WO2021162098A1 - Ｃｄ３に結合するバイスペシフィック抗体 - Google Patents

Ｃｄ３に結合するバイスペシフィック抗体 Download PDF

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丹羽　倫平
進也 小川
摩珠 輪島
麗夫 久保田
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    • G01N2333/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex

Definitions

  • the present invention comprises a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment that binds to CD3, a DNA encoding the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, a vector containing the DNA, the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment.
  • Hybridomas and transformants to be produced methods for producing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, therapeutic and / or diagnostic agents containing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment.
  • therapeutic and / or diagnostic method used and detection or measurement reagents comprising the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment.
  • Non-Patent Document 1 It is known that antibody drugs for cancer that have been approved so far have various mechanisms of action (Non-Patent Document 1). Typical examples are neutralization activity that inhibits the binding of a ligand such as a growth factor to a receptor, agonist activity that activates the bound receptor, and antibody-dependent cellular cytotoxicity: the following. ADCC activity), complement-dependent cytotoxicity (hereinafter referred to as CDC activity), and other effector functions possessed by IgG-type antibody molecules.
  • ADCC activity complement-dependent cytotoxicity
  • CDC activity complement-dependent cytotoxicity
  • biomarker analysis of clinical trials of Rituximab and Trastuzumab suggests that ADCC activity is an important mechanism in clinical practice of antibody drugs (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • ADCC activity is caused by recognition of IgG-type antibody Fc bound to a membrane-type antigen on the surface of cancer cells by natural killer cells (hereinafter referred to as NK cells) via one of the Fc receptors, Fc ⁇ RIIIA (CD16a). It is a mechanism of injury (Non-Patent Document 1).
  • ADCC activity can be enhanced by artificially modifying the human IgG1 type Fc of the antibody drug to increase the binding ability to Fc ⁇ RIIIA.
  • ADCC activity can be enhanced by actually modifying the amino acid of Fc or modifying the sugar chain of the N-linked complex sugar chain that binds to Fc (Non-Patent Document 4), and particularly ADCC by modifying the sugar chain.
  • the activity enhancing technique is applied to approved antibody drugs such as mogamulizumab (Non-Patent Document 5) and obinutuzumab (Non-Patent Document 6).
  • Bispecific antibody is an artificially modified antibody molecule that enables binding to two different types of antigens, unlike natural antibodies, and many molecular forms have been reported (non-patent literature). 7). Examples of its application to pharmaceuticals include a technique of binding to an antigen on a cancer cell and CD3 on the surface of a T cell and cross-linking both to damage the cancer cell.
  • T cell-mediated cytotoxic activity generated by the binding of a CD3 / cancer antigen bispecific antibody to CD3 on T cells is described here as ADTC activity (Antibody-dependent T-cell-mediated cytotoxicity).
  • CD3 / cancer antigen bispecific antibody examples include IgG-type bispecific antibody catumamaxomab (Non-Patent Document 8) against CD3 and cancer antigen EpCAM, and bispecific T-cell engineer [Bite®] (Non-Patent Document 9). ) And the IgG-type bispecific antibody RG7802 against CD3 and the cancer antigen CEA.
  • Non-Patent Document 7 Although there are many other molecular forms (Non-Patent Document 7), these anti-CD3 bispecific antibodies generally have only ADTC activity, and have a structure having no ADCC activity or suppressed structure. Have.
  • BiTE® is a peptide linker that binds two different antibody fragments called single chain Fv (scFv) that bind to CD3 and cancer antigens and is Fc-free, thus such as ADCC activity. It has no mechanism of action via Fc [Fig. 1 (C)]. Further, although RG7802 has Fc, the binding ability to the Fc receptor is removed by introducing a mutation of P329G into Fc, and it also does not show ADCC activity (Non-Patent Document 10).
  • Catumamaxomab which is known to have a hybrid Fc of mouse IgG2a / rat IgG2b that binds to the Fc receptor, thereby inducing ADCC activity. 8).
  • rodent-derived Fc has a lower ability to induce ADCC activity than human-derived Fc used in ordinary antibody drugs (Non-Patent Document 11).
  • T cell activation is caused by Fc receptor-mediated clustering (aggregation on the cell membrane) of CD3. It is thought that this is because it occurs and there are concerns about the side effects that accompany it. Twice
  • the anti-CD3 antibody OKT3 which is used to suppress rejection during organ transplantation, causes side effects of cytokine release syndrome, which is caused by clustering of CD3 by leukocytes having Fc receptors via Fc of mouse IgG2a type of OKT3. It is considered (Non-Patent Document 12).
  • Non-Patent Document 13 A serious side effect associated with cytokine release syndrome after administration of Catumamaxomab, a bispecific antibody of CD3 and EpCAM that has the ability to bind to Fc receptors, is the activity of T cells via Kupffer cells in the liver with Fc receptors. It is presumed that this is the cause (Non-Patent Document 13).
  • heterodimeric type CD3 / cancer antigen bispecific antibody exhibiting ADCC activity or high ADCC activity and its cytotoxic activity have not been investigated in detail, and have high cytotoxic activity and are excessive.
  • anti-CD3 bispecific antibodies that suppress the induction of cytokine production.
  • An object of the present invention is to provide an anti-CD3 bispecific antibody in which cytokine production induction is suppressed, a bispecific antibody that specifically binds to CD3 and a disease-related antigen.
  • a bispecific antibody containing an antigen-binding domain that binds to CD3 and an antigen-binding domain that binds to a disease-related antigen, the bispecific antibody fragment, a DNA encoding the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, and the DNA are included.
  • Vectors, hybridomas and transformants that produce the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, methods for producing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, treatment and diagnosis comprising the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment.
  • CD3 for the production of anti-CD3 bispecific antibody. It is an object of the present invention to provide a CD3 binding domain with attenuated affinity and a CD3 binding domain with attenuated affinity for CD3 for suppressing the induction of cytokine production by an anti-CD3 bispecific antibody.
  • the present invention relates to the following.
  • 1. An anti-CD3 bispecific that contains an Fc region capable of binding to an Fc receptor, one CD3 binding domain with reduced affinity for CD3 is bound to the C-terminal side of the Fc region, and further contains a disease-related antigen-binding domain.
  • An antibody or a bispecific antibody fragment thereof. An anti-CD3 bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody that contains an Fc region capable of binding to an Fc receptor, one CD3 binding domain is bound to the C-terminal side of the Fc region, and further contains a disease-related antigen-binding domain.
  • the CD3 dissociation constant for CD3 binding domain is the 6 ⁇ 10 -8 or more, anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to the 1 or 2.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or fragment thereof according to any one of 1 to 3 above, wherein the dissociation constant of the CD3 binding domain with respect to CD3 is larger than that of the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or KM14 which is a comparative control. 5.
  • the amino acid sequence of the CD3 binding domain has 90% or more homology with the amino acid sequence of the CD3 binding domain of the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or KM14 as a comparative control, and is compared with the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or KM14.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or fragment thereof according to any one of 1 to 4 above, wherein the affinity for CD3 is reduced by 10% or more. 6.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or fragment thereof according to any one of 1 to 6, wherein the CD3 binding domain and the disease-related antigen binding domain are any one selected from scFv, Fab and VHH, respectively.
  • the CD3 binding domain contains heavy chain variable regions (abbreviated as VH) and CDR1 of the antibody light chain, which comprises the complementarity determining regions 1 to 3 of the antibody heavy chain.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or fragment thereof according to any one of 1 to 8 above which comprises a light chain variable region (abbreviated as VL) containing 3 to 3. 10.
  • VL light chain variable region
  • the amino acid sequences of CDR1 to 3 (HCDR1 to 3) of VH and CDR1 to 3 (LCDR1 to 3) of VL of the CD3 binding domain are HCDR1 to 3 of any one selected from the following (a) to (h) and
  • the anti-CD3 bispecific antibody or fragment thereof according to any one of 1 to 10 above which has 90% or more homology with the amino acid sequences of LCDR1 to 3, respectively.
  • the amino acid sequences of VH and VL of the CD3 binding domain have 80% or more homology with the amino acid sequences of any one of VH and VL selected from the following (aa) to (rr), respectively.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody according to any one.
  • Pp VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 171 and VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 183.
  • Pp VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 171 and VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 183.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to 15 or 16 above, wherein the Fc region in which the binding activity to the Fc receptor is enhanced is an Fc region containing both amino acid residue modification and sugar chain modification. .. 18.
  • the sugar chain modification is a sugar chain modification in which fucose that ⁇ 1,6-bonds to N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-linked sugar chain that binds to Asn at position 297 of the EU numbering of the Fc region is deleted.
  • Any of the above 1 to 19, which comprises two Fabs as the disease-related antigen-binding domain, and the C-terminal of the heavy chain (VH-CH1) of each Fab is bound to the Fc region directly or via a linker.
  • the CD3 binding domain is directly or via a linker to the Fc chain that contains one Fab as the disease-related antigen-binding domain and is bound to the heavy chain (VH-CH1) of the Fab.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or fragment thereof according to any one of 19 to 21. 23.
  • the CD3 binding domain is bound directly or via a linker to the Fc chain that contains one Fab as the disease-related antigen-binding domain and is bound to the light chain (VL-CL) of the Fab.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody according to any one of 19 to 21.
  • 24. The anti-CD3 bispecific antibody or fragment thereof according to any one of 20 to 23, wherein the linker is a hinge or a variant thereof. 25.
  • 26. A recombinant vector containing the DNA according to 25.
  • 27. A transformant obtained by introducing the recombinant vector according to 26 above into a host cell. 28.
  • the transformant according to 27 is cultured in a medium, and the anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to any one of 1 to 24 is produced and accumulated in the culture, and the bispecific antibody fragment is produced and accumulated from the culture.
  • the method for producing an anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to any one of 1 to 24 above which comprises collecting an anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment. 29.
  • a therapeutic and / or diagnostic agent for a disease involving at least one of the CD3 and the disease-related antigen which comprises the anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to any one of 1 to 24 as an active ingredient. .. 30. 29. Therapeutic and / or diagnostic agent according to 29, wherein the disease is associated with at least one of the CD3 and the disease-related antigen.
  • 33. The anti-CD3 bispecific antibody or fragment thereof according to any one of 1 to 24, for use in the treatment and / or diagnosis of a disease involving at least one of the CD3 and the disease-related antigen.
  • 34. 33.
  • 35 The use according to 35, wherein the disease involves at least one of the CD3 and the disease-related antigen.
  • a reagent for detecting or measuring at least one of the CD3 and the disease-related antigen which comprises the anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to any one of 1 to 24.
  • An anti-CD3 bispecific antibody or anti-CD3 bispecific antibody comprising a Fc region capable of binding to an Fc receptor and a disease-related antigen-binding domain, which comprises binding a CD3 binding domain with diminished affinity for CD3 to the Fc region. How to make a fragment. 39.
  • Cytokines of an anti-CD3 bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody fragment comprising an Fc region capable of binding to the Fc receptor and a disease-related antigen binding domain characterized by the use of a CD3 binding domain with diminished affinity for CD3.
  • the CD3 dissociation constant for CD3 binding domain (K D) is the 6 ⁇ 10 -8 or more, the method described in the 38 or 39. 41. The method according to any one of 38 to 40 above, wherein the dissociation constant of the CD3 binding domain with respect to CD3 is larger than that of the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or KM14 which is a comparative control. 42.
  • the amino acid sequence of the CD3 binding domain has 90% or more homology with the amino acid sequence of the CD3 binding domain of the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or KM14 as a comparative control, and has an affinity as compared with the anti-CD3 antibody SP34 or KM14.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment comprises one or two disease-related antigen binding domains.
  • 44. The method according to any one of 38 to 43, wherein the CD3 binding domain and the disease-related antigen binding domain are any one selected from scFv, Fab and VHH, respectively. 45.
  • the amino acid sequences of CDR1 to 3 (HCDR1 to 3) of VH and CDR1 to 3 (LCDR1 to 3) of VL of the CD3 binding domain are HCDR1 to 3 of any one selected from the following (a) to (h) and The method according to any one of 38 to 47, which has 90% or more homology with the amino acid sequences of LCDR1 to 3 respectively.
  • the method according to any one. (Aa) VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 124, and VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 125.
  • Qq VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 172, and VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 184.
  • the Fc region is an Fc region in which the binding activity to the Fc receptor is enhanced.
  • 53. A CD3 binding domain with diminished affinity for CD3 for producing an anti-CD3 bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody fragment comprising an Fc region and a disease-related antigen binding domain.
  • 54. A CD3 binding domain with diminished affinity for CD3 for suppressing cytokine production induction of an anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment comprising an Fc region and a disease-related antigen binding domain.
  • a bispecific antibody containing an antigen-binding domain that binds to CD3 and an antigen-binding domain that binds to a disease-related antigen, the bispecific antibody fragment, a DNA encoding the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, the DNA.
  • the bispecific antibody or fragment of the specific antibody of the present invention contains an Fc region capable of binding to an Fc receptor, and one CD3 binding domain having reduced affinity for CD3 binds to the C-terminal side of the Fc region. Furthermore, by including a disease-related binding domain, it has disease-related antigen-specific cytotoxic activity due to ADCC activity and ADTC activity (antibody-dependent cellular cytotoxicity via T cells, Antibody-dependent T-cell-mediated cytotoxicity). .. Therefore, the compositions of the present invention can be used for the treatment of various diseases by targeting antigens expressed by cells associated with the diseases.
  • FIG. 1 (A) to 1 (C) show a schematic diagram of the molecular type of an antibody drug.
  • FIG. 1 (A) is a general IgG antibody
  • FIG. 1 (B) is a CD3 / EpCAM bispecific antibody
  • Catumaxomab is a Bispecific T-cell Engager [BiTE®], Blinatumomab.
  • 2 (A) and 2 (B) are schematic diagrams of molecular types of FIG. 2 (A) IgG1 type monovalent antibody and FIG. 2 (B) IgG4PE (R409K) type monovalent antibody, and amino acid modifications contained in each molecular type. Indicates the location.
  • the H chain is the first polypeptide and the light chain-Fc fusion protein is the second polypeptide.
  • 3 (A) and 3 (B) show the first polypeptide (H chain, VH-CH1-hinge-) of FIG. 3 (A) IgG1 type monovalent antibody or FIG. 3 (B) IgG4PE (R409K) type monovalent antibody.
  • a schematic diagram of a bispecific antibody molecule to which anti-CD3 scFv is added to the C-terminal of the Fc) side Fc region and an amino acid modification site are shown.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the binding of IgG antibody, monovalent antibody and bispecific antibody molecules to HER2 on the cell membrane using the inhibition of binding of fluorescently labeled Trastuzumab as an index.
  • the horizontal axis shows the concentration of the test antibody molecule, and the vertical axis shows the relative value (%) of the average fluorescence intensity of the cells. The higher the binding force to HER2, the smaller the value on the vertical axis depends on the concentration by inhibiting the binding of the fluorescently labeled Trastuzumab.
  • FIG. 5 shows the results of measuring the binding of IgG antibody, monovalent antibody and bispecific antibody molecule to CD3 on the membrane using a fluorescently labeled secondary antibody.
  • the vertical axis indicates the relative value of the average fluorescence intensity of cells (with the reference value as 1) on the logarithmic axis. It shows that the molecule having anti-CD3 scFv is bound to T cells.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the cytotoxic activity against BT-20 cells by a real-time cell analyzer.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the smaller the number of cells adhering to the well, that is, the higher the cytotoxic activity. It is shown that the cytotoxic activity is higher when the antibody having only ADCC activity and the antibody having only ADCC activity are mixed in half.
  • FIG. 7 shows the results of measuring the cytotoxic activity against BT-20 cells by a real-time cell analyzer.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity. It is shown that the cytotoxic activity is higher in the antibody having both ADCC and ADCC activities in one molecule as compared with the case where the antibody having only ADCC activity and the antibody having only ADCC activity are mixed in half.
  • 8 (A) to 8 (E) are the results of measuring the cytotoxic activity against MCF-7 cells by a real-time cell analyzer.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement
  • the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added.
  • the lower the Cell index value the higher the cytotoxic activity.
  • the antibody having both ADCC and ADTC activity in one molecule shows high cytotoxic activity.
  • FIG. 9 shows the results of measuring the binding of the CD3 / HER2 bispecific antibody molecule to HER2 on the membrane using the inhibition of binding of the fluorescently labeled Trastuzumab as an index.
  • the horizontal axis shows the concentration of the test antibody molecule
  • the vertical axis shows the relative value of the average fluorescence intensity of the cells (reference value is 1).
  • the test molecule shows that the linker moiety that binds the C-terminal side of the Fc region and the N-terminal side of the anti-CD3 scFv is different, but the binding activity to HER2 does not change.
  • FIG. 10 shows the results of measuring the binding of IgG antibody, monovalent antibody and bispecific antibody molecule to CD3 on the membrane using a fluorescently labeled secondary antibody.
  • the vertical axis indicates the relative value of the average fluorescence intensity of cells (with the reference value as 1) on the logarithmic axis.
  • the test molecule shows that the linker moiety that binds the C-terminal side of the Fc region and the N-terminal side of the anti-CD3 scFv is different, but the binding activity to CD3 does not change significantly.
  • FIG. 11 shows the results of measuring the cytotoxic activity against BT-20 cells by a real-time cell analyzer.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity.
  • the test molecule shows that the linker moiety that binds the C-terminal side of the Fc region and the N-terminal side of the anti-CD3 scFv is different, but has approximately the same cytotoxic activity.
  • FIG. 12 shows the results of measuring the cytotoxic activity against BT-20 cells by a real-time cell analyzer.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity.
  • the test molecule shows that the linker moiety that binds the C-terminal side of the Fc region and the N-terminal side of the anti-CD3 scFv is different, but has approximately the same cytotoxic activity.
  • FIG. 13 shows the results of measuring the cytotoxic activity against MKN-7 cells by a real-time cell analyzer. The horizontal axis shows the time after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity.
  • FIG. 14 shows the results of measuring the cytotoxic activity against MKN-45 cells by a real-time cell analyzer.
  • FIG. 15 uses a known anti-CD3 bispecific antibody as a control antibody, and measures the cytotoxic activity of the control antibody (left column) and 4D5_mvG1_scT3a (DF) (right column) against the BT-20 antibody and the cytokine concentration in the culture supernatant. It is a figure of the result of plotting the result on the same graph.
  • FIG. 16 (A) to 16 (F) are diagrams showing molecular types designed to verify the synergistic increase in cytotoxic activity due to the combination of ADCC activity and ADTC activity.
  • FIG. 16 (A) to 16 (F) are diagrams showing molecular types designed to verify the synergistic increase in cytotoxic activity due to the combination of ADCC activity and ADTC activity.
  • FIG. 16 (A) shows the molecular type in which the anti-CD3 scFv is bound to the C-terminal of the Fc region of the first polypeptide (H chain) of the monovalent antibody
  • FIG. 16 (B) shows the heavy chain on one side of the divalent antibody.
  • the molecular type in which the anti-CD3 scFv is bound to the C-terminal of FIG. 16 (C) is the same as that in FIG.
  • FIG. 16 (D) shows the molecular type in which anti-CD3 scFv is bound to the C-terminal of the Fc region of the second polypeptide (light chain-Fc fusion protein or VL-CL-hinge-Fc) of the monovalent antibody.
  • FIG. 16 (E) shows the molecular type in which both the cancer antigen side Fab and the anti-CD3 scFv are located on the N-terminal side of the Fc region
  • FIG. 16 (F) shows the molecular types of the first and second polypeptides of the monovalent antibody, respectively.
  • the molecular types in which CD3 scFv is bound to the C-terminal one by one are shown.
  • 17 (A) and 17 (B) show the BT of the CD3 / HER2 bispecific antibody in which the cancer antigen side is divalent [FIG. 17 (A)] and monovalent [FIG. 17 (B)] as a verification of the molecular type.
  • FIGS. 18 (A) and 18 (B) show the results of measuring the cytotoxic activity of a CD3 / GM2 bispecific antibody having a divalent cancer antigen side on SBC-3 cells with a real-time cell analyzer as a molecular type verification. be.
  • FIG. 18 (A) is a negative control molecule using an anti-DNP antibody in the variable region on the cancer antigen side, and FIG.
  • FIG. 18 (B) is a molecule using an anti-GM2 antibody.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity.
  • FIG. 19A is a diagram showing the results of measuring the cytotoxic activity against BT-20 cells such as CD3 / HER2 bispecific antibody having ⁇ 1,6 fucose by a real-time cell analyzer as a verification of the molecular type.
  • 19B shows the results of comparing the cytotoxic activity of an anti-CD3 / HER2 bispecific antibody having ⁇ 1,6 fucose against BT-20 cells with that of a CD3 / HER2 bispecific antibody not having ⁇ 1,6 fucose. It is a figure which shows.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity.
  • FIG. 20 (A) shows a molecule in which an anti-CD3 scFv is bound to the C-terminal of a second polypeptide (light chain-Fc fusion protein or VL-CL-hinge-Fc) of a monovalent antibody as a molecular type verification. It is a figure which shows the result of having measured the cytotoxic activity with respect to BT-20 cells, etc. by a real-time cell analyzer.
  • FIG. 20 (B) shows the cytotoxic activity against BT-20 cells such as a molecule in which anti-CD3 scFv is bound to the C-terminal of the second polypeptide, and the first polypeptide (VH-CH1-hinge-Fc) of the monovalent antibody.
  • FIG. 21 shows the results of measuring the cytotoxic activity of the anti-CD3 bispecific antibody, which is a negative control that does not bind to HER2, and the HER2 / CD3 bispecific antibody against BT-20 cells by a real-time cell analyzer as a verification of the molecular type. It is a figure which shows.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity.
  • Target + PBMC shows no test substance, 0.5% Triton X-100 shows 100% injury activity.
  • the test substance is measured at three points having a final concentration of 50 nM, 5 nM, and 0.5 nM. Since the measured values of * and ** are close to each other, the respective test substances are displayed at the bottom.
  • FIG. 22A is a diagram showing the results of measuring the cytotoxic activity of an anti-CD3 bispecific antibody that does not bind to HER2 against BT-20 cells by a real-time cell analyzer as a verification of the molecular type.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity.
  • Target + PBMC shows no test substance, 0.5% Triton X-100 shows 100% injury activity. Since the variable region 4D5mut does not bind to HER2, the cytotoxic activity observed in this measurement is non-specific activity.
  • FIG. 22B is a diagram showing the results of measuring the cytotoxic activity of an anti-CD3 bispecific antibody that does not bind to HER2 against BT-20 cells by a real-time cell analyzer as a verification of the molecular type.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity.
  • Target + PBMC shows no test substance, 0.5% Triton X-100 shows 100% injury activity. Since the variable region 4D5mut does not bind to HER2, the cytotoxic activity observed in this measurement is non-specific activity.
  • 22C is a diagram showing the results of measuring the cytotoxic activity of an anti-CD3 bispecific antibody that does not bind to HER2 against BT-20 cells by a real-time cell analyzer as a verification of the molecular type.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity.
  • Target + PBMC shows no test substance, 0.5% Triton X-100 shows 100% injury activity. Since the variable region 4D5mut does not bind to HER2, the cytotoxic activity observed in this measurement is non-specific activity.
  • FIG. 22D shows a sensorgram of anti-CD3 bispecific antibody binding activity to human CD3D & E protein measured by surface plasmon resonance (SPR) method. Shows a rough K D values and test antibody name in FIG.
  • FIG. 22E shows a sensorgram of anti-CD3 bispecific antibody binding activity to human CD3D & E protein measured by surface plasmon resonance (SPR) method. Shows a rough K D values and test antibody name in FIG.
  • FIG. 22F shows a sensorgram of anti-CD3 bispecific antibody binding activity to human CD3D & E protein measured by surface plasmon resonance (SPR) method. Shows a rough K D values and test antibody name in FIG.
  • FIG. 22G is an enlarged view of the dotted line portion of FIG. 22F.
  • 23 (A) and 23 (B) are diagrams of the results of measuring the cytotoxic activity of two types of anti-CD3 bispecific antibodies that do not bind to HER2 against BT-20 cells by a real-time cell analyzer as a verification of the molecular type.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity. Since neither the variable region 4D5mut nor DNP2 binds to HER2, the cytotoxic activity observed in this measurement is a non-specific activity.
  • FIG. 24A is a diagram showing the cytotoxic activity of an anti-CD3 / HER2 or negative control bispecific antibody using a high-affinity anti-CD3 scFv.
  • the cytotoxic activity against BT-20 cells was measured by a real-time cell analyzer.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity.
  • FIG. 24B is a measurement of non-specific cytokine production of anti-CD3 / HER2 or negative control bispecific antibody using high affinity anti-CD3 scFv. Cytokine production was measured when human PBMC and test antibody were mixed.
  • FIG. 25 (A) and 25 (B) show design examples of amino acid modification to be introduced into the CDR of the anti-CD3 monoclonal antibody clone SP34.
  • FIG. 25 (A) shows a design that introduces a one amino acid modification into the VL CDR or VH CDR of the anti-CD3 monoclonal antibody clone SP34.
  • the leftmost column of the table shows the serial number of the modification, and the second column from the left shows the amino acid residue number by Kabat numbering of the modified residue and the amino acid residue before and after the amino acid residue modification in one letter.
  • FIG. 25B shows an example of a combination of two or more CDR-modified residues in the CDR of the anti-CD3 monoclonal antibody clone SP34.
  • 26 (A) and 26 (C) show a design example of the FR sequence of a humanized antibody using a modified CDR of the anti-CD3 monoclonal antibody clone SP34 for VL.
  • 26 (B) and (D) show an example of designing the FR sequence of a humanized antibody using a modified CDR of the anti-CD3 monoclonal antibody clone SP34 for VH.
  • FIG. 27 shows the results of measuring the binding activity of a CD3 / HER2 bispecific antibody using a CDR variant of the anti-CD3 monoclonal antibody clone SP34 by the surface plasmon resonance (SPR) method.
  • SPR surface plasmon resonance
  • 28 (A) to (C) show the results of measuring the cytotoxic activity of a CD3 / HER2 bispecific antibody against BT-20 cells using a CDR variant of the anti-CD3 monoclonal antibody clone SP34 with a real-time cell analyzer. It is a figure.
  • the horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity.
  • Target + PBMC shows no test substance, 0.5% Triton X-100 shows 100% injury activity.
  • 28 (B) and 28 (C) are enlarged portions surrounded by a square frame in FIG. 28 (A), and in FIG.
  • FIGS. 29 (A) to 29 (D) are diagrams of the results of measuring cytokine production of CD3 / HER2 bispecific antibody against BT-20 cells during cytotoxicity using a CDR variant of the anti-CD3 monoclonal antibody clone SP34. .. The results of measuring the cytokine concentrations (IL-2, IL-6, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ ) in the culture supernatant by flow cytometry are shown.
  • FIG. 30 shows the results of measuring the non-specific cytokine production (IL-2, IL-6, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ ) of the CD3 / HER2 bispecific antibody using the CDR variant of the anti-CD3 monoclonal antibody clone SP34. It is a figure of. medium indicates PBMC and medium only, and vehicle indicates an equal amount of buffer (citric acid buffer) in which the test substance is dissolved.
  • the vertical axis shows the cytokine concentration (pg / mL), and the horizontal axis shows the type and concentration of the antibody ( ⁇ g / mL).
  • FIG. 31 shows a design example of amino acid modification introduced into the CDR of the anti-CD3 monoclonal antibody clone KM14.
  • the upper part of the figure shows the modification to be introduced into the CDR of VL, and the lower part shows the modification to be introduced into the CDR of VH.
  • the left side of the table shows the serial number of the modification, and the right side shows the number of the amino acid residue by Kabat numbering of the modified residue.
  • the residues shown in bold indicate the residues that are the result of modification.
  • FIG. 31 shows a design example of amino acid modification introduced into the CDR of the anti-CD3 monoclonal antibody clone KM14.
  • the upper part of the figure shows the modification to be introduced into the CDR of VL, and the lower part shows the modification to be introduced into the CDR of VH.
  • the left side of the table shows the serial number of the modification, and the right side shows the number of the amino acid residue by Kabat numbering of the modified residue.
  • FIGS. 32 shows the results of measuring the binding activity of a bispecific antibody having a modified sequence of the anti-CD3 monoclonal antibody clone KM14 as anti-CD3 sc Fv to human CD3 protein with Biacore [KD (M) Biacore], BT-20 cells.
  • the results of measuring the cytotoxic activity against antibodies (Specific) with a real-time cell analyzer are shown in the table. The number of "+" s in cytotoxic activity indicates the strength of the activity.
  • 33 (A) and 33 (B) show the results of measuring the cytotoxic activity of a bispecific antibody having a modified sequence of the anti-CD3 monoclonal antibody clone KM14 as anti-CD3 scFv on BT-20 cells with a real-time cell analyzer. Is. The horizontal axis shows the time (h) after the start of measurement, and the vertical axis shows the Cell index value of the well to which the test antibody was added. The lower the Cell index value, the higher the cytotoxic activity. T + P is a well without test substance, 0.5% Triton X-100 is a line indicating 100% injury. 33 (A) and 33 (B) are experiments performed under the same conditions, but are the results of measurement on different measurement plates. In FIGS.
  • FIGS. 34 (A) and 34 (B) the amount of cytokine produced during cell injury to BT-20 cells of a bispecific antibody having a modified sequence of the anti-CD3 monoclonal antibody clone KM14 as anti-CD3 scFv was measured by flow cytometry. The result.
  • the concentration of the test substance is 10 nM
  • FIG. 34 (A) shows the concentration of INF- ⁇
  • FIG. 34 (B) shows the concentration of IL-6 in the culture supernatant.
  • LLOQ indicates the quantification limit value specified in the kit.
  • 35 (A) and 35 (B) show the results of measuring the cytotoxic activity of a bispecific antibody having a modified clone KM14 sequence as an anti-CD3 scFv on BT-20 cells with a real-time cell analyzer.
  • the Cell index value of the well to which the test substance is not added is 0%
  • the Cell index value of the well to which Triton X-100 is added is 100%
  • the cell injury activity at a specific time is calculated and shown.
  • 35 (A) and 35 (B) show the cytotoxic activity 48 and 120 hours after the addition of the test substance, respectively.
  • the vertical axis shows cytotoxic activity (%) and the horizontal axis shows the type of each antibody.
  • 36 (A) to 36 (C) are diagrams showing concentration-dependent cytotoxic activity of CD3 / CCR4 bispecific antibody or the like against PEER cells.
  • the vertical axis shows cytotoxic activity (%), and the horizontal axis shows antibody concentration (nM).
  • 37 (A) and 37 (B) are diagrams showing the concentration-dependent concentration of cytokines (IL-2 and IFN- ⁇ ) in the culture supernatant at the time of cytotoxicity such as CD3 / CCR4 bispecific antibody against PEER cells. ..
  • the vertical axis shows the cytokine concentration (pg / mL) and the horizontal axis shows the antibody concentration (nM).
  • FIG. 38 (A) and (B) show the concentration-dependent cytotoxic activity of the CD3 / CD123 bispecific antibody against MOLM13 cells, and FIG. 38 (A) and the cytokine concentration in the culture supernatant at that time.
  • FIG. 38 (B). The vertical axis shows cytotoxic activity (%), and the horizontal axis shows antibody concentration (nM).
  • 39 (A) and (B) are diagrams showing the concentration-dependent cytotoxic activity of the CD3 / CD123 bispecific antibody and the cytokine concentration in the culture supernatant at that time.
  • FIG. 39 (A) shows the cytotoxic activity against MOLM13 cells
  • FIG. 39 (B) shows the cytotoxic activity of the antibody against OCI-AML3 cells.
  • 40 (A) to 40 (D) are diagrams showing the concentration-dependent cytokine concentration in the culture supernatant at the time of cytotoxicity of the CD3 / CD123 bispecific antibody.
  • FIG. 40 (A) shows the IL-2 concentration in the culture supernatant at the time of cytotoxicity for MOLM13 cells
  • FIG. 40 (B) shows the IFN- ⁇ concentration.
  • FIG. 40 (C) shows the IL-2 concentration in the culture supernatant at the time of cytotoxicity of the antibody against OCI-AML3 cells
  • FIG. 40 (D) shows the IFN- ⁇ concentration.
  • FIGS. 41 (A) to 41 (C) show the cytotoxic activity of a bispecific antibody having a modified sequence of the anti-CD3 monoclonal antibody clone KM14 as an anti-CD3 scFv on BT-20 cells [FIG. 41 (A)] and cytotoxicity. It is the result of having measured the amount of cytokine production at the time by flow cytometry [FIGS. 41 (B) and (C)].
  • the vertical axis of FIG. 41 (A) shows the name of the bispecific antibody, and the horizontal axis shows the cytotoxic activity (%).
  • FIGS. 41 (B) and 41 (C) show the name of the bispecific antibody, and the horizontal axis shows the cytokine concentration (pg / mL).
  • FIG. 41 (B) shows the concentration of INF- ⁇
  • FIG. 41 (C) shows the concentration of IL-6 in the culture supernatant.
  • LLOQ indicates the quantification limit value specified in the kit.
  • FIG. 42 illustrates design examples and structural positions of amino acid modifications to be introduced into the CH3 region and anti-CD3 scFv for the purpose of improving the productivity and physicochemical stability of bispecific antibodies.
  • FIG. 42 illustrates design examples and structural positions of amino acid modifications to be introduced into the CH3 region and anti-CD3 scFv for the purpose of improving the productivity and physicochemical stability of bispecific antibodies.
  • FIG. 43 shows modifications to the CH3 moiety, scFv clones, VH and VL sequences of scFv, and introductions to scFv with respect to modifications to be introduced into anti-CD3 bispecific antibodies designed to improve productivity and physicochemical stability. It is a figure which listed the amino acid modification to perform element by element.
  • FIG. 44 shows the soluble CD3 in the bispecific antibody in which the modification was introduced into Fc (CH3), the bispecific antibody in which the anti-CD3 scFv was changed to the VL-Linker-VH type, and the bispecific antibody in which the modification was introduced into the anti-CD3 scFv. The results of measuring the binding activity to the surface plasmon resonance (SPR) method are shown.
  • SPR surface plasmon resonance
  • FIG. 45A shows the bispecific antibody in which the modification was introduced into Fc (CH3), the bispecific antibody in which the anti-CD3 scFv was changed to the VL-Linker-VH type, and the bispecific antibody in which the modification was introduced into the anti-CD3 scFv.
  • the cytotoxic activity after 48 hours is shown, where the activity value of the well to which the test substance is not added is 0% and the activity value of the well to which Triton X-100 is added is 100%.
  • the vertical axis shows cytotoxic activity (%), and the horizontal axis shows each bispecific antibody.
  • 45B shows the bispecific antibody in which the modification was introduced into Fc (CH3), the bispecific antibody in which the anti-CD3 scFv was changed to the VL-Linker-VH type, and the bispecific antibody in which the modification was introduced into the anti-CD3 scFv.
  • CH3 Fc
  • VL-Linker-VH VL-Linker-VH
  • the bispecific antibody in which the modification was introduced into the anti-CD3 scFv It is a figure which shows the result of having measured the cytotoxic activity. The cytotoxic activity after 48 hours is shown, where the activity value of the well to which the test substance is not added is 0% and the activity value of the well to which Triton X-100 is added is 100%.
  • the vertical axis shows each bispecific antibody, and the horizontal axis shows cytotoxic activity (%).
  • 45C shows the bispecific antibody in which the modification was introduced into Fc (CH3), the bispecific antibody in which the anti-CD3 scFv was changed to the VL-Linker-VH type, and the bispecific antibody in which the modification was introduced into the anti-CD3 scFv.
  • This is the result of measuring the cytotoxic activity.
  • the cytotoxic activity after 48 hours is shown, where the activity value of the well to which the test substance is not added is 0% and the activity value of the well to which Triton X-100 is added is 100%.
  • the vertical axis shows each bispecific antibody, and the horizontal axis shows cytotoxic activity (%).
  • 45D shows the bispecific antibody in which the modification was introduced into Fc (CH3), the bispecific antibody in which the anti-CD3 scFv was changed to the VL-Linker-VH type, and the bispecific antibody in which the modification was introduced into the anti-CD3 scFv.
  • the cytotoxic activity after 48 hours is shown, where the activity value of the well to which the test substance is not added is 0% and the activity value of the well to which Triton X-100 is added is 100%.
  • the vertical axis shows each bispecific antibody, and the horizontal axis shows cytotoxic activity (%).
  • FIG. 46A shows the bispecific antibody in which the modification was introduced into Fc (CH3), the bispecific antibody in which the anti-CD3 scFv was changed to the VL-Linker-VH type, and the bispecific antibody in which the modification was introduced into the anti-CD3 scFv. This is the result of measuring the amount of cytokine produced at the time of cell injury by flow cytometry.
  • FIG. 46 (A) shows the concentration of INF- ⁇ in the culture supernatant.
  • FIG. 46B shows a bispecific antibody in which a modification was introduced into Fc (CH3), a bispecific antibody in which an anti-CD3 scFv was converted into a VL-Linker-VH type, and a bispecific antibody in which a modification was introduced into an anti-CD3 scFv. This is the result of measuring the amount of cytokine produced at the time of cell injury by flow cytometry.
  • FIG. 46 (B) shows the concentration of IL-6 in the culture supernatant.
  • FIG. 46C shows the results of flow cytometry measurement of cytokine production at the time of cytotoxicity against BT-20 in a bispecific antibody in which a modification was introduced into Fc (CH3) and a bispecific antibody in which a modification was introduced into anti-CD3 scFv. be.
  • FIG. 46 (C) shows the concentration of INF- ⁇ in the culture supernatant.
  • FIG. 46D shows the results of flow cytometry measurement of cytokine production at the time of cytotoxicity against BT-20 in a bispecific antibody in which a modification was introduced into Fc (CH3) and a bispecific antibody in which a modification was introduced into anti-CD3 scFv. be.
  • FIG. 46 (D) shows the concentration of IL-6 in the culture supernatant.
  • FIG. 46E shows the bispecific antibody in which the modification was introduced into Fc (CH3), the bispecific antibody in which the anti-CD3 scFv was changed to the VL-Linker-VH type, and the bispecific antibody in which the modification was introduced into the anti-CD3 scFv. This is the result of measuring the amount of cytokine produced at the time of cell injury by flow cytometry.
  • FIG. 46 (E) shows the concentration of INF- ⁇ in the culture supernatant.
  • FIG. 46F shows the bispecific antibody in which the modification was introduced into Fc (CH3), the bispecific antibody in which the anti-CD3 scFv was changed to the VL-Linker-VH type, and the bispecific antibody in which the modification was introduced into the anti-CD3 scFv. This is the result of measuring the amount of cytokine produced at the time of cell injury by flow cytometry.
  • FIG. 46 (F) shows the concentration of IL-6 in the culture supernatant.
  • the present invention also describes a bispecific antibody containing an antigen-binding domain that binds to CD3 and an antigen-binding domain that binds to a disease-related antigen, or the bispecific antibody fragment (hereinafter, also referred to as the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention). To).
  • the bispecific antibody of the present invention includes a bispecific antibody containing a CD3 binding domain having a diminished affinity for CD3, a bispecific antibody containing an antigen-binding domain that binds to CD3, and an antigen-binding domain that binds to a disease-related antigen, and an Fc receptor.
  • the bispecific antibody of the present invention binds to both CD3 and disease-related antigens to generate cells expressing disease-related antigens in a T cell and / or NK cell-dependent manner without causing excessive cytokine production. Can be injured.
  • CD3 in the present invention is used as a synonym for CD3E, T3E, T-cell surface glycoprotein, CD3 epsilon chain.
  • CD3 for example, in NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), GenBank accession No. Human CD3 and GenBank accession No. containing the amino acid sequence set forth in NP_000724.1 or SEQ ID NO: 138. Examples thereof include monkey CD3 containing the amino acid sequence shown in NP_001270544.1 or SEQ ID NO: 139. Further, for example, SEQ ID NO: 138, GenBank accession No. NP_000724.1, SEQ ID NO: 139, or GenBank accession No. Examples thereof include polypeptides consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in NP_001270544.1, and having the function of CD3.
  • SEQ ID NO: 138 GenBank accession No. NP_000724.1, SEQ ID NO: 139, or GenBank accession No.
