィーに付して、さらに精製し
た。

溶出は50mMトリエチルアンモニウム酢酸溶液（pH7.0）
中10％〜20％の直線濃度勾配にアセトニトリルを用いて
行い、10A₂₆₀units以上の収量で合成DNAが得られた。

得られたオリゴヌクレオチドはMaxam−Gilbert法（Met
h.Enzym.65巻499頁（1980）により塩基配列を調べた結
果、図１に示された配列を有していることが確認され
た。

（iii）プローブ（Ａ）の合成 実施例3.（iii）で得られたアミノ酸配列の中からMet−
Pro−Ala−Phe−Alaで示される５個のアミノ酸の配列に
基づいて14個の連続するヌクレオチドを得た。（図１） 合成は、プローブ（IWQ）と同様な方法で行いヌクレオ
チド樹脂AP−ｄ（Ｔ）（ヤマサ醤油社製）に（DMTr）Cp
Ap（NHR₃）；（DMTr）GpGp（NHR₃）；（DMTr）GpAp（NH
R₃），（DMTr）CpTp（NHR₃），（DMTr）CpGp（NHR₃）お
よび（DMTr）CpCp（NHR₃）の等量混合物；（DMTr）ApGp
（NHR₃），（DMTr）TpGp（NHR₃），（DMTr）GpGp（NH
R₃）および（DMTr）CpGpGp（NHR₃）の等量混合物；（DM
Tr）ApAp（NHR₃）；（DMTr）CpAp（NHR₃）と（DMTr）Cp
Gp（NHR₃）の等量混合物（DMTr）Gp（NHR₃）（いずれも
日本ゼオン社製）の順に縮合させた約10A260unitsの合
成DNAを得た。得られたオリゴヌクレオチドの塩基配列
をMaxam−Gilbert法により調べたところ図１に示された
塩基配列を有していることが確認された。

実施例5.CHU−２細胞の培養とmRNAの精製 １）CHU−２細胞の培養と細胞の回収 樹立されたCHU−２細胞を150cm²の培養フラスコ２本に
完全に密に増殖させた後、これをウシ胎児血清を10％含
有するRPMI1640培養液500mlに浮遊させたのち、1580cm²
のガラス製ローラーボトル（Belco社製）に移し、0.5r.
p.m.の速度で４日間回転培養を行った。細胞がローラー
ボトルの内壁に完全に密に増殖した時点で、ローラーボ
トルから培養液を除き、あらかじめ37℃に加温したEDTA
を0.02％含む生理食塩水100mlを加え、37℃で２分間加
温後、ピペット操作にて細胞をはく離せしめた。得られ
た細胞懸濁液を1500r.p.m.10分間の遠心にて細胞ペレッ
トを得る。細胞をEDTAを含まない生理食塩水5mlに再び
懸濁し、1500r.p.m.10分間遠心にて細胞ぺレットを得た
（湿重量約0.8g）、このようにして得られた細胞はRNA
抽出操作を行うまで−80℃にて凍結保存する。

２）mRNAの精製 上記の如くして得られたCHU−２細胞からのmRNAの単離
は本質的に“Molecular cloning"［Maniatis等,Cold Sp
ring Harbor,196頁（1982）］に記載されているように
して実施した。

凍結保存されていたCHU−２細胞（湿重量3.8g）に20ml
の6Mグアニジン溶液（6Mグアニジンチオシアナート,5mM
クエン酸ナトリウム（pH7.0）,0.1M/β−メルカプトエ
タノール,0.5％ザルコシル硫酸ナトリウム）に懸濁し、
Vortexミキサーにて２〜３分よく混合した後、18Gの注
射針を装てんした20ml容の注射器を用いて10回吸入排出
を繰り返した。ベックマン社製SWW40Tiローターに合う
ポリアロマー製の遠心チューブに6mlの5.7M CsCl−0.1M
EDTA,（pH7.5）を先に加えておき、チューブが満たされ
るように上述の細胞が壊れて粘稠になったグアニジン溶
液約6mlを重層した。このようにして調製された遠心チ
ューブ４本を30,000r.p.m.、20℃で15時間遠心した後、
得られたペレットを少量の70％エタノールを用いて３回
洗浄した。

各々のチューブから得られたペレットを合して550μｌ
の水に溶解せしめNaCl濃度が0.2Mとなるように調整した
のち、フェノール−クロロホルム（1:1）処理、クロロ
ホルム処理後、2.5倍容量のエタノールを加えてエタノ
ール沈澱を行い全RNAを得た。（湿細胞3.8gより全RNA約
10.1mgを得た。） 全RNAからポリ（A⁺）−RNAの精製は以下の如く行った。
この方法はmRNAが３′末端にポリＡ鎖を付加しているこ
とを利用したアフィニティークロマトグラフィーであ
る。オリゴ（dT）−セルロース（Ｐ−L Biochemicals社
製,Type7）を用い、吸着は全RNAを吸着緩衝液（10mMト
リス−塩酸（pH7.5）,0.5M NaCl,1mM EDTA,0.1％SDS溶
液を含む。）に溶解し、65℃で５分間加熱した後、同溶
液にて充てんされたオリゴ（dT）−セルロースカラムに
通過させて行い、溶出はTE溶液（10mMトリス−塩酸（pH
7.5）、1mM EDTAを含む。）で行った。未吸着通過液は
再び同カラムに通して同様に溶出操作を行い、１回目の
溶出液と混合した。このような操作を用いて、ポリ
（⁺A）−RNA400μｇを得た。

