JPS63299A - ヒトｇ−ｃｓｆタンパク質の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般にリンフ才力イン、特にヒト造血前駆細胞
の分化および増殖を誘発する成長因子に関する。

（従来の技術） ヒト血液細胞は骨髄で生産される多分化能性造血幹細胞
から誘導される。これらの幹細胞は赤血球、多形核顆粒
球、単球、Ｂおよび７’　＋７ンパ球および血小板のた
めの前＠細胞を提供する。分葉核および擬プラスミック
顆粒（ｐｓｅｕｄｏ−ｐｌａｓｍｉｃσｒａｔｓｓｌ　
ｇ　）によって特徴づげられる多形核顆粒球は好中球、
好酸球および好塩基球に分化する。単球およびリンパ球
は特別の経路に沿って分化し、代表的な組織マクロファ
ージと区別できないマクロファージに変化する。

造血細胞の分化および増殖はコロニー刺激因子（ＣＳＦ
）と集合的に呼ばれる分泌糖タンパク質により調節され
る。ネズミおよびヒトの系では、これらのタンパク質は
正常骨髄からの顆粒球とマクロファージの生産を促進し
且つ分化した成熟顆粒球およびマクロファージの活性を
調節すると考えられる顆粒球−マクロファージコロニー
刺激因子ＣＧＭ−ＣＳＦ）を言む。その他のＣ５ＦＶＣ
はマクロファージの選択的増殖を誘発するマクロファー
ジＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦまたはＣＳＦ−１）、および赤血
球前駆細胞のヘモグロビン含有細胞への発生を誘導する
バースト・プロモーティング・アクティビティ（δｕｒ
ｓｔｐｒｏｍｏｔｉ−ｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　；ＢＰ
Ａ）が富まれる。ＩＬ−３またはマルチ−ＣＥＦのよう
ないろいろの名称で知られる別のネズミＣＳＦは、造血
系統の多数の細胞型の発生を刺激する。

ネズミ１Ｌ−３のテナガザルおよびヒト同族体はヤン（
Ｙａｔｓｇ）らのＣａ１ｌ　４７：３（１９８６）によ
って報告された。

顎粒球−丑異的コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＥＦ）は多能
性造血幹細胞からの顆粒球前駆細胞の分化および増殖を
誘発する。唾乳動物にＧ−ＣＳＦを投与すると、Ｇ−Ｃ
ＳＦは循環性顆粒球集団の劇的な増力Ｕをもたらす。

ネズミおよびヒト顆粒法コロニー刺激因子に単離され、
部分的に性状決定がなされた。初めに、ネズミＧ−ＣＳ
Ｆがニコラ（ＮｉｅｏＬａ）らのＪ。

されるごとく、エンドトキシン刺激マウス肺調整培地か
ら精製された。このネズミタンパク質はＷＥＨＩ−３Ｂ
ネズミ骨骨髄法白血病細胞株の最終分化を誘導し、そし
て半固体寒天中の好中球コロニーを刺激した。低濃度に
おいて、ネズミＧ−ＣＳＦｎ主として顆粒球コロニー前
駆体を刺激し、高濃匿では顆粒球／マクロファージ混合
コロニーの形成を刺激した。ネズ−，Ｇ−ＣＳＦをコー
ドするｃＤＮＡの単離および塩基配列決定はツチャ（Ｔ
ｓｌＬｅｈｉｙａ）らのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８３ニア６３３（１９８６）に報告さ
れた。

ウエルテ（Ｗａｌｔｚ）らのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
、ａｄ、Ｓｔｉ。

ＵＳＡ　　　８２：１５２６（１９８３）はヒト膀胱癌
細胞株ＨＥＴ５６３７の上清中に見出されたＣＳＦの部
分桔製および予備性状決定を報告した。”多分化能性造
血コロニー刺激因子”と命名されたこの因子は、ヒトの
混合コロニー＜ｍａ球−−＝ｒり。

ファージフロ＝−）および初期赤血球コロ）カ増殖を支
持した。このＣＳＦはまたＷＥＨｌ　−３Ｂ細胞株の最
終分化をａ導した。見掛分子量は約１８．０００である
と報告された。

ノムラ（Ｎｏｍｕｒａ　）らのＥ　Ｍ　Ｅ　ＯＪｏｗｒ
？Ｓａｌ　５　：８７１（１９８６）は顆粒球系列−特
異的ｃｓＦを構成的に産生ずるヒドロ肺癌細胞株（ｃＨ
Ｕ−２）を樹立した。この１９，０００ダルトンタンパ
ク質はネズミａ−ｃｓｐと極めてよく一致する検定プロ
フィールを示した。ナガタ（Ｎａｇａｔａ）うのＮａｔ
ｕｒｅ　３１９：４１５（１９８６）ｉ３個のアミノ酸
から成る挿入物に関して相違するＣＨＵ−２Ｇ−ＣＳＦ
タンパク賞のための２つのｃＤＮＡｆ単離した。呵乳＠
物のｃｏｓ細胞内で発現させたとき、両方のｃＤＮＡと
もＧ−ＣＳＦ活性全示すタンパク質をもたらした。これ
らのｃＤＮＡおよびゲノムＧ−ＣＳＦクローンの塩基配
列決定は、３個のアミノ酸から成る挿入物を含む配列が
他方のｍ　ＲＮ　Ａのスプライス生産物であることを示
唆した。

挿入物を含まないタンパク質は生物学的活性がより大き
かった。

（１９８６）はＨＢＴ５６３７細胞上清からＧ−ＣＳＦ
を精製し、そして３個のコドンかも成る挿入物を欠（Ｃ
ＨＵ−２０−ＣＳＦクローンに相同な塩基配列をもつｃ
　Ｄ　Ｎ　ＡをＨＢＴ５６３７ライブラリーから単離し
た。スープらはＨＢＴ５６３７　　Ｇ−ＣＳＦ配列を大
腸菌（Ｅｓｅｈａｒｉｃｈｉａ　ｃｏｎ　）にクローニ
ングし、発現させて活性タンパク質を得た。

顆粒球前駆細胞の刺激剤としての臨床上の利用可能性ゆ
えに、Ｇ−（、；Ｆは血液学および腫瘍学の分野で相当
に興味がもたれている。Ｇ−ＣＳＦ活性をもつ治療用組
成物は、感染性病原体に対する免疫応答を増強するため
に、あるいは放射線や化学療法に起因する造血細胞の抑
制の後で正常血液細胞集団の再生を助けるために、使用
することができるだろう。また、Ｇ−ＣＳＦは造血系統
のめる種の腫瘍細胞を分１ときぞる筋力をもつので、あ
め種の白血病の治療に利用できるかも仰れない。本発明
は酵母細胞から高収量で発現および分泌される新規な突
然変異Ｇ−ＣＳＦタンパク簀に関する。

（発明の概要） 本発明は均一なタンパク質として精製されたヒト顆粒球
コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）、細胞培養からのそ
の生産方法゛、および五Ｇ−ＣＳＦをコードするｃ　Ｄ
　／Ｖ　Ａを提供する。関連した面において、本発明は
Ａ／Ｔに富む３′コード領域および／または不活性化さ
れた酵母ＫＥＸ２　プロテアーゼプロセッシング部位を
もつヒトＧ−ＣＳＦ（ｈＧ−（、；Ｆ）突然変異タンパ
ク質に関する。これらの突然変異タンパク質は酵母およ
び細胞の発現系において非常に高収率で発現される。本
発明は１だその突然変異タンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を含有する組換え発現ベクター、前記の組換
え発現ベクターにより形質転換された適当な宿主生物か
ら成る関連した微生物発現系、およびその微生物発現系
を使用することによる突然変異タンパク質の生産方法に
関する。

（発明の構成） 粗製ｈＧ−ＣＳＦＦｉ初めに造血成長因子を生産する悪
性腫瘍細胞を、各種の添加物を補光した血清含有培地中
でｉ％ｖｉｔデ０培養することによりつくられる。調整
培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏ％ｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）は最初
に細胞を培地全面に生育さぞ、次いで血清を含む新鮮な
培地と置き換えるためにその培地を細胞から取り出すこ
とにより、その細胞から調製する。

適当な培養期間後、培地を収穫して造血成長因子をより
濃縮された形に精製するために処理する。

粗製の造血成長因子を生産する際（（、例えば癌、肉腫
、リンパ腫、白血病、黒色腫および骨髄腫細胞株のよう
な種々の悪性腫瘍細胞株を含めた多種多様の細胞および
細胞株が使用される。１つのこのような細胞株の例は米
国２０８５２メリーランド州ロツクビル、パークローン
・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）からを託番号Ｈ
ＴＢ−９として入手しつるヒト膀胱癌細胞株ＨＢＴ５６
３７である。

粗製ｈＧ−ＣＳＦを生産するのに適した培地はロスフェ
ル・パーク・メモリアル・インスティチュート（ＲＰＡ
ｆ７）−１６００培地、ダルベツコの修飾イーグル培地
（ＤＭＥＭ）およびクリック培地のような市販されてい
る培地である。抗生物質のペニシリン、ストレフトマイ
シンおよびゲンタマイシンのような添加物全培地に加え
ることができる。

添加物にはＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチ
ルピペラジン−Ｎ−２−エタン−スルボン酸）のような
種々の緩衝液も含１れる。さらに、Ｌ−グルタミン、Ｎ
ａＨＣＯ，，２−メルカプトエタノールおよび各種の血
清（例えばワン胎児血清（ＦＣ３）またに正常ヒト血清
）も添加物に含壕れる。好１シクに、培養物Ｆ１ｐＨ７
，０〜７．４で空気中５〜１０％ＣＯ２の湿った雰囲気
中３５〜３８°Ｃに維持する。