  • a polypeptide containing an amino acid sequence usually having 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more homology with the amino acid sequence shown in NP_001270544.1, most preferably 95% or more, 96% or more, 97.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence having a homology of% or more, 98% or more, and 99% or more and having a function of CD3 is also included in CD3 of the present invention.
  • SEQ ID NO: 138 GenBank accession No. NP_000724.1 or SEQ ID NO: 139, GenBank accession No.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in NP_001270544.1 is a site-specific mutagenesis method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • GenBank accession No. NP_000724.1 or SEQ ID NO: 139 GenBank accession No. It can be obtained by introducing a site-specific mutation into the DNA encoding the amino acid sequence shown in NP_001270544.1.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example, 1 to 20, more preferably 1 to several, for example, 1 to 5 amino acids. Is.
  • Examples of the gene encoding CD3 include SEQ ID NO: 141 or GenBank accession No. The nucleotide sequence of human CD3 shown in NM_0007333.3, and SEQ ID NO: 142 or GenBank accession No. Examples thereof include the base sequence of monkey CD3 shown in NM_001283615.1.
  • SEQ ID NO: 141 GenBank accession No. NM_0007333.3 or SEQ ID NO: 142, GenBank accession No.
  • a gene comprising a DNA encoding a polypeptide having the function of CD3, consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in NM_001283615.1.
  • SEQ ID NO: 141, GenBank accession No. NM_0007333.3 or SEQ ID NO: 142 GenBank accession No.
  • a gene consisting of a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in NM_001283615.1 and a DNA hybridizing under stringent conditions and containing a DNA encoding a polypeptide having the function of CD3 also encodes the CD3 of the present invention. Included in the gene.
  • Examples of the DNA that hybridizes under stringent conditions include SEQ ID NO: 141, GenBank accession No. NM_0007333.3 or SEQ ID NO: 142, GenBank accession No.
  • 0.7 to 1.0 mol / L sodium chloride is present using a filter or slide glass on which DNA derived from hybridized colonies or plaques, or PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized. Hybridization at 65 ° C. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), DNA Cloning 1: Core Tech , A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)], then 0.1 to 2 times the concentration of SSC solution (the composition of the 1 times concentration of SSC solution is 150 mmol / L sodium chloride, 15 mmol / L clone).
  • DNA that can be identified by washing the filter or slide glass under 65 ° C. conditions using (consisting of sodium chloride) can be mentioned.
  • Examples of the hybridizable DNA include SEQ ID NO: 141, GenBank accession No. NM_0007333.3 or SEQ ID NO: 142, GenBank accession No. DNA having a homology of 60% or more, more preferably DNA having a homology of 80% or more, and even more preferably a DNA having a homology of 95% or more with the base sequence shown in NM_001283615.1 can be mentioned. can.
  • Gene polymorphisms are often found in the base sequences of genes encoding eukaryotic proteins.
  • genes in which a small mutation in the base sequence is caused by such a polymorphism are also included in the genes encoding CD3 in the present invention.
  • the value of homology in the present invention may be a value calculated using a homology search program known to those skilled in the art, but for the base sequence, BLAST [J. Mol. Biol. For amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters in., 215, 403 (1990)], BLAST2 [Nucleic Acids Research, 25, 3389 (1997), Genome Research, 7, 649 (1997), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html] includes numerical values calculated using default parameters.
  • the default parameters are 5 when G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 when it is an amino acid sequence, 2 when -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 1 when it is an amino acid sequence.
  • -Q (Penalty for nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • -W (wordsize) is 11 residues, amino acid sequence.
  • -y [Dropoff (X) for blast extensions in bits] is 20, if it is blastn 7, 7 in programs other than blastn
  • -X X dropoff value for gapped sequences in-bits
  • a polypeptide consisting of a partial sequence of the amino acid sequence of CD3 can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • polypeptide or DNA produced by the above method for example, SEQ ID NO: 138, GenBank accession No. NP_000724.1 or SEQ ID NO: 139, GenBank accession No.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the partial sequence of the amino acid sequence shown in NP_001270544.1 can be obtained.
  • a polypeptide consisting of a partial sequence of the amino acid sequence of CD3, or a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the partial sequence of the amino acid sequence of CD3 is fluorenylmethyloxycarbonyl. It can also be produced by a chemical synthesis method such as the (Fmoc) method or the t-butyloxycarbonyl (tBoc) method.
  • GenBank accession No. The amino acid sequence of human CD3 shown in NP_000724.1 can be described by a known transmembrane region prediction program SOSUI (http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html), TMHMM ver. Areas predicted using 2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) or Expasy Proteomics Server (http://Ca.expasy.org/) can be mentioned.
  • SOSUI http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html
  • TMHMM ver. Areas predicted using 2 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
  • Expasy Proteomics Server http://Ca.expasy.org/
  • CD3 The function of CD3 is that it directly associates with the T cell receptor (TCR) to form the subunit structure of the protein complex, recognizes the antigen peptide bound to the major histocompatibility complex (MHC), and signals intracellularly. Is involved in the transmission of Examples of cells expressing CD3 include T cells, NKT cells, ⁇ T cells, progenitor cells thereof, and mature thymocytes.
  • TCR T cell receptor
  • MHC major histocompatibility complex
  • the disease-related antigen in the present invention may be any antigen as long as it is involved in each disease such as cancer, immune disease, allergic disease, autoimmune disease, central nervous system disease, or cardiovascular disease.
  • examples include cytokines, chemokines, growth factors and their receptors, and Cruster of differentiation (hereinafter referred to as CD) antigens.
  • receptors for cytokines or growth factors include interferon (hereinafter referred to as IFN) - ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , interleukin (hereinafter referred to as IL) -2, IL-3, IL-4. , IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL Examples include receptors for -23, IL-27, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), or macrophage colony stimulating factor (M-CSF).
  • chemokine receptors include receptors for SLC, ELC, I-309, TARC, MDC, MIP-3 ⁇ , and CTACK.
  • growth factor receptors include Epideral Growth Factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), angiopoietin, fibroblast growth factor (FGF), and hepto.
  • EGF Epideral Growth Factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • EPO erythropoitin
  • TGF ⁇ TGF ⁇
  • Eefrin angiopoietin
  • Frizzled rigid and SDF-1.
  • CD antigens include CD1a, CD1c (BDCA1), CD1d, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26 (DPP-4), CD27, CD28, CD30, CD32, CD34, CD37, CD38, CD39, CD40, CD43, CD44, CD45, CD47, CD49, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55 , CD56, CD57, CD59, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD66a (CEACAM1), CD66b (NCA-95), CD66c (NCA-50 / 90), CD66d (CGM1), CD66e (CEA), CD66f (PSG) , CD68, CD69, CD70, CD72, CD73, CD74, CD75, CD76, CD77, CD78, CD
  • antigens of antibodies relating to cancer, immune diseases, allergic diseases, autoimmune diseases, central nervous system or cardiovascular diseases, etc. include, for example, gangliosides GM1, GM2, GD2, GD3, Lewis X, Lewis Y, glypican-3. , Claudin, ASCT-2, CD3, CD4, CD40, CD40 ligands, B7 family molecules (eg, CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3 or B7-H4), B7 family molecule ligands.
  • CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 or BTLA OX-40, OX-40 ligand, CD137, tumor necrosis factor (TNF) receptor family molecules (eg, DR3, DR4, DR5, BAFFR, LIGHT, TNFR1 or TNFR2), TNF-related adaptosis-inducing ligand receptor (TRAIL) family molecules, receptor families of TRAIL family molecules (eg, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3 or TRAIL-R3) of nuclear factor cappa B led (RANK), RANK ligand, CD25, folic acid receptor, Mesothelin, SIGLEC8, cytokine / chemocaine receptor [eg IL-1RII, IL-12R ⁇ 2, IL-17RB, IL-23R, IL-27 , IL-31R, IL-33R ⁇ , IL-36R, transforming growth factor (TGF) ⁇ RII, CCR
  • TNF
  • the antibody of the present invention is a gene encoding all or a part of a variable region of a heavy chain and a constant region of a heavy chain constituting an immunoglobulin, and a variable region of a light chain and a constant region of a light chain (“antibody gene”). It is a protein derived from (referred to as).
  • the antibodies of the invention include antibodies or antibody fragments having any immunoglobulin class and subclass.
  • the heavy chain refers to the polypeptide having the larger molecular weight among the two types of polypeptides constituting the immunoglobulin molecule. Heavy chains determine antibody classes and subclasses. IgA, IgD, IgE, IgG and IgM each have an ⁇ chain, a ⁇ chain, a ⁇ chain, a ⁇ chain and a ⁇ chain as heavy chains, and the constant regions of the heavy chains are characterized by different amino acid sequences.
  • the light chain refers to the polypeptide having the smaller molecular weight among the two types of polypeptides constituting the immunoglobulin molecule. In the case of human antibodies, there are two types of light chains, ⁇ chain and ⁇ chain.
  • variable region usually refers to a region rich in diversity existing in the amino acid sequence on the N-terminal side of immunoglobulin.
  • the part other than the variable region has a structure with little diversity, and is therefore called a stationary region (C region).
  • the heavy and light chain variable regions associate to form an antigen-binding site, which determines the binding properties of an antibody to an antigen.
  • variable region is from the 1st to the 117th in the EU index (Kabat et. Al., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Fifth edition) (hereinafter, also simply referred to as the EU index) of Kabat et al. Corresponds to the amino acid sequence of, and the constant region corresponds to the amino acid sequence from the 118th position onward.
  • the amino acid sequences from the 1st to the 107th in the numbering by Kabat et al. correspond to the variable region
  • amino acid sequences from the 108th to the 108th correspond to the steady region.
  • the heavy chain variable region or the light chain variable region is abbreviated as VH or VL.
  • the antigen-binding site is a site that recognizes and binds to an antigen in an antibody, and refers to a site that forms a three-dimensional structure complementary to an antigenic determinant (epitope).
  • the antigen binding site produces a strong intermolecular interaction with the antigenic determinant.
  • the antigen binding site is composed of VHs and VLs containing at least three complementarity determining regions (CDRs). For human antibodies, VH and VL each have 3 CDRs. These CDRs are referred to as CDR1, CDR2, and CDR3 in order from the N-terminal side, respectively.
  • CH is classified by heavy chain subclasses ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain.
  • CH is composed of a CH1 domain, a hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain arranged in order from the N-terminal side, and the CH2 domain and the CH3 domain are collectively referred to as an Fc region.
  • CL is classified into two subclasses called C ⁇ chain and C ⁇ chain.
  • the anti-CD3 antibody of the present invention refers to a monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to the extracellular region of CD3.
  • the antibodies of the present invention also include polyclonal antibodies and oligoclonal antibodies.
  • the binding of a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment to a CD3 or a disease-related antigen can be caused by using, for example, a known immunological detection method, preferably a fluorescent cell staining method, or the like to be associated with the CD3 or the disease. It can be confirmed by a method for confirming the binding property between the cell expressing the antigen and the antibody.
  • a known immunological detection method preferably a fluorescent cell staining method, or the like to be associated with the CD3 or the disease.
  • known immunological detection methods [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third Edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)] and the like can also be used in combination.
  • a monoclonal antibody is an antibody secreted by an antibody-producing cell that retains monoclonality, and recognizes a single epitope (also referred to as an antigenic determinant).
  • Monoclonal antibody molecules have the same amino acid sequence (primary structure) and have a single structure.
  • Polyclonal antibody refers to a population of antibody molecules secreted by antibody-producing cells of different clones.
  • An oligoclonal antibody is a group of antibody molecules in which a plurality of different monoclonal antibodies are mixed.
  • Epitope refers to the structural site of an antigen that an antibody recognizes and binds to.
  • Examples of the epitope include a single amino acid sequence recognized and bound by a monoclonal antibody, a three-dimensional structure consisting of an amino acid sequence, an amino acid sequence to which a sugar chain is bound, and a three-dimensional structure consisting of an amino acid sequence to which a sugar chain is bound. ..
  • Examples of the monoclonal antibody of the present invention include an antibody produced by a hybridoma and a recombinant antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene.
  • Hybridomas can be prepared, for example, by preparing an antigen, obtaining antibody-producing cells having antigen specificity from an animal immunized with the antigen, and further fusing the antibody-producing cells with myeloma cells.
  • a desired monoclonal antibody can be obtained by culturing the hybridoma or administering the hybridoma to an animal to cause the hybridoma to become ascites cancer, and separating and purifying the culture solution or ascites.
  • the animal that immunizes the antigen any animal can be used as long as a hybridoma can be produced, but mice, rats, hamsters, rabbits and the like are preferably used.
  • cells having an antibody-producing ability can be obtained from such an immunized animal, the cells are immunized in vitro, and then fused with myeloma cells to produce a hybridoma.
  • recombinant antibody of the present invention examples include recombinant mouse antibody, recombinant rat antibody, recombinant hamster antibody, recombinant rabbit antibody, human chimeric antibody (also referred to as chimeric antibody), and humanized antibody (CDR transplanted antibody).
  • Antibodies produced by gene recombination technology such as human antibodies and human antibodies.
  • the chimeric antibody refers to an antibody consisting of VH and VL of an antibody of a non-human animal (non-human animal) and CH and CL of a human antibody.
  • non-human animal any mouse, rat, hamster, rabbit, etc. can be used as long as it is possible to produce a hybridoma.
  • cDNAs encoding VH and VL are obtained from a hybridoma derived from a non-human animal that produces a monoclonal antibody, and the cDNA is inserted into an expression vector for animal cells having DNA encoding CH and CL of the human antibody, respectively. It can be produced by constructing a chimeric antibody expression vector, introducing it into animal cells, and expressing it.
  • the humanized antibody refers to an antibody obtained by transplanting the CDRs of VH and VL of non-human animal antibodies into the corresponding CDRs of VH and VL of human antibodies. Regions other than CDRs of VH and VL are referred to as framework regions (hereinafter referred to as FR).
  • the humanized antibody consists of a cDNA encoding the VH amino acid sequence consisting of the VH CDR amino acid sequence of the non-human animal antibody and the VH FR amino acid sequence of any human antibody, and the VL CDR amino acid of the non-human animal antibody.
  • a cDNA encoding the VL amino acid sequence consisting of the sequence and the VL FR amino acid sequence of any human antibody is constructed and inserted into an expression vector for animal cells having DNA encoding CH and CL of the human antibody, respectively, for humans. It can be produced by constructing a humanized antibody expression vector, introducing it into animal cells and expressing it.
  • Human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library and a human antibody-producing trans produced by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering. Antibodies obtained from genetic animals are also included.
  • Antibodies that naturally exist in the human body are obtained by, for example, infecting human peripheral blood lymphocytes with EB virus or the like to immortalize them and cloning them to cultivate the lymphocytes that produce the antibodies. It can be obtained by purifying the antibody.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the surface of a phage by inserting an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene. From the library, phages expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule consisting of two complete H chains and two complete L chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is integrated into a cell.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, transplanting the ES cell into an early embryo of a mouse, and then generating an individual.
  • Human antibody-producing Human antibodies derived from transgenic animals are produced and accumulated in the culture supernatant by obtaining hybridomas using the hybridoma production method that is usually performed in non-human animals and culturing them. Can be prepared by.
  • the CH of the recombinant antibody may be any CH as long as it belongs to human immunoglobulin, but a human immunoglobulin G (hIgG) class is preferable. Further, any of the subclasses such as hIgG1, hIgG2, hIgG3 and hIgG4 belonging to the hIgG class can be used. Further, as the CL of the recombinant antibody, any one belonging to human immunoglobulin may be used, and one of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • hIgG human immunoglobulin G
  • the antibody fragment is a protein containing an antigen-binding site and having an antigen-binding activity against the antigen.
  • peptides containing Fab, Fab', F (ab') 2 , scFv, Diabody, dsFv, VHH or CDR can be mentioned.
  • Fab is a fragment obtained by treating an IgG antibody with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain), and about half of the N-terminal side of the H chain and the entire L chain are disulfides. It is an antibody fragment having an antigen-binding activity having a molecular weight of about 50,000, which is bound by binding (SS bond).
  • Fab polypeptide chains containing VH and CH1 are referred to as Fab heavy chains (H chains) or VH-CH1.
  • the polypeptide chain of Fab containing VL and CL is described as the light chain (L chain) of Fab or VL-CL.
  • F (ab') 2 is a fragment obtained by treating IgG with the proteolytic enzyme pepsin (cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain), and Fab is mediated by the SS bond in the hinge region. It is an antibody fragment having an antigen-binding activity having a molecular weight of about 100,000, which is slightly larger than that bound to the antibody.
  • Fab' is an antibody fragment having an antigen-binding activity having a molecular weight of about 50,000, which is obtained by cleaving the SS bond in the hinge region of F (ab') 2.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using a suitable peptide linker (P) of 12 residues or more, and antigen binding. It is an active antibody fragment.
  • Diabody is an antibody fragment in which scFv having the same or different antigen-binding specificity forms a dimer, and has a divalent antigen-binding activity for the same antigen or an antibody fragment having specific antigen-binding activity for different antigens. Is.
  • DsFv refers to a polypeptide in which each 1 amino acid residue in VH and VL is replaced with a cysteine residue, which is bound via an SS bond between the cysteine residues.
  • VHH also called Nanobody
  • VHH refers to the heavy chain variable region in a VHH antibody and can bind to an antigen in the absence of other polypeptides.
  • VHH antibody is an antibody present in camelids such as alpaca and cartilaginous fish such as sharks, and consists of only heavy chains without light chains and CH1.
  • the CDR-containing peptide is composed of at least one region of the CDR of VH or VL.
  • Peptides containing a plurality of CDRs can be prepared by binding the CDRs directly or via an appropriate peptide linker.
  • the peptide containing CDR constructs a DNA encoding the CDR of VH and VL of the bispecific antibody of the present invention, inserts the DNA into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and inserts the expression vector into a prokaryote. It can be expressed and produced by introducing it into an organism or eukaryote.
  • the peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • a bispecific antibody fragment is a bispecific antibody fragment that essentially consists of a partial structure of a bispecific antibody and has antigen-binding activity against two types of antigens.
  • a fusion protein in which a bispecific antibody fragment of the present invention is bound to an Fc region an Fc fusion protein in which the Fc region is bound to a naturally occurring ligand or receptor (also referred to as immunoadhesin), and a plurality of Fc regions.
  • Fused Fc fusion proteins and the like are also included in the present invention.
  • an Fc region containing amino acid residue modification for the purpose of enhancing or deleting the effector activity of the antibody, stabilizing the antibody, and controlling the half-life in blood can also be used for the bispecific antibody of the present invention.
  • the bispecific antibody of the present invention refers to a polypeptide or protein having two types of antigen-binding domains having different specificities. Each antigen-binding domain of a bispecific antibody may bind to a different epitope of a single antigen or may bind to a different antigen.
  • an antigen-binding domain is a partial structure having a function of specifically recognizing and binding an antigen.
  • the antigen-binding domain of the present invention includes, for example, an antibody, an antibody fragment thereof, a ligand, a receptor, and a polypeptide, a protein molecule and a fragment thereof, which can be produced by gene recombination technology such as a naturally occurring interacting molecule, and the fragment thereof. It may be in any form, such as a small molecule of a protein molecule or a conjugate with a natural product.
  • the two antigen-binding domains of the bispecific antibody of the present invention are a CD3 binding domain and a disease-related antigen-binding domain.
  • a plurality of disease-related antigen-binding domains may be the same antigen or different antigen-binding domains.
  • the bispecific antibody of the present invention contains an Fc region capable of binding to an Fc receptor, a CD3 binding domain and a disease-related antigen binding domain, and the C-terminal of the Fc region binds to the CD3 binding domain directly or via a linker. doing.
  • the CD3 binding domain in the present invention refers to an antigen binding domain that binds to CD3.
  • the disease-related antigen-binding domain in the present invention refers to an antigen-binding domain that binds to a disease-related antigen.
  • the CD3 binding domain in the present invention may be any CD3 binding domain as long as it specifically recognizes and binds to CD3, but a CD3 binding domain containing a CDR sequence derived from an anti-CD3 antibody and a CD3 binding containing VH and VL derived from an anti-CD3 antibody. Domains and the like. ScFv is preferred as the CDR sequence derived from the anti-CD3 antibody or the CD3 antigen binding domain containing VH and VL.
  • the disease-related antigen-binding domain may be anything as long as it specifically recognizes and binds to the disease-related antigen, but is preferably a variable region consisting of Fab or VH and VL of the antibody.
  • the binding of a polypeptide, antibody or antibody fragment thereof or bispecific antibody or bispecific antibody fragment to CD3 and / or disease-related antigen is described, for example, by known immunological detection methods, preferably fluorescent cells. It can be confirmed by a method of confirming the binding property between the antibody and the cell expressing the antigen to be evaluated by using a staining method or the like.
  • known immunological detection methods [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third Edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)] and the like can also be used in combination.
  • the bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody of the present invention includes, for example, an anti-CD3 bispecific in which the CD3 binding domain contains a CD3 binding domain derived from the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 (US Pat. No. 10,066,015).
  • anti-CD3 bispecific antibodies in which the ability to induce cytokine production in the presence of CD3-positive T cells and disease-related antigen-positive cells is reduced as compared with antibodies.
  • Such a bispecific antibody or the bispecific antibody fragment has few side effects such as chills, nausea, malaise, headache, fever, tachycardia, and / or blood pressure fluctuation associated with cytokine production, and is less likely to cause cytokine release syndrome. Is preferable.
  • the ability to induce cytokine production means that the bispecific antibody of the present invention or the bispecific antibody fragment thereof binds to CD3 on T cells, Fc receptors on NK cells and / or disease-related antigens on target cells. This refers to the activity of inducing cytokine production by the T cells, the target cells, NK cells, and the like.
  • the cytokine whose production is preferably reduced may be any cytokine as long as it is a cytokine associated with the side effects of excess or unnecessary cytokine production described above.
  • interferon- ⁇ IFN- ⁇
  • tumor examples thereof include inflammatory cytokines such as necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ) and interleukin-6 (IL-6), IL-2, IL-4 and IL-10.
  • the bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody of the present invention preferably binds to CD3 and a disease-related antigen expressed on different cells.
  • the bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody of the present invention preferably induces cell death of the target cell by binding to CD3 on the T cell and a disease-related antigen on the target cell, and is a CD3-positive T cell. And, in the presence of the target cell, only the target cell is specifically injured, and in the absence of the CD3 positive cell or the absence of the target cell, it is more preferable that the cytotoxic activity is not exhibited.
  • Examples of the mechanism of cytotoxic activity of the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention include ADCC activity, CDC activity, ADCP activity and ADTC activity.
  • bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody of the present invention specifically, when bound to both CD3 positive cells and disease-related antigen-positive cells, cytotoxicity and / or cells of the disease-related antigen-positive cells.
  • examples thereof include a bispecific antibody that specifically induces death, a bispecific antibody fragment thereof, and the like.
  • the number of binding domains to a certain antigen possessed by one molecule of bispecific antibody is called the binding valence.
  • the binding valence For example, in the present invention, if a single molecule of bispecific antibody has two antigen-binding domains that bind to CD3 and two antigen-binding site domains that bind to disease-specific antigens, such bispecific antibodies are CD3 and disease-specific. It binds to each target antigen in a divalent manner.
  • the bispecific antibody of the present invention also includes an antibody containing a plurality of antigen-binding domains bound via an appropriate linker, such as a linker containing an immunoglobulin domain or a fragment thereof.
  • the smallest unit of the immunoglobulin domain used as a linker in the present invention is a peptide consisting of about 100 amino acid residues having an amino acid sequence similar to that of immunoglobulin and having at least 2 cysteine residues.
  • the immunoglobulin domain also includes a polypeptide containing a plurality of the above-mentioned minimum unit immunoglobulin domains.
  • Immunoglobulin domains include, for example, VH, CH1, CH2 and CH3 of immunoglobulin heavy chains, and VL and CL of immunoglobulin light chains.
  • the animal species of immunoglobulin is not particularly limited, but it is preferably human.
  • the subclass of the constant region of the immunoglobulin heavy chain may be any of IgD, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 and IgE, preferably IgG-derived and IgM-derived.
  • the subclass of the constant region of the immunoglobulin light chain may be either ⁇ or ⁇ .
  • Immunoglobulin domains are also present in proteins other than immunoglobulins, such as immunoglobulin domains contained in proteins belonging to the immunoglobulin superfamily such as major histocompatibility complex (MHC), CD1, B7 and T cell receptor (TCR). Can be mentioned. Any immunoglobulin domain can be applied as the immunoglobulin domain used for the bispecific antibody of the present invention.
  • immunoglobulin domains contained in proteins belonging to the immunoglobulin superfamily such as major histocompatibility complex (MHC), CD1, B7 and T cell receptor (TCR).
  • MHC major histocompatibility complex
  • CD1, B7 CD1, B7 and T cell receptor (TCR).
  • TCR T cell receptor
  • CH1 refers to the region having the 118th to 215th amino acid sequences indicated by the EU index.
  • CH2 refers to the region having the 231st to 340th amino acid sequences indicated by the EU index of Kabat et al.
  • CH3 refers to the region having the 341st to 447th amino acid sequences indicated by the EU index of Kabat et al. ..
  • a hinge region there is a highly flexible amino acid region called a hinge region (hereinafter sometimes referred to as a hinge).
  • the hinge region refers to the region having the amino acid sequences 216 to 230 indicated by the EU index of Kabat et al.
  • CL is a region having the 108th to 214th amino acid sequences indicated by Kabat numbering in the case of the ⁇ chain of a human antibody, and the region having the 108th to 215th amino acid sequences in the case of the ⁇ chain. Refer to each.
  • an Fc region contained in the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention an Fc region derived from an antibody of any animal species can be used, but a human-derived Fc region is preferable, and an IgG1-derived Fc region is particularly preferable. preferable.
  • the "Fc region having the ability to bind to the Fc receptor” refers to an Fc region having the ability to bind to various Fc receptors beyond the extent to which effector activity such as ADCC activity is exerted via the Fc receptor.
  • Specific examples thereof include an Fc region of human IgG1, an Fc region of human IgG3, and an Fc region of mouse IgG2a.
  • an Fc region having an enhanced ability to bind to an Fc receptor is also included in the Fc region having an ability to bind to an Fc receptor.
  • the Fc region having the ability to bind to the Fc receptor contained in the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention
  • the Fc region having the ability to bind to Fc ⁇ R is preferable, and the Fc having the ability to bind to Fc ⁇ RIIIA is preferable. Regions are more preferred.
  • the Fc region having the ability to bind to the Fc receptor possessed by the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention
  • the Fc region having enhanced affinity for the Fc receptor is also preferable.
  • the Fc region having an enhanced affinity for the Fc receptor may be any Fc region having an enhanced affinity for the Fc receptor as compared with the Fc region of a naturally occurring antibody. Examples thereof include an Fc region containing an amino acid residue, an Fc region containing an amino acid residue modification, and the like.
  • Fc containing sugar chain modification includes, for example, an Fc region in which the addition amount of ⁇ 1,6 fucose is reduced or deleted, or an amino acid modification in which the affinity for the Fc receptor is enhanced (natural amino acid residue, non-natural amino acid residue). Examples include the Fc region to which the group has been modified).
  • Fc regions containing amino acid residue modifications include, for example, P247I, A339D, F243L, R292P, Y300L, P396L, T393A, H433P, S239D, S298A, A330L, I332E, E333A and K334A, and Current Opinion in Biotechnology in the human IgG1 constant region. 2009, 20: Fc region containing at least one amino acid residue modification selected from the amino acid modifications described in 685-691.
  • the Fc region or antibody constant region is preferably of the IgG class, and a part of their amino acid sequences may be deleted, added, substituted, and / or inserted.
  • all or part of the amino acid sequence consisting of CH1, hinge, CH2 and CH3 of the heavy chain of IgG can be used in appropriate combination.
  • those amino acid sequences can be partially deleted or used in a different order.
  • the IgG subclass of the Fc region or antibody constant region used in the bispecific antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an Fc region or constant region derived from any of the IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 subclasses. IgG1 is preferred.
  • the Fc region or the Fc region containing, for example, the deletion of amino acid residues 216 to 220 in the hinge region and at least one modification selected from the amino acid residue modifications of C220S, H435R and Y436F.
  • Examples include the Fc region containing the modification or the heavy chain constant region.
  • the two polypeptide chains constituting the Fc region of the present invention are also referred to as Fc polypeptide chains or simply Fc chains, respectively.
  • the Fc region in the present invention is composed of an Fc region consisting of an "Fc chain” and an "Fc chain in which a CD3 binding domain is bound to the C-terminal of the Fc chain".
  • the heavy chain constant region including the Fc region in the present invention
  • the heavy chain constant region consisting of "CH polypeptide chain” and “CH chain in which the CD3 domain is bound to the C-terminal of the CH polypeptide chain” " It is a constant region consisting of a polypeptide chain of CH (also referred to as CH1-Fc) and a polypeptide chain in which CL is fused to the Fc chain (hereinafter abbreviated as CL-Fc), and is one of them.
  • CL-Fc polypeptide chain in which CL is fused to the Fc chain
  • Examples thereof include a constant region in which a CD3 binding domain is bound to the C-terminal of a polypeptide chain.
  • the CD3 binding domain may be bound to any of the two polypeptide chains constituting the Fc region or the constant region described above.
  • VH or VL, VH-CH or VL-CL constituting a CD3 binding domain can also be prepared by binding VH or VL, VH-CH or VL-CL constituting a CD3 binding domain to each of the polypeptide chains contained in the Fc region or the heavy chain constant region.
  • the Fc region or constant region contained in the bispecific antibody of the present invention is a heterodimer because the CD3 binding domain is bound to either one of the two polypeptide chains constituting each region.
  • Any modification of addition, deletion, or substitution may be included as long as the present heterodimeric structure can be constructed.
  • a heterodimer in the case of two Fc polypeptide chains or CH polypeptide chains, can be formed by adding an appropriate amino acid residue substitution to the CH3 domain, for example, two Fc polypeptides.
  • Heterodimers in the Fc region or CH region can be formed by adding amino acid residue substitutions of S354C and T366W to one of the chains and amino acid residue substitutions of Y349C, T366S, L368A and Y407V to the other. [Knobs into Holes modification (Nature Biotechnology, vol 16: 677-681, 1998)]. This modification is also called KIH modification.
  • KIH modification When KIH modification is applied to the Fc region contained in the bispecific antibody of the present invention, which polypeptide chain is bound to which of the two polypeptide chains constituting the Fc region has the CD3 binding domain. Knobs modification and Holes modification may be added to the above. Further, a KIH modification other than the modification (S354C and Y349C) that constitutes a disulfide bond in the CH3 moiety can also be applied. In that case, the amino acid residue substitution of T366W is added to one of the two Fc polypeptide chains, and the amino acid residue substitution of T366S, L368A and Y407V is added to the other.
  • Examples of the specific amino acid sequence of the Fc region into which the KIH modification has been introduced are not limited to this, but are represented by the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 147 and SEQ ID NO: 148.
  • Fc region containing a polypeptide containing an amino acid sequence an Fc region containing a polypeptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 149 and a polypeptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 150, represented by SEQ ID NO: 151.
  • Examples include the Fc region containing the polypeptide comprising.
  • hetero CH region a CH polypeptide chain and a hetero CH region containing CL-Fc can be mentioned, but a CH polypeptide chain containing C220S and 216- Deficiency of amino acid residue of 220 and CH region containing CL-Fc containing C214S, CH polypeptide containing C220S, and deficiency of amino acid residue of 216-220, CH region containing CL-Fc containing C214S and H435R, More preferred are CH polypeptides containing C220S, as well as a missing amino acid residue of 216-220, a CH region containing CL-Fc containing C214S, H435R and Y436F.
  • the CD3 binding domain of the present invention may be a single chain or a multimer consisting of a plurality of polypeptide chains as long as it has an antigen-binding ability to CD3.
  • Examples of CD3 antigen binding domains include CD3 binding domains containing 3 or 6 CDR sequences of antibodies against CD3, or CD3 binding domains containing VH and VL of antibodies against CD3, such as Fab, Fab', scFv, dsFv. And VHH are preferred, and Fab and scFv are more preferred.
  • a ligand molecule or a receptor molecule for a cell surface antigen can be used in the same manner.
  • scFv is bound in the order of VH, linker, VL from the N-terminal side (also referred to as VH-linker-VL type or HL type), and VL, linker, VH.
  • VH-linker-VL type or LH type Those bound in the order of (VL-linker-VH type or LH type) are known, and both of them can be used for scFv of the present invention.
  • the framework of scFv may be modified.
  • the modification include modification to enhance physicochemical stability, modification to improve productivity, modification of amino acids on the interaction surface of VH and VL of scFv, and the like.
  • a modification (CC modification) in which the 44th amino acid (according to Kabat numbering) of scFv VH is replaced with Cys and the 100th amino acid (according to Kabat numbering) of VL is replaced with Cys, and the 44th amino acid of VH.
  • Modifications (SE modification) in which the amino acid is replaced with Ser and the 100th amino acid of VL is replaced with Glu can be mentioned.
  • the affinity of the CD3 binding domain of the present invention for CD3 is preferably attenuated.
  • CD3 and Affinity binding domain has reduced, indicating that for instance the dissociation constant for CD3 (K D) is 6 ⁇ 10 -8 or more.
  • CD3 binding domain of the dissociation constant for CD3 (K D) is more preferably 7 ⁇ 10 -8 or more, still more preferably 8 ⁇ 10 -8 or more, it is 9 ⁇ 10 -8 or more Even more preferable.
  • the attenuated affinity of the CD3 binding domain for CD3 indicates that, for example, the dissociation constant for CD3 is larger than that of the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or KM14.
  • the dissociation constant of the CD3 binding domain of the present invention includes, for example, a value calculated by the surface plasmon resonance (SPR) method using Biacore T100 (GE Healthcare).
  • the amino acid sequence of CDR or VH / VL is 80% or more, 85, compared to the amino acid sequence of CDR or VH / VL of the comparative anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or KM14. % Or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more , 98% or more, or 99% or more homology, and the affinity for CD3 is preferably 10% or more, more preferably 20% or more, still more preferably 30% or more lower than SP34 or KM14. There are things.
  • the amino acid sequence of CDR or VH / VL is 80% or more, 85% or more, 86% or more, 87 as compared with the amino acid sequence of the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 which is a comparative control. % Or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% Examples thereof include those having the above homology and having an affinity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more lower than that of SP34.
  • the amino acid sequence of CDR or VH / VL is 80% or more, 85% or more, 86% or more as compared with the amino acid sequence of the anti-CD3 monoclonal antibody KM14 which is a comparative control. , 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or Those having 99% or more homology and having an affinity of preferably 10% or more, more preferably 15% or more, still more preferably 30% or more, still more preferably 40% or more lower than KM14. Can be mentioned.
  • the affinity is decreased by more than A%, when the dissociation constant to the dissociation constant for the CD3 of comparison CD3 binding domain for K D0, CD3 subjects CD3 binding domain was K D1, is the ratio It means that KD0 / KD1 is (100-A)% or less.
  • an antibody containing the amino acid sequences of VH and VL of the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or the amino acid sequences of the six CDRs of SP34 is referred to as an SP34 clone.
  • an antibody containing the amino acid sequences of VH and VL of the anti-CD3 monoclonal antibody KM14 or the amino acid sequences of 6 CDRs of KM14 is referred to as a KM14 clone.
  • the linker may have any molecular structure as long as it can bind the Fc region and the CD3 binding domain, or the Fc region and the disease-related antigen binding domain, and examples thereof include an immunoglobulin domain or a fragment thereof and a peptide chain.
  • peptide chains are preferred.
  • the amino acid sequence of the peptide chain include a so-called GS linker consisting of a repeating sequence of SGGGG or SGGGG, a linker consisting of EAAAK or a repeating sequence thereof, a linker consisting of an amino acid sequence called PAPAP, or a hinge region of an antibody and a CH1 domain.
  • Examples thereof include a sequence derived from a constant region or a modified sequence thereof.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention may have one disease-related antigen-binding domain or two or more.
  • the disease-related antigen-binding domain may be directly bound to the Fc region or may be bound via a linker. Further, it may be bound to the C-terminal side of the Fc region or may be bound to the N-terminal side, but it is preferably bound to the C-terminal side. When one CD3 binding domain is bound to the C-terminal side of the Fc region, the CD3 binding domain may be bound to either of the two polypeptide chains constituting the Fc region.
  • the disease-related antigen-binding domain in the present invention may be a single chain or a multimer consisting of a plurality of polypeptide chains as long as it has an antigen-binding ability to the disease-related antigen.
  • the disease-related antigen-binding domain include an antigen-binding domain containing 3 or 6 CDR sequences of an antibody against a disease-related antigen, or an antigen-binding domain containing VH and VL of an antibody against a disease-related antigen, and Fab, Fab. ', ScFv, dsFv, VHH and the like can be mentioned, but it is preferably an antigen-binding domain or Fab consisting of VH and VL.
  • a ligand molecule or a receptor molecule for a cell surface antigen can be used in the same manner.
  • a monoclonal antibody As an antibody against a disease-related antigen, a monoclonal antibody is preferable, and a gene such as a monoclonal antibody known to specifically recognize and bind to an antigen related to each disease and a monoclonal antibody already marketed as an antibody drug is available. Any antibody having any specificity as long as it is a recombinant antibody can be used as a disease-related antigen-binding domain contained in the anti-CD3 bispecific antibody of the present invention.
  • the bispecific antibody of the present invention In the amino acid sequence constituting the bispecific antibody of the present invention or the bispecific antibody fragment, one or more amino acid residues are deleted, added, substituted or inserted, and the activity is similar to that of the above-mentioned antibody or antibody fragment thereof.
  • the antibody or the bispecific antibody fragment having the antibody is also included in the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention.
  • the number of amino acids deleted, substituted, inserted and / or added is one or more and the number is not particularly limited, but Molecular Cloning, The Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Deletion, substitution, insertion or addition by well-known techniques such as site-specific mutagenesis methods described in Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985), etc. It is as many as possible. For example, it is usually 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 5.
  • deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the bispecific antibody of the present invention described above indicates the following. It means that there is a deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in any and one or more amino acid sequences in the same sequence. Deletions, substitutions, insertions or additions may occur simultaneously, and the amino acid residues substituted, inserted or added may be either natural or non-natural.
  • Natural amino acid residues include, for example, L-alanine, L-aspartin, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L. -Arginine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and L-cysteine and the like.
  • amino acid residues that can be replaced with each other are preferable examples of amino acid residues that can be replaced with each other.
  • Amino acid residues contained in the same group can be replaced with each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadiponic acid, 2-aminosveric acid
  • Group C aspartic acid, glutamic acid
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenylalanine, tyrosine
  • the bispecific antibody of the present invention includes an antibody containing any post-translationally modified amino acid residue.
  • Post-translational modifications include, for example, deletion of the lysine residue at the C-terminus of the H chain [lysine clipping] and replacement of the glutamine residue at the N-terminus of the polypeptide with glutamine (pyroGlu). [Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736 (2013)].
  • bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention include any one of the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment selected from the group consisting of the following (1) to (3). Be done. (1) It contains an Fc region capable of binding to an Fc receptor, one CD3 binding domain is bound to the C-terminal side of the Fc region, and one disease-related antigen binding domain is further bound to the N-terminal side of the Fc region. An anti-CD3 bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody, comprising one or more. (2) It contains an Fc region capable of binding to an Fc receptor, one CD3 binding domain is bound to the C-terminal side of the Fc region, and one disease-related antigen binding domain is further bound to the C-terminal side of the Fc region.
  • An anti-CD3 bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody comprising one or more. (3) It contains an Fc region capable of binding to an Fc receptor, one CD3 binding domain is bound to the C-terminal side of the Fc region, and one disease-related antigen binding domain is further bound to the C-terminal side of the Fc region.
  • An anti-CD3 bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody which comprises one or more and contains one or more disease-related antigen-binding domains on the N-terminal side of the Fc region.
  • the Fc region is a Knobs into Holes modification (Nature Biotechnology. Vol 16: 677-681) in the CH3 portion. , 1998) (also referred to as KIH modification) or a modification obtained by removing the modification for forming a disulfide bond (S354C and Y349C) from the KIH modification to form a heterodimer, and one of the heterodimers.
