KR920005752B1 - 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자 - Google Patents
인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자Info
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 세가지 서로 다른 탐침, IWQ, A 및 LC의 서열을 나타낸 것이고 ;
제2도는 pHCS-1 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이고 ;
제3(a)도는 pBRG4 내의 cDNA 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이고 ;
제3(b)(Ⅰ)도는 pBRG4 cDNA로부터 추론된 인체 G-CSF 전구체의 아미노산 서열을 나타낸 것이고 ;
제3(b)(Ⅱ)도는 pBRG4 cDNA로부터 추론된 인체 성숙 G-CSF의 아미노산 서열을 나타낸 것이고 ;
제4(a)도는 pBRV2 내의 cDNA 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이고 ;
제4(b)(Ⅰ)도는 pBRV2 내의 cDNA로부터 추론된 인체 G-CSF 전구체의 아미노산 서열을 나타낸 것이고 ;
제4(b)(Ⅱ)도는 pBRV2 cDNA4 로부터 추론된 인체 성숙 G-CSF의 아미노산 서열을 나타낸 것이고 ;
제5도는 인체 G-CSF를 코오딩하는 인체 염색체 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이고 ;
제6도는 pBRG-또는 pBRV2-유래의 인체 G-CSF cDNA의 제한 효소 절단 부위를 나타낸 것이고 ;
제7도는 인체 G-CSF 를 코오딩하는 인체 염색체 유전자의 제한효소 절단 부위를 나타낸 것이고 ;
제8도는 tac 프로모터 함유 벡터의 구축 과정중 일부를 나타낸 것(+VSE계)이고 ;
제9도는 PL프로모터 함유 벡터의 구축 방법을 나타낸 것(+VSE계)이고 ;
제10도는 trp 프로모터 함유 벡터의 구축 과정중 일부를 나타낸 것(+VSE계)이고 ;
제11도는 tac 프로모터 함유 벡터의 구축 과정중 일부를 나타낸 것(-VSE계)이고 ;
제12도는 PL프로모터 함유 벡터의 구축 과정을 나타낸 것(-VSE계)이고 ;
제13도는 trp 프로모터 함유 벡터의 구축 과정을 나타낸 것(-VSE계)이고 ;
제14도는 pHGA410의 구조를 개략적으로 나타낸 것이고 ;
제15도는 형질발현 재조합 벡터 pTN-G4, pTN-G4Aα 및 pTN-G4VAβ의 제조방법을 나타낸 것이고 ;
제16a도 및 제16b도는 pHGG4-dhfr을 제조하는 2가지 방법을 나타낸 것이고 ;
제16c도는 pG4DR1 및 pG4DR2의 제조방법을 나타낸 것이고 ;
제17도는 pHGV2의 구조를 개략적으로 나타낸 것이고 ;
제18도는 형질발현 재조합 벡터 pTN-V2, pTN-VAα 및 pTN-VAβ의 제조 ;
제19a 및 제 19b도는 형질발현 재조합 벡터 pHGV2-dhfr을 제조하는 2가지 방법을 나타낸 것이고 ;
제19c도는 pV2DR1 및 pV2DR2의 제조방법을 나타낸 것이고 ;
제20도는 pMLCE3α의 구조를 개략적으로 나타낸 것이고 ;
제21도는 pTNCE3α의 구조를 개략적으로 나타낸 것이고,
제22도는 pD26SVCE3α 및 pDRCE3α의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
본 발명은 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자에 관한 것이다. 보다 상세히는 인체 과립성 백혈구 세포의 콜로니를 형성시키는데 필요한 특이적인 자극인자, 즉 콜로니 자극 인자(이하, 「CSF」라 약칭한다)의 활성을 갖는 폴리펩티드를 코오팅하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 유전자가 삽입된 재조합 벡터(vector), 이 벡터를 함유하는 형질전환체, 상기 형질전환체로부터 생산된 CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 당 단백질, 및 CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 당 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
상층에 표적 세포로서 골수세포를, 및 하층에 신장세포나 태아세포를 넣고 2층 연한천 배양법으로 배양하면, 상층의 세포의 일부가 증식분화하여 호중구계 과립구(이하, 「과립성 백혈구」라 칭한다) 또는 단구성대식 세포의 콜로니가 형성된다는 사실로부터 생체내에 콜로니 형성을 촉진하는 인자가 존재한다는 것이 알려졌다[Pluznik 및 Sach ; J. Cell. Comp. Physiol., 66권 319p(1965), 및 Bradley 및 Metcalf ; Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 44권 287p(1966)].
CSF로 총칭되는 인자는 T-세포, 단구성대식세포, 섬유아세포 및 내피세포와 같은 세포에서 생산되는 것으로 알려져 있으며, 이들 세포는 정상적으로 생체내에 광범위하게 분포되어 있다. CSF에는 과립성 백혈구 또는 단구성대식세포의 간 세포(stem cell)에 작용하여 그 증식을 자극하고 분화를 유도하여(연한천 중에서) 과립성 백혈구 또는 단구성 대식 세포의 콜로니를 형성시키는 작용을 갖는 과립성 백혈구-단구성대식세포 CSF(GM-CSF로 약한다) ; 주로 단구성대식세포의 콜로니를 형성시키는 작용을 갖는 단구성대식세포 CSF(M-CSF로 약한다) ; 보다 미분화한 다능성 간세포에 작용하는 다능성 CSF(multi-CSF로 약한다) ; 및 본 발명에서와 같이 주로 과립성 백혈구계 콜로니를 형성시키는 작용을 갖는 과립성 백혈구 CSF(G-CSF로 약한다)등의 서브클래스(subclass)가 존재하며, 최근 각각의 서브클래스에 따라 표적세포의 분화단계도 다를 것으로 생각되어 왔다[Asano ; Taisha-Metabolism and Disease, 22권 249p(1985) 및 Yuni 등 ; " Growth and Maturation Factors"'', edited by Guroff, John Wiley ＆ Sons, NY, 1권, 209p(1983)].
따라서, 각 CSF 서브클래스를 정제하여 이들의 화학적 및 생물학적 성질을 보다 자세히 규명하는 것이 각종 혈액병의 병리 형태학적 양상을 분석하고 혈액생성 메카니즘을 평가하는데 있어서 매우 중요하다. 연구인들의 관심을 증가시키고 있는 G-CSF의 생물학적 작용은 골수 백혈구 세포의 분화를 유도하고 성숙한 과립성 백혈구의 기능을 증진시키는 것으로서 백혈병의 치료 및 예방분야에서 G-CSF가 임상적으로 중요한 유용성을 발휘할 것으로 기대되어 왔다.
종래 G-CSF를 분리, 정제하는 방법으로서는 세포를 배양하여 그 상층액으로부터 G-CSF를 분리하는 세포배양법이 이용되어 왔으나, 이 때 G-CSF가 낮은 농도로만 생산되며 대량의 배양액으로부터 극미량의 G-CSF를 얻는데 있어서도 복잡한 정제 과정이 요구되므로 아직까지 이 방법으로는 균일한 G-CSF를 대량으로 얻지 못하고 있다. 따라서, DNA 재조합 기술을 이용한 G-CSF의 대량 생산이 절실하게 요망되고 있다.
본 발명의 한가지 목적은 인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 삽입한 재조합 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 숙주를 형질전환시킴으로써 제조된 형질전환체 및 이 형질전환체에 의해 생산된 폴리펩티드 또는 당 단백질을 제공하는 것이다. 나아가, 본 발명의 또 다른 목적은 인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 당 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
제1도는 세가지 서로 다른 탐침인, IWQ, A 및 LC의 서열을 나타낸다.
제2도는 pHCS-1 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제3(a)도는 pBRG4 cDNA 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제3(b)(Ⅰ)도는 pBRG4 cDNA로부터 추론된 인체 G-CSF 전구체의 아미노산 서열을 나타낸다.
제3(b)(Ⅱ)도는 pBRG4 cDNA로부터 추론된 인체 성숙 G-CSF의 아미노산 서열을 나타낸다.
제4(a)도는 pBRV2 내의 cDNA 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제4(b)(Ⅰ)도는 pBRV2 cDNA로부터 추론된 인체 G-CSF 전구체의 아미노산 서열을 나타낸다.
제4(b)(Ⅱ)도는 pBRV2 cDNA4 로부터 추론된 인체 성숙 G-CSF의 아미노산 서열을 나타낸다.
제5도는 인체 G-CSF를 코오딩하는 인체 염색체 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제6도는 pBRG4-또는 pBRV2-유래의 인체 G-CSF cDNA의 제한 효소 절단 부위를 나타낸다.
제7도는 인체 G-CSF 를 코오딩하는 인체 염색체 유전자의 제한효소 절단 부위를 나타낸다.
제8도는 tac 프로모터 함유 벡터의 구축 과정중 일부를 나타낸(+VSE계).
제9도는 PL프로모터 함유 벡터의 구축 방법을 나타낸(+VSE계).
제10도는 trp 프로모터 함유 벡터의 구축 방법을 나타낸다(+VSE계).
제11도는 tac 프로모터 함유 벡터의 구축 과정중 일부를 나타낸다(-VSE계).
제12도는 PL프로모터 함유 벡터의 구축 방법을 나타낸다(-VSE계).
제13도는 trp 프로모터 함유 벡터의 구축 과정을 나타낸다(-VSE계).
제14도는 pHGA410의 구조를 개략적으로 나타낸다.
제15도는 형질발현 재조합 벡터 pTN-G4, pTN-G4Aα 및 pTN-G4VAβ의 제조방법을 나타낸다.
제16a도 및 제16b도는 pHGG4-dhfr을 제조하는 2가지 방법을 나타낸다.
제16c도는 pG4DR1 및 pG4DR2의 제조방법을 나타낸다.
제17도는 pHGV2의 구조를 개략적으로 나타낸다.
제18도는 형질발현 재조합 벡터 pTN-V2, pTN-VAα 및 pTN-VAβ의 제조방법을 나타낸다.
제19a 및 제19b도는 형질발현 재조합 벡터 pHGV2-dhfr을 제조하는 2가지 방법을 나타낸다.
제19c도는 pV2DR1 및 pV2DR2의 제조방법을 나타낸다.
제20도는 pMLCE3α의 구조를 개략적으로 나타낸다.
제21도는 pTNCE3α의 구조를 개략적으로 나타낸다.
제22도는 pD26SVCE3α 및 pDRCE3α의 구조를 개략적으로 나타낸다.
본 발명에 따른 인체 G-CSF활성을 갖는 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자는 수크로오즈 밀도구배 원심분리법을 이용하여 15~17S 분획하여 수득된 인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코오딩하는 메신저 RNA(mRNA)에 상보적인 DNA(cDNA)이다.
본 발명자는 2계열의 이러한 cDNA를 얻었다.
그중 하나의 계열의 cDAN는 제3(b)도에 나타낸 폴리팹티드 Ⅰ 또는 Ⅱ를 코오딩하는 유전자 전체 또는 그 일부를 갖는다. 보다 자세하게는 3(a)도에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에서 32~34 염기 위치의 ATG로부터 650~652 염기 위치에 존재하는 CCC까지의 서열, 122~124 위치의 ACC로부터 650~652 위치에 존재하는 CCC까지의 서열 또는 제3(a)도에 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 그 일부를 갖는다. 이 계열의 cDNA를 이하에서는 cDNA(+VSE계)라 칭한다.
다른 1계열의 cDNA는 제4(b)도에 나타낸 폴리펩티드 I 또는 II를 코오딩하는 유전자 전체 또는 그 일부를 갖는 것으로서, 보다 상세히는 제4(a)도에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에서 31∼33 염기 위치의 ATG로부터 640∼642 염기 위치에 존재하는 CCC까지의 서열, 121∼123 위치의 ACC로부터 640∼642 염기 위치에 존재하는 CCC까지의 서열 또는 제4(a)도에 나타낸 서열 또는 그 일부를 갖는 것이다. 이 계열의 cDNA를 이하에서는 cDNA(-VSE)로 칭한다.
상술한 유전자는 다음 방법으로 얻을 수 있다 : 먼저, G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산하는 능력을 갖는 포유동물세포 또는 다른 숙주세포로부터 G-CSF를 코오딩하는 mRNA를 제조한다 ; 이어서, 이 mRNA를 임의의 공지기술을 이용하여 2중-가닥 cDNA로 변환시킨다 ; 이 cDNA를 함유하는 일군의 재조합체(이를 이하에서는 cDNA 라이브러리(library)로 칭한다)를 공지기술로 연속적으로 선별한다.
본 발명의 유전자는 또한 인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코오딩하는 인체 염색체 유전자도 포함한다. 이 인체 염색체 유전자는 전사조절에 관여하는 뉴클레오티드 서열을 함유하며, 또한 제5도에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부분을 함유한다.
염색체 유전자를 수득하기 위해서는, 먼저 인체 세포로부터 인체 염색체 유전자를 함유하는 일군의 재조합체(이를 이하에서는 인체 염색체 유전자 라이브러리라 칭한다)를 제조하고, 이어서 상기 인체 염색체 유전자 라이브러리를 공지기술로 선별한다.
인체 염색체 유전자는 간, 신장으로부터 추출한 세포 또는 종양세포와 같은 배양세포등의 모든 형태의 인체 세포로부터 얻을 수 있다. 인체 염색체 유전자 라이브러리는 인체 세포로부터 임의의 공지기술로 제조할 수 있으며, [Maniatis 등 Cell, 15, 687(1978) ; 및 Maniatis 등, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 269ff. (1982)] ; 예를 들면 다음과 같다 :
인체 태아의 간과 같은 곳으로부터 페놀 또는 다른 적절한 화학물질로 인체 염색체 DNA를 추출한다 ; 추출한 DNA를 적절한 제한효소를 완전히 또는 부분적으로 절단하여 길이를 갖는 DNA 단편을 얻는다 ; DNA 단편을 T4 DNA 리가제 또는 다른 적절한 리가제를 사용하여 임의로 부착되는 EcoRI과 같은 적절한 효소 절단 부위를 갖는 링커와 함께 λ-파지 벡터에 삽입시킨다 ; 이어서 시험관내 팩키징(packaging)법으로λ-파지 입자를 얻고, 이 생성된 λ-파지 입자로 이. 콜리(E. coli)와 같은 숙주세포를 형질전환시킨다.
상기 방법에서 벡터로 사용 가능한 λ-파지의 예로는 샤론(Charon) 4A 및 EMBL-4가 있다.
mRNA 공급원으로 사용할 수 있는 표유동물 세포는 인체 구강암유래의 세포주 CHU-2이다(프랑스 국제 기탁기관 Collection Nationale de Cultures de Microor-
ganismes, 또는 C.N.C.M.에 수탁번호 I-483으로 기탁되어 있음). 그러나, 이러한 종양세포주 대신에 포유동물로부터 분리할 수 있는 세포 또는 알맞게 주화된 다른 세포주를 사용할 수도 있다. 또한 mRNA의 제조는 이미 다른 몇가지 생리활성 단백질의 유전자를 콜로닝하는데 제안된 방법들중 한가지를 이용할 수도 있다. 예를들면, 바나딜-리보뉴클레오시드 복합체와 같은 리보뉴클레아제 억제제 존재하에 계면활성제 및 페놀로 처리하거나 [Berger 및 Birkenmeier ; Biochemistry, 18권 5143p (1979)] 또는 구아니딘 티오시아네이트로 처리한 후, CsC1 밀도구배 원심분리 [Chirgwin등, Biochemistry, 18권 529p(1979)]를 행하여 전체 RNA를 먼저 수득하고, 이어서 상기 전체 RNA에 대하여 올리고 (dT)-셀룰로오즈 또는 세파로즈 2B를 담체로 하는 폴리-U-세파로즈등을 이용한 친화도 컬럼 크로마토그래피 또는 뱃치식 흡착법을 실시하여 폴리(A+)RNA(mRNA)를 얻는다. 또한, 폴리 (A+)RNA를 수크로오즈 밀도구배 원심분리법과 같은 적절한 방법으로 더욱 분획할 수도 있다. 수득된 mRNA가 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코오딩할 수 있다는 것을 확인하기 위해서는 : 예를들면 mRNA를 단백질로 해독시켜 그의 생리활성을 검사하거나 ; 또는, 항-G-CSF 항체를 사용하여 그 단백질을 동정하는등의 방법을 수행한다. 보다 구체적으로 설명하면 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)의 난모세포에 mRNA를 주입하여 번역시키거나 [Gurdon et al., Nature, 233권 177p(1972)] 또는 토끼 망상 적혈구계나, 소맥배아계를 이용한 번역 반응이 수행되고 있다 [Schleif 및 Wensink, "Practical Methods in Molecular Biology", Springer-Verlag, NY(1981)]. G-CSF 활성의 검정은 골수세포를 이용한 연한천 배양법을 적용하여 실시되며, 이들 수행방법은 총설이 있다 [Metcalf; "Hemopoietic Colonies", Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, NY(197
7)].
이와 같은 방법으로 얻은 mRNA를 주형으로 하여 단일-가닥 cDNA를 합성하고 ; 이 단일-가닥 cDNA로부터 2중-가닥 cDNA를 합성한 후 ; 적절한 벡터 DNA에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제조한다. 이 재조합 플라스미드를 제조한다. 이 재조합 플라스미드를 사용하여 적절한 숙주 예를들면, 에스케리키아 콜리를 형질전환 시킴으로써 형질전환체 내에 일군의 DNA(이하, cDNA라이브러리로 칭한다)를 얻을수 있다.
2중-가닥 cDNA는 다음 2가지 방법들중 한가지를 이용하여 mRNA로부터 얻을 수 있다 : 가령 mRNA의 3'-말단의 폴리 A-연쇄에 상보적인 올리고(dT)를 개시제로 사용하여 역전사효소로 처리한다 : 또는 G-CSF 단백질의 아미노산 서열의 일부에 해당하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이를 개시제로 사용하여 역전사 효소로 처리함으로써 mRNA에 상보적인 cDNA를 합성한다. 2중-가닥 cDNA는 또한 다음 방법으로도 제조가능하다 : 알칼리로 처리하여 mRNA를 분해하여 제거한 후 얻어진 단일-가닥 cDNA를 먼저 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제 I(예. 클레노우 단편)으로 처리하고, 이어서 S1 뉴클레아제로 처리 한다 ; 또 다른 방법으로는 mRNA를 직접 RNase H 및 DNA 폴리머라제(예. E. coli 폴리머라제 I)로 처리한다. 보다 자세한 내용은 하기 문헌[Maniatis et. al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory(1982) ; 및 Gubler 및 Hoffman ; Gene, 25권, 263p(1983)]을 참조하면 된다.
이와 같이 하여 얻어진 2중-가닥 cDNA를 적당한 벡터, 예를들면 pSC101, pDF41, Co1E1, pMB9, pBR322, pBR327, 및 pACYC1으로 대표되는 일종의 EK-형 플라스미드 벡터 또는 λgt, λc, λgt 10 및 λgt WES등으로 대표되는 일종의 파지 벡터에 삽입시켜 이 재조합 벡터를 사용하여 E. coli 균주(χ1776, HB101, DH1, 또는 C600)를 형질전환시켜 cDNA 라이브러리를 얻는다(예, "Molecular Cloning", ibid참조).
2중-가닥 cDNA는 다음 방법으로 벡터에 연결할 수 있다 : cDNA의 말단에 화학적으로 적절히 합성된 DNA 단편을 결합시켜 연결 가능한 말단을 제공하고 ; 미리 제한효소를 사용하여 개열시킨 벡터 DNA와 상기 cDNA를 ATP 존재하에서 T4 파지 DNA 리가제로 처리함으로써 연결시킨다. 다른 방법으로서, 미리 제한 효소를 사용하여 개열시킨 벡터 DNA와 2중-가닥 cDNA에 각각 dC, dG-연쇄(또는 dT, dA-연쇄)를 부가시킨 후, 양 DNA를 함유하는 용액을 어닐링하는 것에 의하여서도 결합시킬 수가 있다("Molecular Cloning", ibid참조).
이와같이 하여 얻어진 재조합 DNA를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키는데 있어서는 임의의 공지방법을 이용할 수 있다. 숙주세포가 이. 콜리(E. coli)일 경우 Hanahan이 상세히 기술하고 있는 방법[J.Mol. Biol., 166권 557p(1983)］즉 CaCl2또는 MgCl2또는 RbCl의 존재하에서 제조된 컴피턴트 세포에 이 재조합 DNA를 가함으로써 실시할 수 있다.
목적하는 유전자를 갖고 있는 세포는 이하에 기재하는 여러가지 방법으로 검색할 수 있다 : 인터페론 cDNA의 클로닝에 사용된 플러스-마이너스 방법[Taniguchi et al., Proc. Jpn. Acad., 55권 Ser. B., 464p(1979)], 혼성화-해독분석법(hybridization-translation assay mehtod)[Nagata et al., Nature, 284권 316p(1980)] 및 인체 G-CSF 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열을 기초로 하여 화학합성한 올리고 뉴클레오티드 탐침을 사용하는 콜로니 또는 플라크 혼성화법[Wallace et al., Nucleic Acids Res., 9권 879p(1981) 및 Benton ＆ Davis, Science, 196권 180p(1977)]등을 이용하면 좋다.
인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코오딩하는 이와같이 하여 클론화된 유전자를 갖는 단편을 적절한 벡터-DNA에 재삽입하여 다른 원핵생물 또는 진핵생성물의 숙주세포를 형질전환시킬 수가 있다. 다시 이들의 벡터에 적절한 프로모터 및 형질발현에 관여하는 서열을 도입함으로써 개개의 숙주 세포에서 유전자를 발현시킬 수 있다.
원핵생성물 숙주세포로서는 예를들면 에스케리키아 콜리(Escherichia coil), 바실러스 서브틸리스(Bacilus subtilis) 및 바실러스 써모필루스(Bacillus thermophilus)등이 있다. 목적하는 유전자를 이들 숙주세포내에서 형질발현시키는 데는 숙주와 적합한 종류로부터 유래된 레플리콘, 즉 복제기원 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터로 숙주세포를 형질전환시키면 좋다. 또한 벡터는 형질전환 세포에 표현형질(표현형)에 대한 선택성을 부여하는 서열을 갖는 것이 바람직하다.
예를들어, 대장균은 이. 콜리(E. coil)내에서 복제할 수 있는 벡터인 pBR322를 사용하여 형질전환시킬 수가 있다.[Bolivar. Gene, 2권 95p(1975)참조]. 이 벡터는 암피실린- 및 테트라사이클린-내성 유전자를 갖고 있으므로 이들중 하나의 내성을 이용하여 형질전환 세포를 동정할 수 있다. 원핵생물 숙주의 유전자 형질발현에 필요한 프로모터로서는 β-락타마네 유전자의 프로모터[Chang et al., Nature, 275권, 615p (1978)], 락토오즈 프로모터[Goeddel et al., Nature, 281권 544p(1979)] 및 트립토판 프로모터[Goeddel et al., Nucleic Acid Res., 8권 4057p(1980)]등이 있다. 이들 모두가 본 발명에 따른 인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 제조에 사용될 수 있다.
진핵생물중, 진핵미생물의 숙주세포로서는 예를들면 싸카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 것을 들수 있고, 플라스미드 YRp7[Stinchcomb et al., Nature, 282권 39p(1979)]의 벡터를 이용하여 형질전환시킬 수 있다. 이 플라스미드는 트립토판을 생산하는 능력이 결핍된 효모주에 대한 선택 표시가 되는 TRP1 유전자를 갖고 있기 때문에 형질전환체는 트립토판 부재하에서 증식시킴으로써 선별할 수 있다. 유전자 형질발현에 사용될 수 있는 프로모터로서는 산성 포스파타제 유전자 프로모터[Miyanohara et al., Prco, Natl. Acad. sc;., USA 80권 19 (1983)] 및 알콜 탈수소 효소 유전자 프로모터 [Valenzuela. et al., Nature. 298권 347p (1982)]등이 있다.
포유동물 세포 유래의 숙주세포로서는 COS세포, 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, C-127 세포 및 Hela 세포 등을 들 수 있고, 이들 세포를 형질전환시키는 벡터로서는 pSV2-gpt[Mulligan 및 Berg ; Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78권 207p(1981)]등이 있다. 이들 벡터는 복제기원, 선택 표시, 발현시키고자하는 유전자의 앞에 위치하는 프로모터, RNA 접합부위, 다중아데닌화 부호 등을 포함한다.