各種の検定法を用いて顆粒球−特異的造血成長因子を検
出する。本明細書で“骨髄検定”と名づけだ第１の検定
は、ヒトまたはネズミの両方の源から採取した骨髄細胞
の増殖を誘発する試料の能力を測定するものである。誘
発コロニー中に存在する細胞型全視覚化するために細胞
を染色する。

ｈＧ−ＣＳＦはヒトおよびネズミの両方の骨髄からの成
熟顆粒球および好中球の形成全誘発する。

第２の検定は３２Ｄ細胞、ＦＤＣ−Ｐ２細胞、ＦＤＣ−
Ｐ１細胞およびＦＤＣ−Ｐ２−１ｄ細胞（これらの細胞
はすべて広く入手可能である）のよっなＩＬ−３依存性
細胞の増殖をひき起こす試料のカ 肖瞭ついて測定する。３２Ｄ細胞はグリーンバーガー（
Ｇｒｅｅ？ｌｂｕｒｇｇｒ　）らのＦｅｄ、Ｐｒｏｃ、
　　４２　：２７６２（１９８３）に記載されるように
、レトロワイルスに感染したＣ　３　Ｈ−ＨｅＪマウス
骨髄培養物から誘導される。ｈＧ−ＣＳＦはＩＬ−３依
存件細胞増殖検定においてポジティブであり、この因子
の活性が顆粒球やマクロファージのみに制限畑れないこ
とを示す。

顆粒球−特異的ＣＳＦのための第３の検定は、白血病細
胞を成熟白血球へ分化させる試料の能力について測定す
る。この目的のための細胞株の例にはネズミ骨髄単球Ｗ
ＥＨＩ−３（ＡＴＣＣＴＩＢ−６８）細胞、およびヒト
赤白皇居ＫＧ１由来のヒト骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０
が言まれる。本発明特有のこの検定法はＷＥＨＩ−３Ｂ
　　Ｄ子細胞を用いて実施された。ニコラ（Ｎｉｃｏｌ
ａ）およびメットカーフ（Ｍａｔｃ（Ｌげ）のＪ、Ｃｇ
Ｌｌ、Ｐｈｙｓ、　１０９　：２５３（１９８１）はＷ
ＥＨＩ−３Ｅ　　Ｄ＋子細胞使用してＧ−ＣＳＦの存在
を検出することについて開示している。

ＨＢＴ５６３７オたに他の適当な細胞の上清中に生産さ
れた粗ｍｈＧ−ＣＳＦは、初めに硫酸アンモニウム沈降
法により、統いてゲルカラムクロマトグラフィーによジ
、その後多重ＨＰＬＣ法によシ精製される。精製の経過
はゲル電気泳動、その後の銀染色法により監視すること
ができる。

好適なゲル濾過媒体にはアガロース、セファデックス、
ポリアクリルアミド（例えぼバイオ−ゲル）、またはＡ
ｃＡ−４４ウルトロゲルやＡｃＡ−５４ウルトロゲルの
ような前記のものの混合物が含まれる。ＡｃＡ−５４’
フルトロゲルが最適である。粗製培養上清から誘導され
たｈＧ−ＣＳＦは、１５．ｆＪＯＯ〜３０．０００ダル
トンの分子ｉ範囲でゲル濾過カラムから溶離された。

ｈＧ−ＣＳＦ活性を示すゲル濾過両分は分離用ＨＰＬＣ
法（好１しくに少なくとも１５〜２０ミクロンの孔サイ
ズをもつオクタデシル結合シリカ逆相カラムを使用）の
ためにプールする。このようなカラムにはウォーターズ
・アソシエーツ社（米国メイン州ミルフォード）から市
販されているカラムのラジオパック（Ｒａｄｉｏｐａｋ
）およびポランル（Ｐａｒａｓｉｌ　）系列が言まれる
。造血成長因子をカラムに加える前に、両分を希釈し、
またトリフルオロ＋６１ＣＴＦＡ）、ヘプタフルオロ酪
酸（ＨＦＢＡ）”！たけ酢酸からなる緩衝欣でカラムを
平衡化する。んＧ−ＣＳＦは、ＴＦＡ％ＨＦＢＡまたは
酢酸中のアセトニトリル′ｉたはＮ−プロパツール緩衝
溶液の直線状勾配を用いてＲＰ−ＨＰＬＣカラムから溶
離される。溶離斧１としてアセトニトリルを便用する場
合、好適な勾配ＦｉＴＦＡｒＰＯ〜１００　（Ｖｖ）％
のアセトニトリルであり、１分当たシ約１％アセトニト
リルの割合でカラムに加えられる。溶離剤がＮ−プロパ
ツールである場合、好適な勾配は０．９Ｍ酢酸および０
．２Ｍビピリジン中０（’／ｖ）％ｎ−プロパツール（
ｐＨ４，ｏ）である。この緩衝溶離剤の好適な勾配範囲
はＯ〜１００チであるが、好ましくは０〜８４％である
。

最初のＨＰＬＣ法で十分なタンパク質精製が達成されな
いときには、類似のまたは異なる溶離緩衝液を用いてそ
れを繰り返すことができる。以下で詳述するように、Ｃ
１４Ｍ合相お１び水性ＴＦＡでの溶離を使用する単−Ｈ
ＰＬＣ工程は、ゲル電気泳動で特定タンパク質の単一バ
ンドを提供するのに十分なほど精製されたｈＧ−ＣＳＦ
を細胞培地から分離しなかった。しかし、同じカラムを
使用するがＮ−プロパツール／酢酸／ピリジン溶離液で
溶離する第２ＨＰＬＣ処理後に、約１９，０００ダルト
／の鮮明なバンドが回収され、これは造血成長因子活性
に一致した。

均一性を達成するために、第３のＨＰＬＣ工程ＶｉＴＦ
Ａで平衡化したＣ１８カラムを使用し、アセトニトリル
勾配で溶離することによシ行った。

この工程の後に、均一な造血成長因子活性が約１９、Ｏ
ＵＯダルトンの分子量をもつ単一画分に観察された。造
血成長因子（ｈＧ−ＣＥＰ）ｕ３２Ｄ細胞株増殖検足に
おいて約１０６単位／マイクログラムＣＵ／μｆ）の比
活性を有し、またネズミ骨髄コロニー形成検定において
１０６コロニー形成単位／マイクログラム（ＣＦＵ／μ
ｍ）を有することが判明した。

造血成長因子活性は、上記のＨＰＬＣ分画化において使
用した有機緩衝液（ＴＦＡ／アセトニトリル甘たはせリ
ジン／酢酸／プロパツール）中４℃で貯蔵したとき、少
なくとも６ケ月間安定であることが見出された。

均一タンパク質の試料はニンヒドリンまたは気相検出を
利用する目動シークエンサーを使ってアミノ酸の組成お
よび配列について分析した。不発明の造血成長因子のア
ミノ宋端部分の最初の２５残基は次の配列から成る： Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌａ１Ｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
８ａｒ−８ａｒ−Ｌａｗ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｓｇｒ−Ｐ
ｈａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−ＬｇｌＬ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｌｙｓ−１１
ｇ。

天然ヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡセグメントは、
ヒト膀胱帰細胞株ＨＢＴ　５６３　’１（ＡＴＣＣＨＢ
Ｔ−９）から単離したポリＡ十　ＲＮＡの逆転写により
作成されたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ライブラリーから単離され
た。天然ヒトｍＲＮＡ配列のＮ末端、Ｃ末端および３′
非コード領域に相同である配列をもつ合成オリゴヌクレ
オチドプローブを使用して、慣用ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法によりｅＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グし１こ。プローブとハイブリダイズしたこれらのクロ
ーンからＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼ切断
、アガロースゲル電気泳動、および電気泳動にかげたフ
ラグメン）を用いる追加のノ１イプリダイゼーション実
験（″サザンプロット法”）により分析した。

各プローブとハイブリダイズした単一クローンを単離し
１こ後、ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子を保有するノ・イブリッド
形成性セグメントをサブクローニングし、慣用技法によ
シ塩基配列を決定し１こ。成熟ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸
４３〜１７４をコードするこのフラグメントの一部を同
定し、特定の制限エンドヌクレアーゼを用いてこの７ラ
グメントの残部から切断した。このＤＮＡセグメントは
３コドン欠失および追加の内部制限部位を含む合成Ｎ末
端配列に連結した。その後、その構築物を部位特異的突
然変異誘発により、Ａ　ｒ　ｙ　２２を定めるコドン（
ＡＧＡ）がＬｙｓを定めるコドン（ＡＡＡ）によって置
き換えられた突然変異類似体配列に改変した。

次いで、突然変異または改変配列は特定のプロモーター
の制御下で酵母発現ベクター内に挿入した。このベクタ
ーを使用して適当な酵母発現菌株を形質転換し、それを
酵母プロモーターの抑制解除を促進する条件下で培養し
た。得られた酵母−調整培養上清を検定して五Ｇ　−Ｃ
Ｓ　Ｆ　（Ｌｙｓ”〕の増大した発現を確かめた。

７義 ”ヒト顆粒球コロニー刺激因子”および”　ｈＧ−ＣＳ
Ｆ′は、多能性造血細胞からの顆粒球前駆細胞の発生を
選択的に誘導するヒト内因性分泌タンパク質を意味する
。