  • a bispecific antibody in which a CD3 binding domain is bound to the C-terminal of the heterodimer via a linker and a bispecific antibody or the bispecific antibody in which a disease-related antigen-binding domain is bound to one or both of the N-terminals of the heterodimer.
  • Specific antibody fragments can be mentioned.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to (1) above in which CL and CH1 are bound to the N-terminal side of two polypeptide chains in the Fc region, respectively.
  • Bispecific antibody fragment, (A) A bispecific antibody or a bispecific antibody fragment thereof, in which VH and VL are bound to the N-terminals of CH1-Fc and CL-Fc, respectively, to form one disease-related antigen-binding domain.
  • (B) A bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody fragment in which VL and VH bind to the N-terminus of CH1-Fc and CL-Fc, respectively, to form one disease-related antigen-binding domain
  • (c) CH1- Examples thereof include bispecific antibodies or fragments thereof in which Fab, VHH, and / or scFv bind to the N-terminus of Fc and / or CL-Fc and contain one or more disease-related antigen-binding domains.
  • VL and VH, or VH and VL, respectively are bound to the N-terminal of CH1-Fc and CL-Fc, respectively, and VH and VL are bound to the N-terminal of CH1-Fc and CL-Fc, respectively. It is more preferable to do so.
  • the amino acid sequences of CH1-Fc and CL-Fc are modified so as to form a heterodimer when expressed in cells.
  • CL-Fc 216-220.
  • the deletion and the amino acid residue modification of C214S, H435R, and Y436F include the amino acid residue modification of C220S in CH1-Fc. Both of these modifications may be introduced, the above-mentioned KIH modification or the modification obtained by removing the modification for forming a disulfide bond from the KIH modification.
  • Disease-related antigen-binding domains include variable regions consisting of Fab, VH and VL, VHH and scFv and the like. Specifically, it is preferable that Fab is bound to both the N-terminals of the heterodimer as a disease-related antigen-binding domain. It does not matter which of the polypeptide chains of VH-CH1 and VL-CL forming the Fab is bound to the N-terminal of the Fc region, but it is more preferable that VH-CH1 is bound.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment described in (2) above in which CL and CH1 are bound to the N-terminal side of two polypeptide chains in the Fc region, respectively. It is a bispecific antibody that forms a heterodimer of CH1-Fc and CL-Fc and has a CD3 binding domain bound to the C-terminal of either CH1-Fc or CL-Fc via a linker. , CH1-Fc and / or CL-Fc to the C-terminal side, Fab, VHH, and / or scFv as a disease-related antigen-binding domain, bispecific antibody or the bispecific antibody fragment thereof.
  • the disease-related antigen-binding domain is bound to the C-terminal side of the CD3 binding domain regardless of whether it is directly bound to CH1-Fc and / or CL-Fc or via a linker. May be good.
  • the amino acid sequence of the heterodimer it is preferable that the amino acid is modified so as to form a heterodimer when expressed in cells.
  • CL-Fc lacks 216-220 amino acid residues, and It is desirable that the amino acid residue modifications of C214S, H435R, and Y436F are the amino acid residue modifications of C220S in CH1-Fc.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to the above (2) in which the Fc region is modified with Knobs into Holes or the KIH modification other than S354C and Y349C.
  • the disease-related antigen-binding domain include antibody variable regions consisting of Fab, VH and VL, VHH, and scFv.
  • the disease-related antigen-binding domain may be directly bound to CH1-Fc and / or CL-Fc, may be bound via a linker, or may be further bound to the C-terminal side of the CD3 binding domain.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to (3) above in which CL and CH1 are bound to the N-terminal side of two polypeptide chains in the Fc region, respectively.
  • It is a bispecific antibody that forms a heterodimer consisting of CH1-Fc and CL-Fc, and has a CD3 binding domain bound to the C-terminal of either CH1-Fc or CL-Fc via a linker. It has one or more disease-related antigen-binding domains on the N-terminal side of CH1-Fc and CL-Fc, and one or more disease-related antigen-binding domains on the C-terminal side of CH1-Fc and CL-Fc.
  • Bispecific antibody having the above or the bispecific antibody fragment thereof can be mentioned.
  • Disease-related antigen-binding domains that bind to the N-terminus of CH1-Fc and / or CL-Fc have VH and VL (or VL and VH, respectively) bound to the N-terminus of CH1-Fc and CL-Fc, respectively. It may form one disease-related antigen-binding domain, or Fab, VHH, and / or scFv bind to at least one N-terminus of CH1-Fc and CL-Fc to form at least one disease-related antigen. It may form a binding domain.
  • VH and VL are bound to the N-terminal of CH1-Fc and CL-Fc, respectively, to form one disease-related antigen-binding domain. It is preferable that VH and VL are bound to the N-terminals of CH1-Fc and CL-Fc, respectively.
  • the disease-related antigen-binding domain bound to the C-terminal side of CH1-Fc and / or CL-Fc may be directly bound to these polypeptide chains or may be bound via a linker. However, it may be bound via the CD3 binding domain.
  • Examples of the disease-related antigen-binding domain include Fab, VHH, and scFv.
  • amino acid sequences of CH1-Fc and CL-Fc are modified so as to form a heterodimer when expressed in cells, and specifically, the amino acids 216-220 in CL-Fc. It is preferable that the residue deletion and the amino acid residue modification of C214S, H435R, and Y436F are the amino acid residue modification of C220S in CH1-Fc.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to the above (3) in which the Fc region is modified with Knobs into Holes or the KIH modification other than S354C and Y349C.
  • examples thereof include a bispecific antibody having a domain or a bispecific antibody fragment thereof.
  • Disease-related antigen-binding domains include, for example, Fab, VHH, scFv and the like.
  • Fab is bound to the N-terminal side of the heterodimer as a disease-related antigen-binding domain, which of the polypeptide chains of VH-CH1 and VL-CL forming the Fab binds to the N-terminal of the Fc region. It may be, but it is more preferable that VH-CH1 is bound.
  • the disease-related antigen-binding domain bound to the C-terminal side of the heterodimer may be directly bound to the C-terminal of the heterodimer, may be bound via a linker, or may be bound to CD3. It may be further bound to the C-terminal side of the domain.
  • an Fc region having an enhanced affinity for the Fc receptor can also be used as the Fc region having an ability to bind to the Fc receptor.
  • the C-terminal of the Fc region is formed by binding VH and VL constituting the CD3 binding domain to the two polypeptide chains constituting the Fc region, respectively.
  • An anti-CD3 bispecific antibody or a fragment of the bispecific antibody can be prepared by binding one CD3 binding domain to the antibody.
  • the anti-CD3 bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention can also be produced by using a known heterodimer production technique in addition to the above.
  • Known technologies include, for example, CrossMAb technology, BEAT technology, XmAb technology, ART-Ig technology, and Azymetric technology (all described in Nat Rev Drug Discov. 18: 585-608, 2019), and Nat Rev Drug Discov. 18 : Other heterodimer fabrication techniques described in 585-608, 2019 can be mentioned.
  • a more preferable aspect of the present invention is a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment in which the CD3 binding domain is scFv.
  • the dissociation constant for CD3 CD3 binding domain is 6 ⁇ 10 -8 or more, 7 ⁇ 10 -8 or more, 8 ⁇ 10 -8 or more, or 9 ⁇ 10 -8
  • examples thereof include the above-mentioned bispecific antibody or the bispecific antibody fragment.
  • One aspect of the present invention includes a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment thereof in which the dissociation constant of the CD3 binding domain with respect to CD3 is larger than that of the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or KM14, which is a comparative control.
  • the CDR or VH / VL amino acid sequence of the CD3 binding domain is 90% or more of the CDR or VH / VL amino acid sequence of the CD3 binding domain of the comparative anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or KM14.
  • examples thereof include a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment thereof having the homogeneity of the above and having an affinity reduced by 10% or more as compared with the anti-CD3 antibody SP34 or KM14.
  • a more preferable aspect of the present invention is a bispecific antibody having ADCC activity and ADTC activity against disease-related antigen-expressing cells and suppressing induction of cytokine production at the time of cytotoxicity of disease-related antigen-expressing cells.
  • the amino acid sequences of CDR1 to 3 (HCDR1 to 3) of VH and CDR1 to 3 (LCDR1 to 3) of VL of the CD3 binding domain are as follows (a) to (h). Examples thereof include CD3 binding domains having 90% or more homology with the amino acid sequences of any one of HCDR1 to 3 and LCDR1 to 3 selected from the above.
  • the amino acid sequences of VH and VL of the CD3 binding domain are 80% or more of the amino acid sequences of any one of VH and VL selected from the following (aa) to (rr), respectively.
  • CD3 binding domains having the same homology of.
  • Aa VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 124, and VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 125.
  • Bb VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 115, and VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 116.
  • the CD3 binding domain in the present invention competes with the CD3 binding domain containing any one selected from the above (a) to (h), (aa) to (rr) and the anti-CD3 monoclonal antibodies SP34 and KM14 to form CD3.
  • the CD3 binding domain to which it binds the CD3 binding domain containing any one selected from the above (a) to (h), (aa) to (rr) and the anti-CD3 monoclonal antibodies SP34 and KM14, binds to an epitope on CD3 to which it binds.
  • CD3 binding domain containing any one selected from the above (a) to (h), (aa) to (rr) and anti-CD3 monoclonal antibodies SP34 and KM14 binds.
  • Examples of the epitope present on the CD3 molecule to which the CD3 binding domain of the present invention binds include the amino acid sequence from the N-terminal to the 27th amino acid sequence of human CD3. Since both the anti-CD3 monoclonal antibodies SP34 and KM14 bind to this epitope, at least one amino acid residue contained in the amino acid sequence from the N end to the 27th amino acid sequence of CD3 is preferably used as the epitope of CD3 in the present invention. Examples thereof include an epitope containing the above, an epitope having a three-dimensional structure consisting of the amino acid sequence, and the like.
  • the above-mentioned antibody that competes with the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 and / or KM14, and the antibody that binds to the epitope to which the antibody binds, is an antibody binding assay using the 1-27 amino acid sequence of the human CD3 amino acid sequence. Can be obtained by performing.
  • Specific examples of the anti-CD3 bispecific antibody of the present invention include the bispecific antibody containing the above-mentioned CD3 binding domain.
  • the CD3 binding domain of the present invention can also be applied to the purpose of producing an anti-CD3 bispecific antibody in which the ability to induce cytokine production is suppressed, and the purpose of suppressing the excessive induction of cytokine production of the anti-CD3 bispecific antibody.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention also includes a bispecific antibody or the bispecific antibody fragment having an effector activity.
  • Effector activity refers to antibody-dependent cellular cytotoxicity caused via the Fc region of an antibody, for example, ADCC activity, complement-dependent cytotoxicity (CDC activity), macrophages and trees. Examples thereof include antibody-dependent phagocytosis activity (ADCP activity) and opsonin effect by phagocytic cells such as dendritic cells.
  • ADCP activity antibody-dependent phagocytosis activity
  • opsonin effect by phagocytic cells such as dendritic cells.
  • ADCC activity and CDC activity can be measured using a known measuring method [Cancer Immunol. Immunoother., 36, 373 (1993)].
  • ADCC activity means that an antibody bound to an antigen on a target cell activates an immune cell (natural killer cell, etc.) by binding to an Fc receptor of the immune cell via the Fc region of the antibody, and damages the target cell. The activity to do.
  • the Fc receptor is a receptor that binds to the Fc region of an antibody, and induces various effector activities by binding the antibody.
  • Each FcR corresponds to a subclass of antibody, and IgG, IgE, IgA, and IgM specifically bind to Fc ⁇ R, Fc ⁇ R, Fc ⁇ R, and Fc ⁇ R, respectively.
  • Fc ⁇ R has subtypes of Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RII (CD32) and Fc ⁇ RIII (CD16), each of which is an isoform of Fc ⁇ RIA, Fc ⁇ RIB, Fc ⁇ RIC, Fc ⁇ RIIA, Fc ⁇ RIIB, Fc ⁇ RIIC, Fc ⁇ RIIIA and Fc ⁇ RIIIB.
  • Fc ⁇ RIIIB is specifically expressed on neutrophils
  • Fc ⁇ RIIIA is expressed on monocytes, natural killer cells (NK cells), macrophages and some T cells.
  • NK cell-dependent ADCC activity is induced through antibody binding to Fc ⁇ RIIIA.
  • CDC activity refers to the activity in which an antibody bound to an antigen on a target cell activates a series of cascades (complement activation pathways) consisting of complement-related proteins in the blood and damages the target cell.
  • cascades complement activation pathways
  • protein fragments produced by complement activation induce migration and activation of immune cells.
  • a cascade of CDC activity is initiated by first binding C1q to the Fc region and then to two serine proteases, C1r and C1s, to form a C1 complex.
  • the CDC activity or ADCC activity of the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention on antigen-expressing cells can be evaluated by a known measurement method [Cancer Immunol. Immunoother., 36, 373 (1993)].
  • an N-linked complex type sugar chain that binds to asparagine (Asn) at position 297 of the Fc region (constant region consisting of CH2 and CH3 domains) of the antibody
  • a method for controlling the amount of fucose (also called core fucose) that binds ⁇ -1,6 to N-acetylglucosamine (GlcNAc) present at the reducing end International Publication No. 2005/035586, International Publication No. 2002/31140 and International).
  • Publication No. 00/61739 and a method of controlling by modifying an amino acid residue in the Fc region of an antibody (International Publication No. 00/42072) are known.
  • the ADCC activity of the antibody can be increased or decreased.
  • bispecific antibody is expressed using host cells lacking the ⁇ 1,6-fucose transferase gene. By doing so, a bispecific antibody having a high ADCC can be obtained.
  • the antibody is expressed using a host cell into which the ⁇ 1,6-fucose transferase gene has been introduced. By allowing the antibody to be obtained, a bispecific antibody having low ADCC activity can be obtained.
  • ADCC activity and CDC activity can be increased or decreased by modifying the amino acid residue in the Fc region of the bispecific antibody.
  • the CDC activity of a bispecific antibody can be increased by using the amino acid sequence of the Fc region described in US Patent Application Publication No. 2007/0148165.
  • ADCC activity is performed by modifying the amino acids described in US Pat. No. 6,737,056, US Pat. No. 7,297,775, US Pat. No. 7,317,091 and the like.
  • the CDC activity can be increased or decreased.
  • a bispecific antibody with controlled effector activity may be obtained by combining the above methods.
  • the stability of the bispecific antibody of the present invention can be evaluated by measuring the amount of aggregates (oligomers) formed in the purification process or in a sample stored under certain conditions. That is, when the amount of aggregates is reduced under the same conditions, it is evaluated that the stability of the antibody is improved.
  • the amount of aggregates can be measured by separating the aggregated and non-aggregated antibodies using suitable chromatography, including gel filtration chromatography.
  • the productivity of the bispecific antibody of the present invention can be evaluated by measuring the amount of antibody produced in the culture medium from the antibody-producing cells. More specifically, it can be evaluated by measuring the amount of antibody contained in the culture supernatant obtained by removing the producing cells from the culture solution by an appropriate method such as an HPLC method or an ELISA method.
  • a radioactive isotope As the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention, a radioactive isotope, a low molecular weight drug, a high molecular weight drug, a protein or an antibody drug or the like is chemically added to the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention. Alternatively, it includes a derivative of a genetically engineered antibody.
  • the derivative of the antibody in the present invention is the N-terminal side or C-terminal side of the H chain or L chain of the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention, and an appropriate substituent or side chain in the antibody or the antibody fragment thereof.
  • radioactive isotopes, low-molecular-weight drugs, high-molecular-weight drugs, immunostimulators, proteins, antibody drugs, etc. are applied to the antibody or the sugar chain in the antibody fragment thereof by chemical methods [Introduction to antibody engineering, local people]. It can be manufactured by combining with a bookstore (1994)].
  • the derivative of the antibody in the present invention is inserted into an expression vector by ligating a DNA encoding the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention and a DNA encoding a desired protein or antibody drug. It can be produced by a genetic engineering technique in which the expression vector is introduced into a suitable host cell and expressed.
  • Radioisotopes include, for example, 111 In, 131 I, 125 I, 90 Y, 64 Cu, 99 Tc, 77 Lu or 211 At.
  • the radioisotope can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like.
  • a substance that chelate the radioisotope may be bound to the antibody.
  • the chelating agent include 1-isothiocyanate benzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA).
  • low-molecular-weight drugs examples include alkylating agents, nitrosoureas, antimetabolites, antibiotics, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, hormone therapeutic agents, hormone antagonists, aromatase inhibitors, P-sugar protein inhibitors, and platinum.
  • Anti-cancer agents such as complex derivatives, stage M inhibitors or kinase inhibitors [clinical oncology, cancer and chemotherapy (1996)], steroids such as hydrocortisone or prednisone, non-steroids such as aspirin or indomethacin, gold thiomalate or Immunomodulators such as penicillamine, immunosuppressants such as cyclophosphamide or azathiopurine, or anti-inflammatory agents such as antihistamines such as chlorpheniramine maleate or indomethacin [Inflammation and anti-inflammatory therapy, Medical and Dental Publishing Co., Ltd. (1982) )] And so on.
  • anticancer agents examples include amifostine (ethiolation), cisplatin, dacarbazine (DTIC), dactinomycin, mechloretamine (nitrogen mustard), streptozocin, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustin (BCNU), romustin (CCNU), doxorubicin.
  • a method for binding a small molecule drug to the bispecific antibody of the present invention or the bispecific antibody fragment thereof for example, a method of binding between the drug and the amino group of the antibody via glutarualdehyde, or a water-soluble carbodiimide. Examples thereof include a method of binding the amino group of the drug and the carboxyl group of the antibody via the above.
  • polymer drug examples include polyethylene glycol (PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid copolymer, polyvinylpyrrolidone, pyran copolymer, and hydroxypropylmethacrylamide.
  • a method for reacting with a PEGylation modification reagent can be mentioned [Bioconjugated drug, Hirokawa Shoten (1993)].
  • the PEGylation modifying reagent include a modifying agent for the ⁇ -amino group of lysine (Japanese Patent Laid-Open No. 61-178926) and a modifying agent for the carboxyl group of aspartic acid and glutamic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 56-23587). No. 2), or a modifying agent for the guanidino group of arginine (Japanese Patent Laid-Open No. 2-117920).
  • the immunostimulant may be a natural product known as an immunoadjugant, and specific examples thereof include ⁇ (1 ⁇ 3) glucan (for example, lentinan or schizophyllan) or ⁇ -galactosylceramide (for example, an immunostimulant drug). KRN7000) and the like.
  • proteins include cytokines or growth factors or toxin proteins that activate immunocompetent cells such as NK cells, macrophages or neutrophils.
  • cytokines or growth factors examples include interferon (hereinafter referred to as IFN) - ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , interferon (hereinafter referred to as IL) -2, IL-5, IL-6, IL-. 10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, tumor necrosis factor (TNF) - ⁇ , TNF- ⁇ , granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), Granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) or macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and the like can be mentioned.
  • IFN interferon
  • IL interferon
  • IL-5 interferon
  • IL-6 interferon
  • IL-12 interferon
  • IL-15 interferon
  • IL-18 interferon
  • IL-21 interferon-23
  • TNF tumor necrosis factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF Gran
  • toxin protein examples include ricin, diphtheria toxin, ONTAK, and the like, and a protein toxin in which a mutation is introduced into the protein to regulate toxicity is also included.
  • a cDNA encoding a protein is linked to a cDNA encoding the bispecific antibody or antibody fragment of the present invention to construct a DNA encoding the fusion antibody, and the DNA is used as a prokaryote or true. It can be expressed and produced by inserting it into an expression vector for a nuclear organism and introducing the expression vector into a prokaryote or a eukaryote. Twice
  • the bispecific antibody of the present invention or a drug that binds to an antibody fragment thereof is commonly used for immunological detection.
  • the bispecific antibody of the present invention or a drug that binds to an antibody fragment thereof is commonly used for immunological detection.
  • labels include, for example, enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase or luciferase, luminescent substances such as acridinium ester or loffin, or fluorescein isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC), Alexa®.
  • fluorescent substances such as Fluor 488 and R-phycoerythrin (R-PE).
  • the present invention includes bispecific antibodies having cytotoxic activity such as CDC activity or ADCC activity and the bispecific antibody fragments.
  • cytotoxic activity such as CDC activity or ADCC activity
  • the CDC activity or ADCC activity of the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention on antigen-expressing cells can be evaluated by a known measurement method [Cancer Immunol. Immunoother., 36, 373 (1993)].
  • the present invention also contains, as an active ingredient, a composition containing a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment that specifically recognizes and binds to CD3 and a disease-related antigen, or the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment. , CD3 and a therapeutic agent for a disease involving at least one of the disease-related antigens, preferably a disease involving cells expressing the disease-related antigen.
  • the disease in which at least one of the CD3 and the disease-related antigen is related may be any disease as long as it is related to at least one of the CD3 and the disease-related antigen, and examples thereof include malignant tumors and cancer.
  • a therapeutic agent containing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment thereof, or a derivative thereof of the present invention contains only the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment thereof as an active ingredient, or a derivative thereof. Although it may be preferable, it is usually preferable to mix it with one or more pharmacologically acceptable carriers and provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method known in the technical field of pharmaceutics.
  • the most effective route of administration for treatment includes oral administration or parenteral administration such as oral administration, intra-airway, intrarectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration. Of these, intravenous administration is preferable.
  • Examples of the administration form include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments or tapes.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the target therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 ⁇ g / kg to 10 mg / kg per day for an adult.
  • the present invention comprises at least one immunoassay or measurement reagent for CD3 and a disease-related antigen, or at least one of a CD3 and a disease-related antigen, containing the bispecific antibody or fragment of the bispecific antibody of the present invention.
  • the present invention relates to a diagnostic agent for a disease associated with a disease, preferably a disease involving cells expressing a disease-related antigen.
  • the present invention comprises a method for immunological detection or measurement of at least one of CD3 and a disease-related antigen using the bispecific antibody of the present invention or the bispecific antibody fragment thereof, and at least one of CD3 and a disease-related antigen.
  • the present invention relates to a method for treating a disease involving cells expressing a related disease, preferably a disease-related antigen, or a method for diagnosing a disease involving at least one of CD3 and the disease-related antigen, preferably a method involving cells expressing the disease-related antigen. ..
  • any known method can be mentioned as a method for detecting or measuring the amount of at least one of CD3 and a disease-related antigen.
  • immunological detection or measurement method may be mentioned.
  • the immunological detection or measurement method is a method for detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • immunoassay or measurement method include radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (EIA or ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescent immunoassay, and western blot.
  • RIA radioimmunoassay
  • EIA or ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • luminescent immunoassay luminescent immunoassay
  • western blot Alternatively, a physicochemical method may be mentioned.
  • a disease in which at least one of the CD3 and the disease-related antigen is involved preferably.
  • Diseases involving disease-related antigen-expressing cells can be diagnosed.
  • Known immunological detection methods can be used to detect cells expressing at least one of CD3 and disease-related antigens, such as immunoprecipitation, immunocell staining, immunohistochemical staining or fluorescence.
  • An antibody staining method and the like can be mentioned.
  • a fluorescent antibody staining method such as the FMAT8100HTS system (manufactured by Applied Biosystems) can be mentioned.
  • Biological samples to be detected or measured for at least one of CD3 and disease-related antigens in the present invention include, for example, tissue cells, blood, plasma, serum, pancreatic fluid, urine, feces, tissue fluid or culture fluid, and the like. It is not particularly limited as long as it may contain cells in which at least one of the related antigens is expressed.
  • the bispecific antibody of the present invention, the bispecific antibody fragment thereof, or a diagnostic agent containing these derivatives includes a reagent for carrying out an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction, depending on the target diagnostic method. But it may be.
  • the reagent for carrying out the antigen-antibody reaction include a buffer and a salt.
  • the detection reagent for example, a conventional immunological detection or measurement method such as the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment thereof, a labeled secondary antibody that binds to a derivative thereof, or a substrate corresponding to the label. Examples of the reagent used for.
  • the method for producing the bispecific antibody of the present invention the method for evaluating the activity of the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, and the method for treating and diagnosing a disease using the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment will be specifically described. To describe.
  • the method for producing a monoclonal antibody in the present invention includes the following working steps. That is, at least one of (1) purification of an antigen used as an immunogen and preparation of cells in which an antigen is overexpressed on the cell surface, and (2) after immunizing an animal with the antigen, blood is collected and the antibody titer thereof is tested.
  • Steps to determine the time to remove the spleen, etc., and prepare antibody-producing cells (3) Preparation of myeloma cells (mieroma), (4) Cell fusion between antibody-producing cells and myeroma, (5) Objectives Selection of antibody-producing hybridoma groups, (6) Isolation (cloning) of monoclonal cells from the hybridoma group, (7) In some cases, culture of hybridomas for mass production of monoclonal antibodies, or hybridomas. (8) Examination of the physiological activity of the monoclonal antibody thus produced and its antigen-binding specificity, or verification of its properties as a labeling reagent.
  • a method for producing a monoclonal antibody that binds to CD3 and a monoclonal antibody that binds to a disease-related antigen which is used for producing a bispecific antibody that binds to CD3 and a disease-related antigen in the present invention, will be described in detail along with the above steps. Describe.
  • the method for producing the antibody is not limited to this, and for example, antibody-producing cells other than spleen cells and myeloma can also be used.
  • a cell expressing a disease-related antigen or CD3 is obtained by introducing an expression vector containing a cDNA encoding the full length or a partial length of the disease-related antigen or CD3 into Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, or the like. be able to.
  • at least one of CD3 and disease-related antigen can be purified from various human tumor cultured cells or human tissues expressing at least one of CD3 and disease-related antigen in a large amount and used as an antigen. Further, the cultured tumor cells or the tissue can be used as an antigen as it is.
  • a synthetic peptide having a partial sequence of CD3 or a disease-related antigen can be prepared by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method and used as an antigen.
  • the CD3 or disease-related antigen used in the present invention is described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), and the like. It can be produced by expressing the DNA encoding the CD3 or the disease-related antigen in the host cell by, for example, the following method. Twice
  • a recombinant vector is prepared by inserting a full-length cDNA containing a portion encoding a CD3 or a disease-related antigen downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a polypeptide-encoding moiety prepared based on the full-length cDNA may be used.
  • a transformant producing CD3 or a disease-related antigen can be obtained. Twice
  • the expression vector as long as it can be autonomously replicated in the host cell used or integrated into the chromosome and contains an appropriate promoter at a position where the DNA encoding CD3 or a disease-related antigen can be transcribed. Both can be used.
  • any microorganism belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, yeast, insect cell or animal cell can be used as long as it can express the target gene.
  • the recombinant vector is capable of autonomous replication in the prokaryote and contains a promoter, a ribosome-binding sequence, a DNA containing a portion encoding CD3 or a disease-related antigen, and transcription. It is preferably a vector containing a termination sequence.
  • the recombinant vector does not necessarily require a transcription termination sequence, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the recombinant vector may contain a gene that controls a promoter.
  • the recombinant vector it is preferable to use a plasmid in which the ribosome-binding sequence Shine dalgarno sequence and the start codon are adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • the base sequence of the DNA encoding the CD3 or the disease-related antigen can be substituted so as to be an optimal codon for expression in the host, whereby the target CD3 or the disease-related antigen can be substituted.
  • the production rate can be improved.
  • any vector that can exert its function in the host cell to be used can be used.
  • pBTrp2, pBTac1, pBTac2 all manufactured by Roche Diagnostics
  • pKK233-2 above, manufactured by Roche Diagnostics
  • pKK233-2 Pharmacia
  • pSE280 Invitrogen
  • pGEMEX-1 Promega
  • pQE-8 Kiagen
  • pKYP10 Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600
  • pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]
  • pLSA1 Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)
  • pGEL1 Proc. Natl.
  • pGKA2 Prepared from Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798), Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-221091
  • pTerm2 US Pat. No. 4,686,191) No., US Pat. No. 4,939,094, US Pat. No. 5,160,735)
  • pSupex pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990))
  • PGEX manufactured by Pharmacia
  • pET system manufactured by Novagen
  • pME18SFL3 manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.
  • the promoter may be any promoter as long as it functions in the host cell used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter or T7 promoter, can be mentioned.
  • an artificially designed and modified promoter such as a tandem promoter in which two Ptlps are connected in series, a tac promoter, a lacT7 promoter, or a let I promoter can be mentioned.
  • Examples of host cells include E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli DH5 ⁇ and the like can be mentioned.
  • any method for introducing DNA into the host cell to be used can be used.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA] , 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)]. Twice
  • any expression vector that functions in the animal cell can be used, for example, pcDNAI (manufactured by Invitrogen), pcDM8 (manufactured by Funakoshi), pAGE107 [Japan].
  • pcDNAI manufactured by Invitrogen
  • pcDM8 manufactured by Funakoshi
  • pAGE107 [Japan].
  • pAS3-3 Japanese Patent Laid-Open No.
  • any promoter that can exert its function in animal cells can be used.
  • a promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV) can be used.
  • IE immediate early
  • CMV cytomegalovirus
  • retrovirus e.g., a promoter of a promoter of a promoter of cytomegalovirus (CMV)
  • IE immediate early
  • SV40 e.g., cytomegalovirus
  • retrovirus e.g., a promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV)
  • Examples of the host cell include human Burkitt lymphoma cell Namalwa, African green monkey kidney-derived cell COS, Chinese hamster ovary-derived cell CHO, and human leukemia cell HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-000299).
  • any method for introducing DNA into animal cells can be used.
  • the electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] and the like can be mentioned. Twice
  • a microorganism or a transformant derived from an animal cell or a microorganism having a recombinant vector incorporating a CD3 or a DNA encoding a disease-related antigen obtained as described above is cultured in a medium, and the CD3 is contained in the culture. And by producing and accumulating at least one of the disease-related antigens and collecting from the culture, CD3 or the disease-related antigens can be produced.
  • the method of culturing the transformant in the medium can be carried out according to the usual method used for culturing the host.
  • CD3 or disease-related antigen to which sugar or sugar chain is added can be obtained.
  • an inducer may be added to the medium as needed.
  • an inducer may be added to the medium as needed.
  • a microorganism transformed with a recombinant vector using a lac promoter isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside or the like is cultured, and a microorganism transformed with a recombinant vector using a trp promoter is cultured.
  • indole acrylic acid or the like may be added to each medium.
  • Examples of the medium for culturing the transformant obtained by using animal cells as a host include the commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)] and Eagle's MEM medium [Science]. , 122, 501 (1952)], Dalveco modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)], Iscover's Modified Dulvecco's Medium (IMDM) medium, or a medium obtained by adding bovine fetal serum (FBS) or the like to these media can be mentioned. Culturing is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C. and the presence of 5% CO 2. In addition, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during culturing, if necessary.
  • RPMI 1640 medium The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]
  • a method for expressing a gene encoding a CD3 or a disease-related antigen in addition to direct expression, a method such as secretory production or fusion protein expression [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] is used. Can be used.
  • Examples of the method for producing CD3 or a disease-related antigen include a method for producing the CD3 or a disease-related antigen inside the host cell, a method for secreting it outside the host cell, or a method for producing it on the outer membrane of the host cell. Appropriate methods can be selected by altering the structure of the host CD3 or disease-related antigen.
  • the DNA encoding the amino acid sequence of the extracellular region includes the DNA encoding the Fc region of the antibody, the DNA encoding glutathione S-transferase (GST), the DNA encoding the FLAG tag, or the DNA encoding the Histide tag.
  • An antigen fusion protein can be prepared by producing a DNA ligated with the above, expressing and purifying the DNA. Specifically, for example, an Fc fusion protein in which the extracellular region of CD3 or a disease-related antigen is bound to the Fc region of human IgG, or a fusion protein of the extracellular region of CD3 or a disease-related antigen and glutathione S-transferase (GST). Can be mentioned.
  • CD3 or disease-related antigens are produced in the host cell or on the outer membrane of the host cell, Paulson et al.'S method [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], Rowe et al.'S method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], Japanese Patent Application Laid-Open No. 05-336963, International Publication No. 94/23021, etc.
  • CD3 or a disease-related antigen can be actively secreted out of the host cell. It is also possible to increase the production amount of CD3 or disease-related antigen by using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075).
  • the produced CD3 or disease-related antigen can be isolated and purified as follows, for example.
  • the cells are collected by centrifugation after the completion of culture, suspended in an aqueous buffer solution, and then an ultrasonic crusher, a French press, a manton gaulin homogenizer, or Crush the cells using a dynomill or the like to obtain a cell-free extract.
  • a usual protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylaminoethyl ( DEAE) -Anion exchange chromatography method using a resin such as Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), Cation exchange chromatography method using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia), Methods such as hydrophobic chromatography using resins such as butyl Sepharose and phenyl Sepharose, gel filtration using a molecular sieve, affinity chromatography, chromatographic focusing, or electrophoresis such as isoelectric point electrophoresis, Purified proteins can be obtained when used alone or in combination. Twice
  • the CD3 or disease-related antigen When the CD3 or disease-related antigen is expressed by forming an insoluble matter in the cells, the cells are collected and then crushed and centrifuged in the same manner as described above to insolubilize the CD3 or the disease-related antigen as a precipitate fraction. Collect the body. The recovered insoluble form of the CD3 or disease-related antigen is solubilized with a protein denaturant. By diluting or dialyzing the solubilized solution, the CD3 or disease-related antigen is returned to a normal three-dimensional structure, and then a purified protein of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the CD3 or a disease-related antigen or a sugar-modified product thereof can be recovered in the culture supernatant.
  • a soluble fraction is obtained by treating the culture supernatant using a technique such as centrifugation in the same manner as described above, and a purified protein is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. be able to.
  • the CD3 or disease-related antigen used in the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • a peptide synthesizer manufactured by Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthesel-Vega, Perceptive, or Shimadzu. can be chemically synthesized using.
  • Immunization is performed by administering the antigen with Freund's complete adjuvant or an appropriate adjuvant such as aluminum hydroxide gel and Bordetella pertussis vaccine.
  • the immunogen administration method for mouse immunization may be subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, intramuscular injection or footpad injection, but intraperitoneal injection, footpad injection or intravenous injection. Is preferable.
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) or KLH (Keyhole Limpet hemocyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • Antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Blood is collected from the fundus venous plexus 3 to 7 days after each administration, and the antibody titer of the serum is measured using an enzyme immunoassay [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] or the like. If an animal in which the above serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as a source of cells producing the fusion antibody, the effect of the subsequent operation can be enhanced.
  • Antibody-producing cells are plasma cells and lymphocytes that are precursors thereof, which may be obtained from any site of the individual, generally spleen, lymph nodes, bone marrow, tonsils, peripheral blood, or any combination thereof. Spleen cells are most commonly used, although they can be obtained from antibodies. When spleen cells are used, the spleen is shredded, loosened, centrifuged, and red blood cells are removed to obtain fusion antibody-producing cells.
  • mice derived from mammals such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits and humans and having no autoantibody-producing ability
  • mice can be used, but generally obtained from mice.
  • Established cells such as 8-azaguanine-resistant mouse (from BALB / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)], P3- NS1 / 1-Ag41 (NS-1) [European J.
  • the cell line is a suitable medium, for example 8-azaguanine medium [RPMI-1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamycin, FCS and 8-azaguanine], Iskov's Modified Dulvecco's.
  • Subculture is performed in a medium such as Medium (hereinafter referred to as "IMDM") or Dulvecco's Modified Eagle Medium (hereinafter referred to as "DMEM").
  • IMDM Medium
  • DMEM Dulvecco's Modified Eagle Medium
  • the above cell lines are subcultured in normal medium (for example, DMEM medium containing 10% FCS) 3 to 4 days before cell fusion, and a cell number of 2 ⁇ 10 7 or more is secured on the day of fusion.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • PBS 1.83 g disodium phosphate, 0 potassium monopotassium phosphate
  • MEM medium normal medium containing hypoxanthine, thymidine, and aminopterin.
  • HAT medium normal medium containing hypoxanthine, thymidine, and aminopterin. The suspension is cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 7-14 days.
  • Cell fusion can also be performed by the following methods.
  • the spleen cells and myeloma cells are thoroughly washed with serum-free medium (for example, DMEM) or phosphate buffered physiological saline (hereinafter referred to as "phosphate buffered solution"), and the ratio of the number of spleen cells to myeloma cells is 5 :.
  • serum-free medium for example, DMEM
  • phosphate buffered solution phosphate buffered physiological saline
  • HAT medium hypoxanthine / aminopterin / thymidine
  • IL-2 human interleukin-2
  • the medium is replaced with a medium from which aminopterin has been removed from the HAT medium (hereinafter referred to as HT medium). Then, a part of the culture supernatant is collected, and a hybridoma producing an antibody can be selected by using the antibody titer measurement method described later.
  • the method for measuring the antibody titer include various known techniques such as radioisotope immunoassay (RIA method), solid phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method), immunofluorescence method and passive hemagglutination reaction method.
  • the RIA method or the ELISA method is preferable from the viewpoints of detection sensitivity, speed, accuracy and possibility of automation of operation.
  • the hybridoma found to produce the desired antibody is transferred to another plate and cloned.
  • this cloning method include a limiting dilution method in which cells are diluted and cultured so that one cell is contained in one well of a plate, a soft agar method in which colonies are collected by culturing in a soft agar medium, and a micromanipulator. Examples thereof include a method of isolating one cell, a method of isolating one cell by a cell sorter, and the like.
  • cloning by the limiting dilution method is repeated 2 to 4 times, and those with stable antibody titers are selected as hybridoma strains that produce monoclonal antibodies against CD3 or disease-related antigens. .. Twice
  • the IgG or IgM fractions are collected and used as purified monoclonal antibodies.
  • a monoclonal antibody that binds to CD3 or a disease-related antigen can be obtained by proliferating the hybridoma in the abdominal cavity of a mouse of the same strain (for example, BALB / c) or a Nu / Nu mouse, rat, guinea pig, hamster or rabbit. A large amount of ascites can be obtained.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in (5) was cultured in RPMI1640 medium or the like to which 10% FBS was added, and then the supernatant was removed by centrifugation, and GIT medium or Hybridoma SFM medium to which 5% Daigo GF21 was added was added. Suspend in the medium and incubate for 3 to 7 days by flask culture, spinner culture, back culture, or the like.
  • the obtained cell suspension can be centrifuged, and the obtained supernatant can be purified by a protein A column or a protein G column to collect an IgG fraction to obtain a purified monoclonal antibody.
  • a commercially available monoclonal antibody purification kit for example, MAbTrap GII kit; manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) or the like can also be used.
  • Determining antibody subclasses is performed by enzyme immunoassay using a subcluster typing kit.
  • the anti-CD3 bispecific antibody of the present invention contains a CD3 binding domain having diminished affinity for CD3, and the CD3 binding domain serves as a control in the binding assay. It can be established using the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or KM14. For example, a desired CD3 binding domain can be established by screening an anti-CD3 monoclonal antibody library for an antibody having a 10% or more lower affinity than the anti-CD3 monoclonal antibody SP34 or KM14.
  • an antibody library in which a random mutation was introduced into the amino acid sequence of the CDR or FR region was prepared, and the anti-CD3 antibody library was used.
  • the desired CD3 binding domain can be established by screening for antibodies that have a 10% or greater affinity lower than the monoclonal antibody SP34 or KM14.
  • the binding activity of a monoclonal antibody against CD3 or disease-related antigen can be measured by a binding assay system such as Ouchterlony, ELISA, RIA, flow cytometry (FCM) or surface plasmon resonance (SPR). can.
  • the Octerlony method is simple, but if the antibody concentration is low, a concentration operation is required.
  • the culture supernatant is directly reacted with the antigen-adsorbing solid phase, and various immunoglobulin isotypes and antibodies corresponding to the subclass are used as the secondary antibody to obtain the antibody isotype. It is possible to identify subclasses and measure antibody binding activity.
  • purified or partially purified recombinant CD3 or disease-related antigen is adsorbed on a solid phase surface such as a 96-well plate for ELISA, and the solid phase surface on which the antigen is not adsorbed is a protein unrelated to the antigen.
  • a solid phase surface such as a 96-well plate for ELISA
  • the solid phase surface on which the antigen is not adsorbed is a protein unrelated to the antigen.