포유동물 세포에서 유전자발현에 사용될 수 있는 프로모터로서는 레트로비루스, 폴리오마비루스, 아데노비루스, 시미안비루스 40(SV40) 등의 프로모터를 예로 들 수 있다. 예를들어 SV40 프로모터를 사용할 때에는 Mulligan 등의 방법[Nature, 277권 108p(1979)]에 따라 목적하는 유전자발현을 용이하게 실시할 수 있다.
복제 기원으로서는 SV40, 폴리오마비루스, 아데노비루스, 소의 파필로마비루스(BPV) 등으로부터 유래된 것을 사용할 수가 있다. 선택 표시로는 인산전이 효소 APH(3')II 또는 I(neo)유전자, 티미딘 카이네이즈(TK) 유전자, 이. 콜리(E. coli) 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Ecogpt)유전자, 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자 등이 사용될 수 있다.
상기 예시한 숙주-벡터계를 사용하여 인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 얻기 위해서는 다음 방법들을 사용할 수 있다 : 유전자를 상술한 벡터중 하나의 적절한 부위에 삽입하여 생성된 인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코오딩하는 재조합 DNA로 숙주세포를 형질전환시킨 후, 얻어진 형질전환체를 배양한다. 다시 원하는 폴리펩티드는 세포내 또는 배양액으로부터 공지기술중의 하나를 사용하여 분리·정제할 수 있다.
진핵생물의 유전자는 일반적으로 인체 인터페론 유전자 등으로 알려진 바와 같이 다형 현상을 나타내고[Nishi et al., Biochem., 97, 153(1985)]이 다형 현상에 의하여 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환되거나 또는 염기 서열의 변화가 있다하여도 아미노산 서열은 전혀 변화되지 않게 한다.
제3(b)도 또는 제4(b)도에 나타낸 아미노산 서열중 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결핍되거나 또는 부가된 폴리펩티드, 또는 하나 그 이상의 아미노산이 하나 또는 그 이상의 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드도 G-CSF 활성을 가질 수 있다. 예를들어 인체 인터루킨-(IL-2) 유전자의 시스테인 코돈 각각을 세리코돈으로 변환하여 얻은 폴리펩티드가 이루어진 -2의 활성을 보유한다는 것도 알려졌다[Wang et al., Science, 224권 1431p(1984)]. 그러므로 천연적으로 존재하는 것 또는 화학 합성을 한 것이거나 폴리펩티드가 인체 G-CSF 활성을 갖기만 하면 이들 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자, 이 유전자를 갖는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의하여 수득된 형질전환체, 또는 형질전환체를 배양하여 얻은 폴리펩티드 또는 당 단백질이 본 발명 범위에 포함된다.
이제부터, 인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자, 이 유전자를 갖는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터를 갖는 형질전환체, 및 이 형질전환체 내에 발현된 인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 당 단백질의 제조방법을 간단하게 설명한다.
(1) 탐침 제조
종양세포주 CHU-2의 배양상층액으로부터 정제하여 얻어진 균일한 인체 CSF 단백질에 대하여 N 말단으로부터 아미노산 서열을 결정한다. 브로모시 안으로 분해하고 트립신으로 처리하여 단편을 얻고, 이 단편에 대하여서도 아미노산 서열을 결정한다[실시예 3(i), (ii) 및 (iii)].
결정된 아미노산 서열중에서 제1도에 나타낸 서열을 갖는 3종류의 뉴클레오티드 탐침(A), (LC) 및 (IWQ)를 합성한다(실시예 4). 탐침(A)는 14개의 연속되는 뉴클레오티드로 구성된 혼합형 탐침이다. 탐침(IWQ)는 인체 콜레시스토키닌 유전자의 클로닝에 사용되는 유형의 탐침으로서 [Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82권, 1931p(1985)]데옥시이노신을 갖는 30개의 연속된 뉴클레오티드이다. 탐침(LC)는 제3도에 나타낸 염기 서열을 기준으로 하여 실시예 3(i)에 나타낸 아미노산 서열의 N말단으로부터 32∼39번 부분에 상당하는 뉴클레오티드로부터 합성한 24개의 뉴클레오티드로 구성된 탐침이다.
뉴클레오티드의 화학적 합성은 개량형 포스포트리에스테르법을 고상법에 적용하여 실시할 수 있으며, 이는 나랑(Narang)의 총설에 기술되어 있다[Narang. Tetrahedron, 39, 3∼22(1983)].
상기 언급된 탐침 내의 위치 이외의 위치의 아미노산 서열을 기준으로 제조한 탐침도 사용될 수 있다.
(2) cDNA 라이브러리의 구축
CHU-2 세포에 구아니딘 티오시아네이트 용액을 가하여 균질화시키고 CsCl 밀도구배 원심분리법을 실시하여 전체 RNA를 얻는다.
이 전체 RNA로부터 올리고(dT)-셀룰로오즈 컬럼 크로마토그래피에 의해 폴리(A+)RNA를 선별한다. 그런후에 역전사효소로 단일-가닥 cDNA를 합성하고, RNase H 및 E. coli DNA 폴리머라제 I을 가하여 2중-가닥 cDNA를 얻는다. 위에서 얻은 2중-가닥 cDNA에 dC 연쇄를 부가하고, Pst I 절단 부위에 dG 연쇄를 부가한 pBR322 벡터와 접합시킨다. 생성된 재조합 DNA를 사용하여 이. 콜리(E. coli) 균주 χ1776을 형질전환시키고, pBR322 계 cDNA 라이브러리를 구축한다(실시예 5 및 6).
유사한 방법으로 EcoRI 링커를 사용하여 2중-가닥 cDNA를 λgt10 벡터와 연결하여 λ-파지계 cDNA 라이브러리를 구축한다(실시예 7).
(3) 선별
pBR322계 cDNA 라이브러리로부터 얻은 재조합체를 왓트만 541 여과지에 고정시키고 32p로 방사표시된 탐침(IWQ)를 사용하여 콜로니 혼성화하여 하나의 클론이 선별되었다. 이 클론을 서던 블룻팅법[Southern blotting method ; Southern, J. Mol. Biol., 98권 530p(1975)]으로 더 상세히 검토한 결과 탐침 (A)와도 혼성화된 것으로 나타났다. 이 클론의 뉴클레오티드 서열은 디데옥시법[Sanger, Science, 214권 1205p(1981)]으로 결정하였다.
얻은 cDNA 삽입체의 염기 서열을 제2도에 나타낸다. 제2도에 나타낸 것과 같이 이 cDNA 삽입체는 탐침(IWQ) 및 (A)를 포함하는 308염기쌍으로 구성되어 있고, 실시예 3(iii)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 83개의 아미노산을 코오딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 갖는 것을 알 수 있다. 이 308 염기쌍을 포함하는 pBR322 유래의 플라스미드를 이하에서는 pHCS-1이라 약칭한다(실시예 8).
pHCS-1로부터 얻어지는 308 염기쌍을 포함하는 DNA 단편을 닉크 트랜스레이션법(nick translation method ; Molecular Cloning ibid)으로 방사 표시하고, 이것을 탐침으로 사용하여 λgt10 유래의 cDNA 라이브러리를 플라크 혼성화[Benton 및 Davis, Science, 196권 180p(1977)]에 의하여 선별하여 5개의 클론을 얻는다. cDNA를 포함하고 있을 것으로 여겨지는 클론에 대하여 그 염기 서열을 위 설명과 같은 방법으로 결정한다.[제3(a)도.]
제3(a)도에 나타낸 바와 같이 이 cDNA 삽입체는 하나의 커다란 오픈리딩 프레임을 갖고 있음을 알 수 있다.
이 cDNA 로 코오딩되는 아미노산 서열은 제3(a)도에 나타낸 것과 같이 추론할 수 있다.
실시예 3(i)에 나타낸 G-CSF 단백질의 N-말단 아미노산 서열과 비교한 결과, 이 cDNA 가 5'말단에서 32∼34 뉴클레오티드 위치의 ATG 서열로 시작하여 119∼211 위치의 GCC 서열로 끝나는 90 염기쌍으로 코오딩되는 시그날 펩티드와 122∼124 위치의 ACC 서열로 시작하여 650∼652 위치의 CCC 배열로 끝나는 531 염기쌍에 의하여 코오딩되는 성숙한 G-CSF 폴리펩티드에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 것으로 나타났다. 그러므로, 제3(b)도에 나타낸 아미노산 서열 I의 폴리펩티드는 207개의 아미노산으로 구성되며, 그의 분자량은 22292.67달톤으로 계산되었다. 아미노산 서열 II의 폴리펩티드는 177개의 아미노산으로 구성되었고, 그 분자량은 18986.74달톤이다(실시예 9).
다만, 단백질의 개시 부위에 관하여서는 32∼34 위치 또는 68∼70 위치의 ATG도 같이 생각될 수 있다. EcoRI 절단 부위에 이 cDNA (+VSE)를 삽입한 pBR322를 보유하는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 균주 χ1776은 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물 공업기술 연구소(Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology)에 기탁되었다(수탁번호 : FERM BP-954).
제6도는 얻어진 유전자의 제한효소 절단 부위를 나타낸다.
이 cDNA 를 pBR327[Soberon et al., Gene, 9권 287p(1980)]의 EcoRI 부위에 결합시킨 플라스미드를 이하에서는 pBRG4로 칭한다.
이렇게 얻은 pBRG4를 제한효소 EcoRI으로 처리하여 약 1500 염기쌍의 cDNA 를 포함하는 DNA 단편을 얻는다. 이 단편을 닉크 트랜스레이션법(molecular Cloning, ibid)으로 방사 표시하고, 이 방사 표시된 DNA 단편을 탐침으로 사용하여 다시 χgt10 유래의 cDNA 라이브러리를 플라크 혼성화(Benton 및 Davis, ibid)에 의하여 성별한다. 이때 동시에 λ-파지 DNA를 고정시킨 니트로 셀룰로우즈 여과지 2장의 작성하여 놓고, 이중의 한장은 상기의 플라크 혼성화에 사용하도 다른 하나에 대하여는 앞에서 설명한 탐침(LC)으로 플라크 혼성화를 행한다. 양쪽 탐침 모두에 양성을 나타낸는 파지를 선별한다. 완전한 길이의 cDNA 를 가지고 있는 것으로 생각되는 클론을 선별하여 디데옥시법으로 상기 cDNA 삽입체의 염기 서열을 결정한 결과 제 4(a)도에 나타낸 것과 같았다.
이 cDNA 는 하나의 커다란 오픈리딩프레임을 가지며, 코오딩하는 아미노산 서열은 제4(a)도에 나타낸 것과 같이 추론된다.
실시예 3(i)에 나타낸 G-CSF 단백질의 N 말단 아미노산 서열과 비교함으로써, 이 cDNA 가 5'-말단으로부터 31∼33 뉴클레오티드 위치의 ATG 서열에서 시작하여 118∼120 위치의 GCC 서열에서 끝나는 90 염기쌍으로 코오딩되는 시그날 펩티드 및 121∼123 위치의 ACC 서열에서 시작하여 640∼642 위치의 CCC 서열에서 끝나는 522 염기쌍으로 코오딩되는 성숙한 G-CSF 폴리펩티드에 상당하는 염기 서열을 포함하는 것을 알 수 있다. 그러므로, 제4(b)도에 나타낸 아미노산 서열 I 의 폴리펩티드는 204개의 아미노산으로 구성되고 그의 분자량은 21977.35달톤으로 계산되었다. 아미노산 서열 II의 폴리펩티드는 174개의 아미노산으로 구성되고 그의 분자량은 18671.42달톤으로 계산되었다(실시예 10).
다만, 단백질의 개시 부위에 관하여서는 31∼33 위치 이외에 58∼60 위치 또는 67∼69 위치의 ATG도 같이 생각될 수 있음을 알아야 한다.
EcoRI 절단 부위에 이 cDNA(-VSE)를 삽입한 pBR322를 유지하는 에스케리아 콜리(Escherichia coli)균주 χ1776은 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물 공업기술 연구소에 기탁되어 있다(기탁 변호 : FERM BP-955).
제6도는 유전자의 제한효소 절단 부위를 나타낸다.
이 cDNA 를 pBR327의 EcoRI 부위에 결합시킨 플라스미드를 이하에서는 pBRV2로 칭한다.
(4) 인체 염색체 유전자 라이브러리의 선별
인체 염색체 유전자 라이브러리를 마니아티스[Maniatis et al., Molecular cloning ibid]가 서술한 방법에 따라 제조하고, 위의 pHCS-1으로 선별한다. 선별에 사용되는 탐침으로서는 다음의 것들을 들 수 있다 : pHCS-1 유래의 308-bp DNA 단편, pBRG4-유래의 약 1500-bp DNA 단편, pBRV2-유래의 약 1500-bp DNA 단편, 이들 DNA 단편들중 하나 또는 그 이상의 일부를 포함하는 적절한 길이의 DNA 단편, 및 전술한 올리고뉴클레오티드 탐침[즉, (IWQ), (A) 및 (IC)]. 이중 pHCS-1 DNA 단편을 사용하는 경우에 대하여 이하에서 설명한다.
이 DNA 단편을 닉크 트랜스레이션법[nick translation method : Roop et al., Cell, 15권 431p(1978)]에 따라32P로 방사 표시한다. 이32P-표시된 단편을 탐침으로 사용하여, 인체 염색체 유전자 라이브러리를 플라크 혼성화(Benton 및 Davis, ibid)에 의해 선별하여 10여개의 클론을 얻는다.
이 클론으로부터 DNA 를 회수한 후, 공지방법[Fritsch et al., Cell 19권 959p(1980)]으로 제한효소 지도를 작성한다.
동일한 DNA 탐침을 사용하여 서던 블롯팅(Southern, ibid)을 수행한 결과, EcoRI 및 XhoI에 의해 전달된 약 4kb의 DNA 단편이 인체 G-CSF 폴리펩티드를 코오딩하는 부분을 포함할 것이라는 것을 알았다. 따라서, 약 4kb DNA 단편을 pBR327의 EcoRI 부위에 EcoRI 링커를 사용하여 삽입시켜서 pBRCE3β를 얻는다. 이 플라스미드를 염기 서열 DNA로 사용하여 디데옥시 법에 의해 약 4kb DNA 단편의 3-kb 부분의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 그 결과로, 상기 DNA 단편이 인체 G-CSF 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자임을 알았다(제5도).
pBRCE3β(즉, EcoRI 부위에 상기 약 4kb DNA 단편이 삽입된 pBR327 플라스미드)를 보유하는 이. 콜리(E. coli) 균주 χ1776은 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물 공업기술 연구소에 기탁되어 있다(수탁번호 : FERM BP-956).
제3도에 나타낸 pBRG4 cDNA 삽입체와 제4도에 나타낸 pBRV2 cDNA 삽입체를 비교해 보면 상기 DNA 단편이 5개의 엑손 부위를 가지며, pBRG4 및 BRV2에서 유래된 아미노산 서열을 코오딩 한다는 것을 알 수 있다.
제7도는 얻은 유전자의 제한효소 절단 부위를 나타낸다.
이 DNA 단편은 인체 G-CSF의 염색체 유전자, 또는 인체 G-CSF mRNA로 전사되는 선행부위와 전사조절에 관여하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다[Benoist 및 Chambon, Nature, 290권 304p(1981) ; Breathnack 및 Chambon, Ann. Rev. Biochem., 50권, 340p(1981)].
(5) 이. 콜리(E. doli)내에서 형질발현 시키기 위한 재조합 벡터의 구축.
(A) +VSE계 재조합 벡터
(3) (실시예 9)에서 얻은 플라스미드 pBRG4로부터, 제한효소를 사용하여 G-CSF 폴리펩티드의 cDNA 단편을 잘라내어 다음 방법들중 하나로 재조합 벡터를 제조한다.
(i)어닐링된 합성 링커를 사용하여, 상기 단편을 tac 프로모터를 갖는 pKK223-3(파마시아 파인 케미칼스 제품)으로부터 얻은 단편과 결찰시킨다(실시예 12 및 제8도) :
(ii)PL프로모터를 갖는 pPL-lambda(파마시아 파인 케미칼스 제품)로부터 얻은 3개의 단편을 어닐링된 합성 링커와 결찰시키고, 이 결찰 생성물과 cDNA 단편을 재조합 벡터의 제조방법에 따라 다시 제조한다(실시예 13, 제9도). 또는
(iii)어닐링된 합성링커를 사용하여, 단편을 trp 프로모터를 갖는 pOY1 플라스미드로부터 제조된 단편과 결찰시킨다(실시예 14 및 제10도).
(B) -VSE계 재조합 벡터
상술한 것과 동일한 방법으로, 실시예 19 및 제11도, 제12도 및 제13도에서 나타내는 바와 같이 플라스미드 pBRV2(실시예 10)를 사용하여 3개의 재조합 벡터를 제조한다.
(6)이.콜리(E. coli)를 숙주로 하는 형질전환체의 제조와 배양 및 그의 형질발현
상기 +VSE계 및 -VSE계에 대하여 각각 3종의 재조합 벡터를 사용하여 앞에서 설명된 Molecular Cloning, ibid에 서술된 염화칼슘법 또는 염화루비듐법으로 각각 이. 콜리(E. coli) 균주 DH1, N4830주 또는 JM105주를 형질전환시킨다(실시예 12, 13, 14 및 19). 수득된 각각의 형질전환체를 암피실린-함유 루리아 배지에서 우선 배양하고 계속하여 필요에 따라 유도적으로 배양을 행하여 형질발현시킨다(실시예 15 및 20).
(7)이. 콜리(E.coli)로부터 G-CSF 폴리펩티드의 회수 및 정제 및 그의 아미노산 분석
형질전환체의 배양액을 원심분리하여 세포 펠릿을 얻는다. 이어서, 수거된 세포를 라이소자임으로 처리하고, 동결-융해를 반복하여 용균시켜서 상층액을 얻는다. 또 다른 방법으로는 구아니듐 클로라이드로 세포를 처리하고 원심분리하여 상층액을 수거한다.
상층액을 울트로겔(Ultrogel) ACA54 컬럼(LKB 제품)으로 겔 여과하고, 활성 분획을 한외여과 기구로 농축시킨다.
이어서, n-프로판올을 함유하는 트리플루오로아세트산 수용액을 농축액에 첨가하고, 얼음중에 방치한 후, 혼합물을 원심분리하여 역상 C18 컬럼에 흡착시킨 다음 용출 조작을 시행한다. 용출 후 각 분획에 대하여 활성을 조사하고, 활서 분획을 수집하요 재차 상술한 것과 동일한 정제 조작을 행한 후 동결건조 시킨다. 이 동결건조 분말을 용해하여 고속분자채 액체 크로마토그래피에 걸러서 분리한다. 얻은 폴리펩티드를 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 걸에 목적하는 G-CSF 폴리켑티드를 나타내는 단일 밴드를 확인한다(실시예 16 및 20). 이와 같이 하여 얻은 G-CSF 폴리펩티드는 인체 G-CSF 활성을 나타낸다(실시예 1 및 20). 상기 G-CSF 폴리펩티드를 히다찌(日立)835 아미노산 자동분석장치(Hitachi 제품)를 사용하여 아미노산 분석법으로 분석한다. N-말단 마이노산 분석은 기상 분석기(에드만 분해), 고압 액체크로마토그래피(HPLC) 및 울트로스피어-ODS 컬럼을 사용하여 시행하였다(실시예 18 및 21).
(8) 동물세포용 재조합 벡터의 구축
숙주동물세포로서 C127 및 NIH3T3세포를 사용할 때의 재조합 벡터(BPV유래) 및 CHO세포를 사용할 때의 재조합 벡터(dhfr 유래)를 +VSE 및 -VSE계 cDNA와 염색체 유전자에 대해 제조한다. COS세포를 사용할때의 재조합 벡터도 또한 제조한다. 이하에는 대표적인 예들을 기술하며, 보다 자세한 내용은 관련된 실시예를 참조하기 바란다.
(A) +VSE계 재조합 벡터의 구축
상기 (3)에서 얻은 cDNA (+VSE) 단편을 pdKCR에 삽입하여 플라스미드 pHG410을 만든다(실시예 22 및 제14도). 이를 EcoRI으로 부분 분해하고 DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편)으로 처리하여 말단을 불런트 엔드(blunt end)로 만든다. 이 DNA에 Hind Ⅲ 링커를 붙인 다음 Hind Ⅱ 및 이어서 T4 DNA 리가제로 연속적으로 처리한다. 이 DNA로 루비듐 클로라이드법을 이용하여 이. 콜리(E.coli) 균주 DH1을 형질전환 시킨다(Molecular Cloning ibid). 이때 얻어진 플리스미드를 pHGA410(H)라 칭한다(제15도).
pHGA410(H)를 sal I 으로 처리하고, 다음에 말단을 블런트엔드화한 후, 다시 Hind Ⅲ로 처리하여 Hind Ⅲ-Sal I 단편을 회수한다. 한편 소의 파필로마 비루스의 형질전환된 단편을 갖는 플라스미드 pbBPV-1을 Hind Ⅲ 및 Pvu II로 처리하여 큰 DNA 단편을 분리하여 미리 따로 분리한 Hind Ⅲ-Sal I 단편과 접합시킨다. 이를 사용하여, 이. 콜리(E.coli) 균주 DH1를 형질전환시켜 플라스미드 pTN-G4를 얻는다. 이 플라스미드는 pHGA410-유래의 CSF-cDNA를 갖는다(제15도 및 실시예 23).
또한 pHGA410 또는 pHGA410(H) 플라스미드와 pAdD26SVpA 플라스미드를 사용하여 CHO 세포용 재조합 벡터(+VSE)인 pHGG4-dhfr을 제조한다(제16a 및 16b도, 실시예 25).
플라스미드 pAdD26SVpA를 EcoRI 및 BamHI으로 처리하여 dhfr 유전자를 포함하는 2-kb DNA 단편을 회수하고 그 단편을 pHGA410(H)의 Hind Ⅲ 부위에 삽입하여 pG4DR1 및 pG4DR2를 제조한다.(제16c도 및 실시예 25).
(B)-VSE계 재조합 벡터의 구축
상기 (3)에서 얻은 cDNA(-VSE) 단편을 벡터 -pdKCR에 삽입하여 플라스미드 pHGV2를 만든 후(실시예 28), 이것을 EcoRI로 부분 절단하고 DNA 폴리머라제 I(클레노우단편)으로 처리하여 말단을 블런트 엔드로 만든다. 상기 DNA에 Hind Ⅲ 링커를 붙이고 다음에 Hind Ⅲ 처리를 그리고 T4 DNA 리가제 처리를 한 후 루비듐 클로라이드법을 사용하여 이. 콜리(E. coli) 균주 DH1을 형질전환 시킨다(Molecular Cloning, ibid). 이렇게 얻은 플라스미드를 pHGV2(H)라 명명한다(제18도).
pHGV2(H)를 Sal I 으로 처리하고, 다음에 말단을 블런트 엔드로 만든 후, 다시 Hind Ⅲ로 처리하여 Hind Ⅲ-Sal I 단편을 회수한다. 한편 소의 파필로마 비루스의 형질전화된 단편을 갖는 플라스미드 pbBPV-1을 Hind Ⅲ 및 Pvu Ⅱ로 처리하여 큰 DNA 단편을 분리하여 미리 따로 분리하여 Hind Ⅲ-Sal I 단편과 접합시킨다. 이를 사용하여, 이. 콜리(E.coli) 균주 DH1를 형질전환시켜 플라스미드 pTN-V2를 얻는다. 이 플라스미드는 pHGV2-유래의 CSF-cDNA를 갖는다(제18도 및 실시예 29).
+VSE와 유사한 방법으로 pHGV2 또는 pHGV2(H)와 pAdD26SVpA를 조합하여 CHO세포용 재조합 벡터(-VSE)인 pHGV2-dhfr을 제조하였다(제19a도 및 제19b도, 실시예 31).
pAdD26SVpA를 EcoRI 및 BamHI으로 처리하여 dhfr 유전자를 함유하는 약 2kb의 DNA 단편을 회수한 후, 이를 pHGV2(H)의 Hind Ⅲ 부위에 삽입하여 pV2DR1 및 pV2DR2를 제조한다(제19c도 및 실시예 31).