６突然変異アミノ酸配列”は天然配列と異なる意図的に
作られたヌクレオチド配列によってコードされるポリペ
プチドを意味する。”突然変異タンパク質”は突然変異
アミノ酸配列から成るタンパク質を意味する。核酸配列
およびアミノ酸配列の両方に関係しうる゛実質的に相同
”とは、特定の対象配列（例えば突然変異配列）が１つ
またはそれ以上の置換、欠失または付加によシ基準配列
と相違し、その作用が最終的に基準配列と対象配列との
間に不利な慎能上の差異をもたらさないことを意味する
。不発明の目的において、８０％以上の相同性、等しい
生物学的比活性および等しい発現特性をもつ配列は実質
的に相同であるとみなされる。より劣った相同性、比較
可能な生物活性および等しい発現特性をもつ配列は均等
であるとみなされる。”天然配列”に遺伝子１１こはタ
ンパク質の野生型もしくは天然型と同一のアミノ酸配列
または核酸配列を意味する。”ＫＥＸ２認識部位”につ
いては以下で定義する。本発明を定義する際に用いる“
不活性化”なる用語は、選ばれたＫＥＸ　２プロテア一
ゼ認識部位を改変してサツカロミセス・セレビシェ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｇｓｃｇｒｇｖｉｓｉａａ　）の
ＫＥＸ　２プロテアーゼによる切断を遅らせるか又は妨
げることを意味する。

本明細書で用いる１組換え”とはタンパク質が組換え微
生物（例えば細菌や真菌）発現系から誘導されることを
意味する。“粗製培養上清”は濃縮または精製工程に付
されていない酵母培養物もしくは細菌培養物から取り出
された培地を意味する。

”ＤＮＡセグメント”は実質的に純粋な形で、すなわち
そのセグメントおよびその成分ヌクレオチド配列の同定
、操作および回収を標準生化学的方法（例えばクローニ
ングベクターを使用）により可能にする量または＃夏で
、少なくとも１度単離されたＤＮＡから誘導された別々
のフラグメントの形の、またはより大きいＤＮＡ構築物
の構成成分としての、ＤＮＡポリマーを意味する。”ヌ
クレオチド配列”はデオキシリボヌクレオチドのヘテロ
ポリマーを意味する。１組換え発現ベクター”は（１）
遺伝子発現において調節役割をもつ１つまたはそれ以上
の遺伝子要素（例えばプロモーターまたげエンハンサ−
）；および（２１ｒｎＲＮＡに転写され且つタンパク質
に翻訳される構造配列もしくはコード配列：の集成体か
ら成る転写単位を含むプラスミドを意味する。好ましく
は、転写単位は翻訳されたタンパク質の宿主細胞による
細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。“組換え
発現系”は発現ベクターと適当な宿主微生物の組合ぞを
意味する。

ｈＧ−ＣＳＦ生物学的活性の検定 ｈＧ−ＣＳＦの生物学的活性を測定するために使用した
検定法を以下に説明する。

１、　ヒトおよびネズミ骨髄コロニー検定この検定では
、５０μを試料をＬｏｇ−２希釈系列で適当なウェルに
加える。１４％寒天懸濁Ｑは沸騰水浴中で加熱すること
により調製し、使用に先立って４０℃に保つ。インキュ
ベーション培地は７部の栄養培地〔ビタミン類、２８５
％ウシ胎児血清（ｐＢｓ）、０．７　Ｘ　１０４Ｍ２−
メルカプトエタノール、０．１２ｍｃｌ／ｍｌアスパラ
ギン、Ｑ、７ｍｑ／ｍｌグルタミン、１５０　Ｕ／ｍｌ
ペニシリンＧおよび１５　ＵＵ／ｍｌストレフ０トマイ
シンヲ補光したα−最少必須培地（αＭＥＭ）〕と３部
の寒天懸濁液を混合することにより調製し、その後３７
℃に１つ。パーコール（Ｐａｒｃｏｌｌ　）で処理した
骨髄細胞を３７℃に温め、インキュベーション培地に加
えて最終′Ｕ＃度を約ｌＸｌ０’細胞／ｍｌとする。得
られた混合物は３７℃に保ちながら２５０μｔアリコー
トｔ−各ウェルに分配するプレートｉ寒天が固化する筐
で２３°Ｃに保持し、その後乾燥しないように蒸留水を
含むプラスチック箱の中で３７℃でインキュベーション
すル。

５０個またはそれ以上の細胞をもつコロ＝−ｅ７日目、
またに１００日目よび１４４日目カウントする。初期の
カウントは顆粒球コロニーのために適しており、−万後
期のカウントｉマクロファージおよび混合コロニーのた
めに適している。各検定において、いくつかのウェルは
バックグラウンドコロニー計数埴を得るために造血成長
因子の試料を含まない。コロニー形成単位／ミリリット
ル（ＣＦＵ／ｍｌ　）で表されるｈＧ−ＣＳＦ活性は、
ｌＸ１０５骨髄細胞によって形成された最大コロニーの
イを与える試料希釈に、最大の場合の半分において観察
されたコロニーの数を乗じたものと定義される。

コロニー中の細胞型は、０６％才ルセインおよび６０％
酢酸から成る染料で個々の細胞を染色することにより決
足される。ｈＧ−ＣＳＦ試料はまた上記方法と実質的に
類似した方法でネズミ骨髄細胞を用いることにより検定
できる。ネズミの検定では、ＦＥＥＯ代わりにウマ血清
を使用し、骨髄細胞をインキュベーション培地１　ｍｌ
当たり５ｘ１０’細胞の濃度でまき、そして４日目また
は５日目および７日目にコロニーをカウントする。

２、ＷＥＨ１分化検定 この検定ではネズミ骨髄単球白血病細胞株ＷＥＨＩ−３
Ｄ　　Ｄ＋の最終分化を誘導する試料の能力について測
定する。この細胞株は研究者の間に広く行き渡っており
、イムネックス・コーポレーション（９８１０１ワシン
トン州ジートル、５１ユニバーシティストリート；　１
ｍｍ％％ａｘ　Ｃｏｒｐｏｒａ−ｔｉｏｎ　）を富めた
多数の源から入手可能である。

ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の存在下
で、ＷＥＨＩ−３Ｂ　　Ｄ子細胞（ＤｈＧ−ＣＳＦ誘導
分化から生じる顆粒球はニトロ−ブルーテトラゾリウム
（ＮＥ　Ｔ　）を細胞内で黄色から宵色に変える。

ＷＥＨＩ−３Ｂ　　Ｄ子細胞は１５％ＦＢＳ、２Ｘ１０
−’Ｍ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ＴＦＬｌペ
ニシリン、５０μ２〜ストレプトマイシンおよび３００
　ｐｆ／ｍｌ新鮮Ｌ−グルタミンを補光したα−ＨＥＭ
（完全α−ＨＥＭ）甲で培養下に保持し、３〜４日おき
に継代培養する。細胞をカウントして、組織培養フラス
コ内の培地２５〜５９ｍ／中に約ｌＸｌ０”細胞／成の
密度でまく。細胞は１５％ＦＢＳ甲で１〜２日ごとに倍
刃口する。

この検定では５０　ｐｆの完全α−ＨＥＭを９６−ウェ
ルプレートの各９エル内に分配する。

２通りの２倍系列希釈の各試料を調製し、そして６０μ
ｔのＷＥＨＩ−３Ｂ　Ｄ十細胞忠濁液（ｌｘ１０５細胞
／ｒｕｌ）を各ウェルに加える。プレートに高湿度にお
いて７％０２．１０％ｃｏ２の存在下３７℃でインキュ
ベーションする。７２時間後、新鮮なＮ　Ｂ　Ｔ　−Ｐ
　Ｍ　Ａ　ｆｄ液（ＰＢＳ中２　ｍｑ　／　＋＋＋ｅＮ
ＢＴおよび４０μりβＩＰＭＡ　）　１０μｔを２通り
の列の第１列に分配し、そしてＮＥＴ（ＰＢｊＪ中２■
／ｍｊ）Ｉｏｏμｔを第２列に分配する。３７°Ｃでさ
らに１〜２時間後、インプロパツール中４０ｍＭ　ＨＣ
Ｌ　　２５μを全容ウェルに刃口える。その後、５７０
　ｓＭで吸光度を測定する。染料の変色は存在する顆粒
球の数に比例し、これはまたｈＧ−ＣＳＦ活性に比例す
る。試料の活性単位は最大ＮＥＴ変化のイを与える希釈
の逆数に等しい。

３．３２Ｄ細胞１’ｌ殖検定 この検定ではレトロウィルス感染Ｃ３Ｈ−ＨｇＪマウス
骨髄細胞から誘導される３２ＤＭ胞の増殖を誘発する試
料の能力について確かめる。３２Ｄ細胞は広く研究者の
間に行き渡っており、イムネツクス・コーポレーション
を含めた多くの源から入手可能である。

３２Ｄ細胞は一般にクマ血清（５〜２ｏｖ／４％入ペニ
シリンＣ３０Ｕ／ｍｅ）、ストレフトマイシン（５０１
１ＷＡｎｔ　）、新鮮なＬ−グＩＬＩＩミニ／（３００
μｇ／ｍｌ　）および２−メルカプトエタノール（２５
Ｘｌｆ）’Ｍ）を補光１．ｒｓＲＰＭＩ　−１６４０培
地中でＷＥＨＩ−３細胞（１〜５Ｘ１０’細胞／ｍｌ）
を４８時間培養することにより調製された５（ｖ／ｖ）
％ＷＥＨＩ−３調整培地を含むＲＰＭＩ−１６４０中で
培養する。細胞に２〜３日おきに継代培養する。