  • BSA bovine serum albumin
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme (horseradish peroxidase; HRP, alkaline phosphatase; ALP, etc.), a chemiluminescent substance or a radiation compound, etc. was dispensed and bound to the plate.
  • the second antibody is reacted with the antibody.
  • Tween-PBS a reaction is carried out according to the labeling substance of the second antibody, and a monoclonal antibody that specifically reacts with the target antigen is selected.
  • the FCM method can measure the binding activity of an antibody to antigen-expressing cells [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)].
  • an antibody binds to a membrane protein antigen expressed on a cell membrane, it means that the antibody recognizes and binds to the three-dimensional structure of a naturally occurring antigen.
  • Examples of the SPR method include kinetics analysis by Biacore.
  • Biacore T100 kinetics in the binding between the antigen and the test substance is measured, and the result is analyzed by the analysis software attached to the device.
  • a test substance such as a hybridoma culture supernatant or a purified monoclonal antibody is flowed to bind an appropriate amount, and the concentration is known. Multiple concentrations of antigen are run and binding and dissociation are measured. Next, the obtained data is subjected to kinetics analysis by a 1: 1 binding model using the software attached to the device, and various parameters are acquired.
  • CD3 or disease-related antigen is immobilized on a sensor chip, for example, by an amine coupling method, and then a plurality of concentrations of purified monoclonal antibody of known concentration are flowed to measure binding and dissociation.
  • the obtained data is subjected to kinetics analysis using a 1: 1 binding model or a bivalent binding model using software attached to the device, and various parameters are acquired.
  • an antibody that competes with an antibody against CD3 or a disease-related antigen and binds to CD3 or a disease-related antigen can be selected by reacting the above-mentioned binding assay system with a test antibody in coexistence. .. That is, by screening for an antibody whose binding to the antigen is inhibited when the test antibody is added, an antibody that competes with the antibody obtained above for binding to CD3 or a disease-related antigen can be obtained.
  • Partial deficiencies and variants of such antigens may be obtained as secretory proteins using suitable host cells such as Escherichia coli, yeast, plant cells or mammalian cells, or on the cell membrane of host cells. It may be expressed and prepared as an antigen-expressing cell.
  • a membrane-type antigen it is preferable to express it on the membrane of a host cell in order to express it while retaining the three-dimensional structure of the antigen. It is also possible to prepare a synthetic peptide that mimics the primary structure or three-dimensional structure of an antigen and confirm the reactivity of the antibody. Examples of the synthetic peptide include a method for producing various partial peptides of the molecule using a known peptide synthesis technique.
  • a chimeric protein is prepared by appropriately combining the domains constituting each region, and the reactivity of the antibody to the protein is confirmed to obtain the epitope of the antibody. Can be identified. Then, in more detail, the oligopeptide of the corresponding portion, or a variant of the peptide, etc. are variously synthesized using an oligopeptide synthesis technique well known to those skilled in the art, and the reactivity of the antibody to the peptide is confirmed to confirm the epitope. Can be identified.
  • a commercially available kit for example, SPOTs kit (manufactured by Genosis Biotechnology), a series of multipin peptide synthesis kits using a multipin synthesis method (manufactured by Chiron), etc. ] Can also be used.
  • An antibody that binds to the same epitope as an epitope that binds to CD3 or a disease-related antigen identifies an epitope of the antibody obtained by the above-mentioned binding assay system, and a partially synthetic peptide of the epitope, a steric structure of the epitope. It can be obtained by preparing a synthetic peptide imitating the structure, a recombinant of the epitope, or the like and immunizing it.
  • the epitope is a membrane protein
  • a recombinant fusion protein in which the entire extracellular region or a part of the extracellular domain is linked to an appropriate tag such as FLAG tag, Histide tag, GST protein or antibody Fc region.
  • an appropriate tag such as FLAG tag, Histide tag, GST protein or antibody Fc region.
  • mRNA is extracted from a hybridoma that produces a monoclonal antibody, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or recombinant plasmid having a cDNA encoding VH or VL is isolated using the DNA encoding the C region portion or the V region portion of the antibody as a probe.
  • the entire base sequence of VH or VL in the isolated recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH or VL is estimated from the base sequence.
  • non-human animal used for producing a hybridoma a mouse, rat, hamster, rabbit or the like is used, but any animal can be used as long as it is possible to produce a hybridoma.
  • RNA easy kit manufactured by Qiagen
  • oligo (dT) immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]
  • Oligo-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit.
  • kit such as (manufactured by Takara Bio).
  • mRNA can also be prepared using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • any vector that can incorporate the cDNA can be used as the vector into which the cDNA synthesized using the mRNA extracted from the hybridoma as a template is incorporated.
  • ZAP Express (Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], ⁇ ZAPII (manufactured by Stratagene), ⁇ gt10, ⁇ gt11 [DNA Cloning] Approach, I, 49 (1985)], Lambda BlueMid (manufactured by Clonetech), ⁇ ExCell, pT7T3-18U (manufactured by Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)] or pUC18 [Gene , 33, 103 (1985)], etc. are used.
  • Any Escherichia coli into which a cDNA library constructed by a phage or a plasmid vector can be introduced can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • XL1-Blue MRF' [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], or JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] is used.
  • the selected cDNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), and the nucleotide sequence of the cDNA is determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method or the like. do. For example, after performing a reaction such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5461 (1977)], A. L. F. Analyze using an automatic base sequence analyzer such as a DNA sequencer (manufactured by Pharmacia).
  • the total amino acid sequences of VH and VL were estimated from the determined total base sequences, respectively, and compared with the total amino acid sequences of VH and VL of known antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. By doing so, it is confirmed whether or not the obtained cDNA encodes the complete amino acid sequence of each of VH and VL of the antibody including the secretory signal sequence.
  • the full amino acid sequence of the known antibody VH and VL [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]
  • the length of the secretory signal sequence and the N-terminal amino acid sequence can be estimated, and the subgroups to which they belong can be identified.
  • amino acid sequence of each CDR of VH and VL should be estimated by comparing with the amino acid sequence of VH and VL of a known antibody [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. Can be done.
  • the recombinant antibody expression vector can be constructed by cloning a DNA encoding at least one of CH and CL of a human antibody into an expression vector for animal cells. ..
  • CH and CL of any human antibody can be used, and for example, CH of the ⁇ 1 subclass of the human antibody and CL of the ⁇ class can be used.
  • cDNA is used as the DNA encoding CH and CL of the human antibody, chromosomal DNA consisting of exons and introns can also be used.
  • any vector can be used as long as it can be expressed by incorporating a gene encoding the C region of a human antibody.
  • pAGE107 [Cytotechnol., 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)]
  • pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proc. Natl. Acad. Sci.
  • promoters and enhancers of expression vectors for animal cells the early promoter of SV40 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], Moloney mouse leukemia virus LTR [Biochem. Biophys. Res. Communi., 149, 960 (1987)] )], CMV promoter (US Pat. No. 5,168,062) or immunoglobulin H chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and enhancer [Cell, 33, 717 (1983)] are used. be able to.
  • antibody H chain and L are considered from the viewpoints of ease of vector construction, ease of introduction into animal cells, and balance of expression levels of antibody H chain and L chain in cells.
  • a vector tandem type vector [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)] carrying both chain genes is used, but a plurality of vectors carrying both antibody H chain and L chain genes separately (separate). Type vector) can also be used in combination.
  • tandem-type recombinant antibody expression vectors include pKANTEX93 (International Publication No. 97/10354), pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)], and N5KG1val (US Pat. No. 6,001,358).
  • N5KG4PE R409K described in International Publication No. 2006/0333386
  • N5KG2 vector described in International Publication No. 2003/033538
  • Tol2 transposon vector described in International Publication No. 2010/143698
  • the non-human antibody obtained in (1) is located upstream of each of the genes encoding CH or CL of the human antibody in the recombinant antibody expression vector obtained in (2).
  • a chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning each cDNA encoding VH or VL.
  • the base sequence of the linking portion encodes an appropriate amino acid.
  • VH and VL cDNAs designed to have appropriate restriction enzyme recognition sequences are prepared.
  • the prepared VH and VL cDNAs are expressed in an appropriate form upstream of each of the genes encoding CH or CL of the human antibody in the recombinant antibody expression vector obtained in (2). Clone each of them to construct a chimeric antibody expression vector.
  • the cDNA encoding VH or VL of the non-human antibody is amplified by the PCR method using synthetic DNA having a recognition sequence of an appropriate restriction enzyme at both ends, and is used for expressing the recombinant antibody obtained in (2).
  • a chimeric antibody expression vector can also be constructed by cloning into a vector.
  • the cDNA encoding VH or VL of the humanized antibody can be prepared as follows. First, the amino acid sequence of the VH or VL framework region (hereinafter referred to as FR) of the human antibody to which the amino acid sequence of the VH or VL CDR of the non-human antibody obtained in (1) is transplanted is selected.
  • FR the amino acid sequence of the VH or VL framework region
  • any one derived from human antibody can be used.
  • the amino acid sequence of FR of human antibody registered in a database such as Protein Data Bank, or the common amino acid sequence of each subgroup of FR of human antibody [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services ( 1991)] etc. are used.
  • the amino acid sequence of human FR having the highest possible homology (60% or more) with the amino acid sequence of FR of VH or VL of the original non-human antibody is selected.
  • the amino acid sequence of the CDR of the original non-human antibody is transplanted to the amino acid sequence of FR of VH or VL of the selected human antibody, respectively, and the amino acid sequence of VH or VL of the humanized antibody is designed respectively.
  • the designed amino acid sequence into a DNA sequence in consideration of the frequency of codon usage found in the base sequence of the antibody gene [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]
  • humans Design the VH or VL cDNA sequences of the antibody, respectively.
  • the humanized antibody VH or VL can be easily incorporated into the gene recombinant antibody expression vector obtained in (2).
  • the cDNA encoding the can be cloned.
  • the amplification product was cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), and the nucleotide sequence was determined by the same method as described in (1) to obtain the desired humanized antibody.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL.
  • modified humanized antibodies having the required antigen-binding activity can be obtained by repeatedly preparing several variants of each antibody, examining the correlation with each antigen-binding activity, and making trial and error. ..
  • the amino acid residues of FR of VH and VL of human antibody can be modified by carrying out the PCR reaction described in (4) using synthetic DNA for modification.
  • the nucleotide sequence of the amplified product after the PCR reaction is determined by the method described in (1), and it is confirmed that the desired modification has been performed.
  • an appropriate restriction enzyme recognition sequence is introduced into the 5'end of the synthetic DNA located at both ends.
  • cloning is performed upstream of each gene encoding CH or CL of the human antibody in the gene recombinant antibody expression vector obtained in (2) so that they are expressed in an appropriate form.
  • a gene recombinant antibody is expressed using the gene recombinant antibody expression vector obtained in (3), (6) and (7), or an expression vector modified thereto. It can be transiently expressed and the antigen-binding activity of the obtained various recombinant antibodies can be efficiently evaluated.
  • Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as the host cell into which the expression vector is introduced.
  • COS-7 cell American Type Culture Collection (ATCC) number: CRL1651] can be used. Use.
  • the DEAE-dextran method Method of Nucleic Acids Res., CRC press (1991)] or the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 ( 1987)] and so on.
  • Examples of the introduction of the expression vector into the host cell include an electroporation method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891, Cytotechnology, 3, 133 (1990)], a calcium ion method, an electroporation method, and spheroplast. Examples include the method, the lithium acetate method, the calcium phosphate method, and the lipofection method. Examples of the method for introducing a gene into an animal described later include a microinjection method, a method for introducing a gene into ES cells using an electroporation or lipofection method, and a nuclear transfer method.
  • any cell can be used as long as it is a host cell capable of expressing the recombinant antibody.
  • mouse SP2 / 0-Ag14 cells ATCC CRL1581
  • mouse P3X63-Ag8.653 cells ATCC CRL1580
  • Chinese hamster CHO-K1 cells ATCC CCL-61
  • DUKXB11 ATCC CCL-9906
  • Pro-5. Cells ATCC CCL-781
  • CHO-S cells Life Technologies, Cat No. 11619
  • CHO cells lacking the dihydrofolate reductase gene (dhfr) (CHO / DG44 cells) [Proc. Natl.
  • protein such as an enzyme involved in the synthesis of intracellular nucleotide GDP-fucose, sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -bonded to the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex sugar chain.
  • Defects in host cells with reduced or deleted activity such as proteins involved in enzymes involved in or proteins involved in the transport of intracellular nucleotide GDP-fucose to the Goldi form, such as the ⁇ 1,6-fucose transposase gene.
  • CHO cells International Publication No. 2005/035586, International Publication No. 02/31140
  • the like can also be used.
  • a transformant that stably expresses the recombinant antibody is selected by culturing in a medium for culturing animal cells containing a drug such as G418 sulfate (hereinafter referred to as G418) (hereinafter referred to as G418).
  • G4108 a drug such as G418 sulfate
  • the culture medium for animal cell culture includes RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen), GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), EX-CELL301 medium (manufactured by JRH), EX-CELL302 medium (manufactured by JRH), and EX. -CELL325 medium (manufactured by JRH), IMDM medium (manufactured by Invitrogen) or Hybridoma SFM medium (manufactured by Invigen), or a medium obtained by adding various additives such as FBS to these media is used.
  • a recombinant antibody By culturing the obtained transformant in a medium, a recombinant antibody is expressed and accumulated in the culture supernatant.
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant can be measured by an ELISA method or the like.
  • the expression level of the recombinant antibody produced by the transformant can be increased by using a DHFR amplification system (Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891) or the like.
  • Recombinant antibody can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring. Harbor Laboratory (1988)]. It can also be purified by combining the methods used in protein purification, such as gel filtration, ion exchange chromatography and ultrafiltration.
  • the molecular weight of the entire H chain, L chain or antibody molecule of the purified recombinant antibody can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third. It can be measured using edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • the bispecific antibody of the present invention is designed by designing a CD3 binding domain, a constant region including an Fc region or an Fc region, and a disease-related antigen binding domain, and designing a bispecific antibody in which they are linked. Can be produced by.
  • CD3 binding domain Design of CD3 binding domain
  • the CD3 binding domain is described in 1. above.
  • the desired CD3 binding domain is obtained using the method described in 2. above, and the cDNA sequence encoding the amino acid sequence of the CDR or variable region contained in each binding domain is obtained. It can be determined using the method described in.
  • one CD3 binding domain is bound to the C-terminal side. Therefore, in the two Fc chains contained in the Fc region or the two CH chains contained in the heavy chain constant region, one CD3 binding domain such as scFv or dsFv is bound to either polypeptide. Alternatively, one CD3 binding domain may be bound by binding VH or VL of the CD3 binding domain to each of the two polypeptides.
  • An amino acid sequence with a base substitution and an amino acid sequence with Y349C, T366S, L368A and Y407V amino acid residue substitutions added to the other CH3 domain are prepared.
  • the amino acid sequence in which the amino acid residue substitution of C220S is added to CH1-Fc, and 216 to CL-Fc is prepared by adding an amino acid residue deletion of -220 and an amino acid residue substitution of C214S.
  • the amino acid residue substitutions of H435R and Y436F can be further added to CL-Fc, or the amino acid residue substitution of the CH3 domain described above can be appropriately combined and used.
  • Each polypeptide chain in the Fc region or CH region prepared in 3-2 is linked with the amino acid sequence of the binding domain for the desired disease-related antigen.
  • the amino acid sequences of VH / VL, VH-CH1 / VL-C ⁇ , scFv, and VHH of a monoclonal antibody that specifically binds to a disease-related antigen are linked to the N-terminal side of the first or second polypeptide, respectively.
  • An anti-CD3 bispecific antibody having a monovalent or bivalent disease-related antigen binding domain can be prepared.
  • a bispecific antibody having a disease-related antigen-binding domain on the C-terminal side at a monovalent value, or an N-terminal binding titer a bispecific antibody having a disease-related antigen-binding domain on the C-terminal side at a monovalent value, or an N-terminal binding titer.
  • Bispecific antibodies having a divalent or trivalent disease-related antigen-binding domain in combination with the number can be prepared.
  • each antigen-binding domain can be prepared with the same epitope or different epitopes.
  • the bispecific antibody has bispecificity or trispecificity in addition to CD3.
  • VH / VL, scFv, and Fab indicate VH / VL, scFv, and Fab of antibodies specific for disease-related antigens, unless otherwise specified.
  • VH-CH1-Fc-CD3scFv and VL-CL-Fc VL-CH1-Fc-CD3scFv and VH-CL-Fc
  • VH-CH1-Fc and VL-CL-Fc-CD3scFv VH-CH1-Fc and VH-CL-Fc-CD3scFv
  • VH-CH1-Fc-CD3VH and VL-CL-Fc-CD3VL VL-CH1-Fc-CD3VH and VH-CL-Fc-CD3VL
  • VH-CH1-Fc-CD3VL and VL-CL-Fc-CD3VH VH-CH1-Fc-CD3VL and VL-CL-Fc-CD3VH
  • VH-CH1-Fc-CD3VL and VL-CL-Fc-CD3VH VL-CH1-Fc-CD3VL and VH-CL-Fc-CD3
  • a bispecific antibody without ⁇ 1,6-fucose can be produced. It is also possible to prepare a bispecific antibody having high ADCC activity by substituting Fc amino acid residues. Protein expression and purification can be carried out by the method described in the above item 2.
  • the binding activity of the bispecific antibody of the present invention to a cell line expressing at least one of CD3 and a disease-related antigen is as described in 1. It can be measured using the binding assay system described in (7).
  • CDC activity or ADCC activity on cells expressing at least one of CD3 and disease-related antigen can be measured by a known measurement method [Cancer Immunol. Immunoother., 36, 373 (1993)].
  • the cytotoxic activity of the bispecific antibody of the present invention can be measured by the following method. For example, target cells expressing disease-related antigens and PBMCs are seeded on a dedicated plate, bispecific antibodies are added, and the cells are cultured for a certain period of time. To analyze. In addition, fluorescently stained target cells and unstained PBMC were seeded on a 96-well plate, a bispecific antibody was added, the cells were cultured for a certain period of time, dead cells were stained, and only the target cells that were alive by flow cytometry were selected. By counting, the cytotoxic activity is calculated.
  • the ability of the bispecific antibody of the present invention to induce cytokine production can be measured by the following method. For example, target cells expressing a disease-related antigen and PBMC are seeded on a 96-well plate, a bispecific antibody is added, and the cells are cultured for a certain period of time. Measure using the system or BD Cytometry Bed Array (CBA) kit.
  • CBA BD Cytometry Bed Array
  • the bispecific antibody of the present invention or the bispecific antibody fragment thereof is a disease related to at least one of CD3 and a disease-related antigen, preferably a disease-related antigen. It can be used to treat diseases involving expressing cells. Diseases associated with at least one of CD3 and disease-related antigens include, for example, malignant tumors and cancer.
  • Malignant tumors and cancers include, for example, colon cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, glioma, malignant melanoma, thyroid cancer, renal cell cancer, leukemia, lymphoma, T-cell lymphoma, gastric cancer.
  • Examples include sarcoma, smooth muscle tumor and Wilms tumor.
  • a therapeutic agent containing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment thereof, or a derivative thereof of the present invention may contain only the antibody or the antibody fragment thereof as an active ingredient, or a derivative thereof. It is usually provided as a pharmaceutical formulation prepared by mixing with one or more pharmacologically acceptable carriers and by a method known in the technical field of pharmaceutics.
  • Examples of the route of administration include oral administration or parenteral administration such as intraoral, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration.
  • Dosage forms include, for example, sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments or tapes.
  • the various formulations are commonly used excipients, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives, and colorants. It can be produced by a conventional method using an agent, a flavoring agent, a stabilizer and the like.
  • excipients include lactose, fructose, glucose, cornstarch, sorbitol, crystalline cellulose, sterilized water, ethanol, glycerol, physiological saline and a buffer solution.
  • Disintegrants include, for example, starch, sodium alginate, gelatin, calcium carbonate, calcium citrate, dextrin, magnesium carbonate and synthetic magnesium silicate.
  • binder examples include methyl cellulose or a salt thereof, ethyl cellulose, gum arabic, gelatin, hydroxypropyl cellulose, polyvinylpyrrolidone and the like.
  • Lubricants include, for example, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol and hardened vegetable oils.
  • the stabilizer examples include amino acids such as arginine, histidine, lysine, and methionine, human serum albumin, gelatin, dextran 40, methyl cellulose, sodium sulfite, and sodium meta sulfite.
  • additives examples include syrup, petrolatum, glycerin, ethanol, propylene glycol, citric acid, sodium chloride, sodium nitrite and sodium phosphate.
  • preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders or granules.
  • Liquid preparations such as emulsions or syrups include water, sucrose, saccharides such as sorbitol or fructose, glycols such as polyethylene glycol or propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil or soybean oil, p-hydroxybenzoic acid. It is produced by using preservatives such as esters, or flavors such as strawberry flavor or peppermint as additives. Twice
  • Capsules, tablets, powders or granules include excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol, disintegrants such as starch or sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate or talc, polyvinyl alcohol, hydroxy. It is produced by using a binder such as propyl cellulose or gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, or a plastic agent such as glycerin as an additive.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, and sprays. Injections are made using a carrier consisting of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • the suppository is manufactured using a carrier such as cocoa fat, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the spray agent is produced using a carrier or the like that does not irritate the oral cavity and airway mucosa of the recipient and disperses the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof as fine particles to facilitate absorption.
  • the carrier include lactose and glycerin. It can also be produced as an aerosol or dry powder.
  • the component exemplified as an additive can be added in a preparation suitable for oral administration.
  • the effective amount of the bispecific antibody of the present invention administered in combination with an appropriate diluent and a pharmacologically usable carrier is 0.0001 mg to 100 mg per kg of body weight at a time, and is administered for 2 days. Is administered at intervals of 8 weeks.
  • the bispecific antibody of the present invention or the bispecific antibody fragment is used to detect or detect cells expressing at least one of CD3 and a disease-related antigen. By measurement, it is possible to diagnose a disease in which at least one of CD3 and a disease-related antigen is involved, preferably a disease in which cells expressing a disease-related antigen-binding domain are involved.
  • Diagnosis of a malignant tumor or cancer which is a disease related to at least one of CD3 and a disease-related antigen, can be made by detecting or measuring at least one of CD3 and a disease-related antigen, for example, as follows.
  • the bispecific antibody of the present invention the bispecific antibody fragment thereof, or a derivative thereof, CD3 and a disease-related antigen are used by the following immunological method. At least one of them is detected or measured, and the abundance of at least one of CD3 and a disease-related antigen in a biological sample of a healthy person is examined.
  • the abundance of at least one of CD3 and the disease-related antigen is similarly examined in the biological sample of the subject, and the abundance is compared with the abundance of a healthy person. For example, when the abundance of a disease-related antigen of a subject is increased as compared with a healthy subject, the subject is diagnosed with a disease such as cancer. Diagnosis of other diseases associated with at least one of CD3 and disease-related antigens can be made in the same manner.
  • the immunological method is a method of detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • a radioactive substance-labeled immunoassay method an enzyme immunoassay method, a fluorescence immunoassay method, a luminescence immunoassay method, a Western blotting method or a physicochemical method can be mentioned.
  • radioactive substance-labeled immunoassay method for example, an antigen or a cell expressing an antigen is reacted with the bispecific antibody of the present invention or the bispecific antibody fragment thereof, and the anti-immunoglobulin antibody or binding fragment further subjected to radiation labeling. After reacting, there is a method of measuring with a scintillation counter or the like.
  • an antigen or a cell expressing an antigen is reacted with the bispecific antibody of the present invention or the bispecific antibody fragment, and further reacted with a labeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment.
  • a method of measuring the color-developing dye with an absorptiometer can be mentioned.
  • the sandwich ELISA method and the like can be mentioned.
  • a label used in the enzyme immunoassay a known enzyme label [enzyme immunoassay, Igaku-Shoin (1987)] can be used.
  • an alkaline phosphatase label, a peroxidase label, a luciferase label, a biotin label, or the like is used.
  • the sandwich ELISA method is a method in which an antibody is bound to a solid phase, an antigen to be detected or measured is trapped, and the trapped antigen is reacted with a second antibody.
  • two types of antibodies that bind to an antigen to be detected or measured and have different antigen-binding sites are prepared, and the first antibody or antibody fragment is prepared in advance on a plate (for example, 96). It is adsorbed on a hole plate), and then the second antibody or antibody fragment is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or biotin.
  • the plate on which the above antibody was adsorbed was reacted with cells or crushed solution thereof, tissue or crushed solution thereof, cell culture supernatant, serum, pleural effusion, ascites, ophthalmic solution, etc. separated from the living body, and then labeled.
  • the antibody or antibody fragment is reacted to carry out a detection reaction according to the labeling substance.
  • the antigen concentration in the test sample is calculated from the calibration curve prepared by diluting the antigen of known concentration stepwise.
  • the antibody used in the sandwich ELISA method either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, and an antibody fragment such as Fab, Fab', or F (ab) 2 may be used.
  • the combination of the two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof that binds to a different epitope, or a combination of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof.
  • fluorescence immunoassay method for example, the method described in the literature [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)] and the like is used for measurement. ..
  • a known fluorescent label [fluorescent antibody method, Soft Science Co., Ltd. (1983)] can be used.
  • FITC or RITC is used.
  • luminescence immunoassay method for example, the method described in the literature [Bioluminescence and chemiluminescence clinical test 42, Hirokawa Shoten (1998)] is used for measurement.
  • the label used in the luminescence immunoassay method include known luminescent substance labels, and for example, acridinium ester or loffin is used.
  • an antigen or cells expressing an antigen are fractionated by SDS (sodium dodecyl sulfate) -PAGE [Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)], and then the gel is subjected to polyvinylidene fluoride (1988).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • An anti-IgG antibody or anti-IgG antibody which is blotting on a PVDF) membrane or a nitrocellulose membrane, reacts with the antibody or antibody fragment that binds to an antigen, and is further labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, or a biotin label. After reacting the antibody fragment, it is measured by visualizing the label. An example is shown below.
  • cells and tissues expressing a polypeptide having a desired amino acid sequence are lysed, and 0.1 to 30 ⁇ g of protein per lane is electrophoresed by the SDS-PAGE method under reducing conditions.
  • the migrated protein is transferred to a PVDF membrane and reacted with PBS containing 1 to 10% BSA (hereinafter referred to as BSA-PBS) for 30 minutes at room temperature to perform a blocking operation.
  • BSA-PBS PBS containing 1 to 10% BSA
  • the bispecific antibody of the present invention is reacted, washed with PBS (Tween-PBS) containing 0.05 to 0.1% Tween-20, and peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG is reacted at room temperature for 2 hours. ..
  • the antigen is detected by washing with Tween-PBS and detecting the band to which the antibody is bound using ECL Western Blotting Detection Reagents (manufactured by Amersham Co., Ltd.) or the like.
  • ECL Western Blotting Detection Reagents manufactured by Amersham Co., Ltd.
  • an antibody capable of binding to a polypeptide that does not retain the natural three-dimensional structure is used.
  • a physicochemical method for example, by binding at least one of the antigen CD3 and the disease-related antigen to the bispecific antibody of the present invention or the bispecific antibody fragment thereof, an aggregate is formed to form the aggregate. Is detected.
  • a capillary method for example, a capillary method, a one-dimensional immunodiffusion method, an immunoturbidimetry method or a latex immunoturbidimetry method [Clinical Examination Method Proposal, Kanehara Publishing (1998)] and the like can also be used.
  • the reaction solution contains the antibody or the antibody.
  • the scattered light increases and the transmitted light decreases.
  • known immunological detection methods can be used for detection or measurement of cells expressing at least one of CD3 and a disease-related antigen, but immunoprecipitation, immunohistochemical staining, and immune system are preferable.
  • a staining method or a fluorescent antibody staining method is used.
  • cells expressing at least one of CD3 and a disease-related antigen are reacted with the bispecific antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, and then an immunoglobulin-specific binding ability such as protein G sepharose is obtained.
  • the bispecific antibody of the present invention or the bispecific antibody fragment thereof is immobilized on a 96-well plate for ELISA, and then blocked with BSA-PBS.
  • the BSA-PBS is then discarded and washed thoroughly with PBS before reacting with lysates of cells or tissues expressing at least one of CD3 and disease-related antigens.
  • the immunoprecipitate is extracted with a sample buffer for SDS-PAGE and detected by the above Western blotting.
  • the immunohistochemical or immunohistochemical staining method refers to the bispecific method of the present invention after treating cells or tissues expressing an antigen with a surfactant, methanol, or the like in some cases in order to improve the permeability of an antibody. After reacting with the antibody and further reacting with an anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment thereof which has been subjected to a fluorescent label such as FITC, an enzyme label such as peroxidase or a biotin label, the label is visualized and visualized with a microscope.
  • FITC fluorescent label such as FITC
  • an enzyme label such as peroxidase or a biotin label
  • a fluorescent antibody staining method [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific, which reacts cells with fluorescently labeled antibodies and analyzes them with a flow cytometer. (1987)] can be detected.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention can detect at least one of CD3 expressed on the cell membrane and a disease-related antigen by a fluorescent antibody staining method.
  • the fluorescent antibody staining methods when the FMAT8100HTS system (manufactured by Applied Biosystem) or the like is used, the formed antibody-antigen complex and the free antibody-antigen complex that is not involved in the formation of the antibody-antigen complex are released.
  • the amount of antigen or antibody can be measured without separating the antibody or antigen. ..
  • Example 1 Preparation of expression vector for animal cells of anti-HER2 monovalent antibody and CD3 / HER2 bispecific antibody
  • Expression vectors for animal cells [having the structure of FIG. 2 (A)] (described as pKANTEX93mvG1 and pKANTEX93mvG4PE (R409K), respectively) were prepared.
  • the monovalent antibody is a heterodimer composed of two different polypeptides, and the polypeptide containing VH is the first polypeptide (VH-CH1-hinge-Fc, also referred to as polypeptide 1), and the polypeptide containing VL is the first. 2 It is described as a polypeptide (VL-CL-hinge-Fc, also referred to as polypeptide 2).
  • Table 1 shows the amino acid sequence and base sequence of the CH1-Hinge-Fc portion of the first polypeptide used to prepare each monovalent antibody.
  • the IgG4PE (R409K) type shown in Table 1 replaces the Ser residue at position 228 of the heavy chain constant region of IgG4 with Pro, the residue Leu at position 235 with Glu, and the residue Arg at position 409 with Lys, respectively. It has a constant region and does not have ADCC activity.
  • amino acid sequences and nucleotide sequences of VH and VL of the anti-Her2 monovalent antibody the amino acid sequences and nucleotide sequences of VH and VL of the anti-Her2 antibody Trastuzumab (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285). , Described in 1992) was used.
  • the nucleotide sequence encoding a part of the C-terminal part of the H-chain constant region of the first polypeptide of the IgG1 type anti-HER2 monovalent antibody expression vector pKANTEX93mvG1 prepared in (1) above was designated as H. It was replaced with a base sequence encoding a part of the C-terminal part of the chain constant region + peptide linker + anti-CD3 scFv. As a result, an expression vector pKANTEX93mvG1_scT3a for IgG1-type CD3 / HER2 bispecific antibody was obtained.
  • amino acid sequence of the peptide linker [SerGlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 143)] 3 was used.
  • amino acid sequence and base sequence of anti-CD3 scFv the amino acid sequence and base sequence of anti-CD3 scFv described in US757592B2 were used.
  • the amino acid sequence of anti-CD3 scFv is shown in SEQ ID NO: 9. This sequence is hereinafter referred to as scT3a.
  • the IgG4PE (R409K) type anti-HER2 monovalent antibody expression vector pKANTEX93mvG4PE (R409K) prepared in (1) above was used to obtain the IgG4PE (R409K) type CD3 / HER2 bispecific antibody expression vector pKANTEX93mvG4PE (R409K) _scT3. rice field.
  • Both the above (1) and the antibody expression vector prepared in this section were prepared using PureYield plasmid Midiprep System (Promega) with Escherichia coli Compent Quick DH5 ⁇ (TOYOBO) as a host, and used in the subsequent experiments.
  • Example 2 Expression and purification of anti-HER2 monovalent antibody and CD3 / HER2 bispecific antibody High ADCC IgG1 type anti-HER2 by the method described below using various antibody expression vectors prepared in Example 1. Monovalent antibody 4D5_mvG1 (DF), IgG4PE (R409K) type HER2 antibody 4D5_mvG4 PE (R409K) (F), high ADCC IgG1 type CD3 / HER2 bispecific antibody 4D5_mvG1_scT3a (DF) and IgG4PE (R409K) type CD3 4D5_mvG4PE (R409K) _scT3a (F) was obtained.
  • DF Monovalent antibody 4D5_mvG1
  • IgG4PE IgG4PE
  • R409K type HER2 antibody 4D5_mvG4 PE
  • F high ADCC IgG1 type CD3 / HER2 bispecific antibody 4D5_mvG1
  • Table 2 shows the name of each antibody, the corresponding expression vector, the host cell used, the structure of the sugar chain of Fc, and the presence or absence of anti-CD3 scFv.
  • CHO / DG44 in the table is CHO / DG44 cells derived from Chinese Hamster Ovaly (Somatic Cell Mol Genet 12; 555, 1986), and FUT8KO CHO is CHO / DG44 cells in which ⁇ 1,6 fucosyltransferase gene (FUT8) is knocked out.
  • FUT8KO CHO is CHO / DG44 cells in which ⁇ 1,6 fucosyltransferase gene (FUT8) is knocked out.
  • US Pat. No. 6,946,292 8 ⁇ g of various expression vectors were added to 4 ⁇ 10 6 host cells, and the gene was introduced by the electroporation method (Cytotechnology. 3: 133, 1990).
  • each cell is cultured in IMDM medium (GIBCO) containing 10% dialed fetal bovine serum (hereinafter abbreviated as dFBS) for 2 days, and then the above medium containing 0.5 mg / mL G418 sulfate.
  • dFBS dialed fetal bovine serum
  • the culture was continued for about 2 weeks to obtain a G418 resistant strain.
  • the G418-resistant strain was cultured in Excell302 medium (SAFC Biosciences), and the culture supernatant containing the expressed protein was collected.
  • the above antibody solution was further subjected to removal of multimers or decomposition products using gel filtration chromatography.
  • a Superdex 200 10/300 GL column (GE Healthcare) was connected to the AKTA explore 10S (GE Healthcare), and the flow path was replaced with 10 mM citric acid and 150 mM sodium chloride (pH 6.0).
  • the prepared antibody solution was added to the column, passed at a flow rate of 0.5 mL / min, and collected by a fraction collector in an amount of 0.5 mL each. Of the collected fractions, the fraction showing the main peak of OD 280 was recovered as a fraction containing the monomer of the target antibody, and the antibody solution was sterilized and stored through a 0.22 ⁇ m filter.
  • an antibody Trastuzumab (DF) from which ⁇ 1,6 fucose in the N-linked sugar chain of the anti-HER2 antibody Trastuzumab was removed was prepared according to the method described in Clin Cancer Res. 13: 1875-1882, 2007. It was made and used in some experiments.
  • an IgG1 type anti-2,4-ditrophenyl (DNP) antibody is used, and a DNA encoding an anti-2,4-ditrophenyl (DNP) IgG1 antibody described in Clin Cancer Res. 11 (8): 3126-3135, 2005. Fragments (clone name DNP2) were used to prepare according to the methods described in Examples 1 and 2 and used in some experiments.
  • Example 3 Evaluation of antigen-binding activity of anti-HER2 monovalent antibody and CD3 / HER2 bispecific antibody (1) Evaluation of HER2-binding activity The HER2-binding activity of various antibodies obtained in Example 2 is a binding inhibition experiment to Trastuzumab. Evaluated by. First, Trastuzumab (Roche) was labeled with Alexa488 using the Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit (Life Technologies) to prepare Trastuzumab_Alx. Next, binding inhibition analysis by a flow cytometer was performed using a HER2-positive human breast cancer cell line SK-BR-3 (ATCC HTB-30).
  • Trastuzumab, various anti-HER2 monovalent antibodies, and various CD3 / HER2 bispecific antibodies inhibit the binding of Trastuzumab_Alx in an antibody concentration-dependent manner and have Her2-specific binding activity.
  • rice field It was revealed that the binding activity to HER2 was similar with respect to the anti-HER2 monovalent antibody and the CD3 / HER2 bispecific antibody.
  • Example 2 (2) Evaluation of CD3 binding activity The CD3 binding activity of various antibodies obtained in Example 2 was evaluated by the binding activity to commercially available frozen T cells (AllCells). Various antibodies were added to T cells at a final concentration of 10 ⁇ g / mL and reacted at 4 ° C. for 1 hour. After washing, Goat anti-Human IgG F (ab) 2- FITC (Acris Antibodies) diluted to 30 ⁇ g / mL was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. for 1 hour.
  • AllCells commercially available frozen T cells
  • the CD3 / HER2 bispecific antibody 4D5_mvG1_scT3a (DF) and 4D5_mvG4PE (R409K) _scT3a (F) all bound to T cells to the same extent.
  • Trastuzumab and anti-HER2 monovalent antibodies 4D5_mvG1 (DF) and 4D5_mvG4PE (R409K) (F) did not bind to T cells. From the above, it was clarified that 4D5_mvG1_scT3a (DF) and 4D5_mvG4PER409K) _scT3a (F) can bind to CD3 with the same strength.
  • Example 4 Evaluation of cytotoxic activity of anti-HER2 monovalent antibody and CD3 / HER2 bispecific antibody
  • ADCC activity via Fc region and ADTC activity by binding to CD3 The cytotoxic activity including both was measured by the method described below using Real time cell analyzer xCELLignence (ACEA Biosciences), which detects the amount of cancer cells attached to the plate over time. It utilizes the fact that the electrical resistance value changes as the amount of cells on the plate changes. That is, the Cell index value obtained by this measurement shows a positive correlation with the amount of cells on the plate.
  • NK cells expressing mainly Fc receptor Fc ⁇ RIIIA are the main effector cells for ADCC activity and T cells expressing CD3 are the main effector cells for ADTC activity
  • mononuclear cells derived from human peripheral blood containing both of them are known to be the main effector cells.
  • PBMC spheres
  • HER2-positive cancer cell lines By using spheres (PBMC) as an effector and HER2-positive cancer cell lines as targets, cellular cytotoxicity including both ADCC activity and ADTC activity of various antibodies can be measured.
  • RPMI1640 medium (10% FBS added) was added to E-plate VIEW 16 (ACEA Biosciences) to perform baseline correction.
  • HER2 medium positive breast cancer cell line BT-20 cells (ATCC HTB-19) or HER2 low expression MCF-7 cells (ATCC HTB-22) were stripped from the flask with 0.02% EDTA (Nacalai Tesque) and washed with PBS. Then, it was diluted with RPMI1640 (10% FBS, 10 ⁇ g / mL Genamicin) to 2.0 ⁇ 10 5 cells / mL, and 50 ⁇ L / well was added to the above plate.
  • FIG. 6 shows IgG1 anti-HER2 monovalent antibody 4D5_mvG1 (DF) (final concentration 50 nM), IgG4PE (R409K) type CD3 / HER2 buy when PBMC is added to BT-20 cells only, BT-20 cells.
  • the Cell index when the specific antibody 4D5_mvG4_scT3a (F) (final concentration 50 nM) or a mixed solution thereof (mixed solution having a final concentration of 25 nM each) is added is shown.
  • the difference between the amount of cancer cells when the target cells and PBMC are added and the amount of cancer cells when the antibody is further added is the cytotoxic activity of the antibody.
  • 4D5_mvG1 (DF) and 4D5_mvG4PE (R409K) _scT3a (F) each have moderate cytotoxic activity, and half of these mixtures are 4D5_mvG1 (DF) or 4D5_mvG4PE (each). It was revealed that it has a high cytotoxic activity that exceeds the cytotoxic activity of R409K) _scT3a (F) alone.
  • the IgG1 type anti-HER2 monovalent antibody 4D5_mvG1 has an IgG1 type constant region to which an N-linked sugar chain lacking ⁇ 1,6 fucose is bound, and is published in International Publication No. 2014/054804. As described in No., it has high ADCC activity mediated by Fc ⁇ RIIIA binding activity, but does not have ADTC activity because it does not have a CD3 binding site.