このようにして調整したmRNAをSchleifとWensinkの実験
技術書（Practical Methods in Molecular Biology,Spr
inger−Verlag,New York,Heiderberg,Berlin,（198
1））中に記載されている方法と同様の操作で、ショ糖
密度勾配遠心法によりサイズ画分した。

すなわち、SW40Tiローター（Beckman社製）用チューブ
に５％〜25％のショ糖密度勾配を作る。ショ糖溶液は0.
1M NaCl,10mMトリス−塩酸，（pH7.5）,1mM EDTA,0.5％
SDSの溶液にそれぞれ５％、25％の割合いで RNaseフリーのショ糖（Schwarz/Mann社製）を含んでい
る。

上記で述べた如き方法で調製したmRNA（ポリ）（A⁺）−
RNA）800μｇを200μｌ〜500μｌのTE溶液に溶解せし
め、65℃で５分間加熱後急冷した後、ショ糖密度勾配液
の上にのせる。30000r.p.m.にて20時間遠心後、0.5mlず
つの分画を集め260nmの吸光度を測り、同様に行った標
準RNA（28S,18S,5SのリボソームRNA）ら分画されたRNA
のサイズを決めると同時に、各分画のＧ−CSF活性をア
フリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞系を用
いて調べた。すなわち各分画のmRNAを１μg/μｌの濃度
の水溶液に調製し、ツメガエル（生後約１年）から取り
出した卵母細胞１個に50ngのmRNAの割合いで注入した
後、96穴のマイクロタイタープレートの１穴に卵母細胞
を10個ずつ入れ、それぞれ100μｌのバース培地（88mM
NaCl,1mMKC1,2.4mM NaHCO₃,0.82mM MgSO₄,0.33mM Ca(NO
₃)₂,0.41mM CaCl₂,7.5mMトリス−塩酸（pH7.6），ペニ
シリン10mg/1,ストレプトマイシン硫酸10mg/1）中で48
時間室温で培養した後上清を回収し、濃縮・精製してＧ
−CSF活性を測定する。

この結果、15〜17S画分にＧ−CSF活性が認められた。

実施例6.cDNAの合成（PBR系cDNAライブラリーの構築） 前述の方法で得られたポリ（A⁺）−RNAからLand等の方
法［Nucleic Acids Res,９巻2251頁（1981）］に基づ
き、GublerとHoffmanの方法［Gene,25巻263頁（198
3）］を加味してcDNAを得た。

１）１本鎖cDNAの合成 エッペンドルフ社製1.5ml容チューブに以下の如くの順
序で試薬を入れる。80μｌの反応緩衝液（500mM KCl,50
mM MgCl₂,250mMトリス−塩酸,pH8.3）,20μｌの200mMジ
チオスレイトール,32μｌの12.5mM dNTP（dATP,dGTP,dC
TP,dTTPを各々12.5mM含む）,10μｌのα−³²Ｐ−dCTP
（アマシャム製,PB 10205）,32μｌのオリゴ（dT）
_12-18（Ｐ−L Biochemicals社製,500μg/ml）,20μｌの
ポリ（A⁺）−RNA（2.1μg/μｌ），蒸溜水206μｌの計4
00μｌの反応液を65℃で５分間加熱後、42℃で５分間加
温する。この反応液に逆転写酵素（宝酒造製）120単位
を加え、さらに42℃、２時間反応させた後、RNaseイン
ヒビター（Bethesda Research Laboratories社製）２μ
ｌ、20μｌのTE溶液、16μｌの100mMピロリン酸ナトリ
ウム、48単位（４μｌ）の逆転写酵素を追加して、今度
は46℃２時間反応せしめた。0.5M EDTA 8μl,10％SDS 8
μｌを加えて反応を停止させた後、フェノール−クロロ
ホルム処理、エタノール沈澱（２回）を行い一本鎖cDNA
を得た。

２）１本鎖cDNAへのdC−鎖付加 上記で得られた一本鎖cDNAを60μｌの蒸溜水に溶解後、
60μｌのdC−鎖付加緩衝液（400mMカコジル酸カリウム;
50mMトリス−塩酸（pH6.9）;4mMジチオスレイトール;1m
M CoCl₂;1mM dCTPに加え、37℃で５分間加温した。この
反応液にターミナルトランスフェラーゼ（27unit/μl,P
−L Biochemicals社製）３μｌを加えて37℃で2.5分間
反応した後、フェノール−クロロホルム処理（１回）、
及びエタノール沈澱（２回）行い、100mM NaClを含むTE
溶液40μｌに溶解せしめた。

３）２本鎖cDNAの合成 上記40μｌのDNA溶液に４μｌのオリゴ（dG）_12-18（20
0μg/ml,P−L Biochemicals社製）を加え65℃５分間、
続いて42℃で30分間加温した後、反応液を０℃に保っ
た。この反応液に緩衝液80μｌ（100mMトリス−塩酸、p
H7.5,20mM MgCl₂,50mM（NH₄)₂SO₄,500mM KCl）,4μｌの
4mM dNTP（dATP,dCTP,dGTP,dTTPを各々4mM含む）、60μ
ｌの1mMβ−NAD、及び210μｌの蒸溜水、20μｌのE.col
i DNAポリメラーゼＩ（宝酒造社製）、15μｌのE.coli
DNAリガーゼ（宝酒造社）、15μｌのE.coli RNase H
（宝酒造社）を加え12℃にて１時間反応させた後、さら
に４μｌの4mMdNTPを追加し、25℃で１時間反応して、
フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱（１
回）を行って、約８μｇの２本鎖cDNAを得た。この２本
鎖cDNAをTE溶液に溶解せしめ、1.2％アガロースゲル電
気泳動を行い、約560塩基対（bp）〜２キロ塩基対（Kb
p）の大きさに相当する部分をワットマンDE81（ワット
マン社製）に吸着させ溶出回収したところ、約0.2μｇ
が回収された。