細胞をカウントし、培養フラスコ内の培地２５〜５０ｍ
／！中に約１〜４　Ｘ　１０’細胞／　ｍｌ”Ｃ”’１
　＜。細胞は比較的一定の成長速度で１２〜２４時間ご
とに倍加し、全気宇５％ＣＯ２の湿った雰囲気中で３５
〜３８℃に保つ。ｈＧ−ＣＳＦ活件を検定するために、
３２Ｄ細胞は２　Ｕ　０１１ｔの容量で９６−ウェル平
底マイクロタイタープレート（２Ｘ１０’細胞／ウエル
）に、試験すべき２倍希釈系列の試料と共に加÷、その
移卆ダ巾ｑ蛎Ｃｎ−の掘っチー９曲句中３７℃で２４〜
４８時間インキュベー・／ヨンする。細胞ｉ４０．５μ
Ｃｉ　　のトリチウム化チミジ／（’Ｈ−Ｔｄｒ　、　
　マサチューセッツ州ボストン、ニューイングランドヌ
クレアー社、比活性２０Ｃｉ１ｍＭ）で約１６時間パル
ス標識し、ガラス線維製フィルターストリップ上に収穫
し、液体シンチレーションカウンターで計数する。ｈＧ
−ＣＳＦと共にインキュベーションした３２Ｄ細胞は用
量に依存して放射性標識を取り込む。造血成長因子の不
在下で培養した３２Ｄ細胞はバンクグラウンドレベルの
”Ｈ−Ｔｄｒのみを取り込む。活性単位は最大チミジン
取り込みの５０％を与える試料希釈の逆数として計算さ
れる。

ｈＧ−Ｃ’；Ｆ天然配列 下記のごとく単離したｈＧ−ＣＳＦ遺伝子を含むＤＮＡ
セグメントのヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸
配列は第１図に示す。第１図において、ヌクレオチドは
成熟天然タンパク質のＮ木端トレオニンに対応するＡＣ
Ｃコドンがも始まって順に番号が付けられる。同様に、
アミノ酸残基もこのトレオニン残基かも番号付けされる
。天然ポリペプチドは分泌の際に切断されて成熟タンバ
ク質を与えるリーダー配列を含む。天然タンパク質は２
２位にＡｒｇ−Ｌｙａ対を有し、これはＳ、セレビ三の
ＫＥＸ２プロテアーゼによる切断を受けやすい。

本発明によれば、部位特異的突然変異誘発法を便用し、
Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ　　’ｔたはＬｙｓ−
Ａｒｇ　　対全改変してこれらの隣接塩基性残基の存在
を排除するためにアミノ酸残基の欠失、付加または置換
を行うことにより、ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシン
グ部位を不活性化することができる。Ｌｙ　ｓ　−Ｌｙ
　ｓ対はＫＥＸ２切断に対して相当に不感受性であり、
Ａｒｇ−ＬｙｓｌｒＬｎＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｔｔ−Ｌ
ｙｓへの転化にＫＥＸ２部位を不活性化するための好適
な保存的方法である。得られる突然変異タンパク質は分
泌の際に切断される予定の酵母α因子リーダー配列以外
の位置においてＫＥＸ２プロテアーゼによる切断を受け
にくくなった。

天然ｈＧ−ＣＳＦ配列はまた残基１４６−１４７にＡｒ
ｇ−Ａｒｇ対を有する。このＫＥＸ２部位が不活性化さ
れた突然変異タンパク質も本発明の範囲内に含まれる。

第１図はさらに天然ｈＧ−ＣＥＦ遺伝子のＣ末端フラグ
メントにスプライシングされて好適な突然変異ヌクレオ
チド配列を与えるヌクレオチド１−１４５の合成配列を
表している。この合成配列はデオキシアデノシンとデオ
キシチミジン残基の割合が３６％〜５７％増加している
Ａ／Ｔに富むＮ末端領域”によって天然配列と相違し、
これにより大腸菌内での効率のよい発現をうながす。本
発明の１つの実施態様において、この突然変異配列は酵
母α因子リーダー配列に、場合によジペプチドＡｓｐ−
Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌ
ｙａ（ＤＹＫＤＤＤＫ）をコードするヌクレオチドから
成るＮ床端融合構築物を介して結合される。

上記配列は扁度に抗原性であり、特異的モノクローナル
抗体によって可逆的に結合されるエピトープを与える。

この配列はまたＡｓｐ−Ｌｙａ対のすぐあとの残基にお
いてウシ粘膜性エンテロキナーゼによｔ）特異的に切断
される。このペプチドによりキャッピングされた融合タ
ンパク質は１だ分泌前の細胞内分解に対して抵抗性を示
す。

本発明の突然変異タンパク質およびヌクレオチド配列の
特徴は、残基２２および２３の天然Ａｒｇ−Ｌｙｓ対を
ＫＥＸ２プロテアーゼ切断に不感受性の配列に転化した
ことにある。しかしながら、追加ノ有用な制限部位を含
むオリゴヌクレオチドカセットと共に、第１図に示すヌ
クレオチド配列の全部またに一部を含む多数のＤＮＡ構
築物が便宜上つくられる。このような構築物を含む発現
ベクターおよび発現系、ならびにこのような系によって
生産されるｈＧ−ＣＳＦ突然変異タンパク質は本発明の
範囲内に含まれる。

突然変異配列は天然配列のフラグメントへの連結を可能
にする制限部位を両側に有する突然変異配列含有オリゴ
ヌクレオチドを合成することにより、特定ｇ、置に導入
することができる。連結後に得られる再構築配列は所望
アミノ酸の挿入、ＵＳまたは欠失をもつ突然変異タンパ
ク質ｔコードする。

別法として、オリゴヌクレオチドにより指定され１こ部
位特異的突然変異誘発法を使用して、置換、欠失１には
挿入により改変された特定コドンをもつ変異遺伝子を提
供することができる。ワルダー（Ｗａｌｄｅｒ）らのＧ
ａｎｇ　　４２　：　１３３　（１９８６）；バウアー
（Ｂｔｚｕｅｒ　）らのＧａｎｇ　３７　ニア３（１９
８５）；クレイク（Ｃ１ａｉｌｔ）のＢｉｏｔｇｃｈｎ
ｉｑｕｇｓ　＋　１９８５年１月、１２−１９；スミス
（Ｓｍｉｔｈ）らのＧｓｎｅｔｉｅ　Ｉ：ｎｇｉｎｅｓ
ｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｅｉｐｌｇｓ　　αｎｄｋｆｅｔｈ
ｏｄｓ（プレナムプレス、１９８１）；および米国特許
第４５１８５８４号に適当な技法を開示しており、これ
らの文献は参照によりここに引用される。

どちらの方法においても、慣用のオリゴヌクレオチド合
成法、例えばノード（５ｏｏｄ）らのＮｕ　ｃｌ　。

Ａｃ１ｄ　Ｒｇｓユニ２５５７（１９７７）およびヒロ
（１９７８）に記載されたトリエステル合成法が適して
いる。

部位特異的突然変異誘発では、改変すべき遺伝子鎖をＡ
ｆ１３−重鎖ファージまたは他の適当なベクターにクロ
ーニングして、改変すべき遺伝子に対応するセンス鎖も
しくはアンチセンス鎖から成る一本鎖（ｍｓ）ＤＮＡ　
　を得る。次いで、このＤＮＡに改変すべきコドンのま
わりの配列に相補的であるが、置換が行われる予定の位
置に新しいアミノ酸全特定するコドン（またばこの種の
コドンに相補的なアンチセンスコドン〕を含むオリゴヌ
クレオチドプライマーにハイブリダイズする。欠失が望
壕れる場合には、プライマーに正しい読み枠を保持しつ
つ、欠失すべきアミノ酸全特定するコドンを言壕ないで
あろう。挿入が望″１′ｒＬる場合に、プライマーは挿
入すべきアミノ酸を特定する新しいコドンをその配列の
適当な位置に含むであろう。

好ましくは、置換コドン、欠失コドンまたは挿入コドン
がオリゴヌクレオチドの中央あるいに中央付近に存在す
る。

使用するオリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突
然変異部位での安定かつ特異なノ・イブリダイゼ＝ジョ
ンを最適化する必要性により決定され、そして５′およ
び３′延長部分はエキソヌクレアーゼによる突然変異の
修正を避けるのに十分な長さである。こうして、本発明
により使用されるオリゴヌクレオチドは一般に約１５〜
約２５個の塩基金言°むであろう。これより長いオリゴ
ヌクレオチドに必要ない。

好適な方法（ワルダーらの上記文献参照）では、得られ
たオリゴヌクレオチド／ＳＳペクターノ１イブリッドを
用いて酵母を直接に形質転換する。１１こは、突然変異
誘発性プライマーを、改変すべき遺伝子ヲ官む一本鎖鋳
型セグメントをもつギャップ保有二本鎖に・・イブリダ
イズさぞる。後者の場合は、プライマー”ｆ　Ｄ　ＮＡ
ポリメラーゼＩ（クレノックラグメント）、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼでたに他の適当なりＮＡポリメラーゼとの
反応により鋳型類に沿って伸長して二本鎖ＤＮＡを得、
この二本鎖ＤＮＡを環化して適当な宿主ヲ株をトランス
フェクションするために使用する。両方の場合に、宿主
によるヘテロ二本鎖の複製は両頭の子孫を与える。大腸
菌では、トランスフェクションした細胞を平板培養して
コロニーを形成させ、そして突然変異誘発法で使用した
オリゴヌクレオチドに対応する標識オリゴヌクレオチド
を用いてそのコロニーをスクリーニングする。酵母が直
凄形質転換される場合は、形質転換細胞をプールし、Ｄ
ＮＡを単離し、そのＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換す
る。得られたコロニーはハイブリダイゼーションにより
スクリーニングする。親Ｄ　Ｎ　Ａ　鎖の子孫でになく
突然変異ＤＮＡに優先的にプライマーがハイブリダイズ
する条件が用いられる。その後、突然変異遺伝子を営む
ＤＮＡを単離し、適当な発現ベクターに挿入し、七σ〕
ベクターを用いて宿主菌株を形質転換する。宿主菌株を
培養下に増殖きぞて類似タンパク質を得る。