  • IgG4PE (R409K) type CD3 / HER2 bispecific antibody 4D5_mvG4 (R409K) _scT3a (F) is an amino acid having an IgG4 type constant region with ⁇ 1,6 fucose added and reducing effector activity. Due to the introduction of residue modification, it has no or very low ability to induce ADCC activity, but has a molecular structure with CD3-mediated ADTC activity.
  • the cytotoxic activity of the group to which these two antibodies were added by 25 nM each was higher than that of the group to which only 4D5_mvG1 (DF) or 4D5_mvG4PE (R409K) _scT3a (F) was added by 50 nM, and the ADCC activity was higher. It was revealed that synergistic cytotoxic activity was exhibited by mixing a molecule having only ADTC activity and a molecule having only ADTC activity.
  • this result shows that half of the antibody having only ADCC activity or the antibody having only ADCC activity is allowed to act on the cancer cells at the same time, rather than acting on the cancer cells alone. Shows that it has a higher antitumor effect.
  • FIG. 7 shows only BT-20 cells, when PBMC is added to BT-20 cells, a mixed solution of 4D5_mvG1 (DF) and 4D5_mvG4_scT3a (F) (mixed solution of 0.3 nM each), or IgG1 type CD3 /.
  • the Cell index when the HER2 bispecific antibody 4D5_mvG1_scT3a (DF) (0.6 nM) is added is shown.
  • FIG. 7 shows a comparison of the cytotoxic activity of 4D5_mvG1 (DF) and 4D5_mvG4PE (R409K) _scT3a (F) mixed (0.3 nM each) and 4D5_mvG1_scT3a (DF) (0.6 nM).
  • 4D5_mvG1_scT3a showed a higher antitumor effect than the simultaneous addition of 4D5_mvG1 (DF) and 4D5_mvG4PE (R409K) _scT3a (F).
  • 4D5_mvG1_scT3a is a molecule having high ADCC activity due to the constant region of IgG1 type to which an N-linked sugar chain lacking ⁇ 1,6 fucose is bound, and ADTC activity mediated by CD3.
  • DF 4D5_mvG1_scT3a
  • the high antitumor effect of the combined use of the molecule having only ADCC activity and the molecule having only ADCC activity shown in FIG. 6 is further enhanced by giving the same molecule the activity of both ADCC and ADTC, and synergistically. It was shown to be more effective.
  • FIG. 8 (A) to 8 (E) show the anti-HER2 antibody Trastuzumab (DF) and the IgG1 type anti-HER2 monovalent antibody 4D5_mvG1 (DF) when PBMC is added to MCF-7 cells only or MCF-7 cells.
  • DF anti-HER2 antibody Trastuzumab
  • IgG1 type anti-HER2 monovalent antibody 4D5_mvG1 DF
  • IgG1 type CD3 / HER2 bispecific antibody 4D5_mvG1_scT3a (DF) all with a final concentration of 50 nM show.
  • Table 3 shows the names of the prepared CD3 / HER2 bispecific antibodies, the amino acid sequences of the peptide linkers, and their structures.
  • H1 and H3 are bispecific antibodies having an ⁇ -helix for 1 or 3 turns, respectively, and Pro having a peptide linker containing proline. All of the peptide linkers contained in these antibodies have a rigid structure as compared with the [SerGlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 143)] n (n is 1 to 3) linker (Chen X, et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 65: 1357-1369, 2013).
  • the C-terminal of the first polypeptide- [SerGlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 143)] 3 linker-anti-CD3 scFv is encoded.
  • the gene fragment containing the base sequence is replaced with the gene fragment containing the base sequence encoding the C-terminal of the first polypeptide-the peptide linker-anti-CD3 scFv shown in Table 3, and the animals of various bispecific antibodies shown in Table 3 are replaced.
  • An expression vector for cells was prepared.
  • the HER2 and CD3 binding activities of the various bispecific antibodies produced were measured by the method described in Example 3. The obtained results are shown in FIGS. 9 and 10. From FIG. 9, 4D5_mvG1_scT3a (DF), G1, G2, H1, H3, and Pro all have the same HER2 binding activity, and from FIG. 10, any antibody is observed, although there is some variation among the antibodies. It was revealed that it has a CD3 binding activity that does not change significantly.
  • the cytotoxic activity of the bispecific antibody against BT-20 cells was measured by the method described in Example 3 (final concentration: 0.617 nM).
  • the comparison control was only the target cells or only the target cells and PBMC (without antibody addition). The obtained results are shown in FIGS. 11 and 12.
  • CD3 / HER2 bispecific antibodies G1, G2, H1, H3, and Pro all show cytotoxic activity equal to or higher than that of 4D5_mvG1_scT3a (DF). rice field. From this result, it was shown that the high cytotoxic activity of IgG1 type CD3 / HER2 bispecific antibody 4D5_mvG1_scT3a (DF) does not depend on the structure of the linker moiety.
  • Example 6 Cellular injury activity of CD3 / HER2 bispecific antibody on gastric cancer cell line An antibody expression vector prepared by modifying the Promega pCI vector for a gene encoding the amino acid sequence of each polypeptide shown in Table 4. Inserted in.
  • DNP2 a negative control antibody using the variable region of the antibody that binds to DNP as the variable region on the cancer antigen side is shown.
  • F described at the end of the antibody name is an abbreviation for fucosylated
  • (DF) is an abbreviation for defucosylated, indicating the presence or absence of ⁇ 1,6 fucose added to the sugar chain in the Fc region.
  • the gene sequence was inserted downstream of the CAG promoter on the heavy chain side (first polypeptide side) and the CMV promoter on the light chain side (second polypeptide side).
  • CHO floating CHO cell
  • FUT8 KO a floating CHO cell
  • FUT8 KO a floating CHO cell
  • Expi293 Expression System (Thermo Fisher Scientific) and Expi293F cells or Expi293F cells in which FUT8 is knocked out (hereinafter referred to as Expi293F (FUT8 KO) can be produced as an antibody)
  • Expi293F FUT8 KO
  • FUT8 KO FUT8 KO
  • the antibody molecule having ⁇ 1,6 fucose was prepared using CHO-S cells or Expi293F cells, and the antibody molecule lacking ⁇ 1,6 fucose was prepared using CHO (Fut8 KO) cells or Expi293F (FUT8 KO) cells.
  • the cell culture solution was centrifuged, and the culture supernatant was collected through a 0.2 ⁇ m filter (Thermo Scientific).
  • a crudely purified antibody was obtained from the culture supernatant by affinity purification using MabSelect SuRe (GE Healthcare). Specifically, after equilibrating the resin packed in the column with PBS, the culture supernatant is added to the column, and the column is washed once with PBS containing 0.1% of Triton X-114 at the final concentration and PBS. Then, the antibody was eluted with an elution buffer (100 mM citrate-NaOH, pH 3.9 or 20 mM acetate-NaOH, 50 mM NaCl, pH 3.9).
  • an elution buffer 100 mM citrate-NaOH, pH 3.9 or 20 mM acetate-NaOH, 50 mM NaCl, pH 3.9.
  • the cytotoxic activity of the above bispecific antibody against human gastric cancer cell line MKN-7 cells (RIKEN BRC RCB0999) positive in Her2 was measured by the method described in Example 3 (final concentration is 50 nM).
  • the comparison control was only the target cells or only the target cells and PBMC (without antibody addition). The obtained results are shown in FIG. None of the antibodies showed cytotoxic activity when the variable region was DNP2.
  • the antibodies having only ADCC activity (4D5_mvG1 (DF) and 4D5_IgG1 (DF)) have cytotoxic activity, but the activity is higher than that of the antibody having only ADCC activity (4D5_mvG4PE (R409K) _scT3a (F)). It was weak. A mixture of 4D5_mvG1 (DF) and 4D5_mvG4PE (R409K) _scT3a (F) in half to 50 nM showed higher activity than the above antibody group. Furthermore, 4D5_mvG1_scT3a (DF), which can exert ADCC activity and ADTC activity in one molecular type, showed the highest cytotoxic activity among all antibody groups.
  • FIG. 14 shows the results of measuring the cytotoxic activity of human gastric cancer cell line MKN-45 cells (JCRB cell bank JCRB0254) positive in Her2. None of the antibodies whose variable region, which is a negative control, was DNP2 showed cytotoxic activity. Only 4D5_mvG1_scT3a (DF) showed clear cytotoxic activity for antibodies with a variable region of 4D5. From the above results, it was clarified that this technique exerts high cytotoxic activity by synergistic action even on HER2-positive cell lines other than BT-20 cells.
  • DF 4D5_mvG1_scT3a
  • Example 7 Cytotoxic activity of CD3 / HER2 bispecific antibody and cytokine production in culture supernatant About the typical anti-CD3 bispecific antibody as described in the background technique and the properties of the bispecific antibody produced in the present invention.
  • a comparative control molecule was prepared and the cytotoxic activity and cytokine production in the culture supernatant at the time of cytotoxicity were measured.
  • a known anti-CD3 bispecific antibody anti-CD3 bispecific antibody having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 160, 359 and 399 described in International Publication No. 2016/071004 was prepared.
  • anti-CD3 bispecific antibody having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 160, 359 and 399 described in International Publication No. 2016/071004
  • An expression vector was prepared in the same manner as in Example 6, and an antibody was expressed using Expi293 Expression System (Thermo Scientific). The subsequent purification procedure was carried out according to the method described in Example 6.
  • the cytotoxic activity of the prepared comparative control bispecific antibody and 4D5_mvG1_scT3a (DF) on BT-20 cells was measured by the method described in Example 4. Day 2 (48 hours after antibody addition), where the Cell index value of the well to which the test substance was not added was 0% activity, and the Cell index value of the well to which Triton X-100 was added instead of the test substance was 100% activity. The cytotoxic activity value of each antibody was calculated from the Cell index value at the time point.
  • the culture supernatant was collected, and the cytokine (IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6) concentration was measured using BD Cytometric Bear Ray (CBA) Human Th1 / Th2 Cytokine Kit II (BD Harmingen). ..
  • CBA Cytometric Bear Ray
  • the results of plotting the cytotoxic activity and the cytokine concentration at each concentration on the same graph are shown in FIG.
  • the maximum cytotoxic activity was similar for both 4D5_mvG1_scT3a (DF) and the control antibody.
  • the degree of cytokine production was significantly different between the two.
  • Example 8 Design of various molecular types of CD3 / HER2 bispecific antibody
  • an anti-CD3 scFv was added to the C-terminal of the first polypeptide based on an IgG1 type anti-HER2 monovalent antibody.
  • the production process of the bound heterodimer type CD3 / HER2 bispecific antibody [Fig. 2 (B)] and the result of activity evaluation are shown. From the results, it was found for the first time that by exerting ADCC activity and ADCC activity in one molecule, synergistically high cytotoxic activity is exhibited while the ability to induce cytokine production is low.
  • FIGS. 16A to 16F each molecular type shown in FIGS. 16A to 16F was designed.
  • FIG. 16A shows the molecules used in the previous examples.
  • FIG. 16B shows a molecule in which anti-CD3 scFv is bound to the C-terminal of the heavy chain on one side of the divalent antibody, and the Fab on the cancer antigen side is divalent.
  • Knobs into Holes modification has been introduced into the CH3 portion.
  • FIG. 16 (C) has the same amino acid sequence as that of FIG. 16 (A), but by using normal CHO cells as the expressing cells, it has a sugar chain to which ⁇ 1,6 fucose is added. It is a molecule.
  • FIG. 16 (D) is a molecule in which anti-CD3 scFv is bound to the C-terminal of the second polypeptide (VL-CL-hinge-Fc) of a monovalent antibody.
  • FIG. 16 (E) is a molecule in which both the cancer antigen side Fab and the anti-CD3 scFv are located on the N-terminal side, and in order to prepare a hetero heavy chain, Knobs into Holes modification is performed in the same manner as in FIG. 16 (B).
  • FIG. 16F shows a molecule in which one anti-CD3 scFv is bound to the C-terminal of each of the first and second polypeptides of the monovalent antibody, and as a result, two anti-CD3 scFvs are contained in one molecule. ..
  • Example 9 Preparation of various molecules and evaluation of cytotoxic activity (1) Preparation of designed bispecific antibody molecule The molecule designed in Example 8 was prepared in the same manner as in the method shown in Example 6. Table 5 shows the prepared antibody and its amino acid sequence.
  • the "molecular type" in Table 5 corresponds to FIGS. 16 (B) to 16 (F).
  • the molecule without scFv used as a negative control in evaluating each molecular type is classified as the same molecular type as the molecule with scFv.
  • the "antibody names” in Table 5 are (1) antibody clone names on the cancer antigen side, (2) origin and structure of antibody subclasses in the constant region, (3) CD3 clone names, and (4) the order of presence or absence of fucose. Indicates the characteristics of the molecule. "Mv” in the antibody name such as mvG1 and mvG4PE (R409K) indicates an antibody in which the cancer antigen side is monovalently bound.
  • G1 in antibody names such as mvG1 and mvG4PE (R409K) means that it has an Fc derived from IgG1
  • G4PE (R409K) means an Fc derived from IgG4 with S228P, L235E, and R409K mutations added. Indicates that it has.
  • (F) indicates that it has fucose
  • (DF) indicates that it does not have fucose.
  • the antibody name described as (DF) was expressed in CHO (FUT8 KO), and the antibody name described as (F) was expressed in CHO-S.
  • “Sc” in antibody names such as scT3a and scSP34 is an abbreviation for scFv
  • scSP34 indicates scFv using VH and VL derived from SP34.
  • (LC) indicates that scFv is bound to a second polypeptide consisting of CL-Fc as shown in FIG. 14 (D).
  • SP34 (H05') indicates an anti-CD3 antibody sequence in which the affinity for CD3 is reduced by amino acid modification of the variable region sequence of SP34 (prepared in Example 11 described later).
  • "4D5mut” indicates a variable region of an antibody in which the binding to HER2 is completely eliminated by introducing a modification of a 2-amino acid residue into the CDR of the heavy chain variable region of Tratsuzumab.
  • Example 4 Cancer antigen-side binding valence and cytotoxic activity of CD3 / HER2 and CD3 / GM2 bispecific antibodies
  • the cytotoxic activity of molecular type (B) shown in Table 5 against BT-20 cells is shown in Example 4. It was measured by the method described. 4D5_IgG4PE (R409K) (F), 4D5_IgG1 (DF), 4D5_IgG4PE (R409K) _scT3a (F), and 4D5_IgG1_scT3a (DF) were added so as to have a final concentration of 50 nM, respectively.
  • 4D5_IgG4PE (R409K) (F) did not have an effector activity, and no cytotoxic activity was observed only by binding to HER2.
  • FIG. 17B cytotoxic activity was observed in both 4D5_IgG4PE (R409K) _scT3a (F) and 4D5_IgG1 (DF), and 4D5_IgG1_scT3a (DF) was compared with 4D5_IgG4PE (R409K) _scT3a (F). It was revealed that it has high cytotoxic activity.
  • the activity of 4D5_IgG1_scT3a (DF) having a divalent Fab in the cancer antigen-binding domain was as strong as 4D5_mvG1_scT3a (DF) having a monovalent Fab in the cancer antigen-binding domain.
  • TSA molecular type anti-cancer specific antigen
  • the activity of the antibody molecule containing the variable region of the anti-DNP antibody is shown in FIG. 18 (A), and the activity of the antibody molecule containing the variable region of the anti-GM2 monoclonal antibody, which is the test substance, is shown in FIG. Shown in B).
  • the divalent ADCC antibody 8962_IgG1 (DF) was not observed to have cytotoxic activity, but the divalent ADCC antibody 8962_IgG1_scT3a (DF), which has both ADCC and ADTC activities, was observed to have high cytotoxic activity.
  • DF divalent ADCC antibody 8962_IgG1
  • 4,D5_mvG1_scT3a (DF) had even stronger cytotoxic activity. From the above results, it was clarified that the phenomenon in which the cytotoxic activity is synergistically increased by exerting ADCC and ADCC in one molecule has generality regardless of the presence or absence of ⁇ 1,6 fucose. Furthermore, it was clarified that exerting high ADCC activity and ATDC activity by removing ⁇ 1,6 fucose with one molecule gives higher cytotoxic activity.
  • cytotoxic activity of molecular type (D) shown in Table 5 against BT-20 cells was determined by the method described in Example 4. It was measured. 4D5_mvG4PE (R409K), 4D5_mvG1 (DF), 4D5_mvG4PE (R409K) _scT3a (LC) (F) and 4D5_mvG1_scT3a (LC) (DF) were added so as to have a final concentration of 50 nM, respectively. The results are shown in FIG. 20 (A).
  • 4D5_mvG4PE (R409K) _scT3a (LC) (F) showed the same degree of cytotoxic activity as 4D5_mvG1 (DF), and 4D5_mvG1_scT3a (LC) (DF) showed higher cytotoxic activity than them.
  • the results of comparing the activities of the molecular type (A) and the molecular type (D) in the same manner are shown in FIG. 20 (B).
  • the cytotoxic activity of the molecular type (E) shown in Table 5 against BT-20 cells was measured by the method described in Example 4.
  • 4D5_scT3a_IgG1 (DF) and 4D5mut_scT3a_IgG1 (DF) were added so as to have a final concentration of 50 nM, 5 nM, and 0.5 nM, respectively.
  • the results are shown in FIG.
  • 4D5_scT3a_IgG1 showed high cytotoxic activity at any concentration.
  • 4D5mut_scT3a_IgG1 did not bind to HER2 as described above, but showed non-specific cytotoxic activity at any concentration.
  • the binding of these antibodies to CD3 was measured by Biacore (GE Healthcare). Specifically, an amine coupling kit (GE Healthcare) was used on the CM5 sensor chip to solidify the anti-tella His mouse antibody (QIAGEN) with 8000 RU as a guide. 10 mM sodium acetate (pH 4.5) was used as the coupling buffer. As a ligand, a His-tag-fused human CD3D & E protein (Sino Biological) dissolved in HBS-EP (+) buffer at 5 ⁇ g / mL was captured at 5 ⁇ L / min for 120 seconds.
  • a His-tag-fused human CD3D & E protein (Sino Biological) dissolved in HBS-EP (+) buffer at 5 ⁇ g / mL was captured at 5 ⁇ L / min for 120 seconds.
  • K D values of 4D5mut_scSP34_IgG1 (DF) is 1.26 ⁇ 10 -8 M
  • K D values of 4D5mut_scSP34 (H05 ') _ IgG1 ( DF) was 1.08 ⁇ 10 -7 M
  • K D values of 4D5mut_scT3a_IgG1 (DF) was calculated not, but binding on sensorgram was observed, had reached bond dissociation equilibrium at about 6RU at the highest concentration added.
  • 4D5mut_scSP34 (H05 ') _ IgG1 ( DF) is because it is reached bond dissociation equilibrium at about 100RU at the highest concentration added, K D values of 4D5mut_scT3a_IgG1 (DF) is greater than this, K D> 1.08 ⁇ 10 - It can be judged that it is 7 M.
  • one molecule of anti-CD3 bispecific antibody having ADCC activity and ADTC activity synergistically exerts high cytotoxic activity and is non-CD3 bispecific antibody. It was shown that the CD3 binding domain needs to be monovalently added to the C-terminal side of the Fc of the anti-CD3 bispecific antibody in order not to generate specific cytotoxic activity.
  • K D values are 1 ⁇ 10 -8 longitudinal) of SEQ ID NO: 73 as an anti-CD3 scFv using , DNP2_mvG1_scI2C (DF) and 4D5_mvG1_scI2C (DF) having the structure of the molecular type (A) shown in Table 5 were prepared in the same manner as in the procedure of Example 6.
  • the cytotoxic activity of these molecules (final concentration 50 nM) on BT-20 cells was measured by the method described in Example 4. The results are shown in FIG. 24A.
  • DNP2_mvG1_scT3a which does not specifically bind to HER2, has no cytotoxic activity and binds specifically to HER2. It was observed in 4D5_mvG1_scT3a (DF).
  • DF DNP2_mvG1_scT3a
  • 4D5_mvG1_scT3a DF
  • high cytotoxic activity was observed in both DNP2_mvG1_scI2C (DF) and 4D5_mvG1_scI2C (DF) regardless of the presence or absence of HER2-specific binding. Therefore, it was clarified that non-specific cytotoxic activity occurs when the clone scI2C is used for anti-CD3 scFv even if the molecular type is the same.
  • human PBMC was incubated with 4D5_mvG1_scT3a (DF) or 4D5_mvG1_scI2C (DF), and the amount of cytokine produced was measured.
  • human PBMC (1 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ L / tube) and antibody (final concentration 100,10,1 ⁇ g / mL) were mixed with X-VIVO® 15 serum-free hematopoietic cell medium, 37. The cells were cultured at ° C for 24 hours. The supernatant after culturing was collected, and the amount of cytokine was measured according to the method shown in Example 7. The results are shown in FIG. 24B.
  • Example 11 Preparation and activity evaluation of CD3 / HER2 bispecific antibody in which the affinity of the anti-CD3 scFv moiety is adjusted (1) Design of amino acid modification From Example 10, the affinity of the anti-CD3 scFv moiety is appropriately controlled. Became important. Using SP34, which is the anti-CD3 monoclonal antibody shown in Example 9 (1), it was attempted to reduce the affinity to an appropriate range by introducing an amino acid modification into the CDR.
  • the nucleotide sequence of scSP34 used as the scFv type, the amino acid sequence, and the amino acid sequence of CDR are shown in SEQ ID NOs: 74, 75, 76 to 81, respectively.
  • FIG. 25 (A) shows the design of one amino acid modification introduction
  • FIG. 25 (B) shows the design of modification introduction of two or more amino acid residues.
  • the amino acid residues in bold in the amino acid sequence in the table are the modified amino acid residues.
  • the amino acid sequence of the humanized antibody of the CDR variant of SP34 was designed by the same procedure as that described in Example 15 (1) of International Patent Publication No. 2019/017401, and the amino acid sequences of the VL and VH thereof were designed.
  • the amino acid sequences of the framework are shown in FIGS. 26 (A) (C) and (B) (D), respectively.
  • the amount of cytokine in the culture supernatant was extremely high in 4D5_mvG1_scSP34 (DF) and significantly low in 4D5_mvG1_scSP34 (H04') (DF), and was significantly low in 4D5_mvG1_scSP34 (H05).
  • DF 4D5_mvG1_scSP34
  • H04' 4D5_mvG1_scSP34
  • H05' 4D5_mvG1_scSP34
  • cytotoxic activity and cytokine production can be controlled by introducing amino acid residue modification into anti-CD3 scFv to adjust affinity.
  • the amino acid sequence of scSP34 (H04'), which is an anti-CD3 scFv with adjusted affinity, is sequenced in SEQ ID NO: 117
  • the amino acid sequence of heavy chain CDR1-3 is sequenced in SEQ ID NO: 118-120
  • the amino acid sequence of light chain CDR1-3 is sequenced.
  • the amino acid sequences of VH and VL are shown in Nos. 121 to 123, respectively, and in SEQ ID NOs: 124 and 125, respectively.
  • amino acid sequence of scSP34 (H05') is assigned to SEQ ID NO: 82
  • amino acid sequence of heavy chain CDR1 to 3 is assigned to SEQ ID NO: 83 to 85
  • amino acid sequence of light chain CDR1 to 3 is assigned to SEQ ID NO: 86 to 88
  • VH VL amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 115 and 116, respectively.
  • Non-specific cytokine production Induction of non-specific cytokine production such as 4D5_mvG1_scSP34 (DF), 4D5_mvG1_scSP34 (H04') (DF) and 4D5_mvG1_scSP34 (H05') (DF) in the same manner as in Example 10. Noh was measured. 4D5_mvG1_scT3a (DF) was used as a negative control that does not induce non-specific cytokine production, and 4D5_mvG1_scI2C (DF) was used as a positive control that induces non-specific cytokine production. The results are shown in FIG.
  • Example 12 Acquisition of anti-CD3 monoclonal antibody from human antibody-producing mice, preparation of CD3 / HER2 bispecific antibody adjusted for affinity and evaluation of activity (1) Immunity to animals and preparation of anti-CD3 monoclonal antibody-producing cells Human antibody-producing mouse [Ishida & Lonberg, IBC's 11 th antibody Engineering, Abstract 2000;. Ishida, I.
  • N-terminal non-acetylated peptide of human CD3 ⁇ was KLH protein conjugated as immunogens: H 2 N-QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTC-KLH (SEQ ID NO: 146) (Scrum Inc.) were administered with 40 [mu] g / animal six times .. Only at the time of initial immunization, an equal amount of TitterMax Gold (TitterMax USA) or Sigma adjuvant system (Sigma-Aldrich) was added to 20 ⁇ L of the antigen solution as an adjuvant.
  • the lymph nodes or spleen were surgically removed by dissection. After homogenizing the removed lymph nodes or spleen, the cells were transferred to a tube through a cell strainer (Falcon) and centrifuged to precipitate the cells. The obtained spleen cells were mixed with an erythrocyte removal reagent (Sigma-Aldrich), reacted in a hot water bath at 37 ° C. for 1 minute, diluted with MEM medium, and further centrifuged. The obtained splenocytes or lymphocytes were washed twice with MEM medium and then subjected to cell fusion.
  • an erythrocyte removal reagent Sigma-Aldrich
  • Cloning Medium CM-B (Sekisui Medical Co., Ltd.) and suspended to 2.5 ⁇ 10 6 cells / 18 mL. , 200 ⁇ L each was seeded on a 96-well plate.
  • the cells are cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 8 to 10 days, and the culture supernatant is used to screen the hybridomas described below to produce an antibody showing specific reactivity to the target antigen.
  • Single cell sorting was performed with a cell sorter SH800 (Sony Corporation) to establish a monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • KM14 which is a hybridoma clone that specifically recognizes human CD3 and cynomolgus monkey CD3, was established.
  • the obtained PCR fragment was sequenced using the next-generation sequencer Ion PGM (Thermo Fisher Scientific) for the light chain and the Sanger sequencer 3130xl Genetic Analoger (Applied Biosystems) for the heavy chain, and the anti-CD3 monoclonal antibody KM14 antibody.
  • the base sequence of the gene was obtained.
  • the nucleotide sequences encoding the amino acid sequences of the light chain variable region and the heavy chain variable region of the anti-CD3 monoclonal antibody KM14 are shown in SEQ ID NOs: 91 and 92, respectively.
  • the amino acid sequences obtained by translating those base sequences are shown in SEQ ID NOs: 93 and 94, respectively, and the amino acid sequences of light chain CDR1 to 3 and heavy chain CDR1 to 3, respectively, are shown in SEQ ID NOs: 95 to 97 and 98 to 100, respectively. do.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of scKM14 as scFv are shown in SEQ ID NOs: 101 and 102, respectively.
  • Design of amino acid residue modification based on anti-CD3 monoclonal antibody KM14 scKM14 prepared using the variable region of anti-CD3 monoclonal antibody KM14 has an affinity for CD3 with the anti-CD3 scFv used in the previous examples. It is stronger than certain scT3a and scSP34 (H05'), and it is considered that non-specific cytotoxic activity may be expressed by combining with ADCC activity. Therefore, the amino acid residue modification of the CDR of the anti-CD3 monoclonal antibody KM14 was designed according to the method described in Example 11 (1). A part of the design is shown in FIG. The amino acid residues in bold in the amino acid sequence in the table represent the modified amino acid residues.
  • the affinity measurement was based on the method shown in Example 9 (4).
  • Cytotoxic activity and cytokine production during cytotoxicity The cytotoxic activity of the prepared antibody against BT-20 cells and the amount of cytokine produced during cytotoxicity were measured in the same manner as in Examples 3 and 7. bottom. The final concentration of the test substance was 400 pM for cytotoxic activity measurement and 10 nM for cytokine production measurement.
  • the cytotoxic activity of 4D5_mvG1_scKM14 (mut1-03) (F), 4D5_mvG1_scKM14 (mut1-04) (F), 4D5_mvG1_scKM14 (mut1-18) (F), 4D5_mvG1_scKM14 (mut1-22) (F) is 4D.
  • the activity of 4D5_mvG1_scKM14 (mut1-26) (F) was equivalent to that of 4D5_mvG1_scSP34 (H05') (F). In the figure, it was revealed that 4D5_mvG1_scKM14 (F) has the highest activity.
  • the cytotoxic activity of the prepared antibody against BT-20 cells was measured in the same manner as described in 3.
  • the final concentration of the test substance was 50, 5, 0.5 nM, the Cell index value of the well to which the test substance was not added was 0%, and the Cell index value of the well to which 0.5% Triton X-100 was added was 100% of the activity.
  • the cytotoxic activity was calculated 48 hours and 120 hours after the addition of the test substance.
  • the results 48 hours after the addition of the test substance are shown in FIG. 35 (A), and the results 120 hours after the addition of the test substance are shown in FIG. 35 (B).
  • BT-20 cells were prepared in RPMI 1640 medium (10% FBS, 10 ⁇ g / mL gentamicin) at 2.0 ⁇ 10 5 cells / mL, and 50 ⁇ L / well was added to a 96-well plate.
  • human immunoglobulin (Japan Blood Products Organization) prepared at 4 mg / mL in RPMI medium, PBMC derived from healthy human peripheral blood prepared at a cell density of 1 ⁇ 10 6 cells / mL, was placed on the above plate at 50 ⁇ L / well each. added.
  • various bispecific antibodies prepared at 4 times the final concentration were added at a rate of 50 ⁇ L / well and incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for 48 hours.
  • cytotoxic activity For the measurement of cytotoxic activity, a cell proliferation / cytotoxicity assay kit Cell Counting Kit-8 (Dojin Chemical Research Institute) that detects live cells was used. The culture supernatant was removed from the 96-well plate after the reaction, washed twice with PBS, a color-developing reagent was added to carry out a color reaction, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader.
  • the absorbance of the well in which only the cells were seeded and no test substance was added was 0%, and the absorbance of the well in which the cells were lysed by adding 0.5% Triton X-100 was 100%, and the value of the cytotoxic activity was set. Calculated. The amount of cytokine produced was measured using the culture supernatant after 48 hours of incubation in the same manner as in the method described in Example 7.
  • 4D5_mvG1_scKM14 (mut1-XX) (DF) (XX: 03, 04, 18, 22, 25, 26), and the anti-CD3 bispecific antibody CD3 / HER2 Fab ⁇ scFv prepared in Example 7 as described above.
  • the cytotoxic activity and cytokine production against BT-20 cells were measured. The results of cytotoxic activity are shown in FIGS. 41 (A), and the results of cytokine production are shown in FIGS. 41 (B) and 41 (C).
  • the production amount of IFN- ⁇ and IL-6 of these bispecific antibodies was very small as compared with CD3 / HER2 Fab ⁇ scFv.
  • the amount of cytokine produced by these bispecific antibodies is the intensity of cytotoxic activity shown in FIGS. 35 (A) and (B) and 41 (A), and the cytokine production shown in FIGS. 34 (A) and 34 (B). It was correlated with quantity. It was also found that the amount of cytokine produced in the fucose-removed bispecific antibody showed a low value as in the case of the fucose-added type.
  • Example 13 Preparation and activity evaluation of CD3 / cancer antigen bispecific antibody against various blood cancer antigens (1) Preparation of CD3 / CCR4 bispecific antibody and CD3 / CD123 bispecific antibody Bispecific antibodies with variable regions were prepared and their cytotoxic activity against hematological cancer-derived cell lines was examined. The bispecific antibody shown in Table 7 was prepared according to the method described in Example 6.
  • a CD3 / CCR4 bispecific antibody was prepared using the VL and VH amino acid sequences of the anti-CCR4 monoclonal antibody KM2160 as a monoclonal antibody that binds to CC-chemokine receptor 4 (CCR4).
  • CD123 for the purpose of comparative verification with a general-purpose anti-CD3 bispecific antibody, based on the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 of International Patent Publication No. 2017/210443, CD3 / CD123 by CD3 / CD123 as a comparative control.
  • the specific antibody XENP14045 was prepared.
  • XENP14045 is a CD3 / CD123 bispecific antibody having an Fc (silent Fc) that lacks Fc receptor-binding activity due to amino acid modification, and damages cancer cells only by ADTC activity.
  • the amino acid sequences of VL and VH of the anti-CD123 antibody portion of XENP14045 are shown in SEQ ID NOs: 109 and 110. Using these sequences, CD123-2_mvG1_scSP34 (H05') (DF), which is a bispecific antibody having VH and VL of the anti-CD123 antibody portion of XENP14045, was prepared.
  • cytotoxic activity of the prepared CD3 / CCR4 bispecific antibody was measured by PER cells (JCRB cell bank JCRB0830), which is a cell line derived from CCR4-positive T cell lymphoma. Was measured by flow cytometry.
  • PEER cells were pre-fluorescent labeled with CellVue® Claret Far Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma-Aldrich), diluted to 2.0 ⁇ 10 5 cells / mL and added 50 ⁇ L / well to 96-well plates. ..
  • human immunoglobulin (Japan Blood Products Organization) prepared at 4 mg / mL in RPMI medium, PBMC derived from healthy human peripheral blood prepared at a cell density of 1 ⁇ 10 6 cells / mL, was placed on the above plate at 50 ⁇ L / well each. added.
  • the PEER cell fraction is selected by FSC and SSC, the APC (+) and BV421 (-) fractions are counted as living cells, and the living cells obtained by adding each bispecific antibody based on the number of living cells without the test substance added. The rate of decrease in number was calculated as cytotoxic activity (%).
  • the culture supernatant was collected, and the cytokine concentration was measured according to the method described in Example 7. The measurement results of the cytotoxic activity are shown in FIGS. 36 (A) to 36 (C).
  • 4D5_mvG1_scSP34 which is an anti-HER2 bispecific antibody having ADCC and ADTC activity but not binding to the PER cell line.
  • No cytotoxic activity was observed in (H05') (DF).
  • Injury activity was observed, and the activity of KM2160_mvG1 (DF) tended to be higher than that of KM2160_mvG4PE (R409K) _scXX (F).
  • KM2160_mvG1_scXX (DF) (XX: T3a, SP34 (H05'), KM14 (mut1-04), KM14 (mut1-18)) having ADCC activity and ADCC activity showed cytotoxic activity far exceeding that of the above antibody.
  • KM2160_mvG1_scSP34 H05' (DF) showed higher cytotoxic activity than KM2160_IgG1 (DF), which is an IgG1 type antibody having strong ADCC activity and binding divalently.
  • FIGS. 37 (A) and 37 (B) The measurement results of the amount of cytokine (IL-2 and IFN- ⁇ ) produced are shown in FIGS. 37 (A) and 37 (B).
  • KM2160_mvG1_scXX (DF) (XX: T3a, SP34 (H05'), KM14 (mut1-04), KM14 (mut1-18)), which showed high cytotoxic activity above, Little increase in IL-2 production was observed.
  • FIG. 37 (B) the amount of IFN- ⁇ produced increased at KM2160_mvG1_scSP34 (H05') (DF) and KM2160_mvG1_scKM14 (mut1-18) (DF) only at the maximum concentration of 50 nM. ..
  • the cytotoxic activity and cytokine production of the prepared CD3 / CD123 bispecific antibody were evaluated by MOLM13, which is a CD123-positive acute myeloid leukemia (AML) -derived cell line.
  • MOLM13 which is a CD123-positive acute myeloid leukemia (AML) -derived cell line.
  • Cells (DSMZ ACC 554) and OCI-AML3 cells (DAMZ ACC 582) were used and measured by flow cytometry according to the method described in Example 13 (2).
  • the measurement results of the cytotoxic activity of the molecule having CD123-1 as the variable region on MOLM13 cells are shown in FIG. 38 (A), and the cytokine production is shown in FIG. 38 (B).
  • FIG. 38 (A) no cytotoxic activity was observed in 4D5_mvG1_scSP34 (H05') (DF) used as a negative control.
  • the cytotoxic activity increases in the order of CD123-1_mvG1 (DF) having ADCC activity, CD123-1_hIgG1 (DF), CD123-1_mvG4 (R409K) _scSP34 (H05') (DF) having ADCC activity, and ADCC activity and ADTC.
  • FIG. 38 (B) no significant difference was observed between the molecules in terms of cytokine production at this time.
  • B) the corresponding cytokine production is shown in FIGS. 40 (A), (B), (C), and (D), respectively.
  • XENP14045 showed cytotoxic activity from a concentration about 1/10 lower in both cell lines as compared with CD123-2_mvG1_scSP34 (H05') (DF). ..
  • the maximum cytotoxic activity was over 80%. No cytotoxic activity was observed with 4D5_mvG1_scSP34 (H05') (DF) used as a negative control.
  • the anti-CD3 bispecific antibody of the present invention does not involve significant cytokine production and has the same cytotoxic activity as the anti-CD3 bispecific antibody, which has a strong affinity for CD3 and has only the mechanism of action of ADTC activity. It became clear that it can exert.
  • Example 14 Design of anti-CD3 / HER2 bispecific antibody modified CH3 region and anti-CD3 scFv region
  • a Knobs into Holes (KIH) modification of a target molecule is introduced into the CH3 region. It is known that the proportion increases.
  • KIH modification was introduced into the anti-CD3 / HER2 bispecific antibody having a bivalent Fab on the cancer antigen side, but in this example, the Fab on the cancer antigen side is monovalent anti-CD3 /.
  • KIH modifications were introduced into the HER2 bispecific antibody.
  • the anti-CD3 / HER2 bispecific antibody having a monovalent Fab on the cancer antigen side includes polypeptide 1 (VH-CH1-Fc-scFv) and polypeptide 2 (VL-CL-Fc). Knobs-type or Holes-type amino acid modifications can also be introduced on the polypeptide side of. Further, in the KIH modification introduced in Examples 8 and 9, an intermolecular disulfide bond is introduced into the two CH3 portions, and the KIH modification having no disulfide bond can also be applied to the CD3 bispecific antibody of the present invention.
  • amino acid residue substitutions of S354C and T366W are added to one of the two Fc polypeptide chains, and amino acid residue substitutions of Y349C, T366S, L368A and Y407V are added to the other.
  • an anti-CD3 bispecific antibody was prepared by modifying scFv to enhance physicochemical stability. Specifically, a disulfide bond was introduced by modifying the amino acid on the interaction surface between VH and VL of scFv with reference to the method described in Nat. Biotechnol. 14, 1239-45, 1996. Specifically, the amino acid at position 44 (according to Kabat numbering) of VH of scFv was replaced with Cys, and the amino acid at position 100 (according to Kabat numbering) of VL was replaced with Cys. This modification is referred to as (CC) or CC modification. In addition, scFv was prepared by substituting the 44th amino acid of VH with Ser and the 100th amino acid of VL with Glu. This modification is referred to as (SE) or SE modification.
  • FIG. 42 shows a design example and structural position of an amino acid modification introduced into the CH3 region and anti-CD3 scFv in an anti-CD3 bispecific antibody in which Fab on the cancer antigen side is monovalent.
  • the modification shown in FIG. 42 can also be applied to an anti-CD3 bispecific antibody having a divalent Fab on the cancer antigen side.
  • Examples 1 to 13 a plurality of specific sequences of anti-CD3 scFv capable of enhancing cytotoxic activity without significant cytokine production were shown, and examples of anti-CD3 bispecific antibodies having those scFvs were shown.
  • the amino acid modification introduced into the CH3 region and the anti-CD3 scFv region described above can be introduced independently of the sequence of the anti-CD3 scFv.
  • scFv is not only bound in the order of VH, linker, VL from the N-terminal side (also referred to as VH-linker-VL type, HL type), but also bound in the order of VL, linker, VH (VL).
  • -Linker-also referred to as VH type and LH type) is also known.
  • the anti-CD3 scFv in the present invention is not limited to the VH-linker-VL type prepared in Examples 1 to 13, and can be designed by the VL-linker-VH type, both of which are shown in FIG. 42. It is possible to introduce amino acid modifications.
  • the modifications introduced into the anti-CD3 bispecific antibody of the present invention the modifications of the CH3 portion, the scFv clone name, the order of VH and VL of scFv, and the amino acid modifications introduced into scFv are shown in the table (FIG. 43).
  • scSP34 H05'
  • the amino acid sequence using the FR sequence shown in FIG. 26 can be used in the same manner. Examples include VH (HV3) represented by SEQ ID NO: 159, VH (HV5) represented by SEQ ID NO: 160, and VL (LV8a) represented by SEQ ID NO: 165.