(C) 염색체 유전자를 함유하는 재조합 벡터의 구축
제5도에 나타낸 염색체 유전자를 함유하는, 상기(4)에서 얻은 플라스미드 pBRRCE3β를 EcoRI으로 처리한다.
Banerji가 Cell, 27권, 299p(1981)에 서술한 pSVH+K+플라스미드를 KpnI으로 처리하여 글로빈 유전자를 제거한다. 상기 플라스미드를 계속 Hind Ⅲ로 부분 절단하여 SV40의 레이트 유전자(late gene)의 일부를 제거하고, 단편들을 재결합시켜 형질발현 벡터 pML-E+를 제조한다.
이 벡터를 제한효소 EcoRI으로 처리하고 알칼린 포스파타제(Takara Shuzo 제품)로 탈인산처리하여 벡터 DNA를 얻은 후, 이것을 T4 DNA 리가제(Takara Shuzo제품)를 사용하여 전술한 염색체 DNA 단편과 접합시켜 COS세포용 재조합 벡터-pMLCE3α를 얻는다(실시예 34). 제20도에 나타낸 바와 같이, 이 플라스미드는 SV40 유전자의 인핸서, SV40의 복제기원, pBR322의 복제기원 및 pBR322 유래의 β-락타마제 유전자(Ampr)를 함유하고, 및 SV40 유전자 인핸서의 하류에 연결된 인체 G-CSF 염색체 유전자를 갖는다.
C127세포용 형질발현 벡터는 다음 방법으로 제조한다. COS세포용 형질발션 벡터인 pMLCE3α를 적절한 제한효소로 절단하여 얻은 염색체 CSF 유전자를 함유하는 DNA 단편을 T4 DNA 리가제로 소의 파필로마비루스(BPV)의 복제기원을 함유하는 DNA 단편 및 SV40의 초기 프로모터를 함유하는 DNA 단편과 결합시킨다. 이렇게 제조한 pTNCE3α는 SV40의 초기 프로모터의 하류에 연결된 염색체 CSF 유전자를 갖는 형질발현 벡터로서 BPV의 65%를 함유한다.
CHO 세포용 형질발현 벡터는 T4 DNA 리가제에 의해 연결된 두개의 DNA 단편을 갖는다 ; 이들 중 한개의 단편은 염색체 CSF 유전자 및 C127세포용 형질발현 벡터인 경우에서와 같이 SV40 초기 프로모터를 함유하고, 나머지 다른 한개의 단편은 pAdD26SVpA-유래의 dhfr 유전자를 함유한다. 이 생성된 pD26SVCE3α는 염색체 CSF 유전자를 SV40 프로모터의 하류에 가지며 dhfr 유전자를 아데노 비루스의 주된 후기 프로머터의 하류에 갖는 형질발현 벡터이다.
(9) 동물세포내에서의 형질발현
대표적인 2가지 예를 이하에 기술하며, 보다 자세한 내용은 관련된 실시예를 참조하기 바란다.
(A) 생쥐 C127세포내에서의 형질발현
플라스미드 pTN-G4 또는 pTN-V2를 BamHI으로 처리한다. 이 처리된 플라스미드를 사용하여 배양 증식시켜 놓은 C127세포를 인산칼슘법으로 형질전환 시킨다. 형질전환된 세포를 배양하여 CSF 생산능력이 높은 클론을 선별한다. 형질발현 G-CSF를 함유하는 당단백질을 형질전환 세포의 배양액으로부터 회수하여 정제한 결과 인체 G-CSF 활성을 갖는 것이 확인되었다. 또한 시료의 아미노산분석 및 당함유량분석을 실시하여 목적하는 당단백질의 존재도 확인되었다.
당 함량을 분석하기 위해서는 아미노산 분석에 사용한 CSF 시료에 대하여 엘손-마르간법(Elson-Margan method)으로 아미노당의 정량, 오르시놀 술페이트법으로 중성당의 정량, 또는 티오바르비투레이트법으로 시알산의 정량을 각각 실시한다. 각각의 정량방법은 도꾜 가가꾸 도진이 출판한 생화학 실험강좌 A 코스 4권, 13장 "당질의 화학(하권)"에 기재되어 있다. 각 정량치를 중량%로 환산한 결과 얻어진 G-CSF의 당 함량이 숙주세포의 종류, 형질발현 벡터 및 배양 조건 등의 차이에 따라 1∼20중량%의 범위에 분포되어 있음을 알 수 있다.
(B) COS세포내에서의 형질발현
원숭이 CV-1세포에서 유도되었고, SV40 복제기원이 결핍된 돌연변이체에 의해서 형질전환되어 SV40의 크기가 큰 T 항원을 형질발현시키는 COS 세포[Gluzman et al., Cell, 32, 175(1981)]를 5(C)에서 얻은 인체 염색체 G-CSF 유전자를 pMLCE3α를 사용하여 형질전환 시킨다. COS 세포배양 상층액은 인체 G-CSF 활성을 나타냈다(실시예 35).
COS 세포를 회수하여 mRNA 분석을 실시한 결과 3(a)도 및 4(a)도에 기재한 아미노산 서열에 해당되는 2개의 mRNA가 각각 존재하는 것으로 나타났다.
[실시예]
실시예들을 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하기 전에, CSF 활성의 분석 방법을 예시하기 위한 목적으로 참고예를 먼저 제시하고자 한다.
[참고예]
CSF 활성의 분석
본 발명에 있어서 CSF 활성(이하에서는 CSA로 약칭한다)을 측정하는 데에는 하기 방법들이 이용된다.
CSA의 측정방법
(a) 인체 골수세포를 사용한 경우 ; Bradly, T. R. 및 Metcalf, D. 의 방법(Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 44권, 287∼300p 1966)에 따라 단층 연한천 배양을 실시하였다. 자세히 설명하면 소의 태아혈청 0.2㎖, 시료 0.1㎖, 인체 골수의 비부착성 세포 현탁액 0.1㎖(1∼2×105유핵 세포), 개변 McCoy's 5A 배양액 0.2㎖ 및 한천을 0.75% 함유하는 개변 McCoy's 5A 배양액 0.4㎖를 혼합하여 조직세포 배양용 플라스틱 접시(35mm 직경)에 부어넣고 응고시킨 다음 37℃, 5% CO2/95% 공기 및 100% 습도 상태에서 배양한다. 10일 후에 형성된 콜로니의 수(한개의 콜로니는 50개 이상의 세포로 구성된다)를 헤아려 한개의 콜로니를 형성하는데 필요한 활성을 1단위(Unit)로 하여 CSA를 측정한다.
(b) 생쥐 골수 세포를 사용하는 경우 ; 말의 혈청 0.4㎖, 시료 0.1㎖, C3H/He(암컷) 생쥐의 골수세포 현탁액 0.1㎖(0.5∼1×105유핵 세포), 한천을 0.75% 함유하는 개변 McCoy's 5A 배양액 0.4㎖를 혼합하여 조직세포 배양용 플라스틱 접시 (35mm 직경)에 부어넣고, 응고시킨 다음 37℃, 5% CO2/95% 공기 및 100% 습도 조건하에서 5일간 배양하여 형성된 콜로니의 수(한개의 콜로니는 50개 이상의 세포로 구성된다)를 헤아려 한개의 콜로니를 형성하는데 필요한 활성을 1단위로 하여 CSA를 측정한다.
상기 방법(a) 및 (b)에서 사용하는 개변 McCoy's 5A 배양액 및 (a)에 사용된 인체 골수 비부착성 세포 현탁액은 다음과 같이 제조한다.
개변 McCoy's 5A 배양액(2배 농도)
개변 McCoy's 5A 배양액(Gibco 제품) 12g, MEM 아미노산-비타민 배지(Nissui Seiyaky 사 제품) 2.55g, 소디움 비카르보네이트 2.18g 및 포타슘 페니실린 G 50,000 단위를 증류수 500㎖에 두번 용해시킨 후, 밀리포아 여과지(0.22㎛)로서 여과시켜 멸균시킨다.
인체 골수 비부착성 세포 현탁액
건강한 사람의 흉골을 찔러 채취한 골수액을 RPMI 1640 배양액으로 5배 희석하여, 피콜-페이크 용액(Pharmacia Fine Chemicals 제품)위에 놓고, 400×g 로 25℃에서 30분간 원심분리한다. 계면의 세포층(비중＜1.077)을 회수한다. 이 세포를 세척한 후, 소태아 혈청 20%를 함유하는 RPMI 1640 배양액을 사용하여 5×106세포 1㎖의 농도로 조정한다. 이를 조직 배양용 25㎠ 플라스틱 플라스크에 부어 넣고, CO2-배양기내에서 30분간 배양한 후, 비부착성 세포를 상층액으로부터 회수하여 다시 플라스틱 플라스크(25㎠)에 넣고 2시간 30분 배양한 다음, 비부착성 세포를 상층액으로부터 회수하여 분석에 사용한다.
[실시예 1]
「CHU-2」의 수립
호중구의 수가 현저히 증가한 구강저암 환자의 종양을 nu/nu 생쥐에 이식한다. 이식한 후 약 10일만에 종양의 중량과 호중구의 수가 현저히 증가하였다. 이식 12일 후에 종양을 무균적으로 추출하여 1∼2㎣ 입방체로 작게 절단하여 이것을 다음 방법으로 배양한다.
상기 세절한 종양 10∼15 조각을 50㎖ 플라스틱 원심분리관에 넣고, 5㎖의 트립신용액(트립신 0.25%, EDTA 0.02% 함유)을 넣은 후 37℃의 따뜻한 욕조물 중에서 10분간 진탕하여 상층액을 따라버린 다음, 다시 트립신용액 5㎖ 를 넣고 37℃에서 15분간 교반하면서 트립신으로 분해시킨다. 상층의 세포부유액을 회수하여 소의 태아혈청 1㎖를 첨가하여 트립신을 불활성화 시키고 얼음에 보존한다.
이상의 조작을 다시 행하여 세포 현탁액을 회수하고, 앞에서 얻은 것과 합쳐서 15,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포펠릿을 얻는다. 이 세포펠릿을 소 태아 혈청을 10% 함유하는 F-10으로 2회 세척한 다음 플라스틱 배양 플라스트(25㎠)에 세포농도 5×106개/플라스크가 되게하여 이식한다. 소 태아 혈청 10%를 함유하는 F-10 배양액을 사용하여 CO2배양기(CO2농도 5%, 습도 100%)중에서 하룻밤 배양한 다음 상층액을 비부착성 세포와 같이 제거하고, 새로운 배양액을 가하여 배양을 계속한다. 배양을 시작한지 6일째에 플라스크에는 세포가 가득차게 증식한다. 여기서 배양액을 새것으로 교환해준다. 그 다음날 배양액을 따라 버리고 RPMI 1640으로 5배 희석한 항-생쥐 적혈구 항체(Cappel 사 제품) 2㎖와 같이, RPMI 1640으로 2.5배 희석한 기니아 피그 보체(kyokuto seiyaku 제품) 2㎖를 가하여 37℃에서 20분 배양한다. 배양을 종료한 후, 소 태아 혈청을 10% 함유하는 F-10으로 2회 세척하여 nu/nu 생쥐 유래의 섬유아세포를 제거한다. 계속하여 소 태아 혈청을 10% 함유하는 F-10 배양액을 가하여 다시 2일간 더 배양한 후, 세포의 일부를 수거하여 한계희석법으로 클로닝을 실시한다.
얻어진 11개의 클론에 대하여 CSF 활성을 검사한 결과 다른 것들보다 약 10배나 높은 활성을 나타내는 1개의 클론(CHU-2)이 얻어졌다.
[실시예 2]
「CSF」의 분리
실시예 1에서와 같이 수립된 세포를 2개의 배양용 플라스크(150㎠)에 가득차게 증식시킨다. 이 세포를 회수하여 소 태아 혈청을 10% 함유하는 F-10 배양액 500㎖에 현탁시킨 다음 1580㎠의 회전유리병(Beolco 제품)에 옮기고, 0.5rpm 의 속도로 회전배양한다.
세포가 회전유리병 내벽에 가득차게 증식되었을때 배양액을 무혈청 RPMI 1640으로 교환해준다. 4일간 배양한 후, 배양 상측액을 회수하고 소 태아 혈청을 10% 함유하는 F-10용액을 가하여 배양을 속행한다. 3일간 배양한 후, 배양액을 다시 무혈청 RPMI 1640용액으로 교환해주고, 4일 후에 배양 상층액을 회수한다. 이와 같은 조작을 반복하여 무혈청 배양상층액을 유리병당 500㎖씩 매주 얻는다. 그리고 이 방법을 이용하여 비교적 장기간에 걸쳐 세포를 유지하여 배양 상층액을 회수하는 것이 가능하였다.
얻어진 배양상층액 5,000㎖를 1배치로 하여 여기에 0.01% 트윈(Tween)20을 첨가한 후, 홀로우 파이버 DC-4 및 아미콘 PM-10(Amicon 제품)을 사용한 한외여과법을 실시하여 약 1000배로 농축시킨 다음 이 농축액을 다음 순서로 정제한다.
(i) 직경 4.6㎝, 길이 90㎝의 Ultrogel AcA 54 컬럼(LKB 사제)법으로 0.15 M NaCl 및 0.01% 트윈20(Nakai Kagaku 제품)을 함유하는 0.01M 트리스-HCl 완충용액(pH 7.4)을 사용하여 상기 농축된 배양 상층액 5㎖를 시속 약 50㎖/시간으로 겔여과한다. 컬럼은 미리 소 혈청 알부민(Mw : 67,000), 오브 알부민(Mw : 45,000) 및 사이토크롬 C(Mw : 12,400)로 검정하였다. 겔 여과가 끝난 후에 각 분획의 0.1㎖씩을 채취하여 10배로 희석한 후「상기 CSA 분석방법(b)」으로 활성을 나타내는 분획을 선별한다. 그 결과 Ve =400∼700㎖에 해당하는 분획이 대식세포-우위의 CSA를 나타내고, 반면에 Ve =800∼1200㎖에 해당하는 분획은 과립성 백혈구-우위의 CSA를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 후자의 분획을 모아 PM-10(Amico 제품)을 사용한 한외여과를 실시하여 약 5㎖로 농축시킨다.
(ii) 상기 농축분획에 n-프로판올을 30% 함유하는 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액(아미노산 서열 결정용 : 도꾜 Kasei K. K. 제품)을 첨가하여 얼음에 15분 정도 방치한 다음 15,000rpm으로 10분간 원심분리하여 침전을 제거한다. 그 상층액을 n-프로판올 및 트리플루오로아세트산을 함유하는 수용액으로 평형화 시킨 μ-본다팍 C18 컬럼(세미분취용 8mm ×30㎝ : Waters 제품)에 흡착시킨 후 ; 이 컬럼을 30∼60%의 직선 농도구배의 n-프로판올을 함유하는 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액으로 순차용출한다. 고압 액체크로마토그래피용 장치는 히다찌 모델 685-50을 사용하고 검출은 히다찌 모델 638-41을 검출기로 사용하여 220nm 및 280nm 에서의 흡수를 동시에 측정한다. 용출후, 각 분획 10㎕를 분취하여 100배 희석한 다음, 상술한「CSA의 측정법(b)」로 활성을 나타내는 분획을 선별한다. 그 결과 4% n-프로판올에서 용출되는 피크가 CSA 활성을 갖는 것으로 밝혀졌기 때문에, 이 피크를 수집하여 다시 같은 조건으로 크로마토그래피하여 동일한 방법으로 CSA를 검사한 결과 또 다시 40% n-프로판올의 위치의 피크에 활성이 나타나서 이 피크를 수집하여 (4분획=4㎖)동결건조시켰다.
(iii)상기 동결건조 분말을 40% n-프로판올을 함유하는 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 200㎕에 용해시키고, 이 용액에 대하여 TSK-G 3000SW 컬럼(Toyo Soda 조달사 : 7.5mm ×6㎝)을 사용한 고압액체 크로마토그래피를 실시한다. 용출은 같은 수용액으로 0.4㎖/분의 유속에서 행하고, 분별수집기(FRAC-100형 :Pharmacia Fine Chemicals 제품)에 의하여 CSA 0.4㎖ 씩 취한다. 분취한 각 분획에 대하여 CSA를 상술한 것과 동일한 방법으로 검사한 결과 잔류 시간이 37∼38분인 분획(MW 약 20,000에 상당함)에서 활성이 나타나므로, 이 분획을 회수하여 다시 분석용 μ-본다팍C18 컬럼(4.6mm ×30㎝)으로 정제한 다음 메인피크를 회수하여 동결건조시켰다. 얻어진 시료에 대하여 앞에서 설명한「CSA의 측정방법(a)」로 검정한 결과 인체 G-CSF 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 3]
아미노산 서열의 결정
(i)N-말단 아미노산 서열의 결정
기상식 분석기(Applied Biosystem 제품)로 시료를 에드만(Edman) 분해하여 얻은 PTH아미노산을 고압 액체 크로마토그래피 장치(벡크만 제품) 및 울트라스피어-ODS 컬럼(벡크만 제품)을 사용하여 통상적인 방법으로 분석한다. 컬럼(5㎛ : 4.6mmΦ ; ×250mmL)을 개시완충용액(15mM 소디움 아세테이트 완충용액(pH4.5) 및 40% 아세토니트릴을 함유하는 수용액)으로 평형화시킨 다음 시료(20㎕의 개시 완충용액으로 용해)를 주입하여 개시완충용액에 의한 이소크라틱 용출을 이용하여 분리한다. 유속은 1.4㎖/분이고, 컬럼 온도는 40℃로 유지한다. PTH 아미노산의 검출은 269nm 및 320nm 의 UV 영역에서의 자외선 흡수를 이용한다. PTH 아미노산 표준시료(시그마 제품) 각 2n몰을 동일계로 분리하여 유지시간을 결정하고, 시료의 유지시간과 비교한다. 그 결과로, 시료는 N-말단으로부터 하기와 같은 40개의 아미노산 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다.
H2N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-
(10)
Leu-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-
(20)
Lue-Glu-Gln-Val-Arg-Lys-Ile-Gln-Gly-
(30)
Asp-Gly-Ala-Ala-Leu--Gln-Glu-Lys-Leu-
(40)
Cys-Ala-Thr-Tyr-Lys-
(ii)브로모시안분해
시료를 70% 포름산에 용해시킨다. 그 용액에 승화정제시킨 브로모시안 200당량을 가한다. 이 혼합물을 37℃에서 하룻밤 방치하여 반응시킨다. 다음에 반응물을 동결 건조시킨후, TSK G3000SW 컬럼(Toyo Soda 조달사 제품)을 사용한 HPLC로 분획화하여 4개의 피크를 얻는다. 이들 피크를 분자량이 큰 것 부터 CN-1, CN-2, CN-3 및 CN-4로 명명하여 수율이 좋은 CN-1, CN-2에 대하여 아미노산 서열을 자동기상식 분석기(Applied Biosystem 제품)로 (i)과 같은 조건으로 분석한다.
그 결과, CN-1은 G-CSF 단백질의 N-말단으로부터의 펩티드인 것으로 밝혀졌으며, CN-2는 하기 아미노산 서열을 갖는 것으로 나타났다 :
Pro-Ala-Phe-Ala-Ser-Ala-Phe-
Gln-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Val-
Leu-Val-Ala-Ser-His-Leu-Gln-
(iii) 트립신 분해
시료를 8M 요소를 함유하는 0.1M 트리스-HCl완충용액(pH 7.4)에 용해시키고, 0.1% 2-메르캅토 에탄올을 함유하는 0.1M 트리스-HCl완충용액(pH 7.4)과 혼합하여 요소의 최종 농도를 2M이 되게 조제한다. 시료대 효소비가 50 : 1이 되도록 TPCK 처리한 트립신(시그마 제품)을 가하여 25℃에서 4시간 반응시킨 후, 다시 동량의 TPCK로 처리한 트립신을 가하고, 25℃에서 16시간 더 반응시킨다. 그런 후에 반응물을 C8 컬럼(Yamamura Kagaku K. K. 제품)을 사용한 고속 역상 컬럼크로마토그래피에 가한다. 용출은 5∼60%의 직선밀도 구배의 n-프로판올을 함유하는 0.1% TFA로 수행한다. 280nm의 자외선 흡수를 측정하여 얻은 여러 피크중 메인피크에 대하여 자동기상식 분석기로 (i)고 같은 조건으로 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과, 메인 피크는 (ii)에서 나타낸 CN-2 단편의 일부를 포함하는 하기 서열을 갖는 펩티드임이 알려졌다.
Gln-Leu-Asp-Val-Ala-Asp-Phe-Ala-Thr
Thr-Ile-Trp-Gln-Gln-Met-Glu-Glu-Leu-
Gly-Met-Ala-Pro-Ala-Leu-Gln-Pro-Thr-
Gln-Gly-Ala-Met-Pro-Ala-Phe-Ala-Ser-
[실시예 4]
DNA 탐침의 제조
(i) 탐침(IWQ)의 합성
실시예 3(iii)에서 얻은 아미노산 서열중에서 Ile-Trp-Gln-Met-Glu-Glu-Leu-Gly-Met으로 나타내는 10개의 아미노산 서열에 의거하여 30개의 연속되는 뉴클레오티드를 얻는다(제1도). 제1도에 나타낸 뉴클레오티드의 기호에 대해 간단히 설명한다. 예를들면, 5'-말단으로부터 9-위치에 있는 뉴클레오티드는 dA 및 dG를 동몰량 함유하는 혼합물인 것을 나타낸다. 원료인 뉴클레오티드는 주로 2량체이나 필요에 따라 모노뉴클레오티드가 사용되기도 한다. 유리 여과기가 장치된 컬럼에 출발원료인 뉴클레오티드 수지 Ap-d(G)(Yamasa shoyu 제품) 20㎎을 채운다. 메틸렌 클로라이드로 반복 세척한 후에, 3% 트리클로로아세트산을 함유하는 메틸렌 클로라이드 용액으로 처리하여 4, 4'-디메톡시트리틸기를 제거한다. 계속하여 컬럼을 메틸렌 클로라이드 1㎖로 수회 세척한다. 컬럼을 무수피리딘으로 세척하여 용매를 치환하고, 뉴클레오티드 2량체(DMTr)ApTp(NHR3) (Nippon Zeon 제품 ; NHR3=트리에틸암모늄 ; DMTr=디메톡시트리틸) 20㎎ 및 피리딘 0.2㎖O를 가하고, 진공 펌프로 컬럼 내부를 진공건조시킨다. 이어서, 2,4,6-트리메틸벤젠술포닐-3-니트로트리아졸리드(MSNT, Wako Pure Chemical Industries 제품) 20㎎ 및 무수피리딘 0.2㎖를 가한후, 컬럼 내부를 질소기체로 교환해준다. 뉴클레오티드 수지를 실온에서 이따금씩 진탕하여 45분간 반응시켜 2량체와 축합시킨다. 반응 종료후, 컬럼을 피리딘으로 세척하고 미반응의 OH 기를 과량의 아세트산 무수물 및 4-디메틸 아미노피리딘을 함유하는 피리딘 용액으로 아세트화시킨다음, 다시 컬럼을 피리딘으로 세척한 후에, 다음의 이량체 또는 단량체를 기록된 순서대로, 상기 조작을 반복하여, 축합시킨다. : (DMTr)Ip(NHR3), (DMTr)GpGp(NHR3), (DMTr)Ip(NHR3), (DMTr)CpTp(NHR3) 및 (DMTr)TpTp(NHR3)의 동몰량 혼합물, (DMTr)ApAp(NHR3) 및 (DMTr)ApGp(NHR3)의 동몰량 혼합물, (DMTr)ApGp(NHR3) 및 (DMTr)GpGp(NHR3)의 동몰량 혼합물, (DMTr)GpAp(NHR3), (DMTr)TpGp(NHR3), (DMTr)ApAp(NHR3) 및 (DMTr)GpAp(NHR3)의 동몰량 혼합물, (DMTr)CpAp(NHR3), (DMTr)ApAp(NHR3) 및 (DMTr)ApGp(NHR3)의 동몰량 혼합물, (DMTr)CpAp(NHR3), (DMTr)ApAp(NHR3) 및 (DMTr)ApGp(NHR3)의 동몰량 혼합물, (DMTr)GpAp(NHR3), (DMTr)TpGp(NHR3), (DMTr)Ip(NHR3) 및 (DMTr)ApTp(NHR3). 이들중 (DMTr)Ip(NHR3)는 Yamasa Shoyu 제품이고, 나머지 다른 모든 것들은 Nippon Zeon 제품이다. 마지막 단계까지 반응이 끝나면, 아세트화시키지 않고 피리딘, 메틸렌 클로라이드 및 에테르의 순서로 연속적으로 수지를 세척하고 건조시킨다. 건조된 수지를 1M 테트라메틸구아니딘 및 1M α-피콜린알드옥심을 함유하는 디옥산 1㎖, 피리딘 0.5㎖ 및 물 0.2㎖의 혼합액 1.7㎖에 현탁시킨후에 상온에서 하룻밤 방치하고 감압하에서 100∼200㎕로 농축시킨다.