４）２本鎖cDNAへのdC−鎖付加 上記の如く得られた２本鎖cDNAを40μｌのTE溶液に溶解
し、２）の項で述べたdC−鎖付加緩衝液８μｌを加え37
℃で２分間加温した後、１μｌのターミナルトランスフ
ェラーゼ（27unit/μｌ）を加えて37℃で３分間反応せ
しめた。反応液を直ちに０℃に冷却し0.5M EDTA1μｌを
加えて反応を停止した後、フェノール−クロロホルム処
理、エタノール沈澱を行い、得られた沈澱をTE溶液10μ
ｌに懸濁した。

５）pBR系cDNAライブラリーの構築 市販のオリゴ（dG）鎖付加pBR322ベクター（ベセスダリ
サーチラボラトリーズ社製、10ng/μｌ）４μｌと上記d
C−鎖付加２本鎖cDNA2μｌを75μｌの0.1M NaClを含むT
E溶液の中でアニールさせた。アニールは65℃、５分加
温した後40℃にて２時間加温、その後、室温になるまで
放置して行った。

一方、Maniatisらの実験書［Molecular cloning,Cold S
pring Harbor,249頁（1982）］に記載されている方法等
を用いて大腸菌X1776株からコンピテント細胞を調製
し、上記アニールされたプラスミドにより形質転換を行
い、トランスフォーマント（形質転換体）が得られた。

実施例7.cDNA合成（λファージ系ライブラリーの構築） １）１本鎖cDNAの合成 実施例５で述べた方法に従って3.8gの凍結保存CHU−２
細胞から２回オリゴ（dT）セルロースカラムによる精製
を経て400μｇのポリ（A⁺）−RNAを得た。

このポリ（A⁺）−RNA12μｇを溶解したTE溶液10μｌを1
0μｇのアクチノマイシンＤ（シグマ社製）を含む反応
チューブに入れた後、以下の順序で試薬類を加えた;20
μｌの逆転写緩衝液（250mMトリス−塩酸（pH8.3）,40m
M MgCl₂,250mM KCl）20μｌの5mMdNTP（dATP,dGTP,dCT
P,dTTPを各々5mM含む）、20μｌのオリゴ（dT）
_12-18（0.2μg/ml P−L Biochemicals社製）,1μｌの1M
ジチオスレイトール、２μｌの30unit/μｌのRNase（プ
ロメガバイオテク社）10μｌの逆転写酵素（10unit/μ
ｌ生化学工業社製）,1μｌのα−［³²p］dATP（10μCi
アマシャム社製）,16μｌの水で計100μｌの液量の反応
液になる。反応液を42℃で２時間保った後、５μｌの0.
5M EDTA及び１μｌの20％SDSを加えて反応を停止した。
フェノール−クロロホルム（100μｌ）処理、エタノー
ル沈澱（２回）を行って約４μｇの１本鎖 cDNAを得
た。

２）２本鎖cDNAの合成 上記の如く得られたcDNAを29μｌのTE溶液に溶解し以下
の順序で試薬類を加えて反応液とした;25μｌのポリメ
ラーゼ緩衝液（400mM Hepes（pH7.6）;16mM MgCl₂;63mM
のβ−メルカプトエタノール;270mM KCl）;10μｌの5mM
dNTP;1.0μｌの15mMβ−NAD;1.0μｌのα−［³²p］dAT
P（10μCi/μｌ）;0.2μl E.coli DNAリガーゼ（60unit
/μｌ宝酒造社製）;5.0μｌのE.coli DNAポリメラーゼ
Ｉ（New England Biolabs社,10unit/μｌ）;0.1μｌのR
NaseH（60unit/μｌ宝酒造社製）;28.7μｌの蒸溜水。

反応液を14℃で１時間インキュベートした後、室温にも
どして、さらに１時間インキューべートした。次いで５
μｌの0.5M EDTAと１μｌの20％SDSを加えて反応を停止
させ、フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈澱
を行った。得られたDNAを0.5mM EDTA20μｌに溶解せし
め、３μｌのKlenow緩衝液（500mMトリス−塩酸（pH8.
0）,50mM MgCl₂）,3μｌの5mM dNTP、及び水４μｌを加
えて反応液を調製した後、１μｌのDNAポリメラーゼ（K
lenow断片）（宝酒造社製）を加えて30℃15分インキュ
ベートした。

この反応液に70μｌのTE溶液を加えて希釈し、さらに５
μｌの0.5M EDTA,1μｌの20％SDSを加えて反応を停止し
た。反応液をフェノール−クロロホルム処理し、エタノ
ール沈澱を行って約８μｇの２本鎖cDNAを得た。

３）２本鎖cDNAのメチル化 ２）の項で合成した２本鎖cDNAの水溶液30μｌ、メチル
化緩衝液（500mMトリス−塩酸（pH8.0）,50mM EDTA）40
μl,SAM溶液（800μM S−アデノシル−Ｌ−メチルメチ
オニン（SAM）,50mM β−メルカプトエタノール）20μ
l,水100μｌを加えた混合液にEcoRIメチラーゼ（New En
gland Biolabs社,20unit/μｌ）15μｌを加えて全反応
液を200μｌとし、37℃２時間インキュべートした。フ
ェノール処理、エーテル処理を行った後、エタノール沈
澱を行ってDNAを回収した。