  • the modification of FIG. 43 can also be applied to an anti-CD3 bispecific antibody whose cancer antigen side is divalent.
  • Example 15 Preparation of anti-CD3 / HER2 bispecific antibody modified CH3 region and anti-CD3 scFv region, evaluation of cytotoxic activity and cytokine production
  • the KIH modification designed in Example 14 The amino acid sequences of the four sets of Fc regions (KIH-1 to KIH-4) introduced are shown in SEQ ID NOs: 147 to 154.
  • various bispecific antibodies having scFv having these four types of KIH modification and / or CC modification or SE modification of scFv were prepared by a method according to the method described in Example 6.
  • the SEQ ID NOs of the amino acid sequences of the various bispecific antibodies produced and their components are shown in Tables 8 and 9.
  • the amino acid sequence of scSP34 (H05') which is the scFv of the bispecific antibody in Table 8, is shown by SEQ ID NO: 82.
  • VH and VL of scFv into which CC modification or SE modification has been introduced are shown in SEQ ID NOs: 155 to 191.
  • Specific examples of the specific amino acid sequence of the anti-CD3 scFv composed of these VH and VL are shown in the VH-linker-VL type sequence in SEQ ID NOs: 192 to 205 and the VL-linker-VH type sequence in SEQ ID NO: Shown in 206-217 (VL-linker-VH type sequences are also shown for sequences that have not been CC-modified or SE-modified).
  • Table 9 shows specific examples of anti-CD3 / HER2 bispecific antibodies prepared according to the method described in Example 6 using these scFv sequences and their anti-CD3 scFv sequences.
  • each component of the bispecific antibody type of introduced KIH modification, anti-CD3 scFv clone name, order of VH and VL of scFv, and modification introduced into scFv is described in order.
  • 4D5_mvG1 (KIH-1) _scXX (YY) (ZZ) (DF) indicates that the Fab clone is 4D5, and mvG1 is monovalent on the cancer antigen side and the Fc region is IgG1-based.
  • KIH-1 indicates that the modified pattern of the Fc (CH3) portion is KIH-1 type
  • scXX indicates that the clone of anti-CD3 scFv is XX
  • the (YY) portion is (YY).
  • LH indicates VL-linker-VH type (the one without this part is VH-linker-VL type), and the one described as (CC) in the (ZZ) part is CC-modified to scFv.
  • CC C-modified to scFv.
  • Table 10 shows the amino acid sequences of VH, VL, heavy chain CDR and light chain CDR contained in various CD3 scFv by SEQ ID NO:. Table 10 applies regardless of whether scFv is HL type or LH type.
  • Cytotoxic activity and cytokine production during cytotoxicity The cytotoxic activity of the prepared bispecific antibody against BT-20 cells and the amount of cytokine produced during cytotoxicity are determined according to the method described in Example 12- (8). It was measured. Cell density at seeding of BT-20 cells were prepared in 5.0 ⁇ 10 5 cells / mL. The results of cytotoxic activity and cytokine production are shown in FIGS. 45A-D and 46A-F, respectively.
  • the bispecific antibody in which four KIH modifications from KIH-1 to KIH-4 were introduced into Fc (CH3) of 4D5_mvG1_scSP34 (H05') (DF) showed the same cytotoxic activity as before the modification. .. Therefore, it was clarified that the presence or absence of KIH modification and its pattern do not affect the activity of the bispecific antibody in the present invention.
  • the bispecific antibody having scSP34 (H05') as anti-CD3 scFv is a bispecific antibody having scSP34 (H05') (SE), scSP34 (H05'_HV3LV8a), or scSP34 (H05'_HV5LV8a). It was found that the cytotoxic activity was similar to that of the above.
  • a bispecific antibody having scSP34 (H05') (CC) as scFv has the same cytotoxic activity as a bispecific antibody having scSP34 (H05'_HV3LV8a) (CC) or scSP34 (H05'_HV5LV8a) (CC). It turned out to show. Since these bispecific antibodies showed the same cytotoxic activity in (LH), the activity of the bispecific antibody was whether scFv was VH-Linker-VL type or VL-Linker-VH type. It turned out that it was not affected by.
  • the anti-CD3 bispecific antibody of the present invention has an anti-CD3 scFv of either VH-Linker-VL type or VL-Linker-VH type regardless of the introduction of KIH modification into Fc (CH3).
  • anti-CD3 scFv even if CC modification or SE modification is introduced into anti-CD3 scFv, if the affinity for CD3 is within an appropriate range, remarkable cytokine production can be achieved by having both ADCC activity and ADCC activity in one molecule. It was clarified that high cytotoxic activity can be exhibited without the presence of.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of CH1-Hinge-Fc portion of IgG1 type anti-HER2 monovalent antibody
  • First polypeptide SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of CH1-Hinge-Fc portion of IgG1 type anti-HER2 monovalent antibody
  • first polypeptide SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence of CL-Hinge-Fc portion of IgG1 type anti-HER2 monovalent antibody
  • Second polypeptide SEQ ID NO: 4 Nucleotide sequence of CL-Hinge-Fc portion of IgG1 type anti-HER2 monovalent antibody
  • First polypeptide SEQ ID NO: 6 IgG4PE (R409K) type anti-HER2 monovalent antibody CH1-Hinge of the first polypeptide -
  • Amino acid sequence number 180 of SE-modified VH of scKM14 (mut1-26): Amino acid sequence number 181 of CC-modified VL of scKM14 (mut1-03) Amino acid sequence number 182 of CC-modified VL of scKM14 (mut1-04) : Amino acid sequence of CC-modified VL of scKM14 (mut1-18) SEQ ID NO: 183: C of scKM14 (mut1-22) Amino acid sequence of C-modified VL SEQ ID NO: 184: Amino acid sequence of CC-modified VL of scKM14 (mut1-25) SEQ ID NO: 185: Amino acid sequence of CC-modified VL of scKM14 (mut1-26) SEQ ID NO: 186: scKM14 (mut1-03) SE Modified VL Amino Acid SEQ ID NO: 187: ScKM14 (mut1-04) SE Modified VL Amino Acid SEQ ID NO: 187:

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Abstract

本発明は、ＣＤ３に結合するバイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片の提供を目的とする。本発明は、ＣＤ３に結合するバイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片、該バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、該バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片の製造方法、該バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片を含む治療および診断剤、該バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片を用いる治療および診断方法、ならびに該バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片を含む検出または測定試薬に関する。

Description

ＣＤ３に結合するバイスペシフィック抗体
　本発明は、ＣＤ３に結合するバイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を含む治療および／または診断薬、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を用いる治療および／または診断方法、ならびに該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む検出または測定用試薬に関する。
　今までに承認されたがんに対する抗体医薬は様々な作用メカニズムを有することが知られる（非特許文献１）。代表的なものとしては増殖因子などのリガンドと受容体の結合を阻害する中和活性、結合した受容体を活性化するアゴニスト活性、さらには抗体依存性細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：以下ＡＤＣＣ活性）、補体依存性細胞傷害活性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：以下ＣＤＣ活性）など、ＩｇＧ型の抗体分子が有するエフェクター機能などがある。この中で、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの臨床試験のバイオマーカー解析から、ＡＤＣＣ活性は抗体医薬の臨床における重要なメカニズムであることが示唆されている（非特許文献２、３）。
　ＡＤＣＣ活性はがん細胞表面の膜型抗原に結合したＩｇＧ型の抗体のＦｃを、ナチュラルキラー細胞（以下ＮＫ細胞）などがＦｃ受容体の一種ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）を介して認識することによって起こる細胞傷害のメカニズムである（非特許文献１）。
　Ｆｃ受容体に強く結合し、ＡＤＣＣ活性を惹起できるのはヒトではＩｇＧ１サブクラスであり、マウスではＩｇＧ２ａサブクラスである。従って抗体医薬のヒトＩｇＧ１型のＦｃを人工的に改変し、ＦｃγＲＩＩＩＡとの結合能を上昇させることによってＡＤＣＣ活性を増強させることができる。
　実際にＦｃのアミノ酸の改変、あるいはＦｃに結合するＮ－結合型複合型糖鎖の糖鎖を改変することによってＡＤＣＣ活性を増強できることが知られ（非特許文献４）、特に糖鎖改変によるＡＤＣＣ活性増強技術は、ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ（非特許文献５）、ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ（非特許文献６）といった承認済の抗体医薬に応用されている。
　バイスペシフィック抗体とは、天然の抗体とは異なり、二種類の異なる種類の抗原に結合することを可能にした人工的な改変抗体分子であり、数多くの分子形が報告されている（非特許文献７）。その医薬への応用例としては、がん細胞上の抗原とＴ細胞表面のＣＤ３に結合し、この両者を架橋することによりがん細胞を傷害する技術が挙げられる。
　ＣＤ３／がん抗原バイスペシフィック抗体がＴ細胞上のＣＤ３と結合することによって生じるＴ細胞を介した細胞傷害活性を、ここではＡＤＴＣ活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｔ－ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）と記載する。
　ＣＤ３／がん抗原バイスペシフィック抗体の例としては、ＣＤ３とがん抗原ＥｐＣＡＭに対するＩｇＧ型のバイスペシフィック抗体ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（非特許文献８）、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｅｎｇａｇｅｒ［ＢｉＴＥ（登録商標）］（非特許文献９）およびＣＤ３とがん抗原ＣＥＡに対するＩｇＧ型のバイスペシフィック抗体ＲＧ７８０２などが挙げられる。
　この他にも多くの分子形が存在するが（非特許文献７）、これらの抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体は一般的にＡＤＴＣ活性のみを有し、ＡＤＣＣ活性を有さない、あるいは抑制された構造を有する。
　例えばＢｉＴＥ（登録商標）はＣＤ３およびがん抗原に結合する二種の異なるｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる抗体断片をペプチドリンカーで結合したものであり、Ｆｃを含まず、従ってＡＤＣＣ活性のようなＦｃを介した作用機序は有しない［図１（Ｃ）］。またＲＧ７８０２はＦｃを有するが、Ｐ３２９Ｇの変異をＦｃに導入することによりＦｃ受容体への結合能を除去しており、やはりＡＤＣＣ活性を示さない（非特許文献１０）。
　例外はＣａｔｕｍａｘｏｍａｂであり、この抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体はＦｃ受容体に結合するマウスＩｇＧ２ａ／ラットＩｇＧ２ｂのハイブリッド型のＦｃを有し、それによりＡＤＣＣ活性を惹起することが知られている（非特許文献８）。しかしながらげっ歯類由来のＦｃは通常の抗体医薬に用いられるヒト由来Ｆｃと比較してＡＤＣＣ活性を惹起する能力が低い（非特許文献１１）。
　抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体に強いＦｃ受容体結合能を有するＦｃを組み合わせる検討が行われてこなかった理由は、ＣＤ３のＦｃ受容体を介したクラスタリング（細胞膜上での凝集）によってＴ細胞の活性化が起こり、それに伴う副作用が懸念されるためだと考えられる。　
　例えば、臓器移植時の拒絶抑制に用いられる抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３はサイトカイン放出症候群の副作用が起こるが、それはＯＫＴ３のマウスＩｇＧ２ａ型のＦｃを介した、Ｆｃ受容体を有する白血球によるＣＤ３のクラスタリングが原因として考えられている（非特許文献１２）。
　ＣＤ３とＥｐＣＡＭのバイスペシフィック抗体であり、Ｆｃ受容体への結合能を有するＣａｔｕｍａｘｏｍａｂの投与後のサイトカイン放出症候群を伴う深刻な副作用は、Ｆｃ受容体を有する肝臓のＫｕｐｆｆｅｒ細胞を介したＴ細胞の活性化が原因であると推定される（非特許文献１３）。
　また、Ｆｃを有するバイスペシフィック抗体のフォーマットとしては、ＣＤ３の非特異的な活性化による副作用の懸念を回避するため、ＣＤ３結合部位を一価で有するためのヘテロダイマー型の構造が一般的に用いられる（特許文献１～４）。
　ＣＤ３に対するアフィニティが低い抗ＣＤ３抗体を用いた抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体も作製されている。このようなバイスペシフィック抗体としては、ＣＤ３へのアフィニティがＫＤ=１．０×１０－７であるＲＧ７８０２が臨床開発されている（非特許文献１４、１５）。ＲＧ７８０２はＦｃ受容体への結合能を持たないＦｃ領域を有しており、ＡＤＣＣ活性をはじめとしたエフェクター活性を有さない（非特許文献１５）。
国際公開第２０１１／０２８９５２号 国際公開第２０１４／１５１９１０号 国際公開第２０１５／０４８２７２号 国際公開第２０１４／０５４８０4号
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　これまでＣＤ３と特定の抗原とに結合する各種抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体は知られていたが、十分な薬効が得られておらず、またサイトカイン放出症候群などの過剰な免疫反応による重篤な副作用の課題が残されている。
　また、ＡＤＣＣ活性または高いＡＤＣＣ活性を発揮するヘテロダイマー型のＣＤ３／がん抗原バイスペシフィック抗体、およびその細胞傷害活性については詳細な検討はされておらず、高い細胞傷害活性を有しかつ過剰なサイトカイン産生誘導が抑制された抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体は知られていない。
　他方、アミノ酸残基改変Ｆｃや糖鎖改変ＦｃによりＦｃ受容体へアフィニティが増強したＦｃ領域を含む抗体がモノクローナル抗体の高いＡＤＣＣ活性に寄与することは知られていたものの、敢えて重篤な副作用の課題の残る抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体に、アミノ酸残基改変Ｆｃや糖鎖改変ＦｃによりＦｃ受容体へアフィニティが増強したＦｃ領域を用いてＡＤＣＣ活性を高めて、バイスペシフィック抗体による免疫反応を増強する動機付けはない。
　本発明では、サイトカイン産生誘導が抑制された抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体、ＣＤ３および疾患関連抗原に特異的に結合するバイスペシフィック抗体の提供を目的とする。また、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインおよび疾患関連抗原に結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体、該バイスペシフィック抗体断片、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む治療および診断剤、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いる治療および診断方法、ならびに該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む検出または測定用試薬、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体の製造のためのＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメイン、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体によるサイトカイン産生誘導を抑制するためのＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインの提供を目的とする。
　本発明は、以下に関する。
１．Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域を含み、該Ｆｃ領域のＣ末端側にＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインが１つ結合し、さらに疾患関連抗原結合ドメインを含む、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
２．Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域を含み、該Ｆｃ領域のＣ末端側にＣＤ３結合ドメインが１つ結合し、さらに疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片であって、ＣＤ３陽性Ｔ細胞及び疾患関連抗原陽性細胞の存在下で、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４を用いた抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体と比較して、サイトカイン産生誘導能が低下している抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
３．前記ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数（ＫＤ）が６×１０－８以上である、前記１又は２に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
４．前記ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数が比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４よりも大きい、前記１～３のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
５．前記ＣＤ３結合ドメインのアミノ酸配列が、比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４のＣＤ３結合ドメインのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつ該抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４と比べてＣＤ３に対するアフィニティが１０％以上低下している、前記１～４のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
６．前記疾患関連抗原結合ドメインを１又は２つ含む、前記１～５のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
７．前記ＣＤ３結合ドメイン及び前記疾患関連抗原結合ドメインがそれぞれｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨから選ばれるいずれか１である、前記１～６のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
８．前記ＣＤ３結合ドメイン及び／又は前記疾患関連抗原結合ドメインが、リンカーを介して前記Ｆｃ領域に結合している、前記１～７のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
９．前記ＣＤ３結合ドメインが、抗体重鎖の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲと略記する）１～３を含む重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ；ＶＨと略記する）および抗体軽鎖のＣＤＲ１～３を含む軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ；ＶＬと略記する）を含む、前記１～８のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
１０．前記ＣＤ３結合ドメインがｓｃＦｖである、前記１～９のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
１１．前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨのＣＤＲ１～３（ＨＣＤＲ１～３）およびＶＬのＣＤＲ１～３（ＬＣＤＲ１～３）のアミノ酸配列が、下記（ａ）～（ｈ）から選ばれるいずれか１のＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列とそれぞれ９０％以上の相同性を有する、前記１～１０のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
（ａ）それぞれ配列番号１１８～１２０で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１２１～１２３で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｂ）それぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号８６～８８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｃ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３２、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｄ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３３、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｅ）それぞれ配列番号９８、１３４、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｆ）それぞれ配列番号９８、１３５、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｇ）それぞれ配列番号９８、１３６、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｈ）それぞれ配列番号９８、１３７、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
１２．前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列が、下記（ａａ）～（ｒｒ）から選ばれるいずれか１のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列とそれぞれ８０％以上の相同性を有する、前記１～１１のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
（ａａ）配列番号１２４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｂｂ）配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｃｃ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｄｄ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｅｅ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｆｆ）配列番号１２９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｇｇ）配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｈｈ）配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｉｉ）配列番号１５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｊｊ）配列番号１６０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｋｋ）配列番号１６１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｌｌ）配列番号１６２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｍｍ）配列番号１６８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｎｎ）配列番号１６９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｏｏ）配列番号１７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｐｐ）配列番号１７１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｑｑ）配列番号１７２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｒｒ）配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
１３．前記ＣＤ３結合ドメインのＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、下記（ａ）～（ｈ）から選ばれるいずれか１である、前記１～１２のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
（ａ）それぞれ配列番号１１８～１２０で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１２１～１２３で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｂ）それぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号８６～８８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｃ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３２、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｄ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３３、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｅ）それぞれ配列番号９８、１３４、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｆ）それぞれ配列番号９８、１３５、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｇ）それぞれ配列番号９８、１３６、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｈ）それぞれ配列番号９８、１３７、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
１４．前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列が、下記（ａａ）～（ｒｒ）から選ばれるいずれか１である、前記１～１３のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
（ａａ）配列番号１２４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｂｂ）配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｃｃ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｄｄ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｅｅ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｆｆ）配列番号１２９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｇｇ）配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｈｈ）配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｉｉ）配列番号１５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｊｊ）配列番号１６０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｋｋ）配列番号１６１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｌｌ）配列番号１６２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｍｍ）配列番号１６８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｎｎ）配列番号１６９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｏｏ）配列番号１７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｐｐ）配列番号１７１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｑｑ）配列番号１７２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｒｒ）配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
１５．前記Ｆｃ領域がＦｃ受容体への結合活性が増強したＦｃ領域である、前記１～１４のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
１６．前記Ｆｃ受容体への結合活性が増強したＦｃ領域が、アミノ酸残基改変及び／または糖鎖改変を含むＦｃ領域である、前記１５に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
１７．前記Ｆｃ受容体への結合活性が増強したＦｃ領域が、アミノ酸残基改変及び糖鎖改変の両方を含むＦｃ領域である、前記１５又は１６に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
１８．前記アミノ酸残基改変が、Ｆｃ受容体への結合活性を増強させるアミノ酸残基改変を少なくとも１つ含むアミノ酸残基改変である、前記１６又は１７に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
１９．前記糖鎖改変が、Ｆｃ領域のＥＵナンバリング２９７番目のＡｓｎに結合するＮ結合型糖鎖の還元末端のＮ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅにα１，６－結合するｆｕｃｏｓｅを欠損させた糖鎖改変である、前記１６又は１７に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
２０．前記疾患関連抗原結合ドメインとしてＦａｂを２つ含み、それぞれのＦａｂの重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）のＣ末端が、前記Ｆｃ領域と直接またはリンカーを介して結合している、前記１～１９のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
２１．前記疾患関連抗原結合ドメインとしてＦａｂを１つ含み、Ｆａｂの重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）のＣ末端が、前記Ｆｃ領域と直接またはリンカーを介して結合している、前記１～１９のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
２２．前記疾患関連抗原結合ドメインとしてＦａｂを１つ含み、Ｆａｂの重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）と結合している側のＦｃ鎖に前記ＣＤ３結合ドメインが直接またはリンカーを介して結合している、前記１～１９または２１のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
２３．前記疾患関連抗原結合ドメインとしてＦａｂを１つ含み、Ｆａｂの軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）と結合している側のＦｃ鎖に前記ＣＤ３結合ドメインが直接またはリンカーを介して結合している、前記１～１９または２１のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
２４．前記リンカーが、ヒンジまたはその改変体である、前記２０～２３のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
２５．前記１～２４のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ。
２６．前記２５に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
２７．前記２６に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
２８．前記２７に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に前記１～２４のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産蓄積させ、該培養物から該抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を採取することを特徴とする前記１～２４のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法。
２９．前記１～２４のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を有効成分として含有する、前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断薬。
３０．前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである、前記２９に記載の治療および／または診断薬。
３１．前記１～２４のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いる、前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断方法。
３２．前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである、前記３１に記載の治療および／または診断方法。
３３．前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断に使用するための、前記１～２４のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
３４．前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである、前記３３に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
３５．前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断剤の製造のための、前記１～２４のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の使用。
３６．前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである、前記３５に記載の使用。
３７．前記１～２４のいずれか１に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む、前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方を検出または測定するための試薬。
３８．ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインをＦｃ領域に結合させることを特徴とする、Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域及び疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を製造する方法。
３９．ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインを使用することを特徴とする、Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域及び疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片のサイトカイン産生誘導を抑制する方法。
４０．前記ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数（ＫＤ）が６×１０－８以上である、前記３８または３９に記載の方法。
４１．前記ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数が比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４よりも大きい、前記３８～４０のいずれか１に記載の方法。
４２．前記ＣＤ３結合ドメインのアミノ酸配列が、比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４のＣＤ３結合ドメインのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつ抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４と比べてアフィニティが１０％以上低下している、前記３８～４１のいずれか１に記載の方法。
４３．前記抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が疾患関連抗原結合ドメインを１又は２つ含む、前記３８～４２のいずれか１に記載の方法。
４４．前記ＣＤ３結合ドメイン及び前記疾患関連抗原結合ドメインがそれぞれｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨから選ばれるいずれか１である、前記３８～４３のいずれか１に記載の方法。
４５．前記ＣＤ３結合ドメイン及び／又は前記疾患関連抗原結合ドメインが、リンカーを介してＦｃ領域に結合している、前記３８～４４のいずれか１に記載の方法。
４６．前記ＣＤ３結合ドメインが、抗体重鎖のＣＤＲ１～３を含むＶＨおよび抗体軽鎖のＣＤＲ１～３を含むＶＬを含む、前記３８～４５のいずれか１に記載の方法。
４７．前記ＣＤ３結合ドメインがｓｃＦｖである、前記３８～４６のいずれか１に記載の方法。
４８．前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨのＣＤＲ１～３（ＨＣＤＲ１～３）およびＶＬのＣＤＲ１～３（ＬＣＤＲ１～３）のアミノ酸配列が、下記（ａ）～（ｈ）から選ばれるいずれか１のＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列とそれぞれ９０％以上の相同性を有する、前記３８～４７のいずれか１に記載の方法。
（ａ）それぞれ配列番号１１８～１２０で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１２１～１２３で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｂ）それぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号８６～８８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｃ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３２、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｄ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３３、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｅ）それぞれ配列番号９８、１３４、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｆ）それぞれ配列番号９８、１３５、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｇ）それぞれ配列番号９８、１３６、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｈ）それぞれ配列番号９８、１３７、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
４９．前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列が、下記（ａａ）～（ｒｒ）から選ばれるいずれか１のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列とそれぞれ８０％以上の相同性を有する、前記３８～４８のいずれか１に記載の方法。
（ａａ）配列番号１２４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｂｂ）配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｃｃ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｄｄ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｅｅ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｆｆ）配列番号１２９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｇｇ）配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｈｈ）配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｉｉ）配列番号１５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｊｊ）配列番号１６０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｋｋ）配列番号１６１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｌｌ）配列番号１６２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｍｍ）配列番号１６８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｎｎ）配列番号１６９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｏｏ）配列番号１７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｐｐ）配列番号１７１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｑｑ）配列番号１７２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｒｒ）配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
５０．前記ＣＤ３結合ドメインのＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、下記（ａ）～（ｈ）から選ばれるいずれか１である、前記３８～４９のいずれか１に記載の方法。
（ａ）それぞれ配列番号１１８～１２０で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１２１～１２３で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｂ）それぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号８６～８８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｃ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３２、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｄ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３３、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｅ）それぞれ配列番号９８、１３４、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｆ）それぞれ配列番号９８、１３５、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｇ）それぞれ配列番号９８、１３６、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｈ）それぞれ配列番号９８、１３７、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
５１．前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列が、下記（ａａ）～（ｒｒ）から選ばれるいずれか１である、前記３８～５０のいずれか１に記載の方法。
（ａａ）配列番号１２４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｂｂ）配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｃｃ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｄｄ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｅｅ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｆｆ）配列番号１２９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｇｇ）配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｈｈ）配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｉｉ）配列番号１５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｊｊ）配列番号１６０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｋｋ）配列番号１６１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｌｌ）配列番号１６２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｍｍ）配列番号１６８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｎｎ）配列番号１６９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｏｏ）配列番号１７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｐｐ）配列番号１７１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｑｑ）配列番号１７２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｒｒ）配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
５２．前記Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体への結合活性が増強したＦｃ領域である、前記３８～５１のいずれか１に記載の方法。
５３．Ｆｃ領域及び疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を製造するための、ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメイン。
５４．Ｆｃ領域及び疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片のサイトカイン産生誘導を抑制するための、ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメイン。
５５．Ｆｃ領域及び疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を製造するための、ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインの使用。
　本発明により、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインおよび疾患関連抗原に結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体、該バイスペシフィック抗体断片、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む治療および診断剤、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いる治療および診断方法、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む検出または測定用試薬、ならびに抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体の製造のためのＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメイン、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体のサイトカイン放出を抑制するためのＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインを提供できる。
　本発明のバイスペシフィック抗体又は該スペシフィック抗体断片は、Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域を含み、該Ｆｃ領域のＣ末端側にＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインが１つ結合し、さらに疾患関連結合ドメインを含むことにより、ＡＤＣＣ活性およびＡＤＴＣ活性（Ｔ細胞を介した抗体依存性細胞傷害活性、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｔ－ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）による疾患関連抗原特異的な細胞傷害活性を有する。したがって、本発明の組成物は、各種疾患に関連した細胞が発現する抗原を標的としてその疾患の治療に用いることができる。
図１（Ａ）～（Ｃ）は、抗体医薬品の分子型の模式図を示す。図１（Ａ）は一般的なＩｇＧ抗体、図１（Ｂ）はＣＤ３／ＥｐＣＡＭバイスペシフィック抗体であるＣａｔｕｍａｘｏｍａｂ、図１（Ｃ）はＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｔ－ｃｅｌｌ　Ｅｎｇａｇｅｒ［ＢｉＴＥ（登録商標）］であるＢｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂである。 図２（Ａ）および（Ｂ）は、図２（Ａ）ＩｇＧ１型一価抗体および図２（Ｂ）ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型一価抗体の分子型の模式図ならびに各分子型に含まれるアミノ酸改変箇所を示す。各一価抗体においてＨ鎖を第一ポリペプチド、軽鎖－Ｆｃ融合タンパク質を第二ポリペプチドとする。 図３（Ａ）および（Ｂ）は、図３（Ａ）ＩｇＧ１型一価抗体又は図３（Ｂ）ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型一価抗体の第１ポリペプチド（Ｈ鎖、ＶＨ－ＣＨ１－ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ）側Ｆｃ領域のＣ末端に抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを付与したバイスペシフィック抗体分子の模式図およびアミノ酸改変箇所を示す。 図４は、細胞膜上のＨＥＲ２に対するＩｇＧ抗体、一価抗体およびバイスペシフィック抗体分子の結合を、蛍光標識したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂの結合阻害を指標として測定した結果である。横軸は被験抗体分子の濃度、縦軸は細胞の平均蛍光強度の相対値（％）を示す。ＨＥＲ２に対する結合力が高い分子ほど、蛍光標識したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂの結合を阻害することで縦軸の値が濃度依存的に小さくなる。 図５は、膜上のＣＤ３に対するＩｇＧ抗体、一価抗体およびバイスペシフィック抗体分子の結合を、蛍光標識した二次抗体を用いて測定した結果である。縦軸は細胞の平均蛍光強度の相対値（基準値を１とする）を対数軸で示す。抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを有する分子がＴ細胞に結合していることを示す。 図６は、リアルタイム細胞解析装置により、ＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を測定した結果である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、ウェルに接着している細胞数が少ないこと、つまり細胞傷害活性が高いことを示す。ＡＤＣＣ活性のみを有する抗体、ＡＤＴＣ活性のみを有する抗体と比較して、それらを半量ずつ混合した方が、細胞傷害活性が高くなることを示す。 図７は、リアルタイム細胞解析装置により、ＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を測定した結果である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。ＡＤＣＣ活性のみを有する抗体、ＡＤＴＣ活性のみを有する抗体を半量ずつ混合した場合と比較して、１分子でＡＤＣＣ、ＡＤＴＣの両活性を有する抗体の方が、細胞傷害活性が高くなることを示す。 図８（Ａ）～（Ｅ）は、リアルタイム細胞解析装置により、ＭＣＦ－７細胞に対する細胞傷害活性を測定した結果である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。ＡＤＣＣ活性のみを有する抗体、ＡＤＴＣ活性のみを有する抗体が細胞傷害活性をほとんど示さない条件において、１分子でＡＤＣＣ、ＡＤＴＣの両活性を有する抗体は高い細胞傷害活性を示す。 図９は、膜上のＨＥＲ２に対するＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体分子の結合を、蛍光標識したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂの結合阻害を指標として測定した結果である。横軸は被験抗体分子の濃度、縦軸は細胞の平均蛍光強度の相対値（基準値を１）を示す。ＨＥＲ２に対する結合力が高い分子ほど、蛍光標識したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂの結合を阻害することで縦軸の値が濃度依存的に小さくなる。被験分子はＦｃ領域のＣ末端側と抗ＣＤ３　ｓｃＦｖのＮ末端側を結合するリンカー部分が異なっているものの、ＨＥＲ２に対する結合活性は変化しないことを示す。 図１０は、膜上のＣＤ３に対するＩｇＧ抗体、一価抗体およびバイスペシフィック抗体分子の結合を、蛍光標識した２次抗体を用いて測定した結果である。縦軸は細胞の平均蛍光強度の相対値（基準値を１とする）を対数軸で示す。被験分子はＦｃ領域のＣ末端側と抗ＣＤ３　ｓｃＦｖのＮ末端側を結合するリンカー部分が異なっているものの、ＣＤ３に対する結合活性は大きく変化しないことを示す。 図１１は、リアルタイム細胞解析装置により、ＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を測定した結果である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。被験分子はＦｃ領域のＣ末端側と抗ＣＤ３　ｓｃＦｖのＮ末端側を結合するリンカー部分が異なっているものの、概ね同程度の細胞傷害活性を有することを示している。 図１２は、リアルタイム細胞解析装置により、ＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を測定した結果である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。被験分子はＦｃ領域のＣ末端側と抗ＣＤ３　ｓｃＦｖのＮ末端側を結合するリンカー部分が異なっているものの、概ね同程度の細胞傷害活性を有することを示している。 図１３は、リアルタイム細胞解析装置により、ＭＫＮ－７細胞に対する細胞傷害活性を測定した結果である。横軸に測定開始後の時間を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。 図１４は、リアルタイム細胞解析装置により、ＭＫＮ－４５細胞に対する細胞傷害活性を測定した結果である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。 図１５は、公知の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体を対照抗体とし、対照抗体（左列）および４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）（右列）の、ＢＴ－２０抗体に対する細胞傷害活性および培養上清中サイトカイン濃度を測定した結果を、同一グラフ上にプロットした結果の図である。それぞれのグラフにおいて、横軸に被験物質濃度、左縦軸に細胞傷害活性（％）、右縦軸に各サイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。細胞傷害活性を黒四角（■）および実線で、サイトカイン濃度を◇および点線で示す。 図１６（Ａ）～（Ｆ）は、ＡＤＣＣ活性とＡＤＴＣ活性の組み合わせによる細胞傷害活性の相乗的上昇を検証するために設計した分子型を示す図である。図１６（Ａ）は一価抗体の第１ポリペプチド（Ｈ鎖）のＦｃ領域のＣ末端に抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させた分子型を、図１６（Ｂ）は二価抗体の片側の重鎖のＣ末端に抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させた分子型を、図１６（Ｃ）は図１６（Ａ）と同一の分子型だがα１，６フコースが付加された糖鎖を有している分子型を、図１６（Ｄ）は一価抗体の第２ポリペプチド（軽鎖－Ｆｃ融合タンパク質、またはＶＬ－ＣＬ－ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ）のＦｃ領域のＣ末端に抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させた分子型を、図１６（Ｅ）はがん抗原側Ｆａｂと抗ＣＤ３　ｓｃＦｖが両方ともＦｃ領域のＮ末端側に位置する分子型を、図１６（Ｆ）は一価抗体の第１、第２ポリペプチドそれぞれのＣ末端に１つずつＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させた分子型をそれぞれ示す。 図１７（Ａ）および（Ｂ）は、分子型の検証として、がん抗原側が２価［図１７（Ａ）］および１価［図１７（Ｂ）］であるＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置により測定した結果である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。 図１８（Ａ）および（Ｂ）は、分子型の検証として、がん抗原側が２価であるＣＤ３／ＧＭ２バイスペシフィック抗体のＳＢＣ－３細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置により測定した結果である。図１８（Ａ）はがん抗原側可変領域に抗ＤＮＰ抗体を用いた陰性対照分子であり、図１８（Ｂ）は抗ＧＭ２抗体を用いた分子である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。 図１９（Ａ）は、分子型の検証として、α１，６フコースを有するＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体等のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置により測定した結果を示す図である。図１９（Ｂ）はα１，６フコースを有する抗ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体等のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を、α１，６フコースを有さないＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体等と比較した結果を示す図である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。 図２０（Ａ）は、分子型の検証として、一価抗体の第２ポリペプチド（軽鎖―Ｆｃ融合タンパク質、またはＶＬ－ＣＬ－ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ）のＣ末端に抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させた分子等のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置により測定した結果を示す図である。図２０（Ｂ）は、第２ポリペプチドのＣ末端に抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させた分子等のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を一価抗体の第１ポリペプチド（ＶＨ－ＣＨ１－ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ）のＣ末端に抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させた分子と比較した結果を示す図である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。 図２１は、分子型の検証として、ＨＥＲ２に結合しない陰性対照である抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体、およびＨＥＲ２／ＣＤ３バイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置により測定した結果を示す図である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。Ｔａｒｇｅｔ＋ＰＢＭＣは被験物質なしを、０．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００は１００％傷害活性を示す。被験物質は終濃度５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭの３点で測定を行っている。＊および＊＊は測定値が近接しているため、下部にそれぞれの被験物質を表示している。 図２２Ａは、分子型の検証として、ＨＥＲ２に結合しない抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置により測定した結果を示す図である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。Ｔａｒｇｅｔ＋ＰＢＭＣは被験物質なしを、０．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００は１００％傷害活性を示す。