이 농축액에 적은 양(2∼3방울)의 피리딘 및 진한 암모니아수 2∼3㎖를 가하여 55℃로 6시간 가열한다. 이어서 에틸아세테이트로 추출분리하여 얻어진 수층을 감압농축 시킨후에 농축분을 50mM 트리에틸암모늄 아세테이트 용액(pH 7.0)에 용해시켜 C18 컬럼(1.0×15㎝ : Waters 제품)을 이용한 크로마토그래피에 가하였다. 용출은 50mM 트리에틸암모늄 아세테이트 용액(pH 7.0)중 10∼30%의 직선 농도 구배의 아세토니트릴로 시행하여 아세토니트릴농도 25% 부근의 위치에서 용출되는 피크 분획을 감압농축시킨다. 이 농축액에 80% 아세트산을 가하여 상온에서 30분간 방치한 후 에틸아세테이트를 가하여 추출 분리하여 얻어진 수층을 분리하여 감압하에 농축시킨다. 얻어진 농축액은 C18 컬럼(Senshu Kagaku K. K. 제품 : SSC-ODS-272 : 6Φ×200mmL)을 이용한 고압 액체 크로마토그래피에 가하여 다시 정제한다. 용출액은 50mM 트리에틸 암모늄 아세테이트 용액(pH 7.0)중 10∼20%의 직선 농도구배의 아세토니트릴을 사용하여 시행하여 10A260유니튼 이상의 수율로 합성 DNA를 얻는다.
얻어진 올리고뉴클레오티드에 대하여 막삼-길버트 서열분석법[Meth.Enzym., 65, 499(1980)]으로 염기 서열을 조사한 결과 제1도에 나탄낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 것이 확인되었다.
(ii) 탐침(A)의 합성
실시예 3(iii)에서 얻은 아미노산 서열중에서 Met-Pro-Ala-Phe-Ala으로 표시되는 5개의 아미노산 서열을 기준으로 하여 14개의 연속되는 뉴클레오티드를 얻었다(제1도).
합성은 탐침(IWQ)에서와 동일한 방법으로 다음의 뉴클레오티드를 뉴클레오티드 수지 Ap-d(T)(Yamasa Shoyu사 제품)와 기록된 순서로 축합시킨다. : (DMTr)CpAp(NHR3); (DMTr)GpGp(NHR3); (DMTr)CpTp(NHR3); DMTr)CpGp(NHR3) 및 (DMTr)CpGp(NHR3) 및 (DMTr)CpCp(NHR3)의 동몰량 혼합물; (DMTr)ApGp(NHR3), (DMTr)TpGp(NHR3), (DMTr)GpGp(NHR3) 및 (DMTr)CpGp(NHR3)의 동몰량 혼합물 (DMTr)ApAp(NHR3); (DMTr)CpAp(NHR3) 및 (DMTr)CpGp(NHR3); 및 (DMTr)Gp(NHR3)(이들은 모두 Nippon Zeon 제품이다) 합성 DNA 를 약 10A260유니트의 수율로 얻었다. 얻어진 올리고 뉴클레오티드의 염기서열을 막삼-길버트 서열분석법으로 조사한 결과 제1도에 나타낸 염기서열을 갖는 것으로 확인되었다.
(iii) 탐침(LC)의 합성
Applied Biosystems DNA 합성기 380A를 사용하여 DNA를 자동합성하였다. 이 방법은 카루테르 등이 기재한 원리[J. Am. Chem. Soc., 103, 3185(1981)]에 의한 것으로 일반적으로 포스포아미다이트법으로 알려져 있다.
5'-디메톡시트리틸기(DMTr)를 탈보호한 dG-S(S : 지지체)와 테트라졸로 미리 활성화시킨(DMTr)-dT의 포스포아미다이트체를 축합시킨다. 그런후에, 미반응 수산기를 아세트화하고 물 존재하에서 요오드로 산화시켜 인산기를 만든다. DMTr기를 탈보호하여 이하 동일하게 축합을 반복함으로써 제1도에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 24개의 뉴클레오티드를 합성하였다. 얻어진 뉴클레오티드를 지지체로부터 떼어 내어 탈보호시킨후 C18 컬럼(Senshu Kagaku사 제품 : SSC-ODS-272)을 이용한 역상 고압 액체 크로마토그래피를 실시하여 정제한다.
[실시예 5]
CHU-2 세포의 배양 및 mRNA의 정제
1) CHU-2 세포의 배양 및 회수
수립립 CHU-2 세포를 배양 플라스크(150㎠) 두개에 완전 밀접하게 증식시킨후, 수거하여 이것을 소 태아 혈청 10%를 함유하는 RPMI 1640 배양액 500㎖ 에 현탁시켜서, 1580㎠의 유리회전병(Belco 제품)에 옮긴 다음 0.5rpm의 속도로 4일간 회전배양한다. 세포가 회전배양병 내벽에 완전히 밀접하게 증식된 것이 확인되면 회전배양병에서 배양액을 제거하고, 미리 37℃로 가열한 EDTA를 0.02% 함유하는 생리식염 100㎖에 가하여 37℃에서 2분간 가온한 후, 피펫으로 플라스크의 내벽의 세포를 분리한다. 얻어진 세포 현탁액을 1500rpm으로 10분간 원심분리하여 세포 펠릿을 얻는다. 세포를 EDTA가 없는 생리식염수 5㎖에 다시 현탁시키고 1500rpm으로 10분간 원심분리하여 세포 펠릿(습윤중량, 약 0.8g)을 얻었다. 이와 같이하여 얻은 세포를 RNA 추출조작을 하기 전까지 -80℃에 냉동보존한다.
2)mRNA의 정제
1)에서 얻은 CHU-2 세포로부터 "Molecular Cloning"(Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 196p 1982)에 기재되어 있는 것과 같은 방법으로 mRNA를 분리한다. 동결보존된 CHU-2 세포(습윤중량 3.8g)를 20㎖의 6M 구아니딘 용액[6M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 5mM 소디움 시트레이트(pH 7.0), 0.1M β-메르캅토에탄올 및 0.5% 소디움 사르코실술페이트]에 현탁시키고, 와류 혼합기로 2∼3분간 잘 혼합한 후, 18G의 바늘을 낀 주사기(용량, 20㎖)로 10회 흡인 배출을 반복한다. 벡크만 SW40 Ti 로터에 맞는 폴리알로마 원심분리관에 6㎖의 5.7M CsCL-0.1M EDTA(pH 7.5)를 먼저 가해두고, 튜브가 가득차도록 상기 세포가 파괴되어 점성이 있는 구아니딘 용액 약 6㎖를 적층하였다. 이와 같이하여 조제된 4개의 원심분리관을 20℃에서 30,000rpm 으로 15시간 동안 원심분리한 후, 얻어진 펠릿을 소량의 70% 에탄올로 세번 세척한다.
각 관에서 얻은 펠릿들을 합하 550㎕의 물에 용해시켜 NaCl 농도가 0.2M로 되도록 조제한 후, 페놀-클로로포름(1: 1) 혼합물 및 클로로포름으로 처리하고, 2.5배 용량의 에탄올을 가하여 침전시켜 전체 RNA를 얻는다(습윤세포 3.8g에서 전체 RNA 약 10.1mg을 얻는다).
전체 RNA에서 폴리(A+)-RNA의 정제는 다음과 같이 시행한다. 이 방법은 mRNA가 3' 말단에 폴리(A) 체인을 부착하고 있는 것을 이용한 하기 친화도 크로마토그래피법이다. 올리고(dT)-셀룰로오즈(P-L 바이오케미칼사제 형 7)을 사용하여 흡착은 전체 RNA를 흡착 완충액[10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 0.5M NaCl, 1mM EDTA 및 0.1% SDS용액을 함유]에 용해시켜 65℃에서 5분 가열한 후, 동일한 용액으로 평형시킨 올리고 (dT)-셀룰로오즈 컬럼에 통과시켜 행하며, TE 용액[10mM 트리스-HCl(pH 7.5) 및 1mM EDTA를 함유]으로 폴리(A+)RNA를 용출시킨다. 흡착되지 않은 통과액은 위의 방법으로 다시 동 컬럼을 사용하여 동일하게 용출조작을 실시하여 첫번째 용출액과 혼합한다. 그 결과로 400㎍의 폴리(A+)RNA를 얻는다.
이와 같이 하여 얻은 mRNA를 Schleif 및 Wensink의 실험 기술서 [Practical Methods in Molecular Biology, Spring-Verlag, New York, Heideberg, Berlin(1981)]에 기재되어 있는 동일한 방법과 동일한 방법으로 수크로오즈 밀도구배 원심분리하여 크리별로 분획한다.
좀 더 자세히 설명하면, 벡크만 SW40 Ti 원심분리관에 5∼25%의 수크로오즈 밀도구배를 만든다. 두 수크로오즈 용액은 0.1M NaCl, 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA 및 0.5% SDS를 함유하는 용액에 각각 5% 및 25%의 비율로 RNase가 없는 수크로오즈 (Schwarz/Mann 제품)를 함유하고 있다.
상기에서 설명한 방법으로 제조한 800㎍의 mRNA[폴리(A+)-RNA]를 TE 용액 200∼500㎕에 용해시키고, 용액을 65℃에서 5분간 가열하고 급냉시킨 후에 수크로오즈 밀도구배역 위에 놓고 30,000rpm으로 20시간 동안 원심분리한다. 0.5㎖씩 분획을 수집하여 260nm에서의 그의 흡광도를 측정한다. 동일하게 시행한 표준 RNA (28S, 18S, 5S의 리보솜 RNA)의 위치를 기준으로 하여 분획된 RNA의 크기를 결정하는 동시에, 각 분획의 G-CSF 활성을 다음 방법으로 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)의 난모세포계를 이용하여 조사한다. 우선 각 분획의 mRNA를 1㎍/㎕의 농도를 갖는 수용액이 되도록 조절한다 : 제조푸스(약 1년생)로부터 채취한 난모세포에 1개당 50ng mRNA의 비율로 mRNA 용액을 주입한후 96개의 구멍의 미세 분석판의 1개 구멍에 난모세포를 10개씩 집어넣고, 각각 10㎕의 바르스(Brath) 배지[88mM NaCl, 1mM KCl, 2.4mM NaHCO3, 0.82mM MgSO4, 0.33mM Ca(NO3)2, 0.41mM CaCl2, 7.5mM 트리스-HCl(pH 7.6), 페니실린 10mg/L, 및 스트렙토마이신 술페이트 10mg/L]중에서 상온으로 48시간 배양한다 : 배양상층액을 회수하여 농축·정제하여 G-CSF 활성을 측정한다.
이 결과, 15∼17S 분획에서 G-CSF 활성이 나타났다.
[실시예 6]
cDNA의 합성(pBR 계 cDNA 라이브러리의 구축)
란드[Land et al., Nucleic Acids Res., 9, 2251(1981)]의 방법을 구블레르 및 호프만 [Gubler 및 Hoffman, Gene, 25, 263(1983)]이 개량한 방법에 따라 실시예 5에서 얻은 폴리(A+)RNA로부터 cDNA를 합성한다.
1) 단일-가닥 cDNA의 합성
에펜도르프관(용량 1.5㎖)에 다음 순서로 시약을 가한다 : 80μl 반응 완충액(500mM KCl, 50mM MgCl2, 250mM 트리스-HCl, pH 8.3), 20μl의 200mM 디티오트레이톨, 32μl의 12.5mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 각 12.5mM 함유), 10μl의 α-32P-dCTP(애머샴 제품 PB 10205), 32μl의 올리고(dT)12-18(P-L Biochemicals ; 500μg/ml), 20μl의 폴리(A+)RNA(2.1μg/μl), 증류수 206μl의 합계 400μl의 반응액을 65℃에서 5분간 가열한 후 42℃에서 5분간 가열한다. 이 반응액에 역전사효소(Takara Shuzo 제품) 120단위를 가하고, 다시 42℃에서 2시간이상 반응시킨 후, RNase 억제제(BRL 제품) 2μl, TE용액 20μl, 100mM 소디움 피로포스페이트 16μl 및 역전사효소 48단위(4μl)를 가하고 46℃에서 2시간 반응시킨다. 0.5M EDTA(8μl) 및 10% SDS(8μl)를 가하여 반응을 중지시킨 후, 페놀/클로로프롬으로 처리하고 에탄올로 2회 침전시켜 단일-가닥 cDNA를 얻는다.
2) 단일-가닥 cDNA에 dC-체인 부착
1)에서 얻은 단일-가닥 cDNA를 증류수에 용해시킨후, 여기에 60㎕의 dC-체인부착 완충액[400mM 포타슘 카코딜레이트, 50mM 트리스-HCl(pH 6.9), 4mM 디티오트레이톨, 1Mm CoCl2, 1mM dCTP]을 가하여 혼합물을 37℃에서 5분간 가열한다. 이 반응액에 말단 전이 효소(terminal transferase)(27유니트/㎕ ; P-L Biochemicals 제품) 3㎕를 가하여 37℃에서 2.5분간 반응시킨후, 페놀/클로로포름으로 1회 처리하고 에탄올(2회)로 침전시켜, 이 dC가 말단에 연결된 cDNA를 100mM NaCl을 함유하는 TE 용액 40㎕에 용해시킨다.
3) 이중-가닥 cDNA의 합성
2)에서 제조한 DNA 용액 40μl에 4μl의 올리고(dG)12-18(200μg/ml ; P-L Biochemicals 제품)을 가하고, 혼합물을 65℃에서 5분, 계속해서 42℃에서 30분 가열한 후, 반응액을 0℃로 유지시키고 이 반응액을 완충액 80μl[100mM-트리스-HCl(pH 7.5), 20mM MgCl2, 50mM(NH4)2SO4, 및 500mM KCl], 4μl의 4mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 각각 4mM씩 함유), 60μl의 1mM β-NAD, 210μl의 증류수, 20μl의 이. 콜리(E. coli) DNA 폴리머라제 I(Takara Shuzo 제품), 15μl의 이. 콜리(E. coli) DNA 리가제(Takara Shuzo 제품) 및 15μl의 이. 콜리(E. coli)RNase H(Takara Shuzo 제품)를 가하여 혼합물을 12℃에서 한시간 반응시킨다. 다시 4μl의 4mM dNTP를 추가하여 25℃에서 1시간 반응시킨다. 연속적으로 페놀-클로로포름으로 처리하고 에탄올(1회)로 침전시켜 약 8μg의 이중-가닥 cDNA를 얻는다. 이중-가닥 cDNA를 TE 용액에 용해시키고, 1.2% 아가로즈 겔 전기연동을 실시한다. 약 560bp 내지 2kbp의 크기에 해당하는 단편들을 왓트만 DE 81에 흡착시키고, 용출공정을 실시함으로써 약 2.0㎍의 이중-가닥 cDNA를 회수할 수 있다.
4)이중-가닥 cDNA에 dC-체인 부착
3)에서 얻어진 이중-가닥 cDNA를 40㎕의 TE 용액에 용해시키고, 2)에서 설명한 dC-체인 부착 완충액 8㎕를 가하여 37℃에서 2분간 가열한다. 1㎕의 말단전이 효소(27유니트/㎕)를 가하여 37℃에서 3분간 반응시킨 후, 반응액을 곧바로 0℃로 냉각시키고, 0.5M EDTA 1㎕를 가하여 반응을 중지시킨 후, 페놀-클로로포름으로 처리하고 이어서 에탄올로 침전시켜 얻은 침전물을 TE 용액 10㎕에 현탁시킨다.
5) pBR 계 cDNA 라이브러리의 구축
시판되고 있는 올리고(dG) 체인 부착 pBR 322벡터(BRL 제품 10ng/㎕) 4㎕ 및 4)에서 얻은 dC-체인 부착 이중-가닥 cDNA 2㎕를 75㎕의 0.1M NaCl을 함유하는 TE 용액중에서 어닐링시킨다. 어닐링은 65℃에서 5분간 가열, 40℃에서 2시간 가열, 그후 상온으로 냉각되기까지 방치하는 세단계로 이루어진다.
Maniatis등의 실험서[Molecular Cloning, CSH, 249p(1982)]에 기재되어 있는 방법등을 이용하여(다른 통상적인 방법도 사용할 수 있다)이. 콜리(E. coli) 균주χ1776으로부터 형질전환 가능세포를 조제하고, 상기 어닐링시킨 플라스미드로 형질전환시켜 형질전환체를 얻는다.
[실시예 7]
cDNA의 합성(λ 파지계 라이브러리 제조)
1) 단일-가닥 cDNA의 합성
실시예 5의 방법에 따라 3.8g의 냉동 보존된 CHU-2 세포를 올리고(dT)-셀룰로오즈 컬럼에 2회 통과하여 정제시켜 400㎍의 폴리(A+)-RNA를 얻는다.
이 폴리(A+)-RNA 12μg을 용해시킨 TE 용액 10μl를 10μg의 액티노마이신 D(시그마 제품)를 함유하는 반응관에 넣은후, 다음의 순서로 시약류를 가한다. 20μl의 역전사 완충액[250mM 트리스-HCl(pH 8.3) ; 40mM MgCl2; 250mM KCl], 20μl의 5mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 각각 5mM 함유), 20μl의 올리고(dT)12-18(0.2μg/ml ; P-L Biochemicals 제품), 1μl의 1M 디티오트레이톨, 2μl의 RNase(30유니트/μl; Promega Biotech 제품), 10μl의 역전사효소(10유니트/μl; Seikagaku kogyo 제품), 1μl의 α-32P-dATP(10μCi ; Amerscham 제품) 및 16μl의 증류슈로 합계 100μl의 반응액으로 된다. 이 반응액을 42℃에서 2시간 유지한 후, 0.5M EDTA(5μl) 및 20% SDS(1μl)를 가하여 반응을 중지시킨다. 페놀/클로로포름(100㎕)으로 처리하고 에탄올로(2회) 침전시켜, 약 4㎍의 단일-가닥 cDNA를 얻는다.
2) 이중-가닥 cDNA의 합성
1)에서 얻은 cDNA를 29㎕의 TE 용액에 용해시키고 다음 순서로 시약류를 가하여 반응액을 제조한다 : 25μl의 폴리머라제 완충액[400mM 헤페스(pH 7.6); 16mM MgCl2; 63mM β-메르캅토에탄올 ; 및 270mM KCl]; 10μl의 5mM dNTP ; 1.0μl의 15mM β-NAD ; 1.0μl의 α-32P-dATP(10μCi/μl); 0.2μl의 이. 콜리(E. coli) DNA 리가제(60유니트/μl, Takara Shuzo 제품), 5.0μl의 이. 콜리(E. coli)DNA 폴리머라제 I(New England Biolabs 제품 ; 10유니트/μl); 0.1μl의 RNaseH(60유니트/μl; Takara Shuzo 제품) 및 28.7μl의 증류수.
반응액을 14℃에서 1시간 배양한 후, 상온으로 환원시키고 한시간 더 반응시킨다. 그런후에 O.5M EDTA(5㎕) 및 20% SDS(1㎕)를 가하여 반응을 중지시키고, 페놀/클로로포름으로 처리하고 에탄올로 침전시킨다. 얻어진 DNA를 0.5mM EDTA 20㎕에 용해시키고 3㎕의 클레노우 완충액[500mM 트리스-HCl(pH 8.0), 및 50mM MgCl2], 3㎕의 5mM dNTP, 4㎕의 증류수를 가하여 반응액을 조제한 후, 1㎕ 의 DNA 폴리머라제(클레노우 단편 ; Takara Shuzo 제품)을 가하고 30℃에서 15분간 배양한다.
배양 반응액에 70㎕의 TE 용액을 가하여 희석하고 0.5M EDTA(5㎕) 및 20% SDS(1㎕)를 가하여 반응을 중지시킨다. 반응액을 페놀/클로로포름으로 처리하고 에탄올로 침전시켜 약 8㎍ 이중-가닥 cDNA를 얻는다.
3) 이중-가닥 cDNA의 메틸화
2)에서 합성한 이중-가닥 cDNA의 수용액(30㎕)에 40㎕의 메틸화 완충액[500mM 트리스-HCl(pH 8.0), 50mM EDTA], 20㎕의 SAM 용액[800μM S-아데노실-L-메틸메티오닌(SMA) ; 50mM β-메르갑토 에탄올] 및 100㎕의 물을 가한다. 이 혼합액에 EcoRI 메틸라제(New England Biolabs 제품 ; 20유니트 /㎕)15㎕를 가하여 전체 반응액을 200㎕로 만든다. 37℃에서 2시간 반응시키고, 페놀 및 에테르로 처리한 후 에탄올로 침전시켜 DNA를 회수한다.
4) EcoRI 링커의 부착
상기 메틸화된 이중-가닥 DNA 약 1.2㎍에 1.5㎕의 리가제 완충액[250mM 트리스-HCl(pH 7.5), 및 100mM MgCl2], 0.5㎕의 미리 인산화시킨 EcoRI 링커(10량체 ; Takara Shuzo 제품), 1.5㎕의 10mM ATP, 1.5㎕의 100mM 디티오트레이톨 및 2㎕의 H2O를 가하여 반응액을 총 15㎕로 만든다. T4DNA 리가제(3.4유니트/㎕ ; Takara Shuzo 제품) 0.7㎕ 가하여 4℃에서 하룻밤 반응시킨다. 그런후에 65℃에서 10분간 가열하여 리가제를 비활성화시킨다. 이 반응액에 100mM 트리스-HCl(pH 7.5), 5mM MgCl2, 50mM NaCl 및 100㎍/㎖의 젤라틴을 가하여 총 50㎕로 되도록 조제한 후, EcoRI(3.5㎕ ; 10유니트/㎕)을 가하여 37℃에서 2시간 반응시킨다. 다음에 0.5M EDTA 2.5㎕ 및 20% SDS 0.5㎕를 가한후, 페놀/클로로포름으로 처리하고, 에탄올로 침전시켜 DNA를 회수한다. 이어서 올트로겔 AcA34(LKB 제품)의 겔여과법 또는 아가로스 겔 전기영동법을 실시하여 미반응 EcoRI 링커를 제거하고, 링커가 부착된 이중-가닥 cDNA 약 0.5∼0.7㎍을 회수한다.
5) 이중-가닥 cDNA와 λgt10벡터의 결합
상기 링커부착 이중-가닥 cDNA를 2.4㎕의 미리 EcoRI으로 처리한 λgt10벡터(Vector Cloning System 제품), 리가제 완충액(250mM 트리스-HCl 및 100mM MgCl2) 1.4㎕ 및 증류수 6.5㎕와 혼합하고 42℃에서 15분 가열한 후 10mM APT 1㎕, 0.1M 디티오트레이톨 1㎕, 및 T4DNA 리가제 0.5㎕를 가하여 총량을 15㎕로 만들고 12℃에서 하룻밤 반응시킨다.
6)시험관내 팩키징(in vitro packing)
상기 5)에서 얻어진 재조합 DNA의 약 3분의 1을 인 비트로 팩키징 키트(Promegar Biotech 제품)를 이용하여 팩키징하여 파지 플라크를 얻는다.
[실시예 8]
탐침(IWQ)를 이용한 pBR계 라이브러리의 선별
콜로니가 성장한 한천배지 위에 왓트만 541 여과지를 놓고 37℃에서 2시간 방치한 후 이하에 기재하는 Taub 및 Thompson의 방법[Anal. Biochem., 126, 222(1982)]에 따라 여과지를 처리한다.
즉, 541 여과지에 콜러니를 옮긴후 클로람페니콜(250㎍/㎕)을 함유하는 한천배지에 옮기고 다시 37℃에서 하룻밤 배양한다.