４）EcoRIリンカーの付加 上記メチル化された２本鎖DNA約1.2μｇにリガーゼ緩衝
液（250mMトリス−塩酸（pH7.5）,100mM MgCl₂）1.5μ
l,あらかじめリン酸酸化されたEcoRIリンカー0.5μｌ
（10mer,宝酒造社製）,1.5μｌの10mM ATP,100mMジチオ
スレイトール1.5μl,2μｌのH₂Oを加え、反応液を15μ
ｌとしてT₄DNAリガーゼ（3.4u/μl,宝酒造社）0.7μｌ
加えて４℃で一晩反応させた後、65℃にて10分間加熱し
リガーゼを失活させた。この反応液をさらに100mMトリ
ス−塩酸（pH7.5）,5mM MgCl₂,50mM NaCl,100μg/mlの
ゼラチンの濃度で全液量が50μｌになるように調製した
後、EcoRI（10unit/μｌ）3.5μｌ加え、37℃、２時間
反応させた。次いで0.5MのEDTA2.5μl,20％SDS0.5μｌ
を加えた後フェノールクロロホルム処理を行いエタノー
ル沈澱によりDNAを回収した。この後Ultrogel AcA34（L
KB社製）のゲル濾過法あるいはアガロースゲル電気泳動
法にて未反応のEcoRIリンカーを除去し、リンカー付加
２本鎖cDNA約0.5〜0.7μｇを回収した。

５）２本鎖cDNAとλgt10ベクターの結合 上記のリンカー付加２本鎖cDNAを2.4μｇの予じめEcoRI
処理したλgt10ベクター（ベクタークローニングシステ
ム社），リガーゼ緩衝液（250mMトリス塩酸、100mM MgC
l₂）1.4μl,蒸溜水6.5μｌを加えて、42℃、15分間処理
した後10mM ATP1μl,0.1Mジチオスレイトール１μl,T4D
NAリガーゼ0.5μｌを加え全量を15μｌとした後、12℃
で一晩反応させた。

６）インビトロパッケージング 上記５）で得られた組換え体DNAの約1/3をインビトロパ
ッケージングキット（プロメガ バイオテク社）を用い
てパッケージングし、ファージプラークを得た。

実施例8.プローブ（IWQ）によるpBR系ライブリーのスク
リーニング コロニーの成育した寒天培地上にワットマン541濾紙を
のせ37℃で２時間放置した。以下、TaubとThompsonの方
法［Anal.Biochem.126巻222頁（1982）］に準じて濾紙
を処理した。

すなわち、541濾紙にコロニーを移した後、クロラムフ
ェニコール（250μg/μｌ）を含んだ寒天培地に移し、
さらに37℃で一晩放置した。

541濾紙を取り出した後、室温下で0.5N NaOH溶液を浸し
た濾紙上に３分間放置し、これを２回くり返した。以下
同様な操作を0.5Mトリス塩酸（pH8）溶液を用いて３分
間、２回行ない、さらに４℃下に0.05Mトリス塩酸（pH
8）溶液で３分、1.5mg/mlのリゾチーム液（0.05 Mトリ
ス塩酸（pH8）,25％ショ糖を含む）で10分間、次いで37
℃下に１×SSC（0.15M NaClおよび0.015クエン酸ナトリ
ウム）溶液で２分間、200μg/mlプロテアーゼｋを含む
１×SSC溶液で30分、再び室温下に１×SSC溶液で２分
間、95％エタノール溶液で２分間、２回行った後、 541濾紙を乾燥させた。得られた乾燥 541濾紙を室温下
にフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール
（25:24:1,100mMトリス塩酸（pH8.5）,100mM NaCl,10mM
EDTAで平衡化したもの）溶液に30分間浸した。以下同
様の操作を５×SSC溶液で３分間、３回次いで95％エタ
ノール溶液で３分間、２回行った後、濾紙を乾燥させ
た。

プローブ（IWQ）常法を「Molecular cloningを参照」に
伴って₃₂Pを用いて放射標識した後、Wallace等の方法
（Nucleic Acids Res.９巻879頁（1981））に従ってコ
ロニーハイブリダイゼーションを行った。６×NET［0.9
M NaCl,0.09Mトリス塩酸（pH7.5）,6mM EDTA］,5×Denh
ardt溶液,0.1％SDS,0.1mg/ml変性DNA（仔牛胸線DNA）を
含むハイブリダイゼーション緩衝液中で65℃、４時間、
プレハイブリダイゼーションを行った後、放射標識化し
たプローブ（IWQ）１×10⁶cpm/mlを含む前記ハイブリダ
イゼーション緩衝液を用いて56℃で一夜ハイブリダイゼ
ーションを行った。反応終了後541濾紙を室温下に0.1％
SDSを含む６×SSC溶液で30分、２回および56℃、1.5分
間洗滌した後、オートラジオグラフィーを行った。

シグナルの出たクローンよりプラスミドを分離した後、
プローブ（IWQ）を用いてサザンプロッティングを行っ
た。ハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフ
ィーは前述と同一の条件で行なった。

同様にプローブ（Ａ）を用いてサザン ブロッティング
を行った。ハイブリダイゼーションは前述のハイブリダ
イゼーション緩衝液を用い、49℃で１時間行い、39℃ま
で徐冷後さらに39℃で１時間行なった。反応終了後、ニ
トロセルロースフィルターを0.1％SDSを含む６×SSCで
室温下に30分で２回洗滌し、次いで39℃で３分間洗滌し
た後、オートラジオグラフィーを行なった。

この結果、１個のクローンがポジティブなものとして得
られ、ジデオキシ法により塩基配列を決定したところ図
２に示した如く、プローブ（IWQ）及びプローブ（Ａ）
部分を含む308塩基対よりなるDNAであることが判明し、
このインサートを含むpBR322由来プラスミドをpHCS−１
と命名した。