可変領域４Ｄ５ｍｕｔはＨＥＲ２には結合しないものであるため、この測定で観察される細胞傷害活性は非特異的活性である。 図２２Ｂは、分子型の検証として、ＨＥＲ２に結合しない抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置により測定した結果を示す図である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。Ｔａｒｇｅｔ＋ＰＢＭＣは被験物質なしを、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００は１００％傷害活性を示す。可変領域４Ｄ５ｍｕｔはＨＥＲ２には結合しないものであるため、この測定で観察される細胞傷害活性は非特異的活性である。 図２２Ｃは、分子型の検証として、ＨＥＲ２に結合しない抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置により測定した結果を示す図である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。Ｔａｒｇｅｔ＋ＰＢＭＣは被験物質なしを、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００は１００％傷害活性を示す。可変領域４Ｄ５ｍｕｔはＨＥＲ２には結合しないものであるため、この測定で観察される細胞傷害活性は非特異的活性である。 図２２Ｄは、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体のヒトＣＤ３Ｄ＆Ｅタンパク質に対する結合活性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法にて測定したセンサーグラムを示したものである。被験抗体名と大まかなＫＤ値を図中に示している。 図２２Ｅは、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体のヒトＣＤ３Ｄ＆Ｅタンパク質に対する結合活性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法にて測定したセンサーグラムを示したものである。被験抗体名と大まかなＫＤ値を図中に示している。 図２２Ｆは、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体のヒトＣＤ３Ｄ＆Ｅタンパク質に対する結合活性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法にて測定したセンサーグラムを示したものである。被験抗体名と大まかなＫＤ値を図中に示している。 図２２Ｇは図２２Ｆの点線部を拡大した図である。 図２３（Ａ）および（Ｂ）は、分子型の検証として、ＨＥＲ２に結合しない２種類の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置により測定した結果の図である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。可変領域４Ｄ５ｍｕｔ、ＤＮＰ２ともにＨＥＲ２には結合しないものであるため、この測定で観察される細胞傷害活性は非特異的活性である。 図２４Ａは、高アフィニティの抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを用いた抗ＣＤ３／ＨＥＲ２または陰性対照バイスペシフィック抗体の細胞傷害活性を測定した図である。リアルタイム細胞解析装置により、ＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を測定した。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。 図２４Ｂは、高アフィニティの抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを用いた抗ＣＤ３／ＨＥＲ２または陰性対照バイスペシフィック抗体の非特異的サイトカイン産生を測定した図である。ヒトＰＢＭＣと被験抗体を混合した場合のサイトカイン産生を測定した。横軸に被験抗体濃度、縦軸に培養上清中サイトカイン濃度を示す。凡例及び略語は図の下部に示す。 図２５（Ａ）および（Ｂ）は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＳＰ３４のＣＤＲに導入するアミノ酸改変の設計例を示す。図２５（Ａ）は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＳＰ３４のＶＬのＣＤＲまたはＶＨのＣＤＲに１アミノ酸の改変を導入する設計を示す。表の一番左のカラムには改変の通し番号、左から二番目のカラムには改変した残基のＫａｂａｔナンバリングによるアミノ酸残基番号とアミノ酸残基改変の前後のアミノ酸残基を一文字で示した。表中の各ＣＤＲのアミノ酸配列の太字で示したアミノ酸残基が改変後のアミノ酸残基を示す。図２５（Ｂ）は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＳＰ３４のＣＤＲに２つ以上のＣＤＲ改変残基の組み合わせの例を示す。 図２６（Ａ）および（Ｃ）は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＳＰ３４の改変したＣＤＲを用いたヒト化抗体のＦＲ配列の設計例を、ＶＬについて示したものである。図２６（Ｂ）および（Ｄ）は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＳＰ３４の改変したＣＤＲを用いたヒト化抗体のＦＲ配列の設計例を、ＶＨについて示したものである。 図２７は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＳＰ３４のＣＤＲ改変体を用いたＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の結合活性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法にて測定した結果を示したものである。左列より、被験バイスペシフィック抗体名、変異導入箇所、測定におけるサイクル数、ｋａ（Ｍ－１ｓ－１）、ｋｄ（ｓ－１）、ＫＤ（Ｍ）を示す。ｍｕｔａｔｉｏｎ列の“－”は変異導入がないことを、“Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｎｏｔ　ｏｂｔａｉｎｅｄ”は被験バイスペシフィック抗体を精製タンパク質として取得できなかったことを示す。 図２８（Ａ）～（Ｃ）は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＳＰ３４のＣＤＲ改変体を用いたＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を、リアルタイム細胞解析装置により測定した結果の図である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。Ｔａｒｇｅｔ＋ＰＢＭＣは被験物質なしを、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００は１００％傷害活性を示す。図２８（Ａ）の四角枠で囲った部分を拡大したものが図２８（Ｂ）および図２８（Ｃ）であり、図２８（Ｂ）では４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’）（ＤＦ）、図２８（Ｃ）では４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）の活性を図中に他の抗体群と比較して示している。 図２９（Ａ）～（Ｄ）は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＳＰ３４のＣＤＲ改変体を用いたＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害時のサイトカイン産生を測定した結果の図である。培養上清中サイトカイン濃度（ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α）をフローサイトメトリーにて測定した結果を示している。縦軸にサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）、横軸に抗体濃度（ｎＭ）を示す。 図３０は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＳＰ３４のＣＤＲ改変体を用いたＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の非特異的サイトカイン産生（ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α）を測定した結果の図である。ｍｅｄｉｕｍはＰＢＭＣと培地のみ、ｖｅｈｉｃｌｅは被験物質の溶解しているバッファー（クエン酸バッファー）を等量加えたものを示す。縦軸にサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）、横軸に抗体の種類及び濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。図中の被験物質名は略称で示し、対応は下部に示している。 図３１は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＫＭ１４のＣＤＲに導入するアミノ酸改変の設計例を示す。図の上部はＶＬのＣＤＲへ、下部はＶＨのＣＤＲへ導入する改変を示す。表の左には改変の通し番号、その右側には改変した残基のＫａｂａｔナンバリングによるアミノ酸残基の番号を示す。太字で示した残基が改変した結果の残基を示す。 図３２は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＫＭ１４を改変した配列を抗ＣＤ３　ｓｃ　Ｆｖとして有するバイスペシフィック抗体の、ヒトＣＤ３タンパク質に対する結合活性をＢｉａｃｏｒｅで測定した結果［ＫＤ（Ｍ）　Ｂｉａｃｏｒｅ］、ＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置にて測定した結果（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を表に示す。細胞傷害活性の「＋」の数は活性の強さを示す。 図３３（Ａ）および（Ｂ）は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＫＭ１４を改変した配列を抗ＣＤ３　ｓｃＦｖとして有するバイスペシフィック抗体の、ＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置にて測定した結果である。横軸に測定開始後の時間（ｈ）を、縦軸に被験抗体を加えたウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を示す。Ｃｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値が低いほど、細胞傷害活性が高いことを示す。Ｔ＋Ｐが被験物質なしのウェル、０．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００は１００％傷害を示す線である。図３３（Ａ）と図３３（Ｂ）は同一の条件下で行った実験であるが、別の測定用プレート上で測定した結果である。 図３４（Ａ）および（Ｂ）は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＫＭ１４を改変した配列を抗ＣＤ３　ｓｃＦｖとして有するバイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害時のサイトカイン産生量をフローサイトメトリーで測定した結果である。被験物質の濃度は１０ｎＭであり、図３４（Ａ）ではＩＮＦ－γ、図３４（Ｂ）ではＩＬ－６の培養上清中の濃度をそれぞれ示す。ＬＬＯＱはキットで規定されている定量限界値を示す。 図３５（Ａ）および（Ｂ）は、クローンＫＭ１４を改変した配列を抗ＣＤ３　ｓｃＦｖとして有するバイスペシフィック抗体の、ＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性をリアルタイム細胞解析装置にて測定した結果である。被験物質を添加しないウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を０％、０．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加したウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を１００％として、特定の時間における細胞傷害活性を計算して示している。図３５（Ａ）、図３５（Ｂ）はそれぞれ被験物質添加後４８、１２０時間後の細胞傷害活性である。縦軸に細胞傷害活性（％）横軸に各抗体の種類を示す。 図３６（Ａ）～（Ｃ）はＰＥＥＲ細胞に対するＣＤ３／ＣＣＲ４バイスペシフィック抗体等の濃度依存的な細胞傷害活性を示した図である。縦軸に細胞傷害活性（％）、横軸に抗体濃度（ｎＭ）を示す。 図３７（Ａ）および（Ｂ）はＰＥＥＲ細胞に対するＣＤ３／ＣＣＲ４バイスペシフィック抗体等の細胞傷害時の濃度依存的な培養上清中サイトカイン（ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ）濃度を示した図である。縦軸にサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）横軸に抗体濃度（ｎＭ）を示す。 図３８（Ａ）および（Ｂ）は、ＭＯＬＭ１３細胞に対するＣＤ３／ＣＤ１２３バイスペシフィック抗体の濃度依存的な細胞傷害活性を示した図３８（Ａ）および、その際の培養上清中サイトカイン濃度を示した図３８（Ｂ）である。縦軸に細胞傷害活性（％）、横軸に抗体濃度（ｎＭ）を示す。 図３９（Ａ）および（Ｂ）は、ＣＤ３／ＣＤ１２３バイスペシフィック抗体の濃度依存的な細胞傷害活性とその際の培養上清中サイトカイン濃度を示した図である。図３９（Ａ）はＭＯＬＭ１３細胞に対する細胞傷害活性を示し、図３９（Ｂ）は同抗体のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞に対する細胞傷害活性を示す。それぞれ縦軸に細胞傷害活性（％）、横軸に抗体濃度（ｎＭ）を示す。 図４０（Ａ）～（Ｄ）は、ＣＤ３／ＣＤ１２３バイスペシフィック抗体の細胞傷害時の濃度依存的な培養上清中サイトカイン濃度を示した図である。図４０（Ａ）はＭＯＬＭ１３細胞に対する細胞傷害時の培養上清中のＩＬ－２濃度、図４０（Ｂ）はＩＦＮ－γ濃度を示す。図４０（Ｃ）は同抗体のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞に対する細胞傷害時の培養上清中のＩＬ－２濃度、図４０（Ｄ）はＩＦＮ－γ濃度を示す。それぞれ縦軸にサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）、横軸に抗体濃度（ｎＭ）を示す。 図４１（Ａ）～（Ｃ）は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体クローンＫＭ１４を改変した配列を抗ＣＤ３　ｓｃＦｖとして有するバイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性［図４１（Ａ）］、および細胞傷害時のサイトカイン産生量をフローサイトメトリーで測定した結果［図４１（Ｂ）および（Ｃ）］である。図４１（Ａ）の縦軸はバイスペシフィック抗体の名称を、横軸には細胞傷害活性（％）を示す。図４１（Ｂ）および（Ｃ）の縦軸はバイスペシフィック抗体の名称を、横軸はサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）をそれぞれ示す。図４１（Ｂ）はＩＮＦ－γ、図４１（Ｃ）はＩＬ－６の培養上清中の濃度をそれぞれ示す。ＬＬＯＱはキットで規定されている定量限界値を示す。 図４２は、バイスペシフィック抗体の生産性および理化学的安定性を向上させる目的で、ＣＨ３領域および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに導入するアミノ酸改変の設計例および構造上の位置を図示したものである。 図４３は、生産性および理化学的安定性を向上させる目的で設計された抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体に導入する改変に関して、ＣＨ３部分の改変、ｓｃＦｖクローン、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの順序、およびｓｃＦｖに導入するアミノ酸改変を要素ごとに列挙した図である。 図４４は、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にしたバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体における、可溶型ＣＤ３への結合活性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法にて測定した結果を示したものである。左列より、被験バイスペシフィック抗体名、ＫＤ（Ｍ）を示す。 図４５Ａは、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にしたバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体における、ＢＴ－２０に対する細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。被験物質を添加しないウェルの活性値を０％、０．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加したウェルの活性値を１００％として、４８時間後における細胞傷害活性を示す。縦軸に細胞傷害活性（％）、横軸に各バイスペシフィック抗体を示す。 図４５Ｂは、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にしたバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体における、ＢＴ－２０に対する細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。被験物質を添加しないウェルの活性値を０％、０．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加したウェルの活性値を１００％として、４８時間後における細胞傷害活性を示す。縦軸に各バイスペシフィック抗体、横軸に細胞傷害活性（％）を示す。 図４５Ｃは、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にしたバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体における、ＢＴ－２０に対する細胞傷害活性を測定した結果である。被験物質を添加しないウェルの活性値を０％、０．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加したウェルの活性値を１００％として、４８時間後における細胞傷害活性を示す。縦軸に各バイスペシフィック抗体、横軸に細胞傷害活性（％）を示す。 図４５Ｄは、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にしたバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体における、ＢＴ－２０に対する細胞傷害活性を測定した結果である。被験物質を添加しないウェルの活性値を０％、０．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加したウェルの活性値を１００％として、４８時間後における細胞傷害活性を示す。縦軸に各バイスペシフィック抗体、横軸に細胞傷害活性（％）を示す。 図４６Ａは、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にしたバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体における、ＢＴ－２０に対する細胞傷害時のサイトカイン産生量をフローサイトメトリーで測定した結果である。図４６（Ａ）はＩＮＦ－γの培養上清中の濃度を示す。 図４６Ｂは、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にしたバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体における、ＢＴ－２０に対する細胞傷害時のサイトカイン産生量をフローサイトメトリーで測定した結果である。図４６（Ｂ）はＩＬ－６の培養上清中の濃度を示す。 図４６Ｃは、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体における、ＢＴ－２０に対する細胞傷害時のサイトカイン産生量をフローサイトメトリーで測定した結果である。図４６（Ｃ）はＩＮＦ－γの培養上清中の濃度を示す。 図４６Ｄは、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体における、ＢＴ－２０に対する細胞傷害時のサイトカイン産生量をフローサイトメトリーで測定した結果である。図４６（Ｄ）はＩＬ－６の培養上清中の濃度を示す。 図４６Ｅは、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にしたバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体における、ＢＴ－２０に対する細胞傷害時のサイトカイン産生量をフローサイトメトリーで測定した結果である。図４６（Ｅ）はＩＮＦ－γの培養上清中の濃度を示す。 図４６Ｆは、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にしたバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体における、ＢＴ－２０に対する細胞傷害時のサイトカイン産生量をフローサイトメトリーで測定した結果である。図４６（Ｆ）はＩＬ－６の培養上清中の濃度を示す。
　本発明は、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインおよび疾患関連抗原に結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体、または該バイスペシフィック抗体断片（以下、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片とも記載する）に関する。
　本発明のバイスペシフィック抗体としては、ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインおよび疾患関連抗原に結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体、Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域を含み且つＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメイン及び疾患関連抗原に結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体、Ｆｃ受容体へのアフィニティが増強したＦｃ領域を含み且つＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメイン及び疾患関連抗原に結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体などが挙げられる。本発明のバイスペシフィック抗体は、ＣＤ３と疾患関連抗原の両方に結合することで、過剰なサイトカイン産生を引き起こすことなく、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞依存的に疾患関連抗原を発現している細胞を傷害することができる。
　本発明におけるＣＤ３は、ＣＤ３Ｅ、Ｔ３Ｅ、Ｔ－ｃｅｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ＣＤ３　ｅｐｓｉｌｏｎ　ｃｈａｉｎと同義として使用される。ＣＤ３としては例えば、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）においてＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１または配列番号１３８に示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３およびＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＰ＿００１２７０５４４．１または配列番号１３９に示されるアミノ酸配列を含むサルＣＤ３などが挙げられる。また、例えば、配列番号１３８、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１３９、またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００１２７０５４４．１に示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＤ３の機能を有するポリペプチドが挙げられる。
　配列番号１３８、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１３９、またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００１２７０５４４．１に示されるアミノ酸配列と通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、最も好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上および９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＣＤ３の機能を有するポリペプチドも本発明のＣＤ３に包含される。
　配列番号１３８、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１または配列番号１３９、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００１２７０５４４．１に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons （1987-1997）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 （1982）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 （1982）、Gene, 34, 315 （1985）、Nucleic Acids Research, 13, 4431（1985）、Proceeding of the National Academy of Sciences in USA, 82, 488 （1985）］などを用いて、例えば、配列番号１３８、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１または配列番号１３９、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００１２７０５４４．１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　ＣＤ３をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１４１またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０００７３３．３に示されるヒトＣＤ３の塩基配列、および配列番号１４２またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２８３６１５．１に示されるサルＣＤ３の塩基配列などが挙げられる。
　また、例えば配列番号１４１、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０００７３３．３または配列番号１４２、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２８３６１５．１に示される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつＣＤ３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、
配列番号１４１、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０００７３３．３または配列番号１４２、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２８３６１５．１に示される塩基配列と好ましくは６０％以上の相同性を有する塩基配列、より好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＣＤ３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、並びに
配列番号１４１、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０００７３３．３または配列番号１４２、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２８３６１５．１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつＣＤ３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども、本発明のＣＤ３をコードする遺伝子に包含される。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば配列番号１４１、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０００７３３．３または配列番号１４２、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２８３６１５．１に示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
　具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドグラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃にてハイブリダイゼーション［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons （1987-1997）、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University （1995）］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、配列番号１４１、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０００７３３．３または配列番号１４２、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１２８３６１５．１に示される塩基配列と好ましくは６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、より好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子内に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明におけるＣＤ３をコードする遺伝子に包含される。
　本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Research,25, 3389 （1997）、Genome Research, 7, 649 （1997）、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎ　の場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５および－Ｚ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html）。　
　ＣＤ３のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製でき、例えば、ＣＤ３の部分配列からなるポリペプチドは、配列番号１３８、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１または配列番号１３９、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００１２７０５４４．１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製できる。
　また、上記の方法で作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、例えば、配列番号１３８、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１または配列番号１３９、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００１２７０５４４．１に示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
　さらに、ＣＤ３のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、またはＣＤ３のアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明におけるＣＤ３の細胞外領域としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１に示されるヒトＣＤ３のアミノ酸配列を、公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html）、ＴＭＨＭＭ　ｖｅｒ．２（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）またはＥｘＰＡＳｙ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　Ｓｅｒｖｅｒ（http://Ca.expasy.org/）などを用いて予測された領域などが挙げられる。具体的には、ＣＤ３の細胞外領域としては配列番号１４０またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４．１の２２番目～１２６番目に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
　ＣＤ３の機能としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と直接会合してタンパク質複合体のサブユニット構造を形成し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に結合した抗原ペプチドを認識して細胞内シグナルの伝達に関与することが挙げられる。ＣＤ３を発現する細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞、及びそれらの前駆細胞や、成熟胸腺細胞が挙げられる。
　本発明における疾患関連抗原とは、がん、免疫疾患、アレルギー疾患、自己免疫疾患、中枢神経系疾患、または循環器系疾患など各疾患に関与する抗原であればいずれの抗原でもよく、例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子及び該受容体並びにＣｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）抗原などが挙げられる。
　サイトカイン又は増殖因子の受容体としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、又はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）に対する受容体などが挙げられる。
　ケモカイン受容体としては、例えば、ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ－３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、ＭＩＰ－３α、ＣＴＡＣＫに対する受容体が挙げられる。
　増殖因子の受容体としては、例えば、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、Ｉｅｐｈｒｉｎ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ　ｌｉｇａｎｄ、ＳＤＦ－１に対する受容体などが挙げられる。
　ＣＤ抗原としては、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ１）、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６（ＤＰＰ－４）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＤ４９、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ１）、ＣＤ６６ｂ（ＮＣＡ－９５）、ＣＤ６６ｃ（ＮＣＡ－５０／９０）、ＣＤ６６ｄ（ＣＧＭ１）、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡ）、ＣＤ６６ｆ（ＰＳＧ）、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ８５ａ（ＩＬＴ－５）、ＣＤ８５ｂ（ＩＬＴ８）、ＣＤ８５ｃ（ＬＩＲ８）、ＣＤ８５ｄ（ＩＬＴ４）、ＣＤ８５ｆ（ＩＬＴ１１）、ＣＤ８５ｇ（ＩＬＴ７）、ＣＤ８５ｈ（ＩＬＴ１）、ＣＤ８５ｉ（ＬＩＲ６ａ）、ＣＤ８５ｊ（ＩＬＴ２）、ＣＤ８５ｋ（ＩＬＴ３）、ＣＤ８５ｍ（ＩＬＴ１０）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ８７、ＣＤ８９、ＣＤ９４（ＮＫＧ２）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ９８、ＣＤ１０３、ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ１）、ＣＤ１１４（Ｇ－ＣＳＦＲ）、ＣＤ１１５（Ｍ－ＣＳＦＲ）、ＣＤ１１６（ＧＭ－ＣＳＦＲ）、ＣＤ１１７（ＳＣＦ－Ｒ）、ＣＤ１１９（ＩＦＮＧＲ１）、ＣＤ１２１ａ（ＩＬ－１Ｒ１）、ＣＤ１２２（ＩＬ－２Ｒｂ）、ＣＤ１２３（ＩＬ－３Ｒａ）、ＣＤ１２４（ＩＬ－４Ｒａ）、ＣＤ１２５（ＩＬ－５Ｒａ）、ＣＤ１２６（ＩＬ－６Ｒａ）、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒａ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３８（Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１）、ＣＤ１４０（ＰＤＧＦＲ）、ＣＤ１４６（ＭＵＣ１８）、ＣＤ１４７（ＥＭＭＲＲＩＮ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）、ＣＤ１５８ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８ｂ１（ＫＩＲ２ＤＬ２）、ＣＤ１５８ｂ２（ＫＩＲ２ＤＬ３）、ＣＤ１５８ｃ（ＫＩＲ２ＤＳ６）、ＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ２ＤＬ４）、ＣＤ１５８ｅ１（ＫＩＲ３ＤＬ１）、ＣＤ１５８ｅ２（ＫＩＲ３ＤＳ１）、ＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ２ＤＬ５）、ＣＤ１５８ｇ（ＫＩＲ２ＤＳ５）、ＣＤ１５８ｈ（ＫＩＲ２ＤＳ１）、ＣＤ１５８ｉ（ＫＩＲ２ＤＳ４）、ＣＤ１５８ｊ（ＫＩＲ２ＤＳ２）、ＣＤ１５８ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ２）、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＣＤ１６１（ＮＫＲＰ１Ａ）、ＣＤ１６２（ＰＳＧＬ－１）、ＣＤ１６３、ＣＤ１６９（ＳＩＧＬＥＣ１）、ＣＤ１７８（ＦａｓＬ）、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＤ１８５（ＣＸＣＲ５）、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１９５（ＣＣＲ５）、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ１９８（ＣＣＲ８）、ＣＤ１９９（ＣＣＲ９）、ＣＤ２００（ＯＸ２）、ＣＤ２０６（ＭＭＲ）、ＣＤ２０７（Ｌａｎｇｅｒｉｎ），ＣＤ２０９（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ２１２（ＩＬ－１２Ｒβ１）、ＣＤ２１３ａ１（ＩＬ－１３Ｒａ１）、ＣＤ２１３ａ２（ＩＬ－１３Ｒａ２）、ＣＤ２１５（ＩＬ－１５ＲＡ）、ＣＤ２１７（ＩＬ－１７Ｒ）、ＣＤ２１８ａ（ＩＬ－１８Ｒａ）、ＣＤ２１８ｂ（ＩＬ－１８Ｒβ）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２５２（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ２８１（ＴＬＲ１）、ＣＤ２８２（ＴＬＲ２）、ＣＤ２８３（ＴＬＲ３）、ＣＤ２８４（ＴＬＲ４）、ＣＤ２８６（ＴＬＲ６）、ＣＤ２８８（ＴＬＲ８）、ＣＤ２８９（ＴＬＲ９）、ＣＤ２９４（ＣＲＴＨ２）、ＣＤ３０１（ＭＧＬ）、ＣＤ３０２（ＤＣＬ１）、ＣＤ３０３（ＢＤＣＡ２）、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ４）、ＣＤ３１７（ＢＳＴ２）、ＣＤ３２４（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３５８（ＤＲ６）、ＣＤ３６０（ＩＬ－２１Ｒ）、ＣＤ３６５（ＴＩＭ－１）、ＣＤ３６６（ＴＩＭ－３）、ＣＤ３６９（ＤＥＣＴＩＮ－１）、ＣＤ３７０（ＣＬＥＣ９Ａ）、ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）－Ｃｌａｓｓ　ＩＩ及びＨＬＡ－Ｉなどが挙げられる。
　その他、癌、免疫疾患、アレルギー疾患、自己免疫疾患、中枢神経系又は循環器系疾患等に関する抗体の抗原としては、例えば、ガングリオシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、Ｌｅｗｉｓ　Ｘ、Ｌｅｗｉｓ　Ｙ、ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ｃｌａｕｄｉｎ、ＡＳＣＴ－２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３又はＢ７－Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１又はＢＴＬＡ）、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（例えば、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＴＮＦＲ１又はＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｌｉｇａｎｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（例えば、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３又はＴＲＡＩＬ－Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｋａｐｐａ　Ｂ　ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＳＩＧＬＥＣ８、サイトカイン・ケモカイン受容体［例えば、ＩＬ－１ＲＩＩ、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－２３Ｒ、ＩＬ－２７Ｒα、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ－３３Ｒα、ＩＬ－３６Ｒ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）βＲＩＩ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２］、ＮＫ細胞受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、Ｅ４ＢＰ４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＡｈＲ）、Ｔ細胞受容体（例えば、ＴＣＲα／β、ＴＣＲ　Ｖβ１１、ＴＣＲγ／δ、ＴＳＬＰＲ、ＳＬＡＭ、ＳＬＡＭＦ６、ＬＡＰ，ＧＡＲＰ、ＳＲ－Ａ１、ＣＤ２００Ｒ、ＤＣＲ３、ＴＩＧＩＴ）、Ｂ細胞受容体（例えば、ＢＬＹＳ、ＡＰＲＩＬ、ＴＳＬＰＲ）、樹状細胞受容体（例えば、ＦＣＥＲ１Ａ、ＴＬＲ７、ＣＡＤＭ１、ＸＣＲ１、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰＡ、ＤＣＩＲ、ＴＲＯＰ２、ＡＸＬ、ＳＩＧＬＥＣ６、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＣＸ３ＣＲ１、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＡＳＧＲ１）などが挙げられる。
　本発明の抗体とは、イムノグロブリンを構成する重鎖の可変領域および重鎖の定常領域、並びに軽鎖の可変領域および軽鎖の定常領域の全部または一部をコードする遺伝子（「抗体遺伝子」と称する）に由来するタンパク質である。本発明の抗体は、いずれのイムノグロブリンクラスおよびサブクラスを有する抗体または抗体断片をも包含する。
　重鎖（Ｈ鎖）とは、イムノグロブリン分子を構成する２種類のポリペプチドのうち、分子量が大きい方のポリペプチドを指す。重鎖は抗体のクラスとサブクラスを決定する。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭは、それぞれα鎖、δ鎖、ε鎖、γ鎖およびμ鎖を重鎖として有し、重鎖の定常領域は異なるアミノ酸配列で特徴付けられる。軽鎖（Ｌ鎖）とは、イムノグロブリン分子を構成する２種類のポリペプチドのうち、分子量が小さい方のポリペプチドを指す。ヒトの抗体の場合、軽鎖にはκ鎖とλ鎖の２種類が存在する。
　可変領域（Ｖ領域）とは、通常は、イムノグロブリンのＮ末端側のアミノ酸配列内に存在する多様性に富んだ領域を指す。可変領域以外の部分は多様性の少ない構造をとることから、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。重鎖と軽鎖の各可変領域は会合して抗原結合部位を形成し、抗原への抗体の結合特性を決定する。
　ヒトの抗体の重鎖では、可変領域はＫａｂａｔらのＥＵインデックス（Kabat et. al., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Fifth edition）（以下、単にＥＵインデックスとも言う）における１番目から１１７番目までのアミノ酸配列に該当し、定常領域は１１８番目以降のアミノ酸配列に該当する。ヒトの抗体の軽鎖ではＫａｂａｔらによる番号付け（Ｋａｂａｔ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）における１番目から１０７番目までのアミノ酸配列が可変領域に該当し、１０８番目以降のアミノ酸配列が定常領域に該当する。以下、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を、ＶＨまたはＶＬと略記する。
　抗原結合部位は、抗体において抗原を認識し結合する部位であり、抗原決定基（エピトープ）と相補的な立体構造を形成する部位を指す。抗原結合部位は、抗原決定基との間に強い分子間相互作用を生じる。抗原結合部位は、少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶＨおよびＶＬにより構成される。ヒトの抗体の場合、ＶＨおよびＶＬはそれぞれ３つのＣＤＲを有する。これらのＣＤＲを、それぞれＮ末端側から順番にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称する。
　定常領域のうち、重鎖定常領域または軽鎖定常領域は、それぞれＣＨまたはＣＬと表記される。ＣＨは、重鎖のサブクラスであるα鎖、δ鎖、ε鎖、γ鎖およびμ鎖によって分類される。ＣＨは、Ｎ末端側より順に整列したＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインから構成され、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを併せてＦｃ領域という。一方、ＣＬは、Ｃλ鎖およびＣκ鎖とよばれる２つのサブクラスに分類される。
　本発明の抗ＣＤ３抗体とは、ＣＤ３の細胞外領域を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体をいう。また、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体およびオリゴクローナル抗体をも包含する。
　本発明において、バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片がＣＤ３または疾患関連抗原に結合することは、例えば、公知の免疫学的検出法、好ましくは蛍光細胞染色法等を用いて、ＣＤ３または疾患関連抗原を発現した細胞と抗体との結合性を確認する方法により確認できる。また、公知の免疫学的検出法［Monoclonal Antibodies - Principles and Practice, Third Edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987）］などを組み合わせて用いることもできる。
　モノクローナル抗体は、単一性（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｉｔｙ）を保持した抗体産生細胞が分泌する抗体であり、単一のエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識する。モノクローナル抗体分子同士は同一のアミノ酸配列（１次構造）を有し、単一の構造をとる。ポリクローナル抗体とは、異なるクローンの抗体産生細胞が分泌する抗体分子の集団をいう。オリゴクローナル抗体とは、複数の異なるモノクローナル抗体を混合した抗体分子の集団をいう。
　エピトープは、抗体が認識し、結合する抗原の構造部位をいう。エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列および糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、および抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により産生される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
　ハイブリドーマは、例えば、抗原を調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体産生細胞を取得し、さらに、該抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させることによって、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、または該ハイブリドーマを動物に投与して該ハイブリドーマを腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより、所望のモノクローナル抗体を取得できる。抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、マウス、ラット、ハムスターおよびラビットなどが好適に用いられる。また、このような被免疫動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ　ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマを作製できる。
　本発明の遺伝子組換え抗体としては、例えば、組換えマウス抗体、組換えラット抗体、組換えハムスター抗体、組換えラビット抗体、ヒト型キメラ抗体（キメラ抗体ともいう）、ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体ともいう）およびヒト抗体などの、遺伝子組換え技術により製造される抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体においては、対象とする動物種や目的に応じて、どの動物種由来の重鎖および軽鎖の可変領域並びに定常領域を適用するかを決定することができる。例えば、対象とする動物種がヒトの場合には、可変領域をヒトまたはマウスなどの非ヒト動物由来とし、定常領域およびリンカーをヒト由来とすることができる。
　キメラ抗体とは、ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体を指す。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスターおよびラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物由来のハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してキメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることによって、製造できる。
　ヒト化抗体とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植した抗体を指す。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）と称される。ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることによって、製造できる。
　ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
　ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球にＥＢウイルスなどを感染させて不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養し、該培養上清より該抗体を精製することにより取得できる。
　ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することにより、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として、所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へ変換することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組み込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、個体を発生させることにより、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物由来のヒト抗体は、通常の非ヒト動物で行われているハイブリドーマ作製法を用いてハイブリドーマを取得し、培養することで、培養上清中に抗体を産生、蓄積させることにより調製できる。
　遺伝子組換え抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリンに属すればいかなるものでもよいが、ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇ（ｈＩｇＧ）クラスのものが好ましい。さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３およびｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、遺伝子組換え抗体のＣＬとしては、ヒトイムノグロブリンに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
　本発明において、抗体断片とは、抗原結合部位を含み、該抗原に対する抗原結合活性を有するタンパク質である。例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＶＨＨまたはＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体とがジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ＶＨおよびＣＨ１を含むＦａｂのポリペプチド鎖を、Ｆａｂの重鎖（Ｈ鎖）またはＶＨ－ＣＨ１と記載する。また、ＶＬおよびＣＬを含むＦａｂのポリペプチド鎖を、Ｆａｂの軽鎖（Ｌ鎖）またはＶＬ－ＣＬと記載する。
　Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を切断した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬまたはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドであり、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片であり、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性、または異なる抗原に対し各々特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中の各１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のＳ－Ｓ結合を介して結合させたものをいう。
　ＶＨＨ（ナノボディともいう）は、ＶＨＨ抗体における重鎖可変領域を指し、他のポリペプチドの存在なしで抗原に結合することができる。
　ＶＨＨ抗体は、アルパカ等のラクダ科の動物およびサメ等の軟骨魚に存在する抗体であり、軽鎖とＣＨ１がなく、重鎖のみからなる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＲ同士を直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることで作製することができる。ＣＤＲを含むペプチドは、本発明のバイスペシフィック抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明において、バイスペシフィック抗体断片とは、本質的にバイスペシフィック抗体の部分構造からなり、２種類の抗原に対する抗原結合活性を有するバイスペシフィック抗体断片である。
　本発明のバイスペシフィック抗体断片とＦｃ領域とが結合した融合タンパク質、該Ｆｃ領域と天然に存在するリガンドまたは受容体とが結合したＦｃ融合タンパク質（イムノアドヘシンともいう）、および複数のＦｃ領域を融合させたＦｃ融合タンパク質等も本発明に包含される。また、抗体のエフェクター活性の増強または欠損、抗体の安定化、および血中半減期の制御を目的としたアミノ酸残基改変を含むＦｃ領域も、本発明のバイスペシフィック抗体に用いることができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体とは、特異性が異なる２種類の抗原結合ドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質をいう。バイスペシフィック抗体のそれぞれの抗原結合ドメインは、単一の抗原の異なるエピトープに結合してもよいし、異なる抗原に結合してもよい。
　本発明において抗原結合ドメインとは、抗原を特異的に認識し、結合する機能を有する部分構造である。本発明の抗原結合ドメインとしては、例えば、抗体、該抗体断片、リガンド、受容体、および天然に存在する相互作用分子など遺伝子組換え技術によって作製可能なポリペプチド、タンパク質分子およびその断片、並びに該タンパク質分子の低分子または天然物とのコンジュゲート体などいずれの形態であってもよい。
　本発明のバイスペシフィック抗体の２種類の抗原結合ドメインは、ＣＤ３結合ドメインおよび疾患関連抗原結合ドメインである。疾患関連抗原結合ドメインが複数含まれる場合は、同一の抗原であっても異なる抗原結合するものであってもよい。
　本発明のバイスペシフィック抗体は、Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域、ＣＤ３結合ドメインおよび疾患関連抗原結合ドメインを含み、該Ｆｃ領域のＣ末端がＣＤ３結合ドメインと直接またはリンカーを介して結合している。
　本発明におけるＣＤ３結合ドメインとは、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインをいう。
　本発明における疾患関連抗原結合ドメインとは、疾患関連抗原に結合する抗原結合ドメインをいう。
　本発明におけるＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３を特異的に認識し、結合すればいかなるものでもよいが、抗ＣＤ３抗体由来のＣＤＲ配列を含むＣＤ３結合ドメイン、抗ＣＤ３抗体由来のＶＨ及びＶＬを含むＣＤ３結合ドメインなどが挙げられる。抗ＣＤ３抗体由来のＣＤＲ配列又はＶＨ及びＶＬを含むＣＤ３抗原結合ドメインとして、ｓｃＦｖであることが好ましい。
　本発明において疾患関連抗原結合ドメインは、疾患関連抗原を特異的に認識し、結合すればいかなるものでもよいが、抗体のＦａｂまたはＶＨおよびＶＬからなる可変領域であることが好ましい。
　本発明において、ポリペプチド、抗体もしくは該抗体断片またはバイスペシフィック抗体もしくは該バイスペシフィック抗体断片がＣＤ３および／または疾患関連抗原に結合することは、例えば、公知の免疫学的検出法、好ましくは蛍光細胞染色法等を用いて、評価したい抗原を発現した細胞と抗体との結合性を確認する方法により確認することができる。また、公知の免疫学的検出法［Monoclonal Antibodies - Principles and Practice, Third Edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987）］などを組み合わせて用いることもできる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片としては、例えば、ＣＤ３結合ドメインに抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４（米国特許第１０，０６６，０１５号明細書）由来のＣＤ３結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体と比較して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞及び疾患関連抗原陽性細胞の存在下でのサイトカイン産生誘導能が低下している抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体が挙げられる。このようなバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、サイトカイン産生に伴う悪寒、悪心、倦怠感、頭痛、発熱、頻脈、および／または血圧変動などの副作用が少なく、サイトカイン放出症候群が起きにくい点で好ましい。
　本発明においてサイトカイン産生誘導能とは、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が、Ｔ細胞上のＣＤ３、ＮＫ細胞上のＦｃ受容体および／または標的細胞上の疾患関連抗原に結合することにより、該Ｔ細胞、該標的細胞、およびＮＫ細胞などによるサイトカイン産生を誘導する活性をいう。
　産生が低下していることが好ましいサイトカインとしては、上述過剰又は不要なサイトカイン産生による副作用に関連するサイトカインであればいずれのサイトカインであってもよいが、例えばｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ（ＩＦＮ－γ）、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－α（ＴＮＦ－α）、およびｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６（ＩＬ－６）などの炎症性サイトカイン、ＩＬ－２、ＩＬ－４並びにＩＬ－１０などが挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、異なる細胞上に発現しているＣＤ３および疾患関連抗原に結合するものが好ましい。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片としては、Ｔ細胞上のＣＤ３および標的細胞上の疾患関連抗原に結合することにより、標的細胞の細胞死を誘導するものが好ましく、ＣＤ３陽性Ｔ細胞および標的細胞の存在下では標的細胞のみを特異的に傷害し、ＣＤ３陽性細胞の非存在下または標的細胞の非存在下では、細胞傷害活性を発揮しないものがより好ましい。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の細胞傷害活性のメカニズムとしては、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性及びＡＤＴＣ活性などが挙げられる。
　すなわち、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片として、具体的には、ＣＤ３陽性細胞および疾患関連抗原陽性細胞の両方に結合したときに、疾患関連抗原陽性細胞の細胞傷害及び／又は細胞死を特異的に誘導するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片などが挙げられる。
　一分子のバイスペシフィック抗体が有する、ある抗原に対する結合ドメインの数を、結合の価数と呼ぶ。例えば、本発明において、一分子のバイスペシフィック抗体が、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインおよび疾患特異的抗原に結合する抗原結合部位ドメインを２つずつ有する場合、かかるバイスペシフィック抗体は、ＣＤ３および疾患特異的抗原にそれぞれ二価で結合する。
　また、イムノグロブリンドメインまたはその断片を含むリンカーなど、適切なリンカーを介して結合させた複数の抗原結合ドメインを含む抗体も本発明のバイスペシフィック抗体に含まれる。
　本発明においてリンカーとして用いられるイムノグロブリンドメインとしては、イムノグロブリンに類似したアミノ酸配列を持ち、少なくとも２個のシステイン残基が存在する約１００個のアミノ酸残基からなるペプチドを最小単位とする。本発明において、イムノグロブリンドメインは、上記の最小単位のイムノグロブリンドメインを複数含むポリペプチドをも包含する。イムノグロブリンドメインとしては、例えば、イムノグロブリン重鎖のＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、並びにイムノグロブリン軽鎖のＶＬおよびＣＬなどが挙げられる。
　イムノグロブリンの動物種は特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。また、イムノグロブリン重鎖の定常領域のサブクラスは、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２およびＩｇＥのいずれでもよく、好ましくは、ＩｇＧ由来およびＩｇＭ由来が挙げられる。また、イムノグロブリン軽鎖の定常領域のサブクラスは、κおよびλのいずれでもよい。
　また、イムノグロブリンドメインはイムノグロブリン以外のタンパク質にも存在し、例えば主要組織適合抗原（ＭＨＣ）、ＣＤ１、Ｂ７およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などのイムノグロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質が含むイムノグロブリンドメインが挙げられる。本発明のバイスペシフィック抗体に用いるイムノグロブリンドメインとしては、いずれのイムノグロブリンドメインも適用することができる。
　ヒトのＩｇＧの場合、ＣＨ１は、ＥＵインデックスで示される１１８番目から２１５番目のアミノ酸配列を有する領域を指す。同様に、ＣＨ２はＫａｂａｔらのＥＵインデックスで示される２３１番目から３４０番目のアミノ酸配列を有する領域を、ＣＨ３はＫａｂａｔらのＥＵインデックスで示される３４１番目から４４７番目のアミノ酸配列を有する領域を各々指す。ＣＨ１とＣＨ２の間には、ヒンジ（蝶番）領域（以下ヒンジと記載することもある）と呼ばれる柔軟性に富んだアミノ酸領域が存在する。ヒンジ領域は、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスで示される２１６番目から２３０番目のアミノ酸配列を有する領域を指す。
　ＣＬは、ヒトの抗体のκ鎖の場合には、Ｋａｂａｔ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで示される１０８番目から２１４番目のアミノ酸配列を有する領域を、λ鎖の場合には、１０８番目から２１５番目のアミノ酸配列を有する領域を各々指す。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が有するＦｃ領域としては、どの動物種の抗体由来のＦｃ領域も用いることができるが、ヒト由来のＦｃ領域が好ましく、中でもＩｇＧ１由来のＦｃ領域が好ましい。
　本発明において、「Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域」とはＦｃ受容体を介してＡＤＣＣ活性などのエフェクター活性を発揮する程度以上に各種Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域を言う。具体的にはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域、およびマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域などが挙げられる。また、Ｆｃ受容体への結合能を増強したＦｃ領域も、Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域に含まれる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が有する「Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域」としては、ＦｃγＲへの結合能を有するＦｃ領域が好ましく、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合能を有するFc領域がより好ましい。
　また、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が有する「Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域」としては、「Ｆｃ受容体へのアフィニティを増強させたＦｃ領域」も好ましい。
　Ｆｃ受容体へのアフィニティを増強させたＦｃ領域とは、天然に存在する抗体のＦｃ領域と比較して、Ｆｃ受容体へのアフィニティが増強していればいかなるものでもよいが、糖鎖改変を含むＦｃ領域、アミノ酸残基改変を含むＦｃ領域などが挙げられる。
　糖鎖改変を含むＦｃとしては、例えばα１，６フコースの付加量を減少または欠損させたＦｃ領域、またはＦｃ受容体へのアフィニティが増強させるアミノ酸改変（天然型アミノ酸残基、非天然型アミノ酸残基による改変）を加えたＦｃ領域などが挙げられる。
　アミノ酸残基改変を含むＦｃ領域としては、例えばヒトＩｇＧ１定常領域におけるＰ２４７Ｉ、Ａ３３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｐ３９６Ｌ、Ｔ３９３Ａ、Ｈ４３３Ｐ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ及びＫ３３４Ａ、およびCurrent Opinion in Biotechnology 2009, 20: 685-691に記載のアミノ酸改変から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基改変を含むＦｃ領域が挙げられる。
　なお、以下アミノ酸残基改変の表記は、［改変前のアミノ酸残基の１文字表記］、［ＥＵインデックスで示されるアミノ酸位置］及び［改変後のアミノ酸残基の１文字表記］の順で示している。
　前記Ｆｃ領域又は抗体定常領域は、ＩｇＧクラスのものが好ましく、それらのアミノ酸配列の一部を欠失、付加、置換、および／または挿入してもよい。また、ＩｇＧの重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３からなるアミノ酸配列の、全部または一部の断片を適宜組み合わせて用いることができる。また、それらのアミノ酸配列を部分的に欠損、または順番を入れ替えて使用することもできる。