541 여과지를 들어낸후 0.5N NaOH 용액에 담궈 놓았던 다른 여과지 위에 3분간 방치하고 이것을 2회 반복한다. 이하, 동일한 조작을 0.5M 트리스-HCl(pH 8) 용액을 이용하여 3분간 2회 실시하고, 다시 4℃에서 0.05M 트리스-HCl(pH 8) 용액으로 3분간, 1.5㎎/㎖의 리소자임용액[0.05M 트리스-HCl(pH 8) 및 25% 수크로오즈를함유]으로 10분간 같은 과정으로 수행하고 ; 37℃에서 1×SSC 용액(0.15M NaCl 및 0.015M 소디움시트레이트)으로 2분간, 200㎍/㎖ 프로테이나제 K를 함유하는 1×SSC 용액으로 30분, 마지막으로 상온에서 1×SSC 용액으로 2분간, 95% 에탄올로 2분간 2회 처리한후, 541 여과지를 건조시킨다. 얻어진 건조 541 여과지를 페놀/클로로포름/이소아밀알콜의 25 : 24 : 1 혼합물[100mM 트리스-HCl(pH 8.5), 100mM NaCl 및 10mM EDTA로 평형화시킨 것]의 용액에 상온에서 30분간 담구어둔다. 이하, 동일한 조작을 5×SSC 용액으로 3분간 3회 반복하고 95% 에탄올 용액으로 3분간 2회 반복한 후 여과지를 건조시킨다.
탐침(IWQ)를 통상적인 방법(Molecular Cloning 참조)에 따라32P로 방사표시하여 왈라스 등의 방법[Wallace et al. Nucleic Acids Res., 9권 879(1981)]에 따라 콜로니 혼성화를 수행한다. 혼성화 완충액[6×NET(0.9M NaCl ; 0.09M 트리스-HCl(pH 7.5) ; 및 6mM EDTA), 5×덴하르트 용액(Denhardt's soultion), 0.1% SDS 및 0.1㎎/㎖ 의 변성 DNA(송아지 흉선 DNA)]중에서 65℃로 4시간 동안 사전 혼성화를 수행한 후, 방사표시된 탐침(IWQ)를 1×106cpm/㎖ 함유하는 혼성화 완충액(조성은 하기와 같음)을 이용하여 56℃로 하룻밤 동안 혼성화시킨다. 반응이 끝난후에 541 여과지를 6×SSC 용액(0.1% SDS 함유)으로 상온에서 30분간 2회, 이어서 56℃에서 1.5분간 세척한 후 이 541 여과지를 방사능 자동 사진으로 검출한다.
양성 클론으로부터 플라스미드를 분리하고 탐침(IWQ)를 이용하여 서던 블롯팅을 수행한다. 혼성화 및 방사능 자동 사진법은 상기와 같은 조건으로 수행한다.
동일하게 탐침(A)를 이용하여 서던 블롯팅을 수행한다. 상술한 조성을 갖는 혼성화 완충액으로 먼저 49℃에서 1시간 혼성화를 실시하고, 39℃가 될때까지 방치한후, 다시 39℃에서 1시간동안 혼성화를 실시한다. 반응 종료후, 니트로 셀룰로오즈 여과지를 0.1% SDS를 함유하는 6×SSC 로 상온에서 30분간 2회, 39℃에서 3분간 세척한 후 방사능 자동사진법을 수행한다.
이 결과, 하나의 클론이 양성으로 얻어지며, 디데옥시법에 의해 뉴클레오티드 서열분석을 실시한 결과, 이 클론이 탐침(IWQ) 및 탐침(A)부분을 함유하는 308 염기쌍으로 구성된 DNA를 갖는 클론임이 판명되었다. 이 삽입체를 함유하는 pBR 322 유래의 플라스미드를 pHCS-1로 명명하였다.
[실시예 9]
pHCS-1 유래의 DNA 탐침을 이용한 λ 파지계 라이브러리의 선별
Benton 및 Davis법[Science, 196권, 180p(1977)]에 따라 플라크 혼성화를 수행한다. 실시에 8에서 얻은 pHCS-1을 Sau3A 및 EcoRI으로 처리하여 약 600bp의 DNA 단편을 얻고, 이 DNA 단편을 통상의 방법에 따라 닉크 트랜스레이션으로 방사표시한다. 파지 플라크가 생긴 한천 배지위에 니트로셀룰로오즈 여과지 (S ＆ S 제품)를 놓아 파지를 여과지상에 옮긴다. 파지 DNA를 0.5M NaOH로 변성시키고, 여과지를 다음 순서로 처리한다. 0.1M NaOH 및 1.5M NaCl로 20초, 계속하여 0.5M 트리스-HCl(pH 7.5) 및 1.5M NaCl로 20초간 2회, 마지막으로 120mM NaCl, 15mM 소디움 시트레이트, 13mM KH2PO4및 1mM EDTA(pH 7.2)로 20초간 처리한다.
이어서 여과지를 건조시키고 80℃에서 2시간 가열하여 DNA를 고정화시킨다. 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 50mM 인산염완충액, 50% 포름아미드, 0.25㎎/㎖의 변성 DNA(연어의 정자 DNA) 및 0.1% SDS를 함유하는 사전 혼성화 완충액에서 42℃로 하룻밤 동안 사전 혼성화를 실시하고, 닉크 트랜스레이션에 의하여 방사표시된 pHCS-1탐침 4×105cpm/㎖를 함유하는 혼성화 완충액[5×SSC, 5×덴하르트 용액, 20mM 인산염 완충액(pH 6.0), 50% 포름아미드, 0.1% SDS, 10% 덱스트란 술페이트 및 0.1㎎/㎖의 변성 DNA(연어의 정자 DNA)의 혼합액]중에서 42℃로 20시간 혼성화를 실시한다.
혼성화된 니트로셀룰로오즈 여과지를 상온에서 0.1% SDS를 함유하는 2×SSC로 20분간, 44℃에서 0.1% SDS를 함유하는 0.1×SSC로 30분간, 마지막으로 상온에서 0.1×SSC로 10분간 세척한 후 방사능 자동사진법으로 검출한다.
그 결과, 다섯개의 양성 클론(G1∼G5)을 얻었다. 여기서 얻어진 클론중 완전길이의 cDNA를 함유하는 클론의 DNA 뉴클레오티드 서열을 디데옥시법으로 조사하여 제3(a)도에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드서열을 확인하였다. 이 cDNA를 λgt10 벡터에서부터 잘라내어 pBR327[Soberon et al., Gene, 9권 287p(1980)]의 EcoRI 부위에 연결시켜 플라스미드로 대량으로 조제한다. 이 플라스미드를 pBRG4로 칭한다.
[실시예 10]
pBRG4-유래의 DNA 탐침 및 탐침(LC)를 이용한 λ 파지계 라이브러리의 선별
실시예 9에서 이용한 Benton 및 Davis 법(Science, ibid)에 따라 플라크 혼성화를 실시한다. 파지 플라크가 생긴 한천 배지위에 니트로셀룰로오즈 여과지(S ＆ S 제품)을 놓아 파지를 여과지상으로 옮긴다. 0.5M NaOH 로 파지 DNA를 변성시킨 후에 여과지를 다음 순서로 처리한다 : 0.1M NaOH 및 1.5M NaCl로 20초간 처리하고, 계속하여 0.5M 트리스-HCl(pH 7.5) 및 1.5M NaCl로 20초간 2회 처리하고 ; 마지막으로 120mM NaCl, 15mM 소디움 시트레이트, 13mM KH2PO4및 1mM EDTApH 7.2)로 20초간 처리한다. 계속하여 여과지를 건조시키고 80℃에서 2시간 가열하여 DNA 고정화시킨다. 이와 같이 하여 동일한 여과지를 2장 준비하여 pBRG4-유래의 DNA 탐침 및 탐침(LC)를 사용하여 선별작업을 각각 시도한다.
pBRG4 유래의 DNA 탐침을 사용하는 경우, 다음 방법으로 선별한다. pBRG4를 EcoRI으로 처리하여 약 1500bp의 DNA 단편을 얻고, 이 DNA 단편을 통상법에 따라 닉크 트랜스레이션으로 방사표시한다. 2장의 니트로셀룰로오즈 여과지중의 하나를 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 50mM 인산염 완충액, 50% 포름아미드, 0.25㎎/㎖의 변성 DNA(연어의 정자 DNA) 및 0.1% SDS를 함유하는 사전혼성화 완충액 중에서 42℃로 하룻밤 동안 사전 혼성화를 실시하고, 상기 방사표시된 약 1500bp의 DNA 탐침(약 1×106cpm/㎖)을 함유하는 혼성화 완충액[5×SSC, 5×덴하르트 용액, 20mM 인산염 완충액(pH 6.0), 50% 포름아미드, 0.1% SDS, 10% 덱스트란 술페이트 및 0.1㎎/㎖의 변성 DNA(연어의 정자 DNA)의 혼합액]중에서 42℃로 20시간 동안 혼성화를 실시한다. 혼성화된 니트로셀룰로오즈 여과지를 상온에서 0.1% SDS를 함유하는 2×SSC로 20분간, 44℃에서 0.1% SDS를 함유하는 0.1×SSC로 30분간, 마지막으로 상온에서 0.1×SSC로 10분간 세척한 후 방사능 자동사진법으로 검출한다.
탐침(LC)를 사용하는 경우는 다음 방법에 따라 선별을 수행한다. 다른 여과지를 미리 0.1% SDS를 함유하는 3×SSC에서 65℃로 2시간 처리한 후, 6×NET, 1×덴하르트 용액 및 100㎍/㎖의 변성 DNA(연어의 정자 DNA)를 함유하는 용액중에서 65℃로 2시간 동안 사전혼성화를 실시한다. 이어서, 방사 표시된 탐침(LC)(2×106cpm/㎖)를 함유하는 혼성화 완충액[6×NET, 1×덴하르트 용액 및 100㎍/㎖의 변성 DNA(연어의 정자 DNA)]중에서 63℃로 하룻밤 동안 혼성화를 실시한 후, 혼성화된 니트로셀룰로오즈 여과지를 상온에서 0.1% SDS를 함유하는 6×SSC로 3회(20분씩), 63℃에서 0.1% SDS를 함유하는 6×SSC로 2분간 세척한다.
상기 여과지를 건조시킨 후 방사능 자동사진법으로 검출한다.
상술한 바와 같이한 선별작업에서 2개의 탐침 모두에 대하여 양성인 클론을 선별하고 그중 완전 길이의 cDNA를 함유하는 클론의 염기 서열을 디데옥시법으로 조사한 결과 제4(a)도에 나타낸 염기서열을 갖는 것으로 밝혀졌다. 여기서, 이 cDNA를 λgt10 벡터에서 잘라내어 pBR327의 EcoRI 부위에 연결시켜 플라스미드 pBRV2를 얻었다.
[실시예 11]
인체 염색체 유전자 라이브러리의 선별
1) 인체 염색체 유전자 라이브러리의 구축
하바드대학의 마니아티스 박사(Dr. Maniatis)에 의해 제공된 인체 염색체 유전자 라이브러리는 다음 방법으로 만들어진 것이다 : 사람의 태아 간으로부터 페놀 또는 다른 적절한 화학물질을 사용하여 전체 염색체 DNA를 추출하여 제한효소 HaeⅢ 및 Alu I으로 부분 절단한다 ; 생성된 DNA 단편을 수크로오즈 밀도구배 원심분리하여 약 18∼25kb의 체인 길이를 갖는 단편을 집결시키고 ; 이 농축된 단편을 이. 콜리(E. coli)파지 λ 샤론 4A의 DNA 한쪽에 제한효소 EcoRI의 절단부위를 갖는 짧은 연쇄의 합성 뉴클레오티드를 사용하여 연결하여 감염성 파지 DNA 재조합체를 제조한다 ; 감염성을 높이기 위한 목적으로 패키징에 의해 보다 정제된 파지λ 입자를 만든다. 이렇게 만든 인체 유전자 라이브러리는 실제적으로 모든 인체 유전자를 함유하는, 약 18∼25kb의 체인 길이를 갖는 인체 DNAs를 함유하는 재조합체군으로 이론적으로 간주된다.
2) pHCS-1 유래의 DNA 탐침을 이용한 인체 염색체 유전자 라이브러리의 선별
벤톤 및 데이비스이 방법[Science, 196, 180(1977)에 따라 플라크 혼성화를 수행한다. 실시예 8에서 얻은 pHCS-1을 Sau3A 및 EcoRI으로 처리하여 약 600bp의 DNA 단편을 얻는다. 이 DNA 단편을 통상적인 방법에 따라 닉크 트랜스레이션으로 방사표시한다. 니트로셀룰로오즈 여과지(S ＆ S 제품)를 파지 플라크가 생긴 한천 배지상에 놓고 파지를 여과지로 옮긴다. 0.5M NaOH 로 파지 DNA를 변성시킨 후, 여과지를 다음 방법으로 처리한다 : 0.1M NaOH 및 1.5M NaCl로 20초간 처리 ; 0.5M트리스-HCl(pH 7.5) 및 1.5M NaCl로 20초간 2회 처리 ; 마지막으로 120mM NaCl, 15mM 소디움 시트레이트, 13mM KH2PO4및 1mM EDTA(pH 7.2)로 2초간 처리한다.
계속하여 여과지를 건조시키고 80℃에서 2시간 가열하여 DNA 고정화시킨다. 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 50mM 인산염 완충액, 50% 포름아미드, 0.25㎎/㎖의 변성 DNA(연어의 정자 DNA) 및 0.1% SDS를 함유하는 사전 혼성화 완충액 중에서 42℃로 하룻밤 동안 사전 혼성화를 실시한다. 그런후에 닉크 트랜스레이션에 의해 방사표시된 4×105cpm/㎖의 pHCS-1 탐침을 함유하는 혼성화 완충액 중에서 42℃로 20시간 동안 혼성화를 수행한다. 상기 혼성화 완충액은 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 20mM 인산완충액(pH 6.0), 50% 포름아미드, 0.1% SDS, 10% 덱스트란 술페이트 및 0.1㎎/㎖의 변성 DNA(연어의 정자 DNA)의 혼합액이다.
혼성화된 니트로셀룰로오즈 여과지를 상온에서 0.1% SDS를 함유하는 2×SSC로 20분, 44℃에서 0.1% SDS를 함유하는 0.1×SSC로 30분, 마지막으로 상온에서 0.1×SSC로 10분간 세척한 다음 방사능 자동 사진법으로 검출한다.
그 결과로, 10여개의 양성 클론이 수득된다. 이들 클론으로부터 마니아티스의 방법[Maniatis, Cell, 15, 687(1978)]에 따라 재조합 DNA을 제조하여, EcoRI, BamHI 및 BglII와 같은 제한효소로 처리하고, 아가로스 겔 전기영동법으로 분석한 후, 프리치의 방법(Fritsch, Cell, ibid)에 따라 제한효소 지도를 작성한다.
앞서 서술한 선별과정에서 사용한 것과 동일한 방사 표시된 pHCS-1 유래 DNA 탐침으로 이용하여 서던 혼성화를 수행한다. EcoRI으로 절단한 약 8kbp의 DNA 단편을 탐침과 혼성화된 클론으로부터 선별한다. 이 단편을 pBR327의 EcoRI부위에 서브클로닝시킨다. 이 서브클로닝된 DNA를 또다시 제한효소로 처리하고, 이어서 서던 혼성화를 반복하여 실시한다. EcoRI 및 Xho I 으로 절단된 약 4kbp의 DNA 단편이 인체 G-CSF 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 상기 DNA 단편에 대하여 디데옥시법으로 약 3kbp 부분에 해당하는 서열을 검사한 결과, 제5도에 나타낸 뉴클레오티드 서열임이 확인되었다. 이 DNA 단편은 제7도에 나타낸 제한 효소 절단부위를 갖는다.
또한, pBRG4 유래의 DNA 및 pBRV2 유래의 DNA를 탐침으로 사용하여 인체염색체 유전자를 선별한다. 두가지 경우에서 모두, EcoRI으로 처리한 1500bp의 DNA단편을 앞서 서술한 방법에 따라 닉크 트랜스레이션을 이용하여 직접 방사표시하거나, 또는 다른 방법으로 EcoRI 및 Dra I으로 연속처리하여 얻은 약 700bp의 DNA단편을 닉크 트랜스레이션으로 방사표시한다. 이렇게 얻은 탐침을 사용하여 앞서 서술한 것과 동일한 조건들하에서 플라크 혼성화를 실시한다. 선별된 클론을 서던 혼성화로 분석하여 제5도에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편을 얻었다. 이렇게 얻은 플라스미드를 pBRCE3β로 명명한다.
[실시예 12]
이. 콜리(E. coli) 재조합 벡터(+VSE)의 구축 및 형질전환(tac프로모터 함유 벡터를 사용)
1) 재조합 벡터의 구축
(i) 벡터의 제조
tac프로모터 함유 벡터 pKK223-3(Pharmacia 제품) 5㎍을 30㎕의 반응액(40mM 트리스-HCl, 7mM MgCl2, 100mM NaCl 및 7mM 2-메르캅토 에탄올)중에서 EcoRI(Takara Shuzo 제품) 8단위로 37℃에서 2시간 처리한다. 계속하여 알칼리포스파타제(Takara Shuzo 제품) 3㎕를 가하여 60℃ 에서 30분 처리하고 통상적인 방법에 따라 페놀로 3회, 에테르로 1회 처리한 후, 에탄올로 침전시켜 DNA단편을 회수한다.
회수된 DNA단편을 50mM 트리스-HCl, 5mM MgCl2, 10mM DTT 및 각각 1mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP로 구성된 50㎕의 혼합액에 용해시키고, 이. 콜리(E. coli) DNA폴리머라제 I-클레노우단편(Takara Shuzo 제품) 3㎕를 가한후, 14℃에서 2시간 반응시켜 말단을 블런트 엔드로 만든다.
(ii) 합성 링커의 제조
합성 링커, CGAATGACCCCCCTGGGCC 및 CAGGGGGGTCATTCG의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 3㎍을 40㎕의 반응액 (50mM 트리스-HCl, 10mM MgCl2, 10mM 2-메르캅토에탄올 및 1mM ATP)중에서 4단위의 T4폴리뉴클레오티드 키나제 존재하에 37℃에서 60분간 반응시켜 인산화 처리한다.
다음 인산화된 올리고 뉴클레오티드(0.2㎍)를 각각 100mM NaCl 을 함유하는 TE용액(10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA) 20㎕에 용해시키고 65℃에서 10분간 처리한 후 상온까지 서서히 냉각시킴으로써 올리고뉴클레오티드를 어닐링시킨다.
(iii) G-CSF cDNA단편의 제조
실시예 9에서 얻은 제3(a)도에 나타낸 cDNA를 함유하는 pBRG4 60㎍을 제한효소 Apa I(New England Biolabs 제품) 100단위 및 Dra I(Takara Shuzo 제품) 50단위로 6mM 트리스-HCl, 6.6mM MgCl2, 및 6mM 2-메르캅토에탄올로 구성된 반응액 200㎕중에서 37℃에서 3시간 처리하고, 이어서 1.2%아가로스 겔 전기영동을 실시하여 약 590bp의 Apa I- Dra I 단편 약 2㎍을 회수한다.
(iv) 단편들의 결창
(i), (ii) 및 (iii)의 각각에서 제조한 단편 각각 약 0.1㎍을 취하여 20㎍ 의 결찰반응액(66mM 트리스-HCl, 6.6mM MgCl2, 10mM DTT 및 1mM ATP)에 용해시키고 T4DNA리가제 175단위를 가하여 4℃에서 하룻밤 반응시켜 재조합 벡터(제8도)를 얻는다.
2) 형질전환
(iv)에서 얻어진 재조합 벡터를 함유하는 반응액 20㎕를 사용하여 이. 콜리(E. coli)균주 JM 105를 루비듐 클로라이드법[M.Maniatis 등, Molecular Cloning, p.252(1982)참조]에 따라 형질전환시킨다. 얻어진 형질전환주의 암피실린-내성 콜로니 배양액으로부터 플라스미드를 분리하고, 제한효소 BamH I, Acc II 및 Apa I으로 처리하여 형질전환주가 목적하는 형질전환주인 것을 확인할 수 있다.
실시예 13
이. 콜리(E. coli) 재조합 벡터(+VSE)의 구축 및 형질전환(PL프로모터 함유 벡터사용)
1) 재조합 벡터의 구축
(i) 벡터의 제조
PL프로모터를 함유하는 벡터 pPL-람다(Pharmacia 제품) 100㎍을 제한효소 BamH I 50단위로 반응액(10mM 트리스-HCl(pH 7.6), 7mM MgCl2, 100mM NaCl 및 10mM DTT] 100㎕중에서 37℃에서 하룻밤 동안 처리한다.
이 반응액에 대하여 1% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여, 약 4kb의 단편 약 49㎍ 및 약 1.2-kb단편 11㎍을 회수하였다.
상기외 단편들중 우선 약 4kb단편을 TE완충액 100㎕(조성은 상기와 같음)에 용해시키고 알칼리포스파타제(Takara Shuzo제품)와 60℃에서 60분간 반응시켜 탈인산화 처리한다. 나머지의 약 1.2kb의 단편은 완충액(10mM 트리스 -HCl, 10mM MgCl2, 6mM KCL 및 1mM DTT) 20㎕에 용해시키고 제한효소 Mbo II(New England Biolabs제품) 20단위로 37℃에서 하룻밤 처리한다. 다음에 4% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시하여 약 200bp의 BamH I -Mbo II 단편 약 0.9㎍ 및 약 310bp의 Mbo II-BamH I 단편 약 1.9㎍을 회수한다.
(ii)합성 링커의 제조
합성 링커 TAAGGAGAATTCATCGAT 및 TCGATGAATTCTCCTTAG의 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 실시예 12의 (ii)에서와 같이 인산화 및 어닐링시켜 합성 S/D링커를 제조한다.
(iii)형질발현 벡터의 구축
상기 (1)에서 조제한 약 4-kb단편 0.1㎍, OLPL영역을 갖는 BamH I - Mbo II 단편, 및 tL1영역을 갖는 Mbo II-BamH I 단편 각각 0.05㎍[이들 세가지 단편은 (i)에서 제조됨]및 (ii)에서 제조한 어닐링된 합성 S/D링커 0.1㎍을 40㎕의 반응액(66mM 트리스-HCl, 6.6mM MgCl2, 10mM DTT 및 1mM ATP)중에서 T4DNA리가제(Takara Shuzo 제품) 175단위 존재하에 12℃에서 하룻밤 반응시킨다. 이 반응액 20㎕를 사용하여 이. 콜리(E. coli) 균주 N99CI+(Pharmacia제품)를 염화칼슘법(Molecular Cloning, ibid 참조)으로 형질전환시킨다.
이 형질전환주를 배양하여 그이 암피실린 내성 콜로니 배양액으로부터 플라스미드를 분리하여 제한효소 EcoR I, BamH I 및 SmaI으로 처리한 결과 목적하는 플라스미드 임이 확인된다. 이 플라스미드 2㎍을 제한효소 ClaI (New England Biolabs 제품)와 함께 20㎕의 완충액(10mM 트리스-HCl, 6mM MgCl2, 및 50mM NaCl)중에서 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 65℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨다. 다시 이 반응액 1㎕를 상술한 조성을 갖는 결찰 반응액중에서 T4DNA리가제(Takara Shuzo 제품) 175단위를 사용하여 12℃에서 하룻밤 반응시킨 후 상기와 동일하게 하여 이. 콜리(E. coli) 균주 N99CI+(Pharmacia 제품)를 다시 형질전환시킨다. 형질전환체의 암피실린-내성콜로니 배양액으로부터 플라스미드를 분리하고 EcoR I 및 BamH I으로 처리하여 목적하는 플라스미드임을 확인한다.
(iv) G-CSF형질발현 재조합 벡터 및 형질전환체의 제조
(iii)에서 제조한 형질발현 플라스미드를 제한효소 Cla I으로 처리하고 말단을 블런트 엔드로 만든후, 실시예 12에서와 동일하게 조작하여 G-CSF의 cDNA단편이 삽입된 재조합 벡터를 제조한다. 이 벡터를 사용하여 상기의 Molecular Cloning(ibid)에 기재된 염화칼슘법으로 N4830(Pharmacia Fine Chemicals제품)을 형질전환시킨다. 목적하는 형질전환체의 확인은 실시예 12에서와 같이 수행한다(제9도).