実施例9.pHCS−１由来DNAプローブによるλファージ系
ライブラリーのスクリーニング BentonとDavisの方法［Science196巻,180頁，（197
7）］に準じてプラークハイブリダイゼーションを行っ
た。実施例８で得られたpHCS−１をSau3AおよびEcoRIで
処理して約600塩基対のDNA断片を得、このDNA断片を常
法に従いニックトランスレーションにより放射標識し
た。ファージプラークの生じた寒天培地上にニトロセル
ロース濾紙（Ｓ＆Ｓ社）をのせてファージを移し、0.5M
NaOHにてDNAを変性させ、以下の順序で濾紙を処理し
た。0.1M NaOH,1.5M NaClで20秒続いて0.5Mトリス塩酸
（pH7.5）,1.5M NaClで20秒２回，最後に120mM NaCl,15
mMクエン酸ソーダ,13mMKH₂PO₄,1mM EDTA,pH7.2で20秒処
理した。

次いで濾紙を乾燥し、80℃で２時間加熱してDNAを固定
した。５×SSC,5×Denhardt溶液,50mMリン酸緩衝液,50
％ホルムアミド,0.25mg/mlの変性DNA（鮭精巣DNA），及
び0.1％SDSを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で42
℃にて一晩プレハイブリダイゼーションを行い、ニック
トランスレーションにより放射標識化したpHCS−１プロ
ーブ４×10₅cpm/mlを含むハイブリダイゼーション緩衝
液（５×SSC,5×Denhardt溶液,20mMリン酸緩衝液（pH6.
0）,50％ホルムアミド,0.1％SDS,10％デキストラン硫
酸,0.1mg/mlの変性DNA（鮭精巣DNA）の混合液）で42℃
にて20時間ハイブリダイゼーションを行った。

ニトロセルロース濾紙を室温下に0.1％SDSを含む２×SS
Cで20分間洗滌し、次いで44℃で、0.1％SDSを含む0.1×
SSCで30分間、さらに室温下で0.1×SSCで10分間洗滌し
た後、オートラジオグラフィーで検出した。

その結果、５個のポジティブなクローン（G1〜５）が得
られた。そこで、得られたクローンのうち完全長cDNAを
含むと思われるクローンのDNA塩基配列をジデオキシ法
にて調べたところ図３（Ａ）に示される如き塩基配列が
得られた。そこでこのcDNAをλgt10ベクターより切りだ
し、pBR327［Soberon等;Gene９巻287頁（1980）］とEco
RI部位で結合させ、プラスミドとして大量調製した。こ
のプラスミドをpBRG4と称する。

実施例10.［tacプロモーター含有ベクターを用いた例］ １）組換えベクターの構築 ベクターの調製 tacプロモーター含有ベクターpKK223−３（ファルマシ
ア社製）５μｇを30μｌの反応液（50mM Tris−HCl、7m
M MgCl₂、100mM NaCl、7mM 2−メルカトプトエタノー
ル）中、EcoRI（宝酒造社製）８単位で37℃、２時間処
理した。

次いで、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）３μｌ
を加え60℃、30分間処理し、常法に従いフェノール処理
３回、エーテル処理及びエタノール沈澱を行ってDNA断
片を回収した。

このDNAを50mMTris−HCl、5mMMgCl₂、10mM DTT、1mMのd
ATP,dCTP、dGTP、TTPからなる50μｌの混合液に溶解
し、大腸菌DNAポリメラーゼＩ−Klenow断片（宝酒造社
製）３μｌを加えて14℃、２時間反応せしめ、末端をブ
ラントエンド（bluntend）にした。

合成リンカーの調製 合成リンカー、CGAATGACCCCCCTGGGCC及びCAGGGGGGTCATT
CGの配列を有するオリゴヌクレチオド３μｇを50mM Tri
s−HCl、10mM MgCl₂、10mM 2−メルカプトエタノール、
1mM ATPからなる反応液40μｌ中でT₄ポリヌクレチオド
キナーゼ４単位存在下、37℃、60分間反応せしめ、リン
酸化した。

次いで該リン酸化オリゴヌクレチオドを夫々0.2μｇを1
00mM NaClを含むTE（10mMTris−HCl、pH8.0、1mMEDTA）
20μｌに溶解し、65℃、10分間処理した後、室温まで徐
冷することによりアニーリングを行った。

Ｇ−CSFのcDNA断片の調製 実施例９で得た図３（Ａ）で示すcDNAを含有するpBRG4
60μｇを6mM Tris−HCl、6mM MgCl₂、6mM 2−メルカプ
トエタノールからなる反応液200μｌ中、制限酵素ApaI
（New England Biolabs社製）100単位、DraI（宝酒造社
製）50単位で37℃、３時間処理し、1.2％アガロースゲ
ル電気泳動にて約590bpのApaI−DraI断片約２μｇを回
収した。

上記各断片の連結 ，，各断片を夫々約0.1μｇとり、20μｌの連結
反応液（66mM Tris−HCl、6.6mM MgCl₂、10mM DTT、1mM
ATP）に溶解しT₄DNAリガーゼ175単位を加えて４℃で一
晩反応し組換えベクターを得た。

２）形質転換 上記で得られた組換えベクターを含む反応液20μｌを
用いて塩化ルビジウム法（前出T.Maniatis等「Molecula
r cloning」P252（1982）参照）によりE.coli JM105株
を形質変換した。得られた形質転換株はアンピシリン耐
性のコロニー培養液よりプラスミドを分離し、制限酵素
BamHl、AccII、ApaIで処理したところ目的の形質転換
株であることが確認できた。