組換え酵母系によるタンパク質の発現 酵母系は不発明の組換え類似タンパク質（例えばに〇−
ＣＳＦ〔Ｌｙｓ”　〕突然変異タンパク質）の発現に適
している。発現ベクターの１つの例にｐＢｃ１０２・Ｋ
２２（ＡＴＣＣ６７，２５５）であり、このベクターは
大腸菌内での複製および選択のためのｐＢＲ３２２由来
のＤＮＡ配列（Ａｐ遺伝子および複製起点）およびグル
コース抑制性のアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ
２）プロモーターを含む酵母ＤＮＡ配列を有する。ＡＤ
Ｈ２プロモーターはラッセル（Ｒｈｍｓａｌｌ）ものＪ
、Ｂｉｏｌ。

ＣＡｇｍ、２５８：２６７４（１９８２）およびペイア
ー（Ｂａ１ｅｒ　）らのＮａｔｕｒｅ　３００　ニア２
４（１９８２）に記載はれている。プラスミドｐＢＣ１
０２・Ｋ２２ばまた選択マーカーとしてのＴｒｐ１遺伝
子および酵母２μ復製起点を言む。酵母宿主からの異種
タンパク質の分泌を可能にする酵母α因子リーダー配列
にプロモーターに近接している。α因子リーダー配列は
その３′宋端近付にＡｓｐ７１８（Ｋｐｎｌお工びＡｓ
ｐ７１８はアイノシゾマーである）制限部位を含むよう
に修飾され、それによりこの配列の外米性遺伝子および
上記のＤＹＫＤＤＤＤＫ配列への融合を促進する。分ｉ
ｚりンパク質の効果的プロセッシングを行わせるためれ
るごとく、ＧＥ−−Ａｔα−Ｇ１１Ｌ−Ａｌαアミノ酸
をコードする配列を除去した。このプラスミドの作製に
関する細部は以下で述べる。

別の発現ベクターはα因子プロモーターを含む酵母ベク
ターであり、例えば野生型ヒトＧＭ−ｃｓｐ遺伝子を含
むｐ　Ｙ（１ＨｘＧＭ　（ＡＴ　ＣＣ５３１５７）であ
る。その他のものは当分野で習熟した者に知られている
。ｐｙαＨｕＧＭの作製は南アフリカ国特許第８５７６
１０８号に記載されており、その自答は参照によりここ
に引用きれる。

形質転換用に適する酵母菌株の選択は、選択マーカーの
性質およびベクターのその他の特徴に応じて決定される
だろう。ｐＥｃ１０２・Ｋ２２ま１こはｐＹ　ａ　Ｈｗ
　Ｇ　Ｍもしくはこれらのベクターから誘導きれる種々
の構築物による形質転換に適するＳ、セレビシェ菌株に
は米国カリフォルニア州バークレーのイースト・ジエネ
テツク・ストック・センター（Ｙｇαｓｔ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｇａｎｔａｒ：下記参照から入手し
うる菌株Ｘ２１８１−ＩＢ（遺伝子型好適な発現菌株Ｘ
”／２１８１は２樵の半数体菌株、すなわち米国９４７
０２カリフオルニア州バークレー、カリフォルニア大学
生物物理学および医療物理学部、イースト・ジエネテツ
ク・ストック・センターから入手しうるＸ２１８１−Ｉ
Ｂ；および米国９８１０５ワシントン州シアトル、ワシ
ントン大学遺伝学部、またに米国９８１０１ワシントン
州シアトル、ユニバーシティ−ストリート５１、イムネ
ツクスコーポレーション（ＩｍｎｎｔｎｇＺＣｏｒｐｏ
ｒａ百ｏｎ　）から入手しうるＸＶ６１７−１−３Ｂを
接合することによって形成された２倍体である。適当な
形質転換法はヒネン（Ｈｉｎｎｇｎ）らの（１９７８）
に記載されるものであり、０．６７％酵母望素塩基、０
５チカザミノ酸、２％グルコース、１０μｆ／ｍｌアデ
ニンおよび２０μｆ／ｍｌウラシルから成る選択培地を
用いてＴｒｐ＋形質転換細胞について選択する。

ｐＢＣ１０２・Ｋ２２、またはＡＤＨ２もしくはα因子
プロモーターを含む他の構築物を保有する宿主菌株１’
１８０／ｊｆ、Δｔアデニンおよび８０μｔ　７ｍｌウ
ラシルを補充した１％酵母エキス、２％ペプトンおよび
１％グルコースから成る富化培地中で発現のだめに増殖
させる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は培地グルコ
ースの消耗の際に起こる。

ＨＢＴ５６３７付着性ヒト膀胱癌細胞 （ＡＴＣＣＨＴＥ９）を、１０％ＦＣ８を補充したＲＰ
ＭＩ−１６４０培地上で培地全面に増殖さぞた。ひとた
び細胞が全面生育しだら、培地を細胞からデカントし、
そして０．１％ＦＣＳを含む新鮮なＲＰＭＩ−１６４０
培地と置き換えた。次いで、細胞を空気中５％ＣＯ２の
湿潤雰囲気下で約７２時間培養した。その後、培地を収
穫し、２０００Ｘ２で遠心して浮遊細胞や死滅細胞を除
いた。

上記のようにして調製したＨＢＴ５６３７調整培地を初
めに硫酸アンモニウム沈降により濃縮した。培地は固体
の硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら４℃で加え
ることにより８０％飽和へ導イた。硫酸アンモニウムは
約１２時間の長期にわたり添加した。８０％飽和の時点
で、さらに４〜８時間穏やかに撹拌し続け、得られた混
合物を１０．０００　Ｘ　ｆで３０分遠心した。その後
、最終タンパク質沈殿物ｆＰＢｓ（＋）ン酸緩衝化食塩
水１、Ｈ７，２＞中に懸濁し、数倍容景のＰＢＳ（ｐＨ
７，２）に対して４℃で１２〜２４時間透析した。

透析′ｍｍ初物さらに２．５　Ｘ　９０ａｎ　　ＡｃＡ
−５４ウルトロゲル力ラム（１００〜１０キロダルトン
の分画化を有するアクリルアミドーアガロースウルトロ
ゲル、スウェーデン国ブロマ、ＬＫＢ）を用いるゲル濾
過クロマトグラフィーで精製した。試料を装填する前に
、カラムはＰＢＳ緩衝液で平衡化した。両分は２０μ９
／ｍｅのゲンタマイシンを含むＰＢＳによりカラムから
溶離し、生物学的活性について検定した。活性画分は１
５，０００〜３０．０００ダルトンの見掛分子量でカラ
ムから溶離した。

ゲルクロマトグラフィ一工程からの活性画分をプールし
、そして１５〜２０ミクロン粒径のバイブツク（Ｖｙｄ
ａｃ　）　Ｃ４樹脂を装填した８ｍｍＸ１０ロクオータ
ーズ・ラジオパックＨＰＬＣカラム（ウォーターズ・ア
ソシエーツ社）　（０，Ｉ　Ｖ／ｖ％ＴＦＡで平衡化し
たもの）に直接装填した。装填したタンパク質の全量は
一般に約２０〜３００ｍ１の容量巾約４〜４０ｒｎｑで
あった。このカラム全２１４　ｎｍでの吸光度が基底匝
に達するまで０．ＩＶｖ％ＴＦＡで洗い、その後０．１
’／ｖ％ＴＦＡ中０〜１００％直線勾配のアセトニトリ
ルを用いて１弁当たり１％アセトニトリルで溶離した。

１分の画分を果めて生物学的活性について検定した。

活性を示す両分をプールし、１０ｍの緩衝液Ａ（０，９
Ｍ酢酸、０．２Ｍピリジン、ｐＨ４，０）で希釈し、そ
して予め緩衝液Ａで平衡化したラジオパックＩＩ　Ｐ　
Ｌ　Ｃカラムに再度装填した。このカラムを緩衝液Ａで
洗って非結合成分を除き、その後０〜８４％勾配の緩衝
液Ｂ（０，９Ｍ酢酸、０．２　Ｍピリジン、ｐＨ４，０
中６０％　Ｎ−プロパツール）で溶離した。υ〜２０％
緩衝液Ｂの初期勾配は１０分間にわたってカラムに加え
、２０〜８４％緩衝液Ｂの第２勾配は１１０分間にわた
って加えた。カラムは１ａｙ分の流速でポンピングし、
その間に１．５分の画分を集めて検定した。活性画分の
５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は約１９，０ＯＯＡ／Ｗのタンパ
ク質バンドを示した。

活性を示す一分をプールし、０．１　／ｖ％ＴＦＡ水溶
液１０水溶液１沢 水溶液で平衡化したバイダックＣ１８カラム（３．９朋
Ｘ３０ｃｍ，１（Ｊミクロン粒径、ウォーターズ・アノ
シエーツ社）に装填した。この方うムニ０，１％ＴＦＡ
中０〜１００ｙ／Ｖ％直線勾配のアセトニトリルを用い
て１弁当たり１％の制置（全量１００ｍ１　）で溶離し
た。１分の画分を集めて検定した。

活性画分のタンパク質成分の均一性は５ＤＳ−ＰＡＧＥ
および銀染色法によって確かめ、約１９、０００ダルト
ンの単一バンドを得た。この均一物質の比活性は３２Ｄ
検定で約１０６Ｕ／μ２、ネズミおよびヒト骨髄コロニ
ー検定で１０６ｃＦＵ／μ２であると決定された。