[실시예 14]
이. 콜리(E. coli) 재조합벡터(+VSE)의 구축 및 형질전환(tac프로모터 함유 벡터)
1) 재조합벡터의 구축
(i)벡터의 제조
트립토판 프로모터를 함유하는 HpaII-Taq I 단편(약 330bp)을 pBR322의 Cla I 분위에 삽입시켜 제조한 pOY1플라스미드 10㎍을 제한효소 Cla I 7단위 및 PvuII 8단위로 30㎕의 반응액(10mM Tris-HCl, 6mM MgCl2, 및 50mM NaCl)중에서 37℃에서 3시간 동안 처리한다. 이어서, 알칼리 포스파타제(Takara Shuzo 제품)2㎕를 가하고 60℃에서 1시간 반응시킨다. 반응액으로부터 1% 아가로스 겔 전기영도동을 실시하여 2.6kb의 DNA단편(약 2.5㎍)을 회수한다.
(ii) 합성링커의 제조
CGCGAATGACCCCCCTGGGCC 및 CAGGGGGGTCATTCG의 서열을 갖는 합성링커를 갖는 올리고 뉴클레오티드를 실시예 12의 (ii)에서와 같은 방법으로 인산화 및 어닐링시켜 합성링커를 제작한다.
(iii) 재조합 벡터의 제조
(i)에서 제조한 벡터 단편 약 1㎍, (ii)에서 제조한 합성 링커 약 1㎍ 및 실시예 12의 (iii)에서 제조한 G-CSF cDNA 단편 약 1㎍을 실시예 12, 1) (iv)에 서술한 조성을 갖는 결찰 반응액 20㎕중에서 T4DNA리가제 175단위와 12℃에서 하룻밤 반응시켜서 재조합 벡터를 얻는다(제10도).
2) 형질전환
(iii)에서 제조한 반응액 20㎕를 사용하여 Molecular Cloning에 서술된 루비듐 클로라이드법에 따라 이. 콜리(E. coli) DH1주를 형질전환시킨다. 실시예 12에서와 동일하게하여 형진전환체의 암피실린-내성 콜로니로부터 플라스미드를 회수하고, 제한효소 Apa I, Dra I, Nru I 및 Pst I으로 처리하여 목적하는 형질전환체가 얻어지는 것을 확인한다.
[실시예 15]
형질전환체의 배양
1) 실시예 12에서 수득한 형질전환체(tac함유)의 배양
형질전환체를 37℃에서 하룻밤 배양하고, 이 배양액 1㎖를 25㎍/㎖ 또는 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 루리아배지 100㎖에 가하여 37℃에서 2∼3시간 배양한다. 계속하여 이소프로필-β-D-티오갈락토시드를 최종농도가 2mM이 되도록 가한 후, 37℃에서 2∼4시간 배양한다.
2) 실시예 13에서 수득한 형질전환체(PL함유)의 배양
형질전환체를 28℃에서 하룻밤 배양하고, 이 배양액 1㎖를 25 또는 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 루리아배지 100㎖에 가하여 28℃에서 약 4시간 동안 배양한다. 그후 이것을 42℃에서 2∼4시간 배양한다.
3) 실시예 14에서 얻은 형질전환체(trp함유)의 배양
형질전환체를 37℃에서 하룻밤 배양하고, 이 배양액 1㎖를 M9배지[0.5% 글루코오스, 0.5% 카스아미노산(Difco 제품) 및 25 또는 50㎍/㎖의 암피실린을 함유] 100㎖에 가하여 37℃에서 4∼6시간 동안 배양한후, 3-β-인돌아크릴산(IAA) 50㎍/㎖가하고, 37℃에서 4∼8시간 배양한다.
[실시예 16]
이. 콜리(E. coli)로부터 G-CSF폴리펩티드의 회수 및 정제
1) 회수
실시예 15에서 배양한 3종류의 형질전환체를 다음방법으로 회수한다. 배양액(100㎖)을 원심분리하여 세포 펠릿을 수거한 후, 20mM 트리스-HCl(pH 7.5) 및 30mM NaCl의 혼합물 5㎖에 현탁시킨다. 이어서, 0.2M 페닐메틸 술포닐플루오라이드, 0.2M EDTA 및 리소자임을 가하여 각각 1mM, 10mM 및 0.2㎎/㎖의 농도로 만든후, 현탁액을 0℃에서 30분간 방치한다.
동결-융해를 3회 반복하고 필요에 따라 초음파 처리를 하여 용균시킨다. 얻어진 용균액을 원심분리하여 상층액을 얻는다. 또다른 방법으로는, 용균액을 8M 염산 구아니딘을 사용하여 염산구아니딘의 최종농도가 6M이 되도록 처리한 후, 30,000rpm으로 5시간 동안 원심분리하여 그 상층액을 회수한다.
2)정제
(i)1)에서 얻은 상층액을 울트로겔 AcA54컬럼(4.6㎝Φ×90㎝L; LKB제품)에 0.15M NaCl 및 0.01% 트윈 20(Nakai kagaku 제품)을 함유하는 0.01M 트리스-HCl완충액(pH 7.4)을 사용하여 유속 약 50㎖/hr의 속도로 통과시켜 겔여과를 실시한다.
CSA분석법(b)(앞에 서술)로 분석하여 활성을 나타내는 분획을 취한 후, pM-10(아미콘사제)을 이용하는 한외여과기를 사용하여 약 5㎖로 농축시킨다.
(ii) 이 농축된 분획에 n-프로판올 (아미노산 서열결정용 ; Tokyo kasei 제품)및 트리플루오로아세트산을 최종 농도가 각각 30% 및 0.1%가 되도록 가하고 얼음에 15분 정도 방치한 후, 15000rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 제거한다. 상층액을 상기 n-프로판올 및 트리플루오로아세트산을 함유하는 수용액으로 평형시킨 μ-본다팍 C18컬럼(세미분취용 : Waters 제품 ; 8mm×30㎝)에 흡착시킨 후, 30∼60% 직선 농도 구배의 n-프로판올을 함유하는 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액으로 순차 용출한다. 히다찌 685-50형 (Hitachi사의 고압 액체 크로마토그래피 장치) 및 히다찌 638-41형(Hitachi사의 검출기)를 사용하여 220nm 및 280nm에서의 흡수를 동시에 측정한다. 용출후에 각 분획에서 10㎕씩 취하여 100배 희석한 후, CSA분석법(b)를 이용하여 활성분획을 선별한다. 그 결과, n-프로판올 40%에서 용출되는 피크에서 활성이 나타났다. 이들 피크를 모아서 위와 같은 조건으로 다시 크로마토그래피를 실시하고 CSA 분석법(b)로 활성을 조사한 결과, 역시 n-프로판올 40% 위치의 피크에 활성이 나타났다. 이들 활성을 나타내는 분획을 수집하여 (4분획=4㎖) 동결 건조시킨다.
(iii) 상기 동결 건조분말을 40% n-프로판올을 함유하는 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 200㎕에 용해시키고, TSK-G3000SW 컬럼(7.5㎝×60㎝ ; Toyo Soda Manufacturing사 제품)을 사용하여 고압 액체 크로마토그래피를 실시한다. 40% n-프로판올을 함유하는 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액을 사용하여 0.4㎖/min 의 유속으로 용출시키고, 분별수집기 FRAC-100(Pharmacia Fine Chemicals제품)으로 0.4㎖씩 수집하여 각 분획에 대해 상술한 방법으로 CSA 를 조사하여 활성을 나타내는 분획들을 회수한다. 이들을 분석용 μ-본다팍 C18컬럼(4.6mm×30㎝)에서 보다 정제시킨 후, 메인피크를 회수하여 동결건조 시킨다. 이와 같이하여 얻은 단백질을 2-메르캅토 에탄올로 처리하고 SDS-폴리아크릴아미드겔(15.0%) 전기영동을 실시(15mV, 6시간)한다. 코마씨 블루로 염색하면 목적하는 G-CSF폴리펩티드를 하나의 밴드로서 확인할 수 있다.
[실시예 17]
발현물질의 G-CSF활성의 검정(+VSE)
실시에 16에서 얻은 CSF시표를 앞서 설명한(참고예) CSF활성의 측정방법(a)에 따라 검정하였다. 그 결과는 표 1에 나타내는 바와 같다.
[표 1]
[실시예 18]
아미노산 분석(+VSE)
1) 아미노산 조성의 분석
실시예 16에서 정제한 CSF시료를 통상적인 방법으로 가수분해하고, 가수분해물중 단백질 부분의 아미노산 조성을 Hitachi 835아미노산 자동분석 장치(Hitachi제품)를 이용하여 특수 아미노산 분석법으로 분석한다. 결과는 표 2에 나타내는 바와 같다. 가수분해 조건은 다음과 같다.
(i) 6N HCl, 110℃, 24시간, 진공중
(ii) 4N 메탄술폰산 +0.2% 3-(2-아미노에틸) 인돌, 110℃, 24시간 48시간, 72시간, 진공중.
시료 40% n-프로판올 및 0.1% 트리플루오로 아세트산을 함유하는 용액(1.5㎖)에 용해시킨 후, 각각 0.1㎖를 취하여 건조질소 기체로 건조시킨 후 (i) 또는 (ii)에 나열한 시약을 가하여 진공봉관하여 내용물을 가수분해시킨다.
표 2에 나타낸 값들은 (i)의 24시간 및 (ii)의 24, 48 및 72시간 가수분해한 4회 측정치의 평균값이다. 예외로 Thr, Ser, 1/2 Cys, Met, Val, Ile 및 Trp은 다음 방법에 따라 계산하였다("Tampaku kagaku(단백질화학)II", 생화학실험강좌, Tokyo Kagaku Dohjin참조).
-Thr, Ser 1/2 Cys 및 Met에 대해서는 (ii)의 24, 48 및 72시간치의 시간경과에 따른 변화를 0시간에 대해 보외.
-Val 및 Ile의 경우에는 (ii)의 72시간 치를 사용.
-Trp의 경우에는 (ii)의 24, 48 및 72시간치의 평균을 사용.
[표 2]
2) N-말단 아미노산의 분석
시료를 기상식 시퀀서(Applied Biosystems 제품)로 에드만 분해하여 얻은 PTH아미노산을 고압 액체 크로마토그래피 장치 (Beckman Instruments제품) 및 울트라 스피어 -ODS컬럼(Beckman Instruments제품)을 사용하여 통상적인 방법으로 분석한다. 컬럼(5㎛ ; 4.6㎜Φ×250nm)을 개시완충액[15mM 소디움 아세테이트 완충액(pH 4.5)및 40% 아세토니트릴을 함유하는 수용액]으로 평형화 시킨후, 시료를 20㎕의 개시 완충액에 용해시켜 주입하고 개시 완충액에 의한 이소크라틱 용출에 의하여 분리한다. 유속은 1.4㎖/min, 컬럼의 온도는 40℃로 유지한다. PTH아미노산 검출은 269nm 및 320nm의 자외부흡수를 이용한다. PTH아미노산의 표준시료(Sigma제품, 각 2n몰)를 동일의 계로 분리하여 유지시간을 측정하고, 이를 시료의 그것과 비교하여 N-말단 아미노산을 확인하는데 사용한다. 그 결과로 PTH-메티오닌 및 TPH-트레오닌이 검출되었다.
[실시예 19]
이. 콜리(E. coli) 재조합 벡터(-VSE)의 구축 및 형질전환
1) tac프로모터 함유-벡터를 사용하는 경우
실시예 12의 과정을 반복한다. 단, 제3(a)도에 나타낸 cDNA를 함유하는 실시예 9에서 제조한 pBRG4 대신에 실시예 10에서 얻은 제4(a)도에 도시한 cDNA를 함유하는 pBRV2를 사용한다(실시예 12의 (iii)참조). 실시에 12에서와 같이 얻어진 형질전환체가 목적하는 형질전환체임을 확인한다(제11도).
2) PL프로모터 함유-벡터를 사용하는 경우
cDNA(-VSE)를 사용하여 실시예 13의 과정을 반복하고 얻은 형질전환체가 목적하는 형질전환체 임을 확인한다(제12도).
3)trp프로모터 함유 벡터를 사용하는 경우
cDNA(-VSE)를 사용하여 실시예 14의 과정을 반복하여 목적으로 하는 형질전환체가 얻어지는 것을 확인한다(제13도).
[실시예 20]
G-CSF활성의 검정(-VSE)
실시예 19에서 얻은 3가지 형질전환체를 실시예 15에 기재한 방법으로 배양한 다음, 이 배양한 대장균 세포로부터 실시예 16에 기재한 방법으로 G-CSF폴리펩티드를 회수 및 정제하여 인체 G-CSF폴리펩티드를 단일의 밴드로 얻는다.
이와 같이 하여 얻은 CSF시료를 앞서 설명한 CSF활성측정법(a)에 따라 검정한다. 결과는 표 3에 나타내는 바와 같다.
[표 3]
[실시예 21]
아미노산 분석(-VSE)
1)아미노산 조정분석
실시예 20에서 정제한 CSF시료의 아미노산조성을 실시예 18의 1)에 기재한 방법으로 분석하여 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
2)N-말단 아미노산의 분석
시료를 실시에 18의 2)에 기재한 방법에 따라 N-말단 아미노산 분석을 수행한다. 그 결과로 PTH-메티오닌 및 PTH-트레오닌이 검출되었다.
[실시예 22]
pHGA410 벡터의 구축 동물 세포용, +VSE계
실시예 9에서 얻어진 제3(a)도에 나타낸 cDNA를 갖는 EcoRI 단편을 제한효소 DraI으로 37℃에서 2시간 처리한 후 DAN 폴리머라제 I의 클레노우단편(Takara Shuzo 제품)으로 처리하여 말단을 볼런트 엔드로 만든다. 1㎍의 Bg1II 링커 (8 량체, Takara Shuzo 제품)를 ATP로 인산화 시킨후 따로 이 수득한 약 1㎍의 DAN 단편 혼합물과 결합시킨다. 결합된 단편을 제한효소 Bg1II로 처리하여 아가로즈 겔 전기영동을 실시한 후, 가장 큰 DAN단편만을 회수한다.
이 DAN 단편은 인체 G-CSF 폴리펩티드를 코오딩하는 부분을 함유하는 약 710염기쌍에 해당된다(제6도 참조). 벡터 pdKCR[Fukunaga et al. proc Natl. Acad. Sci., USA, 81권, 5086p(1984)]을 제한효소 BamHI으로 처리한 후 알칼리 포스파타제(Takara Shuzo 제품)로 탈인산화 처리하여 얻어진 벡터 DNA를 T4DAN 리가제(Takara Shuzo 제품)를 가하여 710 bp cDAN 단편과 연결시켜 pHGA410을 얻는다(제 14도). 제14도에 나타낸 바와 같이 이 플라스미드는 SV40 초기 유전자의 프로모터, SV40의 복제개시영역, 토끼β-글로빈 유전자의 일부, pBR322의 복제 개시영역 및 pBR322 유래β-락타마제 유전자(Ampr)를 함유하며 SV40 초기 유전자의 프로모터 하류에 인체 G-CSF유전자가 접속되어 있다.
[실시예 23]
C127 세포 형질전환용 재조합벡터(+VSE)의 구축
1) pHGA410(H)의 구축
실시예 22에서 얻어진 pHGA410 플라스미드(제 14도) 20㎍을 5mM 트리스-HCl(pH 7.5), 7mM MgCl2, 100mM NaCl, 7mM 2-메르캅토 에탄올 및 0.01% 소혈청 알부민 (BSA)으로 구성된 반응액에 용해시키고, 제하효소 EcoRI(10∼15단의 ; Takara Shuzo 제품)을 가하고 37℃에서 약 30분 반응시켜 EcoRI으로 부분 절단한다. 계속하여 DAN 단편을 페놀/클로로포름의 1 : 1 혼합물로 2회, 에테르로 1회 처리하고 에탄올로 침전시킨다.
이 DAN 단편을 50mM 트리스-HCl, 5mM MgCl2, 10mM DTT 및 1mM의 dATP, dCTP, cGTP, dTTP로 구성된 용액 50㎕에 용해시키고, 이. 콜리 DAN 폴리머라제의 클레노우 단편(Takara Shuzo 제품) 5㎕를 가하여 14℃에서 2시간 배양하여 볼런트 엔드로 만든다.
이것에서 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 약 5.8kbp의 DAN 단편 6㎍을 회수한다.
회수한 DNA 단편 5㎍을 다시 50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 10mM DTT 및 1mM ATP로 구성된 반응액 50㎕에 용해시키고 HindIII링커(Takara Shuzo 제품) 2㎍ 및 T4DAN 리가제(Takara SHuzo 제품) 100단위를 가하여 4℃에서 하룻밤 반응시킨다.
계속하여 페놀 및 에테르로 처리하고 에탄올로 침전시킨후 침전물을 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 7mM MgCl2, 및 60mM NaCl로 구성된 용액 30㎕에 용해시키고, 제한효소 HindIII 10단위로 37℃에서 3시간 배양한다. 다시 T4DAN 리가제로 처리한 후, 이 DAN를 사용하여 루비듐 클로라이드법(상기의 Molecular Cloning참조)에 따라 이 콜리 균주 DH1을 형질전환시키고, 암피실린-내성 형질전환제(Ampr)의 콜로니를 얻어 pHGA410 플라스미드의 EcoRI부위가 HindIII로 치환된 플라스미드를 유지하는 세포를 선택한다. 이와 같이 하여 얻어진 플라스미드를 pHGA410(H)라 명명한다(제15도).
2) 형질발현 재조합 벡터 pTN-G4
상기 1)에서 얻어진 pHGA410(H) 20㎍을 10mM 트리스-HCl (pH 7.5), 7mM MgCl2, 175mM NaCl, 0.2mM EDTA, 7mM 2-메르캅토 에탄올 및 0.01% 소혈청 알부민으로 구성된 반응액 50㎕에 용해시키고, 제한효소 Sal I(Takara Shuzo 제품) 20단위를 가하고 37℃에서 약5시간 배양한다. 계속하여 페놀 처리후, 에탄올로 침전시키고, 1)에서와 같이 DAN 폴리머라제의 클레노우단편 (Takara Shuzo 제품)을 가하여 14℃에서 2시간 배양시켜 블런트 엔드로 만든다. 이것을 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 DAN를 회수하지 않고, 반응액을 바로 에탄올로 침전시킨다. 생성된 DAN단편을 제한효소 HindIII로 처리하여 1% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 HindIII-SalI 단편 (약 2.7 kbp) 5㎍을 회수한다. 한편, 소 파필로마비루스(BPV)를 갖는 플라스미드 pdBPV-1[이 플라스미드는 Howley 박사가 제공. Sarver, N., Sbyrne, J. C. ＆ Howley, P. M. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79권, 7147∼715p(1982)]를 Nagata등의 방법과 같이 [Fukunga, Sokawa 및 Nagat, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81권, 5086∼5090p(1984)]HindIII-SalI DNA 단편(약 2.7kb)을 통상법에 따라 T4DNA 리가제로 결찰시킨다. 이를 사용하여 "Molecular Cloning"에 기재된 루비듐 클로라이드법에 따라 이, 콜리 균주 DH1을 형질전환시킨다. pHGA410 유래 G-CSF의 cDNA를 가지는 플라스미드를 유지하는 대장균 콜로니를 선별한다. 이 플라스미드를 pTN-G4라 명명한다(제15도).
아데노비루스II형[Tanpakushitsu, kakusan, koso (단백질, 핵산 및 효소), 27권, 12월, 1982, Kyoritsu shuppan]을 같은 방법으로 처리하여, VA I 및 VAII를 갖는 약 1700bp SalI-HindⅢ 단편을 함유하는 △pVA 플라스미드를 회수하고, 이 플라스미드로부터 VA I 및 VA II를 함유하는 단편을 회수한다. 이 단편을 pTNG4의 Hind Ⅲ부위에 삽입하여 pTNG4VAα 및 pTNG4VAβ를 얻는다(제15도). 아데노비루스의 VA 유전자로 인해 이 플리스미드는 SV40초기 프로모터의 전사 생성물의 형질발현을 증진시킬 수 있게 되었다.
[실시예 24]
C127세포의 형질전환 및 G-CSF의 형질발현(+VSE)
실시예 23에서 얻은 pTN-G4를 사용하여 생쥐 C127세포를 형질전환 시키기 전에 제한 효소 BamHI으로 처리한다. pTN-G4 플라스미드 20㎍을 100㎕의 반응액[10mM 트리스-HCl (pH 8.0), 7mM MgCl2, 100mM NaCl, 2mM 2-메르캅토 에탄올 및 0.01% BSA]에 용해시켜 BamHI(Takara Shuzo 제품) 20단위로 처리하고, 페놀 및 에테르로 처리한 후, 에탄올로 침전시킨다.
생쥐 C127I 세포를 소태아혈청(Gibco) 10%를 함유하는 둘베코의 최소 필수배지 중에서 증식시킨다. 배양접시(5㎝Φ)에서 증식시킨 C127I 세포를 별도로 인산칼슘법으로 제조한 상기 DNA를 배양접시당 10㎍의 비율로 사용하여 형질전환시킨다[Haynes, J. ＆ Weissman, C., Nucleic Acids Res., 11권 687∼706(1983)]. 이 세포를 글리세롤로 처리한 후, 37℃에서 12시간 배양한다.
배양 세포를 3개의 새로운 배양접시(5㎝Φ)로 옮기고, 일주일에 2번씩 배지를 교환해준다. 16일째되는 날에 포우사이(foci)를 형성한 부분을 각각 새로운 배양접시로 옮기고, 소태아 혈청(Gibco)을 10% 함유하는 둘베코 최소 필수 배지에서 연속적으로 배양하고, G-CSF 생산력이 높은 클론을 선별한다. 이들 클론은 약 1㎎/L정도의 G-CSF를 생산하였다. 계속적인 클로닝으로 10㎎/L 또는 그 이상의 G-CSF를 생산하는 클론이 수득된다. 숙주세포로는 상기 C127I 세포외에 NIH373 세포도 이용될 수 있다.
[실시예 25]
CHO 세포내에서의 G-CSF의 형질발현(+VSE)
1) pHGG4-dhfr의 구축
실시예 22에서 얻은 플라스미드 pHGA410 20㎍을 10mM 트리스-HCl (pH 7.5), 7mM MgCl2, 175mM NaCl, 0.2mM EDTA, 0.7mM 2-메르캅토 에탄올 및 0.01% BSA를 함유하는 반응액 100㎕ 에 용해시키고, 제한효소 Sall(Takara Shuzo 제품) 20단위를 가하여 37℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 페놀 및 에테르로 처리하고 에탄올로 침전시킨다.
이 DNA 침전물을 50mM 트리스-HCl, 5mM MgCl2, 10mM DTT 및 1mM의 dATP, dCTP, cGTP, dTTP로 구성된 반응액 100㎕에 용해시키고, 이. 콜리 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편(10㎕ ; Takara Shuzo 제품)을 가하여 14℃에서 2시간 반응시키고, 페놀 및 에테르로 처리한 후 에탄올로 침전시킨다.
이 침전된 DNA에 EcoRI링커를 부가한다. 즉, 상기 DNA를 50mM 트리스-HCl (pH 7.4), 10mM DTT, 0.5mM 스퍼미딘, 2mM ATP, 2mM 헥사민-코발트 클로라이드 및 20㎍/㎖ BSA로 구성되는 반응액 50㎕에 용해시키고, EcoRI 링커(Takara Shuzo 제품) 및 T4DNA 리가제(Takara Shuzo 제품) 200단위를 가하여 4℃에서 12∼16시간 반응시킨다. 페놀로 처리하고, 이어서 에테르로 세척한 후, 통상법에 따라 에탄올로 침전시킨후 침전된 DNA를 EcoRI으로 절단하고 1% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 약 2.7kbp의 DNA 단편 3㎍을 회수한다.