実施例11.［PLプロモーター含有ベクターを使用した
例］ １）組換えベクター構築 ベクターの調製 PLプロモーターを含むベクターpPL−lambda（ファルマ
シア社製）100μｇを制限酵素BamHI、50単位で反応液
（10mM Tris−HCl、pH7.6、7mM MgCl₂、100mM NaCl、10
mM DTT）100μｌ中、37℃、一晩処理した。

これから、１％アガロースゲル電気泳動にて、約4Kbpの
断片約49μｇと約1.2Kbpの断片約11μｇを回収した。

上記の断片のうち、まず約4Kbpの法を前記のTE緩衝液10
0μｌに溶解し、アルカリホスファターゼ（宝酒造社
製）５μｌと60℃、60分間反応せしめ脱リン酸化した。

残りの約1.2Kbpの断片の方は緩衝液（10mMTris−HCl、1
0mM MgCl₂、6mMKCl、1mM DTT）20μｌに溶解し、制限酵
素MboII（New England Biolabs社製）20単位で37℃、一
晩処理した。

次いで、４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約
200bpのBamHI−MboII断片約0.9μｇと約310bpのMboII−
BamHI断片約1.9μｇを回収した。

合成リンカーの調製 合成リンカーTAAGGAGAATTCATCGATおよびTCGATGAATTCTCC
TTAGを実施例10のと同様にしてリン酸化しアニーリン
グし、合成S/Dリンカーを得た。

発現用ベクターの調製 上記で調製した約4Kbp断片0.1μｇ及びO_LP_L領域を有
するBamHI−MboII断片、tL₁領域を有するMboII−BamHI
断片夫々0.05μｇとアニールした合成S/Dリンカー0.1μ
ｇを40μｌの反応液（66mM Tris−HCl、6.6mM MgCl₂、1
0mM DTT、1mMATP）中、T₄DNAリガーゼ（宝酒造社製）17
5単位存在下12℃、一晩反応せしめた。

この反応液20μｌを用い、E.coliN99cI＋株（ファルマ
シア社製）をCaCl₂法（前出の“Molecular cloning"参
照）にて形質転換した。

該形質転換株を培養し、そのアピシリン耐性のコロニー
の培養液よりプラスミドを分離して、制限酵素EcoRI、B
amHI、SmaIで処理したところ目的のプラスミドであるこ
とが確認された。

次に、このプラスミドを２μｇとり、20μｌの緩衝液
（10mM Tris−HCl、6mM MgCl₂、50mM NaCl）中、制限酵
素ClaI（New England Biolabs 社製）を37℃、２時間反
応させた後65℃10分間で失活させた。

更にその反応液１μｌを20μｌの前記連結反応液及びT₄
DNAリガーゼ（宝酒造社製）175単位を用いて12℃、一晩
反応した後、上記と同様にしてE.coli N99cI⁺株（ファ
ルマシア社製）を再び形質転換した。アンピシリン耐性
コロニー培養液からプラスミドを分離しE.CoRI、BamHI
で処理し、目的のプラスミドを確認した。

Ｇ−CSF発現用組換えベクター及び形質転換体の調
製 で得られた発現用プラスミドを制限酵素ClaIで処理
し、末端をブラントエンドにした後実施例10と同様にし
てＧ−CSFのcDNA断片を組み込み組換えベクターを得
た。これを用い、前出のMolecular Cloningに記載され
ているCaCl₂法にてE.coli N4830株（ファルマシア社
製）を形質転換した。なお、目的の形質転換体の確認も
実施例10と同様に行った。

実施例12.［trpプロモータ含有ベクターを用いた例］ １）組換えベクターの構築 ベクターの調製 pBR322のClaI部位にトリプトファンプロモーターを含む
約330bpのHpaII−TaqI断片を挿入し作製したpOY1プラス
ミド10μｇを10mMTris−HCl、6mM MgCl₂、50mMNaClの反
応液30μｌ中、制限酵素ClaI7単位PvuII8単位で37℃３
時間処理した。

次いで、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）２μｌ
を加え60℃、１時間反応せしめた。

これから１％アガロースゲル電気泳動により約2.6Kbpの
断片を約2.5μｇ回収した。

合成リンカーの調製 合成リンカーCGCGAATGACCCCCCTGGGCC及びCAGGGGGGTCATT
CGを実施例10のと同様にしてリン酸化し、アニーリン
グした。

組換えベクターの調製 上記で調製ベクターの断片約１μｇ、及びの合成リ
ンカー約１μｇと、実施例10ので調製したＧ−CSFのc
DNA断片約１μｇを前記の連結反応液20μｌ中、T₄DNAリ
ガーゼ（宝酒造社製）175単位と12℃で一晩反応せしめ
組換えベクターを得た。

２）形質転換 上記の反応液20μｌを前出「Molecular cloning」の
塩化ルビジウム法でE.coliDHI株に形質転換した。

実施例10と同様にしてアンピシリン耐性のコロニーから
プラスミドをとり、制限酵素APaI、DraI、NruI、PstIで
目的とする形質転換体が得られていることを確認した。

実施例13.:形質転換株の培養 １）実施例10で得た形質転換株（Tac含有）の培養 アンピシリン25μg/ml又は50μg/mlを含むルリア（Luri
a）培地100mlに、37℃、一晩培養した該形質転換株の培
養液1mlを加え37℃で２〜３時間培養する。