前記ＨＰＬＣ工程で精製したタンパク質試料は。

アプライド・バイオシステム・モデル４７０アプローチ
ング・シークエンサーを使用して、自動アミノ末端エド
マン分解法によりアミノ酸配列を決定した。約３１０ピ
コモルのタンパク質を使用する第１の配列決定実験にお
いて、８５チの配列は単一タンパク質に割り当てられた
。その後、約５００ピコモルの物質を使用して、第２の
確認実験を行った。得られたＮ床端配列はＴｈｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｔｒｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｅａｒ−８ａ
ｙ−Ｌａｗ−Ｐｒ。

−Ｇｌｔ−８ｅｒ−Ｐｈａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−
Ａｓｎ−Ｌｅｘ−Ｇ１１Ｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−
ＩＩｇ−Ｌｙｓ−１１ｇであった。

実　施　例　２　：　ｈＧ−ＣＳＦｆコードするｃＤＮ
Ａ−□岬→訃□■― の単離、部位特異的突然変異誘発、および活性突然変異
タンパク質の酵母発現 ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子の３つの選ばれた配列に相補的な
配列をもつＡ，ＢおよびＣと呼ばれる合成オリゴヌクレ
オチドを作製した。リーダーの一部および成熟ＧーＣＳ
Ｆタンパク質の第１アミノ酸（Ｔｈｒ）をコードする配
列に相補的なプローブＡは次の配列：　５’　−ＧＧＴ
ＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＣＡ−３’　を有す
る。成熟タンパク質のアミノ酸３６〜４２をコードする
領域に対応するプローブＢは次の配列：　５　’　−　
ＧＴＡＧＧＴＧＧｃＡＣＡｃＴＣＡＣＴｃＡＣ−　３’
を有する。天然遺伝子の３′非コード領域に相補的なプ
ローブＣは次の配列：　５’−ＡＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴ
ＧＣＡＧＧＧＡＡＧＧ−３’を有する。合成法はソード
（Ｓｏｏｄ）らのＮｘｃｌｇｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｇｓ
．４　：　２　５　５　７（１９７７）およびヒロセ（
Ｈｆｏｓｇ）らのＴｇｔ。

Ｌｇｔｔ．２Ｂ　：　２４４９　（　１　９７８　）に
記載の方法と実質的に類似した標準自動トリエステル法
であった。合成後に、オリゴヌクレオチドは保護基を除
き、分離用ゲル電気泳動により精製した。これらのオリ
ゴヌクレオチドはスクリーニング用プロ−プとして使用
するために、マニアチス（＆ｃＬ−ｎｊα−Ｍａｎｕａ
ｌ）ｓ　コールド・スプリング・ハーバ−研究所　１９
８２に記載されるような標準技法により、”Ｐ−ＡＴＰ
およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して末端に
放射性標識を付けた。

ｃＤＮＡ　　ライブラリーはヒト膀胱癌細胞株ＨＥＴ５
６３７（ＡＴＣＣＨＢＴ−９）から抽出した全ＲＮＡよ
り単離されたポリＡ十ｍＲＮＡの逆転写によって作製し
た。ｃＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖と
なし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平衡末端を作り、
Ｆ：ｃｏＲ■　メチラーゼでメチル化してｃＤＮＡ内の
Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ切断部位を保護し、セしてＥｃ　ｏ　
Ｒｌ　リンカ−に連結した。得られた構築物をＥｃｏＲ
ｌで消化してＣＤ　Ｎ　Ａの各末端のリンカ−の１つの
コピー全部いて全部除去し、そしてバクテリオファージ
λ２ｔ１０のＥｃｏＲ■切断および脱リン酸化したアー
ムに連結した〔フィン（ＨｕｙｎＡ）ものＤＮＡクロー
ニング：実際的方法（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）、グローバー編
集、ＩＲＬプレス、ｐ・、４９〜７８を参照〕。連結Ｄ
ＨＡｌｌ”Ｊ−ファージ粒子の中にパッケージングして
、７５０，０００個の組換え体のライブラリーを作製し
た。１５０，０００個の組換え体を大腸菌株Ｃ６００Ａ
７１″″と平板培養し、そして標識オリゴヌクレオチド
プローブを用いて標準プラークハイプリダイゼーショ７
法によりスクリーニングした。３種のプローブのすべて
と−・イブリダイズする２つのクローンがライブラリー
から単離された。これらのプラークを精製してバクテリ
オファージＤＮＡを作るべく便用した。バクテリオファ
ージＤＮＡはＥ　ｃ　ｏ　Ｒｌで消化し、消化物をアガ
ロースゲル上で電気泳動にかけ、ナイロンフィルター上
ヘブロツテイングし、そして再びハイブリダイゼーショ
ンについて試験した。１つのクローンｆ　Ｅ　ｅ　ｏ　
Ｒ■で部分消化し、分離用アガロースゲル電気泳動にか
け、その後唯−のＥ　ｃ　ｏ　Ｒｒ部位、ＢａｍＨ）部
位および多数の他の特異な制限部位をもつポリリンカー
を含む標準クローニングベクターｐＢＲ３２２のＥ　ｃ
　ｏ　ＲＩ切断誘導体にサブクローニングした。この型
のベクターはプント（Ｄｇｎｔｇ　）らのＮｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｓｓｇａｒｃｈ　１１：１６４５（
１９８３）に開示されている。制限マツピングはヒトＧ
−ＣＳＦについて以前に報告されたものと一致する制限
部位の存在を示した。

Ｋ　ｐ　ｎ　１部位から始まる酵母α因子リーダーペプ
チドのＣ末端５アミノ酸、およびそのα因子リーダー配
列に同じ読み枠で融合されたｈＧ−ＣＳＦのＮ末端４６
アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを合成した。

第２図において、合成Ｎ末端ｈＧ−（ＳＦ配列はフラグ
メントＡとして示てれる。

この配列は内部のＨｉ　ｎ　ｄ　ｍおよびＸ　ｂ　ａ　
１部位に加えて、そのＣ末端のＡνα■部位およびＰｓ
ｔｌ制限部位に対応する接着末端を宮んでいた。このフ
ラグメントは残基３６から始まる内部のＶａｌ−３ａｒ
−Ｇｌｕ配列に対応する３つのコドンを欠き、こうして
ｈＧ−ＣＳＦの＋３型からより活性な一３型に転４１５
（１９８６）を参照されたい。得られた１６１塩基対の
Ｋｐｎｌ　−Ｐｓ　ｔ　Ｔフラグメント（それぞれ約４
０ヌクレオチドの８個のオリゴマーから構築された）は
ＫｐｎｌおよびＰｓｔ（で切断したｐＢＲ３２２誘導体
のｐＵＣ９にクローニングした。

適当な大腸菌株を上記のそれぞれのプラスミドで形質転
換した後、ＤＮＡを標準技法により精製して次のように
消化した。合成Ｎ末端（フラグメントＡ）を含むｐＵＣ
９ベクターはＫ　ｐ　ｎ　ＩおよびＡνα■で消化し、
１４５塩基対のフラグメントを回収した。ｈＧ−ＣＳＦ
　　ｃＤＮＡを含むベクター（第２図のｐＧＥＭＢＬ）
ｆ”ｉ初メＫ　Ｓ　ｔ　１ＬＴ　テ消化シ、その後Ａτ
α■で部分消化した。ｈＧ−ＣＳＦのＣ末端アミノ酸４
３〜１７４をコードする約３１０塩基対のＡναＴ−８
ｔｘ■フラグメントヲ上記の部分消化物から単離した。

これらの７ラグメントはＡＤＨ２プロモーター、α因子
リーダー配列、酵母および大腸菌の複製起点、酵母Ｔｒ
ｐｌ遺伝子および大腸菌Ａｐｒ遺伝子を含むＫ　ｐ　ｎ
　ｌおよび５ｔｒｂ（切断酵母発現ベクターｐＢｃ１０
に連結した。得られた構築物はｐＢｃ８８と名づけた。

ｐＢｃ８８はＡｓｐ７１８　（Ｋｐ？１１部位で切断）
およびＡｐａｉ（ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子のヌクＶオチド１
３で切断）で消化した。得られた大フラグメントは次の
オリゴヌクレオチド（第２図のオリゴＢ）、すなわちＫ
ＥＸ２プロテアーゼ認識部位で終止するα因子リーダー
配列のＣ末端の一部、ウシエンテロキナーゼにより切断
しつる抗原性の親水性合成Ｎ末端（ＤＹＫＤＤＤＤＫ　
）をコードする８コドン配列、およびＡｐａ　ｒ接着末
端までのｈＧ−ＣＳＦタンパク質をコードし且つその接
着末端をもつ短い配列を含むオリゴヌクレオチドに連結
した。オリゴヌクレオチドＢの配列ならびにその対応す
るアミノ酸配列を以下に示すニ Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔ
ｙｒ　ＬｙｓＧＴＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ
　ＡＧＡ　ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡ　　ＡＡＣＣＴＡ　
　ＴＴＴ　ＴＣＴ　　ＣＴＧ　　ＡＴＧ　　ＴＴＣＡｓ
ｐ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈ
ｆ　Ｐｒｏ　　Ｌａｗ　　ＧｌｙＧＡＣＧＡＣＧＡＴ　
ＧＡＣＡＡＧ　ＡＣＴ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＧＧＣＣＣＴ
Ｇ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＣＴＧ　ＴＴＣＴＧＡ　ＧＧＡ　
ＧＡＣ得られた構築物をｐＢｃ９０と名づけた。