한편, 플라스미드 pAdD26SVpA[Kaufman, R.G.＆ Sharp.P.A.Mol.Cell Bio., 2권 1304∼1319p(1982)]를 EcoRI으로 처리하고, 박테리아 알칼린 포스파타제 (BAP)를 사용하여 탈인산화 처리를 행한다. 즉, 보다 자세히 설명하면, pAdD26SVpA 20㎍ 및 EcoRI 20단위를 반응액 [50mM 트리스-HCl (pH 7.5), 7mM MgCl2, 100mM NaCl, 7mM 2-메르킵토 에탄올 및 0.01% BSA] 100㎕에 가하여 37℃에서 10시간 반응시켜 계속하여 상기 반응액에 BAP 5단위를 가하고, 68℃에서 30분간 반응시킨다. 이어서, 페놀로 처리하고 전기영동을 실시하여 pAdD26SVpA의 EcoRI 단편 약 5㎍을 회수한다. 상기한 약 2.7kbp 단편 및 pAdD26SVpA 단편 각각 0.5㎍씩을 어닐링시킨다. 생성된 DNA로 루비듐 클로라이드법에 따라 이 콜리 균주 DH1을 형질전환시키고 pHGG4-dhfr의 플라스미드를 콜로니를 선별한다. 얻어진 플라스미드를 pHGG4-dhfr로 명명한다(제16a도).
또 다른 방법으로는 다음과 같다 : pHGA410 플라스미드를 SalI으로처리하고 EcoRI링커를 부가하지 않은채로 EcoRI으로 부분 절단한다. 약 2.7kbp의 DNA단편을 회수하고, 이 콜리 DNA 폴리머라제의 클레노우단편으로 이 DNA 단편을 처리하여 말단을 블런트 엔드로 만든다. 한편 상술한 것과 동일한 방법으로 pAdD26SVpA로부터 블런트 엔드화한 EcoRI 단편을 제조한다. 이 EcoRI 단편과 별도로 제조한 상기 단편(약 2.7kb)을 T4DNA 리가제로 처리하여 pHGG4-dhfr을 조제할 수도 있다.
또한 실시예 23에서 제조한 pHGA410(H)를 실시예 23의 2)에 기재한 바와같이 제한효소 HindIII 및 SalI으로 처리하고 HindIII-SalI단편을 상기 pAdD26SVpA의 블런트 엔드화한 EcoRI단편에 연결한다. 이 방법은 또한 pHGG4-dhfr을 제조하는 데에도 이용된다.(제16b도).
2)pG4DR1 및 pG4DR2의 구축
1)에 기술한 플라스미드 pAdD26SVpA 10㎍을 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 7mM MgCl2, 100mM NaCl, 7mM 2-메르캅토 에탄올 및 0.01% BSA 를 함유하는 반응액 50㎕에 용해시키고, 제한효소 EcoRI 및 BamHI을 각각 10단위 가하여 37℃에서 10시간 반응한다. 연속하여 페놀로 처리하고 에테르로 세척한다. 1% 저융점 아가로스겔 전기영동을 실시하여 약 2kb의 DNA 단편을 회수한다. 이 회수된 DNA 단편을 통상적 방법에 따라 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편으로 처리하여 말단을 블런트 엔드로 만든다. 블런트 엔드화한 DNA 단편을 페놀로 처리하고, 에테르로 세척한 후, 에탄올로 침전시킨다.
실시예 23의 1)에서 얻은 플라스미드 pHGA410(H) 10㎍을 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 7mM MgCl2, 및 60mM NaCl로 구성된 반응액 50㎕에 용해시키고,HindIII 10단위를 가하여 37℃에서 6시간 반응시킨다. 1% 저융점 아가로스겔 전기영동을 실시하여 통상적인 방법으로 DNA 단편을 회수한다. 계속하여 회수된 DNA단편을 BAP로 처리하고 말단을 클레노우 단편으로 처리하여 블런트 엔드로 만든다. 이 DNA 단편을 페놀로 처리하고 에테르로 세척한 후, 미리 얻은 상기 2kb DNA 단편의 블런트 엔드에 T4DNA 리가제를 사용하여 다음 방법으로 연결한다 : 각각의 DNA 단편 1㎍을 66mM 트리스-HCl(pH 7.5), 6.6mM MgCl2, 5mM DTT 및 1mM ATP로 구성된 반응액 30㎕에 용해시키고, T4DAN 리가제 50단위의 존재하에 6℃에서 12시간 동안 반응을 수행한다. 결찰된 DNA을 사용하여 이. 콜리 균주 DH1를 형질전환시킨다. 그 결과 제 16c도에 나타낸 pG4DR1 및 pG4DR2가 수득된다.
3) 형질전환 및 형질발현
CHO세포(dhfr-균주 ; 컬럼비아 대학의 L. Chasin 박사 제공)를 배양접시(9㎝Φ, Nunc제품)에 10% 송아지 혈청을 함유하는 알파 최소 필수배지(α-MEM, 아데노신, 데옥시아데오신 및 티미딘 첨가)중에서 배양 증식하여 이것을 다음 방법에 따라 인산칼슘법[Wigler등, Cell, 14, 725 (1978)]으로 형질전환시킨다.
담체 DNA(송아지 흉선 DNA)적당량을 1)에서 제조한 pHGG4-dhfr 플라스미드 1㎍ 에 가하고, 이 혼합물을 TE용액 375㎕에 용해시킨후, 1M CaCl2125㎕를 가한다. 3∼5 분 얼음위에서 냉각시키고, 500㎕의 2×HBS(50mM Hepes, 280mM NaCl 및 1.5mM 인산염 완충액)를 가한다. 다시 얼음에 냉각시킨 후에 상기 CHO 세포 배양액 1㎖와 혼합하여 배양접시로 옮기고 CO2배양기내에서 9시간 배양한다. 배양접시로부터 배지를 제거하고, TBS(트리스-완충 식염수)로 세척한 후 20% 글리세롤-함유 TBS를 첨가하여 다시 세척하고 비선택적 배지(상기 α-MEM 배지에 뉴클레오티드르 보강)를 첨가한다. 2일 배양후에, 배양액을 10배로 희석한 후, 선택배지(뉴클레오티드를 보강안함)로 옮긴다. 2일 마다 새로운 선택적 배지로 교환해주면서 계속 배양하고 생성된 콜로니를 선별하여 새로운 배양접시로 옮겨서, 0.02μM 메토트렉세이트(MTX)존재하에 세포를 증식시키고, 계속해서 0.05μM, 나중에는 0.1μM로 증가시킨 MTX 존재하에서 증식시켜 클로닝을 실시한다.
또한 CHO 세포의 형질전환은 pHGG4 및 pAdD26SVpA로 동시에 형질전환 시킴으로써 수행할 수 있다[Scahill et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80권 4654∼4658p(1983)참조].
CHO세포는 또한 다음 방법에 의해서도 형질전환된다 : 2) 에서 제조한 pG4DR1 또는 pG4DR2를 미리 SalI 및 KpnI 으로 각각 처리하여 DNA 단편을 얻고 이 단편을 10㎍을 사용하여 상술한 바와같이 CHO 세포를 형질전환 시킨다 ; 형질전환된 세포를 위에 서술한 방법에 따라 일련의 선택적 배지중에서 계속 배양한다 ; 약 7일후에 배양접시당 100개 이상의 확실한 콜로니가 나타난다. 이들 콜로니를 한꺼번에 새로운 배양 접시로 옮기고 0.01μM MTX의 존재하에 일련의 선택적 배지중에서 계속 배양하여 10여개의 콜로니가 나타난다 ; MTX의 농도를 0.02μM, 0.05μM 및 0.1μM로 증가시켜 위의 방법을 반복하고, 생존하는 콜로니를 선택한다 ; 콜로니 선택은 얻어진 10여개의 콜로니를 하나하나 선택하여 MTX 농도를 증가시키면서 배양하는 경우에 있어서도 같은 방법으로 수행할 수 있다.
폴리시스트로닉 유전자를 갖는 재조합 벡터도 CHO 세포의 형질전환에 사용될 수 있다. 예를들면, pAdD26SVpA를 PstI으로 처리하여 2개의 단편을 회수하고 이들과 pBRG4-유래 CSF cDNA 단편을 결합시켜 아데노 비루스 프로모터, CSF cDNA DHFR 및 SV40의 폴리(A) 부위의 순서로 삽입된 재조합 벡터를 제조한다. 이 재조합 벡터를 사용하여 CHO 세포를 형질전환 시킨다.
[실시예 26]
G-CSF 활성 검정(+VSE)
실시예 24 및 25에서 얻은 C127 세포 및 CHO 세포의 배양 상층액을 각각 1N 아세트산을 사용하여 pH4로 조절하고, 같은 부피의 n-프로판올을 가한 후 생성된 침전을 원심분리하여 제거한다. 상층액을 C8 역상계 담체(Yamamura Kagaku K. K. 제품)로 충전된 열린 컬럼(1Φ×2㎝L)을 통하여 50% n-프로판올로 용출시킨다. 용출액을 물로 2배 희석한 후, YMC-C8컬럼(Yamamura Kagaku K. K.제품)을 이용한 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행하여 0.1% TFA를 함유하는 n-프로판올(30∼60%일차 밀도 구배)로 용출시킨다. n-프로판올 농도가 40% 부근 위치에서 용출되는 분획을 수거한 후 동결 건조시켜 0.1M글리신 완충액(pH 9)에 용해시킨다. 이와 같은 과정을 거쳐서 C127 세포 및 CHO 세포내의 인체 G-CSF가 20배로 농축된다.
대조하기 위해서 앞서 설명한 방법에 따라 인체 G-CSF cDNA를 함유하지 않는 플라스미드로 세포를 형질전환시킨 후 그 배양상층액을 상술한 방법으로 농축시킨다. 시료의 인체 G-CSF활성을 앞서 기재한 인체 G-CSF활성 측정법(a)로 측정한다. 형질 발현 효율이 충분히 높을 경우에는 배양 상층액을 농축하지 않고 직접 측정할 수도 있다. 결과는 표 5에 요약하는 바와 같으며 이는 농축시료를 기준으로 한 데이타이다.
[표 5]
[실시예 27]
아미노산 분석 및 당분석(+VSE)
1) 아미노산 조성의 분석
실시예 26에서 얻은 조제 CSF 시료를 다시 실시예2의 (iii)에 서술한 방법에 따라 정제하고 이 정제 CSF 시료를 통상의 방법으로 가수분해하여 가수분해물의 단백질 부분의 아미노산 조성을 히다찌 835 아미노산 자동 분석장치(Hitachi 제품)를 사용하여 특수 아미노산 분석법으로 분석한다. 결과를 표 6에 나타내며, 또한 가수분해 조건은 다음과 같다.
(i) 6N HCl, 110℃, 24시간, 진공중, (ii) 4N 메탄술폰산+0.2% 3-(2-아미노에틸) 인돌, 110℃, 24시간, 48시간, 72시간, 진공중.
시료를 40% n-프로판올 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 용액(1.5㎖)에 용해시키고, 각각 0.1㎖씩 건조질소 기체로 건조시킨 후, 위(i) 또는 (ii)의 시약을 가하고 진공봉관하여 그 내용물을 가수분해한다.
표 6에 나타낸 값들은 (i)의 24시간 및 (ii)의 24, 48, 72시간 가수분해하여 얻은 4회 측정치의 평균 값이다. 단 Thr, Ser,Cys, Met, Val, Ile 및 Trp은 다음 방법으로 산출하였다 ("Tampaku Kagaku (단백질 화학) II", 생화학 실험강좌, Tokyo Kagaku Dohjin참조).
-Thr, Ser,Cys 및 Met은 (i) 24, 48 및 72시간의 값의 시간경과에 따른 변화를 0시간에 대해 보외.
-Val 및 Ile의 경우에는 (ii)의 72시간 값을 사용.
-Trp의 경우에는 (ii)의 24, 48 및 72시간 값의 평균치를 사용.
[표 6]
2)당조성 분석
1)의 아미노산 조성분석에 사용한 정제 CSF 시료 200ng에 내부 표준물 (25n 몰의 이노시톨)을 가한 후, 1.5N HCl을 함유하는 메탄올 용액(500㎕)를 가하고, N2가스로 세척한 밀폐관에서 90℃로 4시간 반응시킨다. 관을 열고 탄산은(Ag2CO3)을 가하여 내용물을 중화시킨 후, 아세트산 무수물 50㎕를 가하고 적당히 흔들어주고 상온의 암실에서 하룻밤 방치한다. 상층부를 시료관에 넣고 질소기체로 건조시킨다. 침전물에 메탄올을 가하여 세착한 후 약하게 원심분리한다. 상층부를 동일한 시료관에 넣고 건조시킨다. 여기에 TMS 시약(피리딘. 헥사메틸 디실라잔 및 트리메틸크로로실란의 5 : 1 : 1 혼합물) 50㎕를 가하여, 40℃ 로 20분 반응시킨 후 생성물을 실온냉각기에 보존하다. 표준시표는 이노시톨 25n 몰과 갈락토오즈(Ga1), N-아세틸갈락토오즈아민(Ga1, NAc), 시알산 및 다른 적절한 시약을 각각 50n 몰씩 조합하여 제조한다.
이렇게 제조한 시료를 다음 조건들 하에서 기체 크로마토그래피 한다.
분석 조건
컬럼 : 2% OV-17 VINport HP, 60∼80 메쉬, 3m, 유리
온도 : 4℃/분으로 110℃에서 250℃까지 상승시킨다.
운반기체(N2)압력 : 최초 1.2∼1.6kg/cm2, 종료시 2∼2.5kg/cm2
감도 : 103M범위, 0.1∼0.4V
압력 : H2, 0.8kg/cm2, 공기, 0.8kg/cm2
시료량 : 2.5∼3.0μl
분석결과 본 발명의 CSF 시료 내에서 갈락토오즈, N-아세틸 갈락토오즈아민 및 시알산이 확인되었다.
[실시예 28]
pHGV2 벡터의 구축(동물세포용-VSE계)
실시예 10에서 얻어진 제4(a)도에 나타낸 cDNA의 EcoRI 단편을 제한효소 DraI으로 37℃에서 2시간 처리한 후, DNA 폴리머라제 I의 클레노우단편(Takara Shuzo 제품)으로 처리하여 말단을 볼런트 엔드로 만든다. Bg1II 링커 (8 량체, Takara Shuzo 제품) 1㎍을 ATP로 인산화시킨 다음 상기에서 얻어 DAN 단편 혼합물 약 1㎍과 결합시킨다. 결합된 단편을 제한효소 Bg1II로 처리하여 아가로스 겔 전기영동을 실시한 후, 가장 큰 DNA 단편만을 회수한다.
이 DNA 단편은 인체 G-CSF폴리펩티드를 코오딩하는 부분을 함유하는 약 700bp에 해당된다(제6도 참조). 벡터 pdKCR[Fukunaga et al. proc Natl. Acad. Sci., USA, 81권, 5086(1984)]을 제한효소 BamHI으로 처리한 후, 알칼리 포스파타제(Takara Shuzo 제품)를 사용하여 탈인산화 시킨다. 얻어진 벡터 DNA를 T4DAN 리가제(Takara Shuzo 제품)의 존재하에서 약 700 bp cDNA 단편과 결합시켜 pHGV2를 제조한다.(제17도). 제17도에 나타낸 바와 같이 이 플라스미드는 SV40 초기 유전자의 프로모터, SV40의 복제개시영역, 토끼β-글로빈 유전자의 일부, pBR-322의 복제 개시영역 및 pBR322 -유래β-락타마제 유전자(Ampr)를 함유하며 SV40 초기 유전자의 프로모터 하류에 인체 G-CSF유전자가 접속되어 있다.
[실시예 29]
C127 세포의 형질전환용 재조합 벡터(-VSE)의 구축
1) pHGV2(H)의 제조
실시예 28에서 얻어진 플라스미드 pHGV2(제17도) 20㎍ 을 실시에 23의 1)에 기재한 방법으로 처리하여, pHGV2(H)로 명명하는 플라스미드를 얻는다(제18도).
2) 형질발현 재조합 벡터 pTN-2, pTNVAα 및 pTNVAβ의 제조
상기 1)에서 얻어진 pHGV2(H) 20㎍을 사용하여, 실시예 23의 2)에 기재한 방법에 의하여 pHGV-2 유래 G-CSF의 cDNA를 갖는 플라스미드를 유지하는 이. 콜리(E. coli)를 선별한다. 이 플라스미드를 pTN-V2로 명명한다(제18도). 아데노비루스 II형[Tampakushitsu, Kakusan koso(단백질, 헥산 및 효소), 27권, 12월, 1982, kyoritsu Shuppan]을 같은 방법으로 처리하여 VAI 및 VAII를 갖는 약 1700bp Sa1I-HindIII 단편을 함유하는 △pVA 플라스미드를 얻고, 이 플라스미드로 부터 VAI 및 VAII를 갖는 단편을 회수한다. 이 단편을 pTN-V2 의 HindIII 부위에 삽입하여 pTNVAα 및 pTNVAβ를 얻는다(제18도). 아데노비루스의 VA 유전자로 인해 이 플라스미드는 SV40초기 프로모터로 부터의 전사 생성물의 형질발현을 증진시킬 수 있다.
[실시예 30]
C127 세포 형질전환 및 G-CSF의 형질발현(-VSE)
실시예 29에서 얻은 pTN-V2를 생쥐 C127 세포의 형질 전환용으로 사용하기 전에 제한효소 BamHI으로 처리한다. 계속하여 생쥐 C127I 세포를 상기에서 제조한 DNA로 형질전환시켜 G-CSF를 형질발현시키고(실시예 24 참조) G-CSF 생산기능이 높은 클론을 선별한다. 이들 클론은 약 1㎎/L 수준으로 G-CSF를 생산한다.
계속 클로닝하여, G-CSF를 10㎎/L의 수준으로 생산할 수 있는 클론을 선별한다. 동일한 방법으로, 실시예 29에서 얻은 pTNVAα 및 pTNVAβ로 C127 세포를 형질전환시키고, G-CSF 생산능력이 높은 클론으로 형질전환체를 선별한다. pTNVAα 로부터는 G-CSF 를 20㎎/L 이상 생산하는 클론을 얻을 수 있었으나, pTNVAβ를 이용한 형질전환에서는 생산성이 낮은(수 ㎎/L)클론이 얻어졌다. 또한 숙주세포로서는 상기의 C127 I세포외에도 NIH3T3 세포도 이용될 수 있다.
[실시예 31]
CHO 세포내에서의 G-CSF의 형질발현 (-VSE)
1) pHGV2-dhfr의 구축
pHGV2 플라스미드(실시예 28) 20㎍으로부터 실시예 25의 1)에 기재한 방법에 따라 얻어지는 약 2.7kbp의 DNA 단편(0.5㎍)과 pAdD26SVpA의 EcoRI 단편(0.5㎍)을 어닐링한다. 생성된 플라스미드를 이용하여 루비듐클로라이드법에 따라 이. 콜리 균주 DH1을 형질전환시키고, 플라스미드 pHGV2-dhfr을 유지하는 콜로니를 선별한다. 이렇게 얻은 플라스미드를 pHGV2-dhfr(제9a도)라 명명한다. 다른 방법으로서는 다음과 같다 : 플라스미드 pHGV2를 Sa1I으로 처리하고 EcoRI 링커를 부가하지 않고 EcoRI으로 부분 분해시켜 약 2.7kbp의 DNA 단편을 회수하고, 이 콜리 DNA 플리머라제의 클레노우 단편으로 이 DNA 단편을 처리하여 말단을 블런트 엔드로 만든다. 한편, 앞서 설명한 동일한 방법으로 pAdD26SVpA로부터 블런트 엔드화한 EcoRI 단편을 제조하여 별도로 제조한 단편(약 2.7kbp)과 T4DNA 리가제를 사용하여 접합시킴으로써 pHGV2-dhfr를 제조한다. 실시예 29의 1)에서 제조한 pHGV2(H)를, 실시예 29의 2)에서와 같이, 제한효소 HindIII 및 Sa1I 으로 처리한 후, 이 HindIII-Sa1I 단편을 앞에서 서술한 pAdD26SVpA의 블런드 엔드화한 EcoRI 단편과 결합시킨다. 이 방법은 또한 pHGG4-dhfr의 제조에도 적용된다(제19b도).
2)pV2DR1 및 pV2DR2의 구축
1)에 기재한 플라스미드 pAdD26SVpA 10㎍을 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 7mM MgCl, 100mM NaCl, 7mM 2-메르캅토 에탄올 및 0.01% BSA 를 함유하는 반응액 50㎕에 용해시키고, 제한효소 EcoRI 및 BamHI을 각각 10단위씩 가하여 37℃에서 10시간 반응시킨 후 통상적인 방법으로 페놀 처리하고, 이어서 에테르로 세척한다. 1% 저융점 아가로스겔 전기영동을 실시하여 약 2kb의 DNA 단편을 회수하고, 이를 통상적 방법으로 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편으로 처리하여 블런트 엔드로 만든다. 블런트 엔드화한 DNA 단편을 페놀로 처리하고, 에테르로 세척한 후, 에탄올로 침전시킨다. 실시예 29의 1)에서 얻은 플라스미드 pHGV2(H) 10㎍을 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 7mM MgCl2, 60mM NaCl을 함유하는 반응액 50㎕에 용해시키고,HindIII 10단위를 가하여 37℃에서 6시간 반응시킨다. 통상적인 방법으로 1% 저융점 아가로스겔 전기영동을 실시하여 DNA 단편을 회수한다. 회수된 DNA 단편을 BAP로 처리하고 클레노우 단편으로 처리하여 블런트 엔드로 만든다. 이 DNA 단편을 페놀로 처리하고 에테르로 세척한 후, 다음 방법으로 T4DNA 리가제로 처리하여 앞에서 얻은 약 2kb DNA 단편과 블런트 엔드에 결합시킨다. 각각의 DNA 단편 1㎍을 66mM 트리스-HCl(pH 7.5), 6.6mM MgCl2, 5mM DTT 및 1mM ATP를 함유하는 반응액 30㎕에 용해시키고, T4DAN리가제 50단위를 가하여 6℃에서 12시간 반응시킨다. 이 결찰 생성물을 이용하여 이. 콜리 균주 DH1를 형질전환시킨다. 그 결과 제19c도에 나타낸 pV2DR1및 pV2DR2가 얻어진다.
3)형질전환 및 형질발현
상기1)에서 제조한 pHGV2-dhfr 플라스미드를 이용하여 실시예 25의 3)에 기재한 방법에 따라 CHO 세포를 형질전환시켜 G-CSF를 형질발현시킨다. CHO 세포의 형질전환은 pHGV2 및 pAdD26SVpA로 동시 형질전환하는 것에 의해 수행될 수도 있다. CHO 세포는 또한 다음 방법에 의해서도 형질전환된다 : 2) 에서 제조한 pV2DR1 또는 pV2DR2를 각각 SalI 및 KpnI으로 미리 처리하여 CNA 단편을 얻고, 이 단편 10㎍을 사용하여 위와같이 CHO 세포를 형질전환 시킨다 : 형질전환된 세포를 앞서 서술한 방법으로 일련의 선택적 배지에서 연속적으로 배양한다 : 7일 후, 배양접시당 100개 이상의 확실한 콜로니가 나타난다 : 이 콜로니들을 한꺼번에 새로운 배양접시에 옮겨서 0.01μM MTX 존재하에 일련의 선택적 배지에서 계속 배양한다 : 여기에서 10여개의 콜로니가 나타난다 : MTX 농도를 0.02μM, 0.05μM 및 0.1μM 로 연속적으로 증가시키면서 상기 과정을 반복하여 생존하는 콜로니를 선별한다 : 콜로니 선택은 얻어진 10여 개의 콜로니를개별적으로 선택하여 MTX 농도를 증가시키면서 배양하는 경우에 있어서도 같은 방법으로 수행 할 수 있다.
또 소위 폴리시스트로닉 유전자를 갖는 재조합 벡터를 사용하여 CHO 세포를 형질전환시킬 수도 있다. 예를들면, pAdD26SVpA를 PstI으로 처리하고 2개의 단편을 회수하여 이것들과 pBRV2 유래 CSF cDNA 단편을 결합시킴으로써 아데노비루스 프로모터, CSF cDNA, DHFR 및 SV40의 폴리(A) 부위가 순서대로 삽입된 재조합 벡터를 제조한다. 이 재조합 벡터를 사용하여 CHO 세포를 형질전환 시킨다.
[실시예 32]
G-CSF활성의 검정(-VSE)
실시예 30 및 31에서 각각 얻어진 C127 세포 및 CHO 세포의 배양 상층액으로 부터 실시예 26에 기재한 방법에 따라 인체 G-CSF를 제조하여 그 시료의 인체 G-CSF활성을 검정한다. 결과는 표 7에 나타내는 바와 같다.