次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド2mM
にして37℃、２〜４時間培養した。

２）実施例11で得た形質転換株（P_L含有）の培養 アンピシリン25μg/ml又は50μg/mlを含むルリア培地10
0mlに28℃一晩培養した該形質転換株の培養液1mlを加え
28℃で約４時間培養した。

その後、これを42℃にし２〜４時間培養を行った。

３）実施例12で得た形質転換株（trp含有）の培養 0.5％グルコース、0.5％カザミノ酸（Difco社製）、ア
ンピシリン25μg/ml又は50μg/mlを含むM9培地100mlに3
7℃一晩培養した該形質転換株の培養液1mlを加えて37℃
で４〜６時間培養する。次いで、３−β−インドールア
クリル酸（IAA）50μg/mlを加えて37℃で４〜８時間培
養した。

実施例14.:大腸菌からのＧ−CSFポリペプチドの回収・
精製 １）回収 実施例13で培養した形質転換株、夫々について以下の回
収操作を行った。

培養液100mlを遠心分離にかけて菌体を集め、20mM Tris
−HCl（pH7.5）、30mMNaCl混合液5mlに懸濁させた。

次いで、各々1mM、10mM、0.2μg/mlになるように0.2Mフ
ェニルメチルスルホニルフルオライド、0.2M EDTA、リ
ゾチームを加え、０℃で30分間放置した。

次に凍結−融解を３回くりかえし溶菌させた。続いて8M
塩酸グアニジンを用いて、最終的に6M塩酸グアニジンに
した後、30,000r.p.m.、５時間の遠心分離を行い、その
上澄液を取得した。

２）精製 （ｉ）１）で得た上澄液を直径4.6cm、長さ90cmのUltro
gel AcA54カラム（LKB社製）にて、0.15M NaClおよび0.
01％ツィーン20（半井化学社製）を含む0.01Mトリス塩
酸緩衝液（pH7.4）を用いて流速約50ml/時間でゲル濾過
した。

次いで、前述した「CSAの測定方法（ｂ）」により活性
を示す画分をとりpM−10（アミコン社製）を用いる限外
濾過器によって約5mlに濃縮した。

（ii）上記濃縮画分にｎ−プロパノール（東京化成社
製，アミノ酸配列決定用）を30％含む0.1％トリフルオ
ロ酢酸水溶液を添加し、氷中に15分程度放置したのち、
15,000r.p.m.10分の遠心により沈澱を除去した。次いで
先のｎ−プロパノールおよびトリフルオロ酢酸を含む水
溶液で平衡化したμBondapak C18カラム（Waters社製、
セミ分取用,8mm×30cm）に吸着後、30〜60％の直線濃度
勾配のｎ−プロパノールを含む0.1％トリフルオロ酢酸
水溶液で順次溶出した。高速液体クロマト装置は日立68
5−50型を、検出は日立638−41型検出器（いずれも日立
製作所製）を用い、220nmと280nmの吸収を同時に測定し
た。溶出後、各画分より10μｌを分取100倍希釈したの
ち、前述の「CSAの測定方法（ｂ）」により活性を示す
画分を調べた。この結果、ｎ−プロパノール40％にて溶
出されるピークに活性が認められたので、このピークを
集め再度同じ条件で再クロマトを行い上記と同様にして
CSAを調べたところ、やはりｎ−プロパノール40％の位
置のピークに活性が認められたので、このピークを集め
（４フラクション＝4ml）凍結乾燥した。

（iii）上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパノールを40％含
む0.1％トリフルオロ酢酸水溶液200μｌに溶解し、TSK
−G3000SWカラム（東洋曹達社製、7.5mm×60cm）を用い
た高速液体クロマトグラフィ（HPLC）にかけた。溶出は
同水溶液により0.4ml/分の流速で行い、フラクションコ
レクターFRAC−100（ファルマシア社製）により0.4mlず
つ分取した。分取した各画分についてCSAを前記と同様
にして調べ活性画分を回収し、更に分析用μBondapak C
18カラム（4.6mm×30cm）による精製を施したのち、メ
インピークを回収し凍結乾燥した。

得られたタンパク質を２−メルカプトエタノールで処理
してSDS−ポリアクリルアミドゲル（15.0％）電気泳動
（15mV,6時間）にかけ、クマシーブルーで染色したとこ
ろ目的とするＧ−CSFポリペプチドが単一のバンドとし
て確認できた。

実施例15:発現物質のＧ−CSF活性の検定 実施例14で得たCSF試料を前述の＜参考例＞CSF活性の測
定方法（ａ）に従って検定した。

この結果を表−１に示す。

実施例16:アミノ酸分析 １）アミノ酸組成の分析 実施例14で精製したCSF試料を常法により加水分解し、
そのタンパク部分のアミノ酸組成を日立835アミノ酸自
動分析装置（日立製作所社製）を用いて特殊アミノ酸分
析法により分析した。この結果を表−２に示した。尚、
加水分解条件は次の如くである。

6N HCl,110℃,24時間、真空中 4Nメタンスルホン酸＋0.2％３−（２−アミノエチ
ル）インドール,110℃,24時間,48時間,72時間，真空中 試料は、40％ｎ−プロパノールと0.1％トリフルオロ酢
酸を含む溶液（1.5ml）に溶かした後、各々0.1mlをと
り、乾燥窒素ガスにより乾燥させた後、又はの試薬
を加えて真空封管し、加水分解に供した。

表中、実測値はの24時間値との24,48,72時間値の合
計４回の平均値である。但し、Thr,Ser,1/2Cys,Met,Va
l,IleおよびTrpは以下の方法で算出した。（生化学実験
講座、タンパク質化学II（東京化学同人出版）を参照） ・Thr,Ser,1/2Cys,Metはの24,48,72時間値の経時変化
をとり、零時間に補外。