ｉｎν１ｔｒｏ突然変異誘発はワルダーおよびワルダー
のＧｔｓｇ　４２　：　１３３　（１９８６）に記載の
方法に類似するが次の点で異なる方法を用いて行った。

発現ベクターｐＢ０９０はプント（Ｄ＃％ｔｇ）らのＮ
ｘｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１１　
：　１６４５（１９８３）に記載されるｐＥＭＢＬ　　
ベクターから誘導された、−木調バクテリオファージｆ
ｌの複製起点をコードするＤＮＡフラグメントを含むよ
うに修飾した。これはｐＢ０９０を唯一のＮデｓ■部位
で切断し、その切断プラスミドｔ／１複製起点を含む平
滑末端の５１４　ｈｐ　Ｒｓａｌフラグメントに連結す
ることにより達成した。得られた構築物はｐＢＣ１０２
と名づけられ、酵母内でＧ−ＣＳＦを発現することがで
き、また大腸菌の適当な（雄）菌株内に挿入され且つヘ
ルパーファージを重感染させる場合に一本鎖ＤＮＡを生
成することが可能である。

一本鎖ＤＮＡは大腸菌株ＪＭ１０７を形質転換し、ヘル
パーファージＩＲ１を重感染させることにより生成した
。一本領ＤＮＡｆ単離し、成熟天然ｈＧ−ＣＳＦの残基
２２に対応する位置でＡｒｇの代わりにＬｙｓを使用す
るコドン変更を与える突然変異誘発性オリゴヌクレオチ
ド：　５’−ＧＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣ
ＡＧＣ−３’　（オリゴＤ）にアニーリングした。アニ
ーリングおよび酵母形質転換条件はワルダーおよびワル
ダーの上記文献に記載されるものと実質的に同じであっ
た。酵母形質転換体はトリプトファン不含培地上で生育
させることにより選択し、プールし、セしてホルム（Ｈ
ａｒｍ）らのＧａｎｇ　４２　：　１６９　（１９８６
）に記載されるごとくＤＮＡ’ｆｆ抽出した。このＤＮ
Ａ　（野生型および突然変異プラスミドＤＮＡの混合物
を含む）を用いて、大腸菌ＲＲ１ｆアンピシリン耐性に
形質転換した。得られたコロニーは標準技法を使用して
、放射性標識オリゴヌクレオチドＤへのハイブリダイゼ
ーションによりスクリーニングした。

ｈＧ−ＣＳＦＣＬν、ｕ）をコードするＤＮＡを含むプ
ラスミドは、緊縮条件（例えば５５℃、６ＸＳＳＣ）下
で放射性標識オリゴヌクレオチドＤと−・イプリダイズ
させることにより同定し、そしてヌクレオチドの塩基配
列決定により証明した。

その後、ｈＧ−ＣＳＦＣＬｙｓ”〕遺遺伝子含む大腸菌
クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、これを用いて
改変遺伝子産物発現用の酵母菌株ＸＶ２１８１を形質転
換した。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除をうながす条
件下で生育させた形質転換酵母菌株によってもたらされ
た上清は、マウスモノクローナル抗体との反応、それに
αぐ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体
との反応により検定してＤＹＫＤＤＤＤＫＮ末端ペプチ
ドの存在を検出し、またＧ−（ＳＦ活性についてバイオ
アッセイで調べた。これらの実験は天然タンパク質に関
する類似の発現実験に比べて突然変異タンパク質の発現
が約５倍高いことを示した。

実　施　例　３：大腸菌によるｈＧ−ＣＳＦの高レベル
発現一 実施例２のようにして作製したプラスミドｐＥＣ８８’
ｋＡｐａｌおよび５ｔｓ（で消化して、成熟ｈＧ−ＣＳ
ＦのＣ末端アミノ酸４〜１７４ｔ−コードする約４２７
塩基対のフラグメントを得た。このフラグメントｎＮ末
端４０コドン甲のデオキシアデノシンおよびデオキシチ
ミジン残基の割合が天然ｅＤＮＡ配列に比べて高い”Ａ
／Ｔ富化”Ｎ末端領域によって特徴づけられる。

類似のＡｐα■−５ｔｕｌフラグメン）Ｈ天然ｈＧ−Ｃ
ＳＦ配列を含むクローニングベクター（第２図のｐＧＥ
ＭＢＬ）から単離して、Ａ／Ｔ富化変異型に対応する天
然ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列の領域を得た。

天然および合成フラグメントはそれぞれＣ１ａｌおよび
ＡｐａＴＷ着末端およびＮ末端メチオニン残基と成熟ｈ
Ｇ−Ｃ’ＪＦの最初の３アミノ酸をコードするコドンを
提供する次のオリゴヌクレオチドＥに連結した： Ｃｌ　ａ　Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ＡｐαＩＣＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＣＣＴ　
ＣＴＧ　ＧＧＣＣＴＡ　ＴＧＡ　ＴＡＣＴＧＡ　ＧＧＡ
　ＧＡＣＭｔｒｔ　　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｇｘ　Ｇｌｙ
得られたフラグメントは温度感受性λＰＬプロモーター
をもつＤＮＡフラグメントを含むｐＧＥＭ１（米１ｉワ
イスコンシン州マジンン、フロメガ、バイオチク社）の
Ｃ１α■、Ｓｍα■切断誘導は連結した。このフラグメ
ントはゴース（Ｇｏｕｒｓｇ　）　　らのＰｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、１ｃｓ、　ＵＳＡ　８２　：　１０
６９（１９８５）に詳細に記載されるものと実質的に類
似している。関連するλＰＬプロモーター配列はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクショ／（ＡＴＣＣ）
に寄託番号ＡＴＣＣ３７０９２として寄託された大腸菌
株ＪＭＥＱ中に存在するプラスミド、およびＡＴＣＣ５
３０Ｂ　２として寄託された大腸菌ＲＲＬ中に存在する
プラスミドｐＰＬ２Ｂに含まれている。

ｐＰＬ３　　と名づけたこの発現ベクターはさらに市販
の多重クローニング部位を次のＫｐｎ　７−Ｈｉｎｄ■
フラグメントで置き換えることにより修飾した：３つの
ＤＮＡフラグメントをＴ４　　ＤＮＡリガーゼにより連
結して、成熟ｈＧ−ＣＳＦの最初の１２８先に述べたよ
うに、また第１図に示すようにＡ／Ｔ含量が３６〜５７
チ増加している。天然構築物はｐ　Ｐ　Ｌ　３　／　ｎ
　Ｇ　−ＣＳ　Ｆと名づけられ、一方Ａ／Ｔ富化変異型
はｐ　Ｐ　Ｌ　３　／　ｓ　Ｇ−ＣＳ　Ｆと名づけられ
た。

ｐ　Ｐ　Ｌ　３　／　Ｆ　Ｌ　Ａ　Ｇ　−ｓ　Ｇ　−Ｃ
Ｓ　Ｆと名づけた第３の構築物は、以下に示すＣ１αＩ
−Ａｐａ（オリゴヌクレオチドＦに融合された４２７塩
基対のＡｐａ　ｌ　−８ｔ　ｓ　１ｓＧ−ＣＳＦフラグ
メントから構成された。このオリゴヌクレオチドＦはＡ
ｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬ　ｙ　ｓ
　（Ｄ　Ｙ　Ｋ　Ｄ　Ｄ　Ｄ　Ｄ　Ｋ　）疎水性リーダ
ー配列に融合されたＮ床端メチオニンおよび成熟ｈＧ−
ＣＳＦの最初の３７ミノｌ１ｉ−コードしている。ＤＹ
ＫＤＤＤＤＫは特定の抗体に結合し得る高度に抗原性の
リーダーを提供し、Ｍ製されたウシまたはブタ粘膜性エ
ンテロキナーゼで切断することができ、また融合タンパ
ク質の発現を高めることができる。

−〇 Ｕ 最後に、ｐＰＬ３７Ｆ−ｓｔｏｐ−ｓＧ−ＣＳＦと名づ
けた第４の構築物が以下に示すＣ１ａ１−ＡｐａＩオリ
ゴヌクレオチドＧに融合された４２７塩基対のＡｐａｌ
−３ｔｓｌ　　５Ｇ−ＣＳＦフラグメントから構成され
た。このオリゴヌクレオチドＧはＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡ
ｓｐＡｓｐＡｓｐ（Ｄ　ＹＫ　Ｄ　Ｄ　Ｄ　）疎水性リ
ーダー配列（以前に融合タンパク質の発現を高めること
が注目された）に融合されたＮ末端メチオニン、停止コ
ドン、第２Ｎ末端メチオニン、および成熟ｈＧ−ＣＳＦ
の最初の３アミノ酸をコードしている： ＣＷ ＣＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　　ＧＡＣＴＡＣＡＡＡ　　
ＧＡＴ　　ＧＡＣＴＡ　ＴＧＡ　ＴＡＣＣＴＧ　ＡＴＧ
　　ＴＴＴ　　ＣＴＡ　　ＣＴＧＡｆｇｔ　　Ａｓｐ　
　Ｔｙｒ　　Ｌｙｅ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐｐａｌ ＧＡＴ　　ＴＡＡ　　ＣＡＴ　　ＡＴＧ　　ＡＣＴ　　
ＣＣＴ　　ＣＴＧ　　ＧＧＣＣＣＴＡ　　ＡＴＴ　ＧＴ
Ａ　　ＴＡＣＴＧＡ　　ＧＧＡ　　ＧＡＣＡｓｐ　Ｅｎ
ｄ　　　　　Ｍａｔ　　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　　Ｌａｗ前記
の発現ベクターのそれぞれを使用して、大腸菌株に８０
２　（ｐＲＫ２４８ｅｌｔａ：ＡＴＣＣ３３５２６）’
ｔテトラサイクリンおよびアンピシリン耐性に形質転換
した。Ｇ−ＣＳＦ活性をもつタンパク質の発現を試験す
るために、形質転換体をアンビシリンネ含り培地中３０
℃で６００　ｎｍでの吸光度が約０．４〜０５となるま
で増殖させた。