[표 7]
[실시예 33]
아미노산 분석 및 당 분석(-VSE)
1) 아미노산 조성의 분석
실시에 32에서 얻은 비정제 CSF시료를 다시 실시예 2(iii)에 기재한 방법으로 정제한다. 이정제 CSF시료를 실시예 27 의 1)에 기재한 방법에 따라 아미노산 조성을 분석한다. 결과는 표 8에 나타내는 바와 같다.
[표 8]
2) 당조성 분석
1)의 아미노산 조성분석에 사용된 정제 CSF 시료에 대하여 실시예 27의 2)에 기재한 것과 동일한 방법 및 동일한 분석조건으로 당조성 분석을 실시한다. 분석결과, 본 발명의 CSF 시료내에 갈락토오즈, N-아세틸 갈락토오즈아민 및 시알산이 존재함이 확인 되었다.
[실시예 34]
COS 세포내에서의 형질발현을 위한 염색체 유전자 함유 재조합 벡터의 구축
실시예 11에서 수득한, 제5도에 나타낸 염색체 유전자를 함유하는 플라스미드 pBRCE3β를 EcoRI으로 처리한다. Banerji 등 [cell, 27, 299(1981)]에 의해 발표된 pSVH+K+플라스미드를 KpnI으로 처리하여 글로빈유전자를 제거한다. Hind III를 사용하여 플라스미드를 다시 부분 분해시킴으로써 SV40의 후기 유전자 부분을 제거한다. 단편을 재결합시켜 형질발현 벡터 pML-E+를 제조한다.
이 벡터를 제한 효소 EcoRI으로 처리하고, 알칼리 포스파타제(Takara shuzo Co., Ltd)로 탈인산화 처리하여 벡터 DNA 를 얻고, T4DNA 리가제(Takara Shuzo 제품)을 이용하여 상기 벡터 DNA를 상술한 염색체 DNA에 결합시킴으로써 pMLCE3α를 얻는다. 제20도에 나타낸 바와같이 이 플라스미드는 SV40 유전자의 인헨서, SV40의 복제기원, pBR322의 복제기원 및 pBR322 유래β-락타마제 유전자(Ampr)를 함유하고 인체 G-CSF 염색체 유전자가 SV40 유전자 인헨서의 하류에 연결되어 있다.
[실시예 35]
COS 세포내에서의 인체 G-CSF염색체 유전자의 형질 발현
10% 송아지 혈청을 함유하는 DMEM 배지(둘베코 수정 이글 배지, Nissui Seiyaku K. K. 제품으로 상품명 "Nissui")를 사용하여 페트리디쉬 (9㎝Φ,Nunc 제품)에서 약 70%의 밀도로 배양 증식시킨 COS-1세포(미합중국 콜드 스프링 하버 레이보 레이토리의 글루즈만 박사 제공)를 인산칼슘법[Wigler et al., Cell, 14권, 725p (1978)]또는 DEAE-덱스트란 : 클로로컨법[Grodon et al., Science, 228권, 81OP(1985)참조]을 이용하여 형질 전환 시킨다.
인산칼슘법을 이용한 형진전환은 다음과 같다 : 실시예 34에서 제조한 160㎍의 플라스미드 pMLCE3α를 320㎕의 TE용액에 용해시키고, 증류수(3.2㎖)를 가한 후 504㎕의 2M CaCl2를 가한다.
생성된 용액에 4㎖의 2×HBS (50mM Hepes, 28mM NaCl, 1.5mM 인산염 완충액, pH 7.12)를 가하고 혼합물을 얼음에서 20∼30분간 냉각 시킨다. 냉각된 혼합물을 COS-1 세포가 증식된 페트리 디쉬 1개당 1㎖의 양으로 배지에 가한다. CO2배양기 내에서 37℃로 4시간 동안 배양한 후, 이 세포를 무혈청 DMEM 배지로 세척하고, 20% 글리세롤 함유 DMEM 배지 5㎖에 용해시켜 실온에서 3분간 방치한후, 다시 무혈청 DMEM 배지로 세척한다. 무혈청 DMEM 배지를 제거한 후 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배지 10㎖를 가하고 CO2배양기 내에서 하룻밤 동안 배양한다. 배지를 동일형의 새로운 것으로 교환해준 후 3일간 더 배양시킨다.
DEAE-덱스트란 : 클로로컨법을 이용한 형질전환은 다음과 같이 실시한다 : 인산 칼슘법에서와 마찬가지로, COS-1 세포를 70%의 밀도로 배양 증식시켜서 무혈청 DMEM 배지로 2회 세척한다 : 세척한 세포에 250㎍/㎖ 의 DEAE-덱스트란 및 실시예 34에서 제조한 2㎍/㎖의 플라스미드 pMLCE3α를 함유하는 무혈청 DMEM 배지를 가하고 37℃에서 12시간 동안 배양한다 ; 계속해서 세포를 무혈청 DMEM 배지로 2회 세척하고 10% 송아지 혈청 및 1mM 클로로컨을 함유하는 DMEM 배지중에서 37℃에서 2시간 동안 더 배양한다 ; 이어서 세포를 무혈청 DMEM 배지로 2회 세척하고 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배지중에서 37℃로 3일간 더 배양한다.
이렇게하여 얻어진 COS-1세포 배양물의 상층액을 1N 아세트산을 사용하여 pH 4로 조절한다. 동 부피의 n-프로판올을 가한 후, 생성된 침전물을 원심분리하여 제거한다. 상층액을 C8 역상 담체(Yamamura kagaku K. K.제품)로 채운 열린 컬럼 (1Φ×2㎝L)에 통과시키고 50% n-프로판올로 용출시킨다. 용출액을 물로 2배 희석하고, YMC-C8컬럼 (Yamamura kagaku K. K.제품)을 이용한 역상 고압 액체 크로마토그래피를 실시한 후, 0.1% TEA 함유 n-프로판올 (30∼60% 직선 밀도 구배)로 용출시킨다. 약 40% 농도의 n-프로판올로 용출시킨 분획을 회수하여 동결 건조시키고 0.1M 글리시딘 완충액(pH9)에 용해시킨다. 마지막으로 COS-1세포 배양물의 상층액내의 인체 G-CSF를 약 20배로 농축시킨다.
대조용으로서, 상술한 방법에 따라 G-CSF 염색체 유전자 비함유 pML-E+를 사용하여 COS-1 세포를 형질전환시키고 생성된 배양물의 상층액을 농축시킨다.
얻어진 시료의 인체 G-CSF 활성을 본 명세서에서 이미 설명한 바 있는 "인체 G-CSF 활성 분석법(a)"으로 분석하고 결과는 표 9에 요약한다.
[표 9]
실시예 36
G-CSF(염색체 유전자)의 RNA분석
8×106세포/판(9㎝Φ)의 세포농도로 배양한 COS 세포를 80㎍의 pMLCE3α 플라스미드를 이용하여 형질전환시킨다. 48시간 후, Chirgwin[Biochemistry, 18권, 5294 ∼5299(1979)]의 방법에 따라 전체 RNA를 제조한다.
실시예 9에서 얻어진 플라스미드 pBRG4 를 제한 효소 AhaIII로 절단하고, 생성된 pBRG4-유래 DNA 단편을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 [γ-32P]ATP로 방사 표시함으로써 G-CSF cDNA를 함유하는 약 2.8-kb의 DNA를 얻는다. 이 단편을 회수하여 DNA탐침으로 사용한다. DNA탐침(1.5×105c. p. m., 2.8×106c. p. m/㎍ DNA)을 변성시킨 후, COS 세포로부터 제조한 20㎍의 전체 RNA와 혼합한 다음 45℃에서 15시간 동안 혼성화 시킨다. 이 혼합물을 Weaver와 Weissmann[Nucleic Acid Res., 7권, 1175∼1193p(1979)]의 방법에 따라 200단위/㎖ 또는 400단위/㎖의 S1뉴클레아제(P. L.Biochemicals 제품)로 분해한 후 8.3M 의 우레아 존재하에 4% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 실시한다. 자동 방사선 사진법을 이용하여 검출한다.
결과로서, COS 세포내에 강한 방사 표시 밴드로서 722bp에 해당하는 밴드가 관찰되며 또한 487bp에 해당하는 밴드도 검출된다.
따라서 COS 세포의 RNA 가 +VSE 및 -VSE 두 개열 G-CSF mRNA를 함유하는 것이 확인되었다.
[실시예 37]
아미노산분석 및 당분석(염색체 유전자)
1) 아미노산 조성의 분석
실시예 35에서 제조한 조제 CSF 시료를 실시예 2(iii)에 기술한 방법에 따라 정제시킨다. 실시에 27의 1)의 기술한 방법에 따라, 정제 CSF 시료의 아미노산 조성을 분석한다. 결과는 표 10에 나타내는 바와 같다.
[표 10]
2)당조성의 분석
1)에서 아미노산 조성 분석시 사용했던 정제 CSF 시료를 사용하여 실시예 27의 2)에 기술한 것과 동일한 방법 및 조건하에서 당 조성을 분석한다. 이 분석의 결과로서 본 발명의 CSF 시료 내에 갈락토오즈, N-아세틸 갈락토오즈아민 및 시알산이 존재하는 것이 확인되었다.
[실시예 38]
C127 세포내에서의 인체 G-CSF 염색체 유전자의 형질발현
실시예 34에서 얻어진 플라스미드 pMLCE3α를 EcoRI으로 처리하고 Molecular Cloning, ibid. 에 기술된 방법을 이용하여 약 4kb 의 단편을 회수한다. 회수한 단편을 염색체 G-CSF 유전자원으로 사용한다.
이 단편을 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 처리하여 블런드 엔드로 만든다(A).
Molecular Cloning, ibid. 에 기술된 방법에 따라 pHGA410 플라스미드(실시예 22에서 제조)로부터 SV40의 프로모터(약 0.4-kb EcoRI-EcoRI 단편)를 절단해 내고 계속해서 이를 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편으로 처리한다(B).
별도로, 소의 파필로마 비루스(BPV)를 갖는 플라스미드 pdBPV-1[이 플라스미드는 Howley 박사에 의해 제공되었으며 Sarver, N., Sbyrne, J. C. ＆ Howley, P. M., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79권, 7147∼7151p(1982)에 기술되어 있음]을 HindIII 및 PvuII로 처리하여 약 8.4kb의 DNA 단편을 얻는다. 이 단편을 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 처리하고 박테리아 알칼리성 포스파타제를 사용하여 탈인산 처리한다. (C).
DNA 단편(A), (B) 및 (C) 각각 0.1㎍을 20㎕의 반응액[50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 10mM DTT , 1mM ATP]에 용해시키고 180 단위의 T4DNA 리가제의 존재하에 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨다.
계속해서 반응액을 Molecular Cloning, ibid.에 기술된 염화 루비듐법에 따라 처리하여 플라스미드 pTNCE3α(제21도)를 얻는다.
염색체 G-CSF 유전자 원으로 사용되는 DNA 단편(A)는 다음 방법에 의해 얻어지는 약 1.78kb의 DNA 단편으로 대치될 수 있다 : 20㎍의 pMLCE3α를 10mM 트리스-HCl(pH 8.0), 7mM MgCl2, 100mM NaCl, 7mM 2-메르캅토 에탄올 및 0.01% BSA 의 혼합물 100㎕에 용해시킨 다음 이 용액을 20단위의 StuI의 존재하에 37℃에서 5시간 동안 배양하고, 이어서 1.2% 아가로스겔 전기영동을 실시한다.
이와 같이 하여 얻어진 플라스미드 pTNCE3α를 이용하여 실시예 24에서와 같이 생쥐 C127I 세포를 형질전환시키고, 인체 G-CSF 염색체 유전자를 형질 발현시켜 G-CSF 생산능이 높은 클론을 선택한다.
[실시예 39]
CHO 세포 내에서의 인체 G-CSF 염색체 유전자의 형질발현
C127 세포내에서의 형질발현과 마찬가지로 플라스미드 pMLCE3α를 StuI으로 처리하여 약 1.78kb의 DNA 단편을 회수한다 : 한편, 동일한 플라스미드를 EcoRI으로 처리하여 약 4kb의 EcoRI 단편을 회수한다. 두 단편 모두 염색체 G-CSF 유전자원으로 사용하기에 적당하다.
원단편을 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 처리하다(a).
실시예 38에서와 같이, pHGA410으로부터 SV40의 프로모터(EcoRI-EcoRI단편)를 절단해서 약 0.4kb의 단편을 수득하고 이를 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편으로 동일하게 처리한다(b).
별도로, 플라스미드 pAdD26SVpA[Kaufman, R. G. ＆ Sharp, P. A., Mol. Cell. Biol., 2권,1304∼1319P(1982)]를 EcoRI으로 처리한 다음 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편으로 처리하고 최종적으로 박테리아 알칼리성 포스파타제를 사용하여 탈인산화 처리한다(c).
단편 (a), (b)및 (c) 각각 0.1㎍을 20㎕의 반응액 [50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 10mM DTT , 1mM ATP]에 용해시키고, 180단위의 T4DAN 리가제의 존재하에 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨다.
반응액을 Molecular Cloning, ibid. 기술된 염화 루비듐법에 따라 처리함으로써 이.콜리 균주 DH1을 형질전환시킨다. 생성된 Tet 콜로니를 선별하여 플라스미드 pD26SVCE3α를 함유하는 것을 회수한다.
제22도에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pD26SVCE3α는 SV40의 초기 유전자에 결합된 CSF 유전자 및 아데노비루스의 주 후기 프로모터의 하류에 결합된 dhfr 유전자를 갖는다.
플라스미드 pAdD26SVpA를 실시예 25의 2)에서와 같이 EcoRI 및 BamHI으로 처리하여 dhfr 유전자를 함유하는 DNA 단편(약 2kb)을 수득한다. 이 단편을 단편(a) 및 pHGA410(H)의 EcoRI-SalI 단편에 연결시켜 Amp 형질발현 벡터 pDRCE3α를 제조한다(제22도).
이와 같이 하여 얻어진 플라스미드 pD26SVCE3α 및 pDRCE3α를 사용하여 실시예 25에서와 같이 CHO 세포를 형질전환시킨다. MTX 의 존재하에 증식시키면서 반복 선택함으로써 G-CSF 생산균주의 클론을 수득한다.
[실시예 40]
형질전환체의 G-CSF 활성의 분석
(인체 염색체 유전자의 형질 발현)
실시예 38 및 39에서 각각 얻어진 VC127 세포 및 CHO 세포 배양물의 상층액을 실시예 26의 방법으로 조작하여 인체 G-CSF를 수득하고 그 활성을 분석한다. 결과는 표 11에 나타내는 바와 같다.
[표 11]
[실시예 41]
형질전환체의 분자량 및 등전점
실시예 16, 20, 27, 33 및 37에서 아미노산 조성 분석시 사용한 정제 CSF 시료를 사용하여 다음 방법으로 그의 분자량 및 등전점을 측정한다.
1)분자량
CSF 의 분자량은 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 실시하여 측정한다. 전기 영동 장치는 140mm×160mm×1.5mm 크기의 폴리아크릴아미드 슬랩 겔(T= 15%, C=2.6%)및 농축 겔(T= 3%, C=20%)로 이루어진 겔을 이용한 TROTEANTH(16㎝, Bio-Rad Corporation 제품)이다. 다음 방법에 따라 변성 CSF 시료를 제조한다 : 0.46M 2-메르캅토에탄올에 용해시킨 2% 소디윰 도데실 설페이트를 함유하는 용액내에서 CSF를 3분간 끓인다. 4㎍의 시료를 사용하여 4시간 동안 30mA의 일정 전류로 전기 영동을 실시한 후, 겔을 제거하고, 밴드 검출을 위해 0.25% 코마씨 브릴리안트 블루 R250(Sigma Chemical Co., 제품)으로 염색한다. 같은 방법으로 처리한 후 다음 물질을 분자량 표식자로 사용한다 : 포스포릴라제 B(분자량 92, 500), 소혈청 알부민(BSA, 분자량 67, 000), 오브알부민(OVA, 분자량 45, 000), 탄산 탈수효소(분자량 31, 000), 콩 트립신 억제제 (분자량 21, 500) 및 리소자임(분자량 14, 400).
결과로서, 실시예 16에서 얻은 CSF 시료[이. 콜리/cDNA(+VSE)]및 실시예 20에서 얻은 CSF 시료[이. 콜리/cDNA(-VSE)] 각각에서 185, 000±1, 000의 분자량에 해당하는 단일 밴드가 검출되었으며, 실시예 27에서 얻은 CSF 시료[C127, CHO/cDNA(+VSE)] 실시예 33에서 얻은 CSF 시료[C127, CHO/cDNA(-VSE)] 및 실시예 37에서 얻은 CSF 시료(COS/gDNA) 각각에서는 19, 000±1, 000의 분자량에 해당하는 단일 밴드가 검출되었다.
2)등전점
플랫베드형 등전점 전기영동장치 FBE-3000(Pharmacia Fine Chemicals 제품)을 이용하여 본 발명의 CSF의 등전점을 측정한다. 파마라이트(pH=4∼6.4, Pharmacia Fine Chemicals제품) 및 4M 우레아를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔(T=5%,C=3%, 115mm×230mm)에서 30와트 (Vmax=2, 000볼트)의 일정 전력으로 2시간 동안 전기영동을 실시한 후 CSF를 30% 메탄올/10% 트리클로로아세트산/35% 술포살리실산으로 고정시키고 코마씨 브릴리안트 블루 R-250으로 염색한다. 등전점 표식자로는 낮은 pI 키트(pH ; 2.5∼6.5 Pharmacia Fine Chemicals 제품)을 사용한다.
pH 4∼6.5에서 밴드를 분리 분석하면 실시예 16 및 20에서 수득한 각각의 CSF 시료에 대하여 pI=6.1에 해당하는 단일 밴드가 나타나며, 실시예 27, 33 및 37에서 수득한 CSF 시료에 대하여는 각각 pI=5.5, 5.8 및 6.1에 해당하는 세개의 뚜렷한 밴드가 나타난다.
[실시예 42]
인체 G-CSF의 감염방어 효과
시험방법
1.수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)감염에 대한 방어 효과
8∼9주생(체중 35.3±1.38g)의 ICR계 생쥐(숫컷)에 엔독산(Endoxan : Shionogi사의 상품명) 200㎎/㎏을 복강내 투여한 후, 3군으로 나누고 2개의 군에 인체 G-CSF(25,000단위/생쥐 또는 50,000단위/생쥐)를 함유하는 용매[1% 프로판올 및 0.5%(W/V) 생쥐 혈청 알부민의 생리식염수]를 그리고 나머지 1군에는 용매만을 각각 24시간마다 0.1㎖씩 4번 피하 주사하였다. 4번째 투여하고 3시간 경과후에 각각의 군의 생쥐에 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) GNB-139(3.9×105CFU/생쥐)를 피하 주사하여 감염시킨다. 감염후 21시간 지나서 처음 2개의 군에 인체 G-CSF(25,000단위/생쥐 또는 50,000단위/생쥐)를 함유하는 용매로 다시 한번 피하 주사하고 나머지 1개군은 용매만 주사한다.
인체 G-CSF의 감염방어 효과는 감염후 10일째 되는 날에 살아 있는 생쥐의 수를 세어서 조사한다.
세포현탁액의 제조
수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) GNB-139를 하트-인퓨젼 (Heart Infusion) 액체배지(Difco의 상품명)중에서 37℃에서 진탕하며 하룻밤동안 배양한다. 배양액을 생리식염수에 현탁시킨다.
2. 칸디다(Candida)감염에 대한 방어 효과
8주생(체중 40.5±1.60g)의 ICR계 생쥐(수컷)에 엔독산(Shionogi사의 상품명) 200㎎/㎏를 복강내 투여한 후, 2군으로 나누어 1군에는 인체 G-CSF(50,000단위/생쥐)를 함유하는 용매[1% 프로판올 및 10%(W/V) ICR 생쥐 혈청의 생리 식염수]를 및 나머지 1군에는 용매만을 각각 24시간 마다 0.1㎖씩 4회 피하 주사한다. 4번째 주사하고 4시간 경과후에 각각의 군의 생쥐에 칸디다 알비칸스(Candida albicans)U-50-1(백혈병 환자의 소변에서 분리한 균주, Tohoku 대학교 약학대학의 미생물 실험실에서 제공)을 5.6×105CFU /생쥐로 정맥 주사하여 감염시킨다. 인체 G-CSF의 감염 방어 효과는 감염후 10일째 되는 날에 살아 있는 생쥐의 수를 세어서 조사한다.
세포 현탁액의 제조
칸디다 알비칸스 U-50-1을 효모 추출물 함유 사부로 액체 배지(2%, 뎃스트로오즈, Junsei Pure Chemicals 제품; 10% 트림토카제 펩톤, BBL의 상품명; 5% 효모 추출을 Difco 제품; pH 5.6)중에서 37℃에서 진탕하며 하룻밤 동안 배양한다. 이 배양액을 생리식염수로 2회 세척하고 생리 식염수에 현탁시킨다.
3. 세포내 기생균 리스테리아(Listeria)감염에 대한 방어효과
7주생(체중 34.7±1.24g)의 ICR계 생쥐(숫컷)에 엔독산(Shionogi사의 상품명) 200㎎/㎏를 복강 내 투여한 후, 2군으로 나누어 1개 군에는 인체 G-CSF(50,000단위/생쥐)를 함유하는 용매[1% n-프로판올 및 10%(W/V) ICR 생쥐 혈청의 생리 식염수]를 및 나머지 다른 1개군에는 용매만을 각각 24시간마다 0.1㎖씩 4회 피하 주사한다. 4번째 주사하고 4시간 경과후 각각의 군의 생쥐에 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)46(Tohoku 대학교 약학대학의 미생물 실험실내에서 제공)을 1.0×107CFU /생쥐로 정맥 주사하여 감염시킨다. 인체 G-CSF의 감염 방어 효과는 감염후 12일째 되는 날에 살아 있는 생쥐의 수를 세어서 조사한다.
세포 현탁액의 제조
리스테리아 모노시토게네스 46을 브레인 하트, 인퓨젼(Heart Infusion)액체배지(Difco사의 상품명)중에서 37℃에서 진탕하며 하룻밤동안 배양한다. 배양액을 생리식염수에 현탁시킨다.
결과
i) 실시예 16에서 얻은 이. 콜리(E. coli)G-CSF(+VES) 폴리펩티드에 대하여 시험 1, 2 및 3을 수행한 결과를 표 12, 13 및 14에 나탄낸다.
[표 12]
[표 13]
[표 14]
ii)실시예 20에서 얻은 이. 콜리(E. coli)G-CSF(-VES) 폴리펩티드에 대하여 시혐 1을 수행한 결과를 표 15에 나탄낸다.
[표 15]
iii)실시예 27의 아미노산 조성분석에 사용한 것과 동일한 CHO 세포 유래의 정제 인체 G-CSF 시료 (+VES)에 대하여 상기 시험 1을 수행한 결과를 표 16에 나탄낸다.
[표 16]
실시예 27의 아미노산 조성 분석에 사용한 것과 동일한 C127 세포 유래의 정제 인체 G-CSF 시료를 사용하여 상기 시험 1의 감염방어 효과를 조사한 경우도 대략 동일한 결과가 얻어진다.
iv)실시예 33의 아미노산 조성분석에 사용한 것과 동일한 CHO 세포 유래의 정제 인체 G-CSF 시료 (-VES)에 대하여 상기 시험 1을 수행한 결과를 표 17에 나탄낸다.
[표 17]
실시예 33의 아미노산 조성분석에 사용한 것과 동일한 C127 세포 유래의 정제 인체 G-CSF 시료를 사용하여 상기 시험 1의 감염방어 효과를 조사한 경우도 대략 동일한 결과가 얻어진다.
Claims (2)
- 하기의 아미노산 서열을 코오딩하는 염기서열을 갖는 cDNA 단편을 함유한 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 배양하고 이어서 생산된 인체 과립성 콜로니 자극인자활성을 갖는 단백질을 분리하는 것을 특징으로 하는 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자활성을 갖는 단백질의 제조방법.(여기서 m은 0 또는 1이다).
- 제1항에 있어서, 아미노산 서열을 코오딩하는 염기서열이 하기의 염기 서열인 것을 특징으로 하는 제조방법.(위에서 m은 0 도는 1이다.)
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