・Val,Ileはの72時間値。

・Trpはの24,48,72時間値の平均値。

２）Ｎ末端アミノ酸分析 試料を気相式シークエンサー（アプライドバイオシステ
ム社製）を用いてエドマン（Edman）分解し、得られたP
THアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー装置（ベック
マン・インストルメンツ社製）およびUltrasphere−ODS
カラム（ベックマン・インストルメンツ社製）を用いて
常法により分析した。カラム（５μm,直径4.6mm,長さ25
0mm）を開始緩衝液（15mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5,4
0％アセトニトリルを含む水溶液）にて平衡化したの
ち、検体（20μｌの開始緩衝液にて溶解）を注入して開
始緩衝液によるイソクラティック溶出により分離を行っ
た。流速は1.4ml/分、カラム温度は40℃に保持した。PT
Hアミノ酸の検出は269nmと320nmの紫外部吸収を利用し
た。あらかじめ標準PTHアミノ酸（シグマ社製）各2n mo
lを同一の系で分離して保持時間を決定し、被検検体の
保持時間から同定を行った。

その結果、PTH−メチオニンおよびPTH−スルオニンが検
出された。

＜実施例＞ヒトＧ−CSFの感染防御効果 1.シュードモナス アエルギノーザ（Pseudom onas aer
uginosa）感染に対する防御効果 ８〜９週令（体重35.3±1.38g）のICR系マウス（雄）に
エンドキサン（シオノギ社製、商品名）200mg/Kgを腹腔
内投与した後３群に分け、その２群にヒトＧ−CSF（250
00u/マウス又は50000u/マウス）を含む溶媒（１％プロ
パノール、５％（W/V）マウス血清アルブミン）を、そ
して別の１群には溶媒のみを、それぞれ24時間毎に0.1m
lずつ４回皮下投与した。４回目の投与後３時間して各
々の群にシュードモナス アエルギノーザ（Pseudomona
s aeruginosa）GNB−139（3.9×10₄CFU/マウス）を皮下
投与して感染させた。感染後21時間してさらにもう一度
ヒトＧ−CSF（25000u/マウス又は50000u/マウス）を含
む溶媒又は溶媒のみをそれぞれ対応する群に皮下投与し
た。

感染後10日間までの生存マウス数により感染防御効果を
調べた。（表−３） （菌液の調製） ハートインフュージョン寒天平板（Difco社製、商品
名）を用いて37℃で一夜シュードモナス アエルギノー
ザGNB−139を振とう培養する。培養液を生理食塩水に懸
濁させて調製した。

表−３に示される如く本発明のヒト−Ｇ−CSFは顕著な
感染防御効果を有することが認められた。

〔発明の効果〕

以上、本発明によれば、従前入手が極めて困難であった
ヒトＧ−CSFを組換えベクター技術を用いて大量に、し
かも高品質で提供することが可能となり、これまでCSF
にかけられていた数々の期待、例えば造血機構や種々の
血液学的疾患の病態の解析に多大の貢献をする他、骨髄
性白血病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進という
Ｇ−CSF本来の生化学的作用を利用する治療、及び予防
に使用しうるのである。

したがって放射線照射や抗癌剤投与により骨髄組織の機
能が低下したり白血病が減少して、抵抗力を失った悪性
腫瘍患者や、抗生物質で治療できない重症感染症患者等
に対してもこれを投与することが大いに期待されている
のである。

【図面の簡単な説明】

図１はプローブ（IWQ）、及びプローブ（Ａ）の配列を
示す。 図２はpHCS−１インサートの塩基配列を示す。 図３（Ａ）はpBRG4のcDNAインサートの塩基配列を示
す。 図３（Ｂ）（Ｉ）はpBRG4cDNAから演えきしたヒトＧ−C
SF前駆体のアミノ酸配列を示す。 図３（Ｂ）（II）はpBRG4cDNAから演えきしたヒト成熟
Ｇ−CSFのアミノ酸配列を示す。 図４はpBRG4由来ヒトＧ−CSFcDNAの制限酵素切断部位を
示す。 図５はtacプロモーター含有ベクターの調製プロセスの
一部を示す。 図６は合成P_Lプロモーター含有ベクターの調製プロセス
を示す。 図７はtrpプロモーター含有ベクターの調製プロセスを
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 関森 泰男 東京都豊島区高田３丁目41番８号 中外製 薬株式会社内 (72)発明者 長田 重一 東京都大田区多摩川２丁目24番62号 ３号 棟305号室 (56)参考文献 特開 昭62−236488（ＪＰ，Ａ) 特公 平１−44200（ＪＰ，Ｂ２) 特公 平３−31437（ＪＰ，Ｂ２) 特公 平４−2599（ＪＰ，Ｂ２)

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
   ポリペプチドであって、そのアミノ酸配列中に下記のア
   ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列か
   らなるDNA。
2. 【請求項２】塩基配列が下記の塩基配列である特許請求
   の範囲第１項のDNA。
3. 【請求項３】ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
   ポリペプチドであって、そのアミノ酸配列中に下記のア
   ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列か
   らなるDNAを含む組換え発現ベクター。
4. 【請求項４】塩基配列が下記の塩基配列である特許請求
   の範囲第３項の組換え発現ベクター。
5. 【請求項５】ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する
   ポリペプチドであって、そのアミノ酸配列中に下記のア
   ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列か
   らなるDNAを含む組換え発現ベクターで形質転換された
   細菌。
6. 【請求項６】塩基配列が下記の塩基配列である特許請求
   の範囲第５項の細菌。