その後、培養物はλ−ＰＬプロモーターの抑制解除を促
進するために４３℃に変えて１時間培養した。

３時間後、ｌ　ｒｎｌ培養物から細胞を遠心により集め
、沈殿物ｅ３００ｐｔグアニジン−ＨＣＬで抽出した。

得られた抽出物をリン酸緩衝化食塩水でｌ：ＩＵ。

に希釈し、セして３２Ｄネズミ骨髄増殖検定で調べた。

その結果を下記の表に示す： ｐＰＬ３（挿入物なし）　　　　　　　　０ｎＧ−ＣＳ
Ｆ　　　　　　　　　　　１，２００ｓＧ−ＣＳＦ　　
　　　　　　　１３０，０００ＦｓｔｏｐＧ−ＣＳＦ　
　　　　　　　７０，０００Ｆｌａｇ／　５Ｇ−ＣＳＦ
　　　　　１，６００．０００施　　　４ニジステイン
残基の改変または付加 ｈＧ−ＣＳＦの天然アミノ酸配列は成熟ｈＧ−ＣＳＦ分
子の１７．３６．４２．６４および７４位に５個のシス
ティン残基を含む。奇数番号のシスティンの排除による
天然配列（Ａ　ｒ　ｔｉｔ　２２　）の改変がその結果
生じる４−システィン変異型を安定化することによって
発現を高めるかどうかを試験するために、先に述べた部
位特異的突然変異誘発を使用して、ＣｙｓＩ７をコード
するコドンをＴＧＴからＡＧＴに転化することによりシ
スティンの代わりにセリンを配置した。使用した突然変
異誘発性オリゴヌクレオチドは４９位のデオキシチミジ
ンの代わりにデオキシアデノシンを使用したことを除、
ヌクレオチド３９からヌクレオチド６０”！５−天然配
列と一致していた。得られた構築物（ＤＹＫＤＤＤＤＫ
　　Ｎ末端リーダーをもつ融合タンパク質として構築さ
れた）は標的配列の本性を除いてｐＢｃ１０２・Ｋ２２
と実質的に類似する酵母発現ベクターの中に挿入した。

ｐＢＣ１２２と名づけたこのベクターを用いて、上記の
ような適当な酵母宿主を形質転換した。その後、得られ
た形質転換体はＡＤＨ２プロモーターの抑制解除を促進
する条件下で増殖させた。検定結果を以下に示す。

関連実験において、システィン残基金１個付加して全部
で６個のシスティン残基とすることが分子を安定化する
ことによって発現および回収を高めるであろうという仮
説を試験するために、Ｐｈａ”をシスティン残基と置き
換えた。再度、部位特異的突然変異誘発を使用してＰｈ
ａδ３をコードするコドンをＴＴＣからＴＧＣに転化し
、それによりシスティンを配置した。使用した突然変異
誘発性オリゴヌクレオチドは２４８位のデオキシチミジ
ンの代わりにデオキシグアノシンを使用したことを除い
て、ヌクレオチド２３５かもヌクレオチド２６１までの
天然配列と一致していた。得られた構築物（ＤＹＫＤＤ
ＤＤＫ　　Ｎ末端リーダーを含む）は上記のようにして
酵母発現ベクターに挿入した。

ｐＢＣ１２１と名づけたこのベクターを使用して適当な
宿主を形質転換し、形質転換体はＡＤＨ２プロモーター
の抑制解除を促進する条件下で増殖させた。検定結果を
下記の表に示す。

比較可能な発酵からの酵母培養上清は適当に希釈して３
２Ｄネズミ骨髄増殖検定により調べた。

下記表において、ｐＥｃ９０はＤＹＫＤＤＤＤＫリーダ
ーを含む野生型タンパク質に関し、ｐＢｃ’ｔｘ。

はＤＹＫＤＤＤＤＫリーダーを含むアＢＣ１０２の１、
、％誘導体を示す。ＤＹＫＤＤＤＤＫリーダーに特異的
なモノクローナル抗体を使用するイムノ−ドツト・プロ
ット検定（ｉｍｔｎｓｔｓｏ−ｄｏｔ　ｂｌｏｔ　ａｓ
ｓａｙ）は下記のそれぞれの培養物試料において質的に
類似するレベルの抗体反応性タンパク質を示した。

ｐＢｃ９０　　　　　　　　　　４３９，６６７ｐＢｃ
１１ｏ　　　　　　　　　　８２０，４９２ｐＢｃ１２
１＜６−Ｃ１８）　　　　１，０８７１４７６ｐＢｃ１
２２（４−Ｃ１ｇ）　　　　１，４００，８６４造血成
長因子（ｈＧ−ＣＳＦ）は癌患者における各種の幹細胞
および前原細胞の抑制（例えば化学療法や放射線療法に
よって引き起こされる）を治療するために使用しつる。

また、この因子は白血病および種々の貧血の治療に応用
できる。このような治療のために、１〜ｌＸｌ０’μｆ
／患者／治療の範囲の投与量が用いられる。投与Ｆｉ適
当な方法、例えば食塩水やヒト血清アルブミンと混合し
た食塩水のような薬理学上のキャリアーと共に注射によ
って行うことができる。

【図面の簡単な説明】

ｖｇ１図は天然ヒトＧ−Ｃｆ；Ｆ％および不活性化ＫＥ
Ｘ２部位および発現の増強をもたらす他のヌクレオチド
変化を有する好適な突然変異タンパク質ｈＧ−ＣＳＦ〔
Ｌｙｓ”］のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸
配列を示す。第１図はまた発現タンパク實を安定化する
だめのシスティン残基の好適なυト除位置または付の■
位置を示す。 第２図ｎｈＧ−ＣＳＦＣＬｙｓ”）ｆコードするｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａ　を含むプラスミドｐＢｃｌＯ２・Ｋ２２の作
製を示す模式図である。大腸圀株ＲＲ１の甲に存在する
このプラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ＡＴｃ、ｃ）に！託番号６７２５５として
寄託された。 （外５名） 図面の浄８（内容に変更なし） Ｎ纏プミｆｆ、ｈＧ−ＣＳＦｉＳ璽合声覧、！ツーＮ　
　　　ＣＡＧ　　ＣＴＧ　　ＣＴＧ　　ＣＴＧ　　丁Ｇ
Ｇ　　ＣＡＣＡＧＴＧＣＡ　ＣＴＣＴＧＧ　　ＡＣＡ　
ＧＴＧ　　ＣＡＧ　ＧＡＡ　　ＧＣＧＴｈｒ　Ｐｒｏ　
ＬａｕＧｌｙ　Ｐｒｏ　ＡｌａＳ＠ｒ　Ｓａｒ　　Ｌｓ
ｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｂ＠ｒ　Ｐｈ＠Ｌ＠ＩＩＬｓｕ　
　１５Ｌ１ｓ　　Ｃｙｓ　　Ｌ＠ｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌ
ｎ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　ＩＩｓ　　ＧＩ
＋＋　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　ＧＩＦ　　＾ＩａＡｌ＠
　　３０Ｓ釘

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）精製されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−
   ＣＳＦ）。
2. （２）少なくとも１つの酵母ＫＥＸ２プロテアーゼプロ
   セッシング部位が不活性化されたヒトＧ−ＣＳＦ（ｈＧ
   −ＣＳＦ）突然変異タンパク質。
3. （３）第１図の合成アミノ酸配列に実質的に相同である
   アミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦ突然変異タンパク質
   。
4. （４）天然配列のＣｙｓ＾１＾７がＣｙｓ以外のアミノ
   酸で置き換えられたｈＧ−ＣＳＦ突然変異タンパク質。
5. （５）天然配列のＰｈｅ＾８＾３がＣｙｓ残基によつて
   置き換えられたｈＧ−ＣＳＦ突然変異タンパク質。
6. （６）天然ｈＧ−ＣＳＦ配列に比べてデオキシアデノシ
   ンおよびデオキシチミジンの含量が増大したことにより
   特徴づけられる、ヒトＧ−ＣＳＦタンパク質をコードす
   るＤＮＡセグメント。
7. （７）第１図の合成ＤＮＡ配列に実質的に相同である、
   特許請求の範囲第４項記載のＤＮＡセグメント。
8. （８）特許請求の範囲第２〜５項のいずれかに記載のタ
   ンパク質をコードするＤＮＡセグメント。
9. （９）特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のタ
   ンパク質を少なくとも１０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度
   で含有する粗製培養上清。
10. （１０）ｈＧ−ＣＳＦまたはｈＧ−ＣＳＦ突然変異タン
    パク質をコードするＤＮＡセグメントを含む組変え酵母
    発現ベクター。
11. （１１）特許請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載の
    ＤＮＡセグメントを含む組換え微生物発現ベクター。
12. （１２）ｐＢＣ１０２・Ｋ２２（ＡＴＣＣ６７２５５）
    である、特許請求の範囲第１０項記載の組換え発現ベク
    ター。
13. （１３）特許請求の範囲第１０〜１２項のいずれかに記
    載の発現ベクターを含む宿主微生物を、発現促進条件下
    で培養することから成る、ｈＧ−ＣＳＦまたはｈＧ−Ｃ
    ＳＦ突然変異タンパク質の生産方法。