　本発明のバイスペシフィック抗体に用いられるＦｃ領域又は抗体定常領域のＩｇＧのサブクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のどのサブクラス由来のＦｃ領域又は定常領域であってもよいが、ＩｇＧ１が好ましい。
　ＩｇＧ１のＦｃ領域又は重鎖定常領域の場合、例えばヒンジ領域の２１６～２２０番目のアミノ酸残基の欠損、ならびにＣ２２０Ｓ、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆのアミノ酸残基改変から選ばれる少なくとも１の改変を含むＦｃ領域又は重鎖定常領域、ヒンジ領域の２１６～２２０番目のアミノ酸残基の欠損及びＣ２２０Ｓのアミノ酸残基改変を含むＦｃ領域又は定常領域、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖから選ばれる少なくとも１の改変を含むＦｃ領域又は重鎖定常領域が挙げられる。
　本発明のＦｃ領域を構成する２本のポリペプチド鎖をそれぞれＦｃポリペプチド鎖、または単にＦｃ鎖とも言う。
　本発明のバイスペシフィック抗体は、１のＣＤ３結合ドメインが、Ｆｃ領域のいずれか１のＦｃ鎖に直接又はリンカーを介して結合している。従って本発明におけるＦｃ領域は、「Ｆｃ鎖」及び「Ｆｃ鎖のＣ末端にＣＤ３結合ドメインが結合したＦｃ鎖」からなるＦｃ領域から構成される。
　また、本発明におけるＦｃ領域を含む重鎖定常領域としては、「ＣＨのポリペプチド鎖」及び「ＣＨのポリペプチド鎖のＣ末端にＣＤ３ドメインが結合したＣＨ鎖」からなる重鎖定常領域、「ＣＨのポリペプチド鎖（ＣＨ１－Ｆｃとも記載する）」及び「Ｆｃ鎖にＣＬが融合したポリペプチド鎖（以下、ＣＬ－Ｆｃと略記する）」とからなる定常領域であって、いずれか一方のポリペプチド鎖のＣ末端にＣＤ３結合ドメインが結合している定常領域などが挙げられる。ＣＤ３結合ドメインは、上述のＦｃ領域又は定常領域を構成する２本のポリペプチド鎖のうち、いずれのポリペプチド鎖に結合していてもよい。
　また、Ｆｃ領域又は重鎖定常領域に含まれるポリペプチド鎖のそれぞれにＣＤ３結合ドメインを構成するＶＨまたはＶＬ、ＶＨ－ＣＨ又はＶＬ－ＣＬを結合させて作製することもできる。
　本発明のバイスペシフィック抗体に含まれるＦｃ領域又は定常領域としては、上述の通り、各領域を構成する２本のポリペプチド鎖のいずれか一方にＣＤ３結合ドメインが結合していることから、ヘテロダイマーを形成する。本ヘテロダイマー構造を構成できれば、付加、欠失、置換いずれの改変が含まれていてもよい。
　具体的には、２本のＦｃポリペプチド鎖又はＣＨポリペプチド鎖からなる場合、ＣＨ３ドメインに適当なアミノ酸残基置換を加えることでヘテロダイマーを形成することができ、例えば２本のＦｃポリペプチド鎖のうち一方にＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗのアミノ酸残基置換を加え、もう一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖのアミノ酸残基置換を加えることで、Ｆｃ領域又はＣＨ領域のヘテロダイマーを形成することができる［Knobs into Holes改変(Nature Biotechnology, vol 16: 677-681, 1998)］。この改変をＫＩＨ改変とも言う。
　本発明のバイスペシフィック抗体に含まれるＦｃ領域にＫＩＨ改変を加える場合、Ｆｃ領域を構成する２本のポリペプチド鎖のうちどちらにＣＤ３結合ドメインが結合しているかにかかわらず、どちらのポリペプチド鎖にＫｎｏｂｓ改変、Ｈｏｌｅｓ改変を加えてもよい。また、ＣＨ３部分にジスルフィド結合を構成する改変（Ｓ３５４ＣとＹ３４９Ｃ）を除いたＫＩＨ改変も適応することができる。その場合、２本のＦｃポリペプチド鎖のうち一方にＴ３６６Ｗのアミノ酸残基置換を加え、もう一方にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖのアミノ酸残基置換を加える。
　上記ＫＩＨ改変が導入されたＦｃ領域の具体的なアミノ酸配列の例としては、これに限定されるものではないが、配列番号１４７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号１４８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むＦｃ領域、配列番号１４９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号１５０で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むＦｃ領域、配列番号１５１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号１５２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むＦｃ領域、配列番号１５３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号１５４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むＦｃ領域が挙げられる。
　また、２本のヘテロなＣＨ鎖からなるＣＨ領域（以降、ヘテロＣＨ領域）としてＣＨポリペプチド鎖及びＣＬ－Ｆｃを含むヘテロＣＨ領域が挙げられるが、Ｃ２２０Ｓを含むＣＨポリペプチド鎖、並びに２１６－２２０のアミノ酸残基の欠損及びＣ２１４Ｓを含むＣＬ－Ｆｃを含むＣＨ領域、Ｃ２２０Ｓを含むＣＨポリペプチド、並びに２１６－２２０のアミノ酸残基の欠損、Ｃ２１４Ｓ及びＨ４３５Ｒを含むＣＬ－Ｆｃを含むＣＨ領域、Ｃ２２０Ｓを含むＣＨポリペプチド、並びに２１６－２２０のアミノ酸残基の欠損、Ｃ２１４Ｓ、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆを含むＣＬ－Ｆｃを含むＣＨ領域、がより好ましい。
　本発明のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に対する抗原結合能を有していれば、単鎖であっても複数のポリペプチド鎖からなる多量体であってもよい。ＣＤ３抗原結合ドメインとしては、例えばＣＤ３に対する抗体の３つ又は６つのＣＤＲ配列を含むＣＤ３結合ドメイン、又はＣＤ３に対する抗体のＶＨ及びＶＬを含むＣＤ３結合ドメインが挙げられ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびＶＨＨが好ましく、ＦａｂおよびｓｃＦｖであることがより好ましい。また、細胞表面抗原に対するリガンド分子やレセプター分子も同様に用いることができる。
　本発明のＣＤ３結合ドメインがｓｃＦｖである場合、ｓｃＦｖはＮ末端側からＶＨ、リンカー、ＶＬの順で結合したもの（ＶＨ－リンカー－ＶＬ型、またはＨＬ型とも言う）、およびＶＬ、リンカー、ＶＨの順で結合したもの（ＶＬ－リンカー－ＶＨ型、またはＬＨ型とも言う）が知られているが、そのどちらも本発明のｓｃＦｖに用いることができる。
　本発明のＣＤ３結合ドメインがｓｃＦｖである場合、ｓｃＦｖのフレームワークに改変を加えてもよい。改変の例としては例えば、理化学的な安定性を高めるための改変、生産性を向上させるための改変、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの相互作用面のアミノ酸の改変などが考えられる。具体的には、ｓｃＦｖのＶＨの４４番目（Ｋａｂａｔナンバリングによる）のアミノ酸をＣｙｓに、ＶＬの１００番目（Ｋａｂａｔナンバリングによる）のアミノ酸をＣｙｓにそれぞれ置換する改変（ＣＣ改変）、ＶＨの４４番目のアミノ酸をＳｅｒに、ＶＬの１００番目のアミノ酸をＧｌｕにそれぞれ置換する改変（ＳＥ改変）などが挙げられる。
　本発明のＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対するアフィニティは、減弱していることが好ましい。ＣＤ３結合ドメインのアフィニティが減弱しているとは、例えばＣＤ３に対する解離定数（ＫＤ）が６×１０－８以上であることを示す。ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数（ＫＤ）は、７×１０－８以上であることがより好ましく、８×１０－８以上であることがさらに好ましく、９×１０－８以上であることがさらにより好ましい。また、ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対するアフィニティが減弱しているとは、例えばＣＤ３に対する解離定数が、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４よりも大きいことを示す。
　本発明のＣＤ３結合ドメインの解離定数は、例えばＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により算出した値が挙げられる。
　本発明のＣＤ３結合ドメインの一態様としては、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬのアミノ酸配列が、比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４のＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬのアミノ酸配列と比べて８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有し、かつＳＰ３４またはＫＭ１４と比べてＣＤ３に対するアフィニティが好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上低下しているもの挙げられる。
　本発明のＣＤ３結合ドメインの一態様としては、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬのアミノ酸配列が、比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４のアミノ酸配列と比べて８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有し、かつＳＰ３４と比べてアフィニティが７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上低下しているものが挙げられる。
　また、本発明のＣＤ３結合ドメインの一態様としては、ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬのアミノ酸配列が、比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＫＭ１４のアミノ酸配列と比べて８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有し、かつＫＭ１４と比べてアフィニティが好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは３０％以上、さらにより好ましくは４０％以上低下しているものが挙げられる。
　本発明において、アフィニティがＡ％以上低下しているとは、比較対照ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数をＫＤ０、被験ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数をＫＤ１としたとき、その比であるＫＤ０／ＫＤ１が（１００－Ａ）％以下であることを意味する。
　本発明において、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、またはＳＰ３４の６つのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体をＳＰ３４クローンと言う。
本発明において、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＫＭ１４のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、またはＫＭ１４の６つのＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体をＫＭ１４クローンと言う。
　本発明においてリンカーとは、Ｆｃ領域とＣＤ３結合ドメイン、またはＦｃ領域と疾患関連抗原結合ドメインを結合させることができればどのような分子構造でもよく、例えばイムノグロブリンドメインまたはその断片およびペプチド鎖などが挙げられるが、ペプチド鎖が好ましい。ペプチド鎖のアミノ酸配列としては、例えば、ＳＧＧＧＧもしくはＳＧＧＧＧの繰返し配列からなるいわゆるＧＳリンカー、ＥＡＡＡＫもしくはその繰り返し配列からなるリンカー、ＰＡＰＡＰというアミノ酸配列からなるリンカー、または、抗体のヒンジ領域およびＣＨ１ドメインなどの定常領域由来の配列もしくはその改変配列などが挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、疾患関連抗原結合ドメインを１つ有していてもよいし、２つ以上有していてもよい。
　疾患関連抗原結合ドメインは、Ｆｃ領域に直接結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよい。また、Ｆｃ領域のＣ末端側に結合していてもよいし、Ｎ末端側に結合していてもよいが、Ｃ末端側に結合していることが好ましい。ＣＤ３結合ドメインは、Ｆｃ領域のＣ末端側に１つ結合している場合、ＣＤ３結合ドメインはＦｃ領域を構成する２本のポリペプチド鎖のどちらのポリペプチド鎖に結合していてもよい。
　本発明における疾患関連抗原結合ドメインは、疾患関連抗原に対する抗原結合能を有していれば、単鎖であっても複数のポリペプチド鎖からなる多量体であってもよい。疾患関連抗原結合ドメインとしては、例えば疾患関連抗原に対する抗体の３つ又は６つのＣＤＲ配列を含む抗原結合ドメイン、又は疾患関連抗原に対する抗体のＶＨおよびＶＬを含む抗原結合ドメインが挙げられ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびＶＨＨなどが挙げられるが、ＶＨおよびＶＬからなる抗原結合ドメインまたはＦａｂであることが好ましい。また、細胞表面抗原に対するリガンド分子やレセプター分子も同様に用いることができる。
疾患関連抗原に対する抗体としては、モノクローナル抗体が好ましく、各疾患に関連する抗原を特異的に認識して結合することが知られているモノクローナル抗体や既に抗体医薬品として上市されているモノクローナル抗体など、遺伝子組換え可能な抗体であればいずれの特異性を有する抗体も本発明の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体に含まれる疾患関連抗原結合ドメインとして用いることができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、置換または挿入され、かつ上述の抗体またはその抗体断片と同様な活性を有する抗体または該バイスペシフィック抗体断片も、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片に包含される。
　欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、Molecular Cloning, The Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons（1987-1997）、Nucleic Acids Research, 10, 6487（1982）、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409（1982）、Gene, 34, 315 （1985）、Nucleic Acids Research, 13, 4431（1985）、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488（1985）などに記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換、挿入若しくは付加できる程度の数である。例えば、通常１～数十個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個である。
　上記の本発明のバイスペシフィック抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、次のことを示す。同一配列中の任意、かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
　天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリンおよびＬ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
　Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
　Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
　Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
　Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
　Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
　Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
　Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　本発明のバイスペシフィック抗体は、翻訳後修飾されたいかなるアミノ酸残基を含む抗体をも包含する。翻訳後修飾としては、例えば、Ｈ鎖のＣ末端におけるリジン残基の欠失［リジン・クリッピング（ｌｙｓｉｎｅ　ｃｌｉｐｐｉｎｇ）］およびポリペプチドのＮ末端におけるグルタミン残基のピログルタミン（ｐｙｒｏＧｌｕ）への置換などが挙げられる［Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736(2013)］。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片として具体的には、例えば下記（１）～（３）からなる群より選ばれる、いずれか一つのバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片などが挙げられる。
（１）Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域を含み、該Ｆｃ領域のＣ末端側にＣＤ３結合ドメインが１つ結合し、さらに該Ｆｃ領域のＮ末端側に疾患関連抗原結合ドメインを１つ以上含む、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
（２）Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域を含み、該Ｆｃ領域のＣ末端側にＣＤ３結合ドメインが１つ結合し、さらに該Ｆｃ領域のＣ末端側に疾患関連抗原結合ドメインを１つ以上含む、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
（３）Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域を含み、該Ｆｃ領域のＣ末端側にＣＤ３結合ドメインが１つ結合し、さらに該Ｆｃ領域のＣ末端側に疾患関連抗原結合ドメインを１つ以上含み、かつ該Ｆｃ領域のＮ末端側に疾患関連抗原結合ドメインを１つ以上含む、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
　本発明の一態様として、上記（１）に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片であって、Ｆｃ領域が、ＣＨ３部分にＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓ改変(Nature Biotechnology. vol 16： 677-681, 1998)（ＫＩＨ改変とも言う）、または該ＫＩＨ改変からジスルフィド結合を構成するための改変（Ｓ３５４ＣとＹ３４９Ｃ）を除いた改変を導入したヘテロダイマーを形成しており、該ヘテロダイマーのいずれか一方のＣ末端にリンカーを介してＣＤ３結合ドメインが結合しているバイスペシフィック抗体であって、該ヘテロダイマーのＮ末端の片方または両方に疾患関連抗原結合ドメインが結合しているバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。
　本発明の一態様として、上記（１）に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片であって、Ｆｃ領域の２本のポリペプチド鎖のＮ末端側にそれぞれＣＬ、ＣＨ１が結合してＣＨ１－ＦｃとＣＬ－Ｆｃからなるヘテロダイマーを形成しており、ＣＨ１－ＦｃとＣＬ－Ｆｃのいずれか一方のＣ末端にリンカーを介してＣＤ３結合ドメインが結合しているバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片であって、
（ａ）ＣＨ１－ＦｃおよびＣＬ－ＦｃのＮ末端にそれぞれＶＨおよびＶＬが結合して１つの疾患関連抗原結合ドメインを形成しているバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片、
（ｂ）ＣＨ１－ＦｃおよびＣＬ－ＦｃのＮ末端にそれぞれＶＬおよびＶＨが結合して１つの疾患関連抗原結合ドメインを形成しているバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片、並びに
（ｃ）ＣＨ１－Ｆｃおよび／またはＣＬ－ＦｃのＮ末端にＦａｂ、ＶＨＨ、および／またはｓｃＦｖが結合し１つ以上の疾患関連抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。
　中でも、ＣＨ１－ＦｃおよびＣＬ－ＦｃのＮ末端に、それぞれＶＬおよびＶＨ、またはそれぞれＶＨおよびＶＬが結合していることが好ましく、ＣＨ１－ＦｃおよびＣＬ－ＦｃのＮ末端にそれぞれＶＨおよびＶＬが結合していることがより好ましい。
　また、ＣＨ１－ＦｃとＣＬ－Ｆｃのアミノ酸配列において、細胞で発現させる際にヘテロダイマーを形成するようなアミノ酸改変がされていることが好ましく、具体的には、ＣＬ－Ｆｃにおいて２１６－２２０の欠損、並びにＣ２１４Ｓ、Ｈ４３５Ｒ、およびＹ４３６Ｆのアミノ酸残基改変が、ＣＨ１－ＦｃにおいてＣ２２０Ｓのアミノ酸残基改変が含まれていることが好ましい。これらの改変は、上記のＫＩＨ改変または該ＫＩＨ改変からジスルフィド結合を構成するための改変を除いた改変と、両方とも導入しても良い。
　疾患関連抗原結合ドメインとしては、Ｆａｂ、ＶＨおよびＶＬからなる可変領域、ＶＨＨおよびｓｃＦｖなどが挙げられる。具体的には、上記ヘテロダイマーのＮ末端の両方に、疾患関連抗原結合ドメインとしてＦａｂが結合していることが好ましい。Ｆａｂを形成するＶＨ－ＣＨ１、ＶＬ－ＣＬのポリペプチド鎖のうち、どちらがＦｃ領域のＮ末端に結合していても構わないが、ＶＨ－ＣＨ１が結合していることがより好ましい。
　本発明の一態様として、上記（２）に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片であって、Ｆｃ領域の２本のポリペプチド鎖のＮ末端側にそれぞれＣＬ、ＣＨ１が結合してＣＨ１－ＦｃとＣＬ－Ｆｃのヘテロダイマーを形成しており、ＣＨ１－ＦｃとＣＬ－Ｆｃのいずれか一方のＣ末端にリンカーを介してＣＤ３結合ドメインが結合しているバイスペシフィック抗体であって、ＣＨ１－Ｆｃおよび／またはＣＬ－ＦｃのＣ末端側にＦａｂ、ＶＨＨ、および／またはｓｃＦｖが疾患関連抗原結合ドメインとして結合しているバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。
　この際、疾患関連抗原結合ドメインは、ＣＨ１－Ｆｃおよび／またはＣＬ－Ｆｃに直接結合していても、リンカーを介して結合していても、ＣＤ３結合ドメインの更にＣ末端側に結合していてもよい。
　上記ヘテロダイマーのアミノ酸配列において、細胞で発現させる際にヘテロダイマーを形成するようなアミノ酸改変がされていることが好ましく、具体的には、ＣＬ－Ｆｃにおいて２１６－２２０アミノ酸残基の欠損、並びにＣ２１４Ｓ、Ｈ４３５Ｒ、およびＹ４３６Ｆのアミノ酸残基改変が、ＣＨ１－ＦｃにおいてＣ２２０Ｓのアミノ酸残基改変がされていることが望ましい。
　本発明の別の一態様として、上記（２）に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片であって、Ｆｃ領域にＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓ改変または該ＫＩＨ改変のうちＳ３５４ＣとＹ３４９Ｃ以外の改変を加えており、該Ｆｃ領域を形成するヘテロダイマーのＣ末端側に１つ以上の疾患関連抗原結合ドメインを有するバイスペシフィック抗体が挙げられる。該疾患関連抗原結合ドメインしては、例えば、Ｆａｂ、ＶＨおよびＶＬからなる抗体可変領域、ＶＨＨ、およびｓｃＦｖなどが挙げられる。疾患関連抗原結合ドメインは、ＣＨ１－Ｆｃおよび／またはＣＬ－Ｆｃに直接結合していても、リンカーを介して結合していても、ＣＤ３結合ドメインの更にＣ末端側に結合していてもよい。
　本発明の一態様として、上記（３）に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片であって、Ｆｃ領域の２本のポリペプチド鎖のＮ末端側にそれぞれＣＬ、ＣＨ１が結合してＣＨ１－ＦｃとＣＬ－Ｆｃからなるヘテロダイマーを形成しており、ＣＨ１－ＦｃとＣＬ－Ｆｃのいずれか一方のＣ末端にリンカーを介してＣＤ３結合ドメインが結合しているバイスペシフィック抗体であって、ＣＨ１－ＦｃとＣＬ－ＦｃのＮ末端側に１つ以上の疾患関連抗原結合ドメインを有し、さらにＣＨ１－ＦｃとＣＬ－ＦｃのＣ末端側にも１つ以上の疾患関連抗原結合ドメインを有しているバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。
　ＣＨ１－Ｆｃおよび／またはＣＬ－ＦｃのＮ末端側に結合している疾患関連抗原結合ドメインは、ＣＨ１－ＦｃおよびＣＬ－ＦｃのＮ末端にそれぞれＶＨおよびＶＬ（又はそれぞれＶＬおよびＶＨ）が結合して１つの疾患関連抗原結合ドメインを形成していてもよいし、ＣＨ１－ＦｃおよびＣＬ－Ｆｃの少なくとも一方のＮ末端にＦａｂ、ＶＨＨ、および／またはｓｃＦｖが結合して、少なくとも１つの疾患関連抗原結合ドメインを形成していてもよい。
　また、前記疾患関連抗原結合ドメインとしてはＣＨ１－ＦｃおよびＣＬ－ＦｃのＮ末端に、それぞれＶＨおよびＶＬ（または、それぞれＶＬおよびＶＨ）が結合して１つの疾患関連抗原結合ドメインを形成していることが好ましく、ＣＨ１－ＦｃおよびＣＬ－ＦｃのＮ末端にそれぞれＶＨおよびＶＬが結合していることがより好ましい。
　ＣＨ１－Ｆｃおよび／またはＣＬ－ＦｃのＣ末端側に結合している疾患関連抗原結合ドメインは、これらのポリペプチド鎖に直接結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよいし、ＣＤ３結合ドメインを介して結合していてもよい。該疾患関連抗原結合ドメインとしては、例えば、Ｆａｂ、ＶＨＨ、およびｓｃＦｖなどが挙げられる。
　また、ＣＨ１－ＦｃとＣＬ－Ｆｃのアミノ酸配列において、細胞で発現させる際にヘテロダイマーを形成するようなアミノ酸改変がされていることが好ましく、具体的にはＣＬ－Ｆｃにおいて２１６－２２０のアミノ酸残基の欠損、並びにＣ２１４Ｓ、Ｈ４３５Ｒ、およびＹ４３６Ｆのアミノ酸残基改変が、ＣＨ１－ＦｃにおいてＣ２２０Ｓのアミノ酸残基改変がされていることが好ましい。
　本発明の別の一態様として、上記（３）に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片であって、Ｆｃ領域にＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓ改変または該ＫＩＨ改変のうちＳ３５４ＣとＹ３４９Ｃ以外の改変を加えており、該Ｆｃ領域のヘテロダイマーのＮ末端側に１つ以上の疾患関連抗原結合ドメインを有し、さらに該Ｆｃ領域のヘテロダイマーのＣ末端側にも１つ以上の疾患関連抗原結合ドメインを有しているバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。
　疾患関連抗原結合ドメインとしては、例えば、Ｆａｂ、ＶＨＨおよびｓｃＦｖなどが挙げられる。上記ヘテロダイマーのＮ末端側に、疾患関連抗原結合ドメインとしてＦａｂが結合している場合、Ｆａｂを形成するＶＨ－ＣＨ１、ＶＬ－ＣＬのポリペプチド鎖のうち、どちらがＦｃ領域のＮ末端に結合していても構わないが、ＶＨ－ＣＨ１が結合していることがより好ましい。
　また、上記ヘテロダイマーのＣ末端側に結合している疾患関連抗原結合ドメインは、ヘテロダイマーのＣ末端に直接結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよいし、ＣＤ３結合ドメインの更にＣ末端側に結合していてもよい。
　上述の（１）～（３）のいずれの態様においても、Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域として、Ｆｃ受容体へのアフィニティを増強させたＦｃ領域も同様に用いることができる。
　上述の（１）～（３）のいずれの態様においても、ＣＤ３結合ドメインを構成するＶＨおよびＶＬを、Ｆｃ領域を構成する２本のポリペプチド鎖にそれぞれ結合させることで、Ｆｃ領域のＣ末端に１のＣＤ３結合ドメインを結合させた抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を作製することができる。
　本発明の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、上記の他に公知のヘテロダイマー作製技術を利用して作製することもできる。公知の技術としては、例えば、ＣｒｏｓｓＭＡｂ技術、ＢＥＡＴ技術、ＸｍＡｂ技術、ＡＲＴ－Ｉｇ技術、およびＡｚｙｍｅｔｒｉｃ技術（すべてNat Rev Drug Discov.　18：585-608,　2019に記載）、並びにNat Rev Drug Discov. 18: 585-608, 2019に記載のその他のヘテロダイマー作製技術などが挙げられる。
　本発明のさらに好ましい一態様としては、該ＣＤ３結合ドメインがｓｃＦｖであるバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。
　本発明の更に好ましい一態様としては、ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数（ＫＤ）が６×１０－８以上、７×１０－８以上、８×１０－８以上、または９×１０－８以上であるバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。
　本発明の一態様としては、ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数が比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４よりも大きいバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。
　本発明の一態様としては、ＣＤ３結合ドメインのＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬのアミノ酸配列が、比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４のＣＤ３結合ドメインのＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつ抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４と比べてアフィニティが１０％以上低下しているバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。
　本発明の更に好ましい一態様としては、疾患関連抗原の発現細胞に対するＡＤＣＣ活性およびＡＤＴＣ活性を有し、疾患関連抗原発現細胞の細胞傷害時にサイトカイン産生の誘導が抑えられたバイスペシフィック抗体が挙げられる。
　更に好ましい一態様として、Ｆｃ領域とＣＤ３結合ドメインの間のリンカーのアミノ酸配列が（ＳＧＧＧＧ）ｎ（ｎ＝１～３）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１～３）、またはＰＡＰＡＰから選ばれる１つであるバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。
　本発明におけるＣＤ３結合ドメインとして、具体的にはＣＤ３結合ドメインのＶＨのＣＤＲ１～３（ＨＣＤＲ１～３）およびＶＬのＣＤＲ１～３（ＬＣＤＲ１～３）のアミノ酸配列が、下記（ａ）～（ｈ）から選ばれるいずれか１のＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列とそれぞれ９０％以上の相同性を有するＣＤ３結合ドメインが挙げられる。
（ａ）それぞれ配列番号１１８～１２０で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１２１～１２３で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｂ）それぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号８６～８８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｃ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３２、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｄ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３３、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｅ）それぞれ配列番号９８、１３４、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｆ）それぞれ配列番号９８、１３５、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｇ）それぞれ配列番号９８、１３６、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
（ｈ）それぞれ配列番号９８、１３７、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
　本発明におけるＣＤ３結合ドメインとして、具体的にはＣＤ３結合ドメインのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列が、下記（ａａ）～（ｒｒ）から選ばれるいずれか１のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列とそれぞれ８０％以上の相同性を有するＣＤ３結合ドメインが挙げられる。
（ａａ）配列番号１２４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｂｂ）配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｃｃ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｄｄ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｅｅ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｆｆ）配列番号１２９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｇｇ）配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｈｈ）配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｉｉ）配列番号１５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｊｊ）配列番号１６０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｋｋ）配列番号１６１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｌｌ）配列番号１６２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｍｍ）配列番号１６８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｎｎ）配列番号１６９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｏｏ）配列番号１７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｐｐ）配列番号１７１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｑｑ）配列番号１７２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
（ｒｒ）配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
　本発明におけるＣＤ３結合ドメインとしては、上記（ａ）～（ｈ）、（ａａ）～（ｒｒ）並びに抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４及びＫＭ１４から選ばれるいずれか１を含むＣＤ３結合ドメインと競合してＣＤ３に結合するＣＤ３結合ドメイン、上記（ａ）～（ｈ）、（ａａ）～（ｒｒ）並びに抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４及びＫＭ１４から選ばれるいずれか１を含むＣＤ３結合ドメインが結合するＣＤ３上のエピトープに結合するＣＤ３結合ドメイン、上記（ａ）～（ｈ）、（ａａ）～（ｒｒ）並びに抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４及びＫＭ１４から選ばれるいずれか１を含むＣＤ３結合ドメインが結合するエピトープに含まれるエピトープに結合するＣＤ３結合ドメインが挙げられる。
　本発明のＣＤ３結合ドメインが結合するＣＤ３分子上に存在するエピトープとしては、ヒトＣＤ３のアミノ酸配列のＮ末端から２７番目までのアミノ酸配列が挙げられる。抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４及びＫＭ１４はいずれも本エピトープに結合することから、本発明におけるＣＤ３のエピトープとして好ましくはＣＤ３のアミノ酸配列のＮ末端から２７番目までのアミノ酸配列に含まれる少なくとも１のアミノ酸残基を含むエピトープ、当該アミノ酸配列からなる立体構造からなるエピトープなどが挙げられる。
　上述、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４及び/又はＫＭ１４と競合して結合する抗体、当該抗体が結合するエピトープに結合する抗体は、ヒトＣＤ３のアミノ酸配列の1-２７番目のアミノ酸配列を用いた抗体結合アッセイを行うことで取得することができる。
　本発明の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体として具体的には、上述のＣＤ３結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体挙げられる。
　本発明のＣＤ３結合ドメインは、サイトカイン産生誘導能が抑制された抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体の製造の目的、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体の過剰なサイトカイン産生誘導を抑制する目的にも応用することができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片には、エフェクター活性を有するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片も包含される。
　エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の細胞傷害活性を指し、例えば、ＡＤＣＣ活性、補体依存性細胞傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；　ＣＤＣ活性）、マクロファージや樹状細胞などの食細胞による抗体依存性貪食活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＣＰ活性）およびオプソニン効果などが挙げられる。
　本発明においてＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性は、公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373（1993）］を用いて測定することができる。
　ＡＤＣＣ活性とは、標的細胞上の抗原に結合した抗体が、抗体のＦｃ領域を介して免疫細胞のＦｃ受容体と結合することで免疫細胞（ナチュラルキラー細胞など）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。
　Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体であり、抗体の結合によりさまざまなエフェクター活性を誘発する。各ＦｃＲは抗体のサブクラスに対応し、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭはそれぞれＦｃγＲ、ＦｃεＲ、ＦｃαＲ、ＦｃμＲに特異的に結合する。さらにＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のサブタイプが存在し、それぞれのサブタイプにはＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、ＦｃγＲＩＣ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢのアイソフォームが存在する。これらの異なるＦｃγＲは異なる細胞上に存在する［Annu. Rev. Immunol. 9:457-492(1991)］。ヒトにおいては、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球に特異的に発現しており、ＦｃγＲＩＩＩＡは単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージおよび一部のＴ細胞に発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡへの抗体の結合を介して、ＮＫ細胞依存的なＡＤＣＣ活性が誘発される。
　ＣＤＣ活性とは、標的細胞上の抗原に結合した抗体が血液中の補体関連タンパク質群からなる一連のカスケード（補体活性化経路）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。また、補体の活性化により生じるタンパク質断片により、免疫細胞の遊走および活性化が誘導される。ＣＤＣ活性のカスケードは、まずＣ１ｑがＦｃ領域に結合し、次に２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓと結合することで、Ｃ１複合体を形成し開始される。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の抗原発現細胞に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は、公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373（1993）］により評価することができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域（ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる定常領域）の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ－結合型複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα－１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号および国際公開第００／６１７３９号）や、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基の改変により制御する方法（国際公開第００／４２０７２号）などが知られている。
　バイスペシフィック抗体に結合するコアフコースの量を制御することで、抗体のＡＤＣＣ活性を増加または低下させることができる。例えば、抗体のＦｃに結合しているＮ－結合複合型糖鎖に結合するコアフコースの含量を低下させる方法として、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損した宿主細胞を用いてバイスペシフィック抗体を発現することで、高いＡＤＣＣを有するバイスペシフィック抗体を取得することができる。一方、バイスペシフィック抗体のＦｃに結合しているＮ－結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法として、α１，６－フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、低いＡＤＣＣ活性を有するバイスペシフィック抗体を取得することができる。
　また、バイスペシフィック抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性を増加または低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、バイスペシフィック抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書または米国特許第７，３１７，０９１号明細書などに記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。
　さらに、上述の方法を組み合わせることにより、エフェクター活性が制御されたバイスペシフィック抗体を取得してもよい。
　本発明のバイスペシフィック抗体の安定性は、精製過程や一定条件下で保存されたサンプルにおいて形成される凝集体（オリゴマー）量を測定することによって評価することができる。すなわち、同一条件下で凝集体量が低減する場合を、抗体の安定性が向上したものと評価する。凝集体量は、ゲルろ過クロマトグラフィーを含む適当なクロマトグラフィーを用いて凝集した抗体と凝集していない抗体とを分離することによって測定することができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体の生産性は、抗体産生細胞から培養液中に産生される抗体量を測定することによって評価することができる。より具体的には、培養液から産生細胞を除いた培養上清に含まれる抗体の量をＨＰＬＣ法やＥＬＩＳＡ法などの適当な方法で測定することによって評価することができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片としては、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、タンパク質または抗体医薬などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
　本発明における抗体の誘導体は、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片のＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、該抗体またはその抗体断片中の適当な置換基或いは側鎖、さらには該抗体またはその抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、タンパク質または抗体医薬などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）］により結合させることで製造することができる。
　また、本発明における抗体の誘導体は、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡと、所望のタンパク質または抗体医薬をコードするＤＮＡとを連結させて、発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し発現させる、遺伝子工学的手法により製造することができる。
　放射性同位元素としては、例えば、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕまたは２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
　低分子の薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤若しくはキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学、癌と化学療法社（１９９６）］、ハイドロコーチゾン若しくはプレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン若しくはインドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート若しくはペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド若しくはアザチオプリンなどの免疫抑制剤またはマレイン酸クロルフェニラミン若しくはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
　抗癌剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、５－フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０－ヒドロキシ－７－エチル－カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ－ｌｉｋｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　３（Ｆｌｔ３）阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｏｔｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール－トランスレチノイン酸、サリドマイド、レナリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ－ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（タルグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート若しくはメイタンシノイドまたはその誘導体などが挙げられる。
　低分子の薬剤と本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と該抗体のアミノ基間を結合させる方法、または水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と該抗体のカルボキシル基とを結合させる方法などが挙げられる。
　高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、またはヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。これらの高分子化合物を本発明のバイスペシフィック抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的若しくは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、または（３）免疫原性の消失若しくは抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。
　例えば、ＰＥＧと本発明のバイスペシフィック抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε－アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１－１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６－２３５８７号公報）、またはアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２－１１７９２０号公報）などが挙げられる。
　免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（例えば、レンチナンまたはシゾフィラン）、またはαガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）などが挙げられる。
　タンパク質としては、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージまたは好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカイン若しくは増殖因子または毒素タンパク質などが挙げられる。
　サイトカインまたは増殖因子としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）－２、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）－α、ＴＮＦ－β、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）などが挙げられる。
　毒素タンパク質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシンまたはＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
　タンパク質または抗体医薬との融合抗体は、本発明のバイスペシフィック抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡにタンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。　
　上記抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、定量用試薬または診断薬として使用する場合に、本発明のバイスペシフィック抗体またはその抗体断片に結合する薬剤としては、通常の免疫学的検出用方法または測定用方法で用いられる標識体が挙げられる。標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル若しくはロフィンなどの発光物質、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ（登録商標）　Ｆｌｕｏｒ　４８８、Ｒ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（Ｒ－ＰＥ）などの蛍光物質などが挙げられる。
　本発明には、ＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性などの細胞傷害活性を有するバイスペシフィック抗体および該バイスペシフィック抗体断片が包含される。本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の抗原発現細胞に対するＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 （1993）］により評価することができる。
　また、本発明は、ＣＤ３および疾患関連抗原を特異的に認識し結合するバイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片を含む組成物、または該バイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片を有効成分として含有する、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくは疾患関連抗原の発現細胞が関与する疾患の治療薬に関する。
　ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患としては、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係している疾患であればいかなるものでもよいが、例えば、悪性腫瘍およびがんなどが挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療薬は、有効成分としての該バイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。
　投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内または静脈内などの非経口投与が挙げられる。中でも、静脈内投与が好ましい。
　投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤などが挙げられる。
　投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢および体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。
　さらに、本発明は、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含有する、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方の免疫学的検出用若しくは測定用試薬、またはＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくは疾患関連抗原の発現細胞が関与する疾患の診断薬に関する。また、本発明は、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いた、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方の免疫学的検出用若しくは測定用方法、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくは疾患関連抗原の発現細胞が関与する疾患の治療方法、またはＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくは疾患関連抗原の発現細胞が関与する疾患の診断方法に関する。
　本発明においてＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方の量を検出または測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出または測定方法などが挙げられる。
　免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いてＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が発現した細胞を検出または測定することにより、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくは疾患関連抗原の発現細胞が関与する疾患を診断することができる。
　ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、例えば、免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などが挙げられる。また、例えば、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などの蛍光抗体染色法なども挙げられる。
　本発明においてＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方を検出または測定する対象となる生体試料としては、例えば、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液または培養液など、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が発現した細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
　本発明のバイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的とする診断方法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、例えば、緩衝剤、塩などが挙げられる。
　検出用試薬としては、例えば、前記バイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体に結合する標識された二次抗体、または標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬が挙げられる。
　以下、本発明のバイスペシフィック抗体の作製方法、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の活性評価方法、並びに該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いた疾患の治療方法および診断方法について具体的に記載する。
１．モノクローナル抗体の作製方法
　本発明におけるモノクローナル抗体の製造方法は、下記の作業工程を包含する。すなわち、（１）免疫原として使用する抗原の精製および細胞表面に抗原が過剰発現した細胞の作製の少なくとも一方、（２）抗原を動物に免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓などを摘出する時期を決定し、抗体産生細胞を調製する工程、（３）骨髄腫細胞（ミエローマ）の調製、（４）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、（５）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、（６）ハイブリドーマ群からの単クローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）細胞の分離（クローニング）、（７）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物の飼育、（８）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性およびその抗原結合特異性の検討、または標識試薬としての特性の検定、などである。
　以下、本発明におけるＣＤ３および疾患関連抗原に結合するバイスペシフィック抗体を作製するために使用する、ＣＤ３に結合するモノクローナル抗体および疾患関連抗原に結合するモノクローナル抗体の作製方法を上記の工程に沿って詳述する。該抗体の作製方法はこれに制限されず、例えば脾臓細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマを使用することもできる。
（１）抗原の精製　
　疾患関連抗原またはＣＤ３を発現させた細胞は、疾患関連抗原またはＣＤ３の全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞または動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞またはヒト組織などからＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方を精製し、抗原として使用することができる。また、該腫瘍培養細胞または該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＣＤ３または疾患関連抗原の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
　本発明で用いられるＣＤ３または疾患関連抗原は、Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)やCurrent Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ＣＤ３または疾患関連抗原をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させることで製造することができる。　
　ＣＤ３または疾患関連抗原をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ＣＤ３または疾患関連抗原を生産する形質転換体を得ることができる。　
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体中への組込みが可能で、かつＣＤ３または疾患関連抗原をコードするＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものであれば、いずれも用いることができる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞または動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
　大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であるとともに、プロモーター、リボソーム結合配列、ＣＤ３または疾患関連抗原をコードする部分を含むＤＮＡ、並びに転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターは、プロモーターを制御する遺伝子を含んでもよい。
　該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば、６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　また、該ＣＤ３または疾患関連抗原をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＣＤ３または疾患関連抗原の生産率を向上させることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry, 48, 669（1984）］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277（1989）］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306（1985）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４，６８６，１９１号明細書、米国特許第４，９３９，０９４号明細書、米国特許第５，１６０，７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J. Bacteriol., 172, 2392 （1990）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）またはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（東洋紡社製）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターまたはＴ７プロモーターなどの、大腸菌またはファージなどに由来するプロモーターが挙げられる。また、例えば、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、またはｌｅｔ　Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども挙げられる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、または大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110（1972）、Gene, 17, 107（1982）、Molecular & General Genetics, 168, 111（1979）］が挙げられる。　
　動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報；Cytotechnology, 3, 133 （1990）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Nature, 329, 840 （1987）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 （1987）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３またはｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーターまたはモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　宿主細胞としては、例えば、ヒトバーキットリンパ腫細胞Ｎａｍａｌｗａ、アフリカミドリザル腎臓由来細胞ＣＯＳ、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ、またはヒト白血病細胞ＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）などが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413（1987）］などが挙げられる。　
　以上のようにして得られるＣＤ３または疾患関連抗原をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、または動物細胞などに由来する形質転換体を培地中で培養し、培養物中に該ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＣＤ３または疾患関連抗原を製造することができる。該形質転換体を培地中で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたＣＤ３または疾患関連抗原を得ることができる。
　誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する際には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを、各々培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519（1967）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Science, 122, 501 （1952）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地[Virology, 8, 396（1959）］、199培地［Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中に、必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
　ＣＤ３または疾患関連抗原をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産または融合タンパク質発現などの方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）］を用いることができる。ＣＤ３または疾患関連抗原の生産方法としては、例えば、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法が挙げられ、使用する宿主細胞や、生産させるＣＤ３または疾患関連抗原の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　例えば、細胞外領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、抗体のＦｃ領域をコードするＤＮＡ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードするＤＮＡ、またはＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡまたはＨｉｓｔｉｄｉｎｅタグをコードするＤＮＡなどを連結したＤＮＡを作製して、発現し精製することで抗原融合タンパク質を作製することができる。具体的には、例えばＣＤ３または疾患関連抗原の細胞外領域をヒトＩｇＧのＦｃ領域に結合させたＦｃ融合タンパク質、ＣＤ３または疾患関連抗原の細胞外領域とグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質が挙げられる。
　ＣＤ３または疾患関連抗原が宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989）］、ロウらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 （1989）、Genes Develop., 4, 1288（1990）］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報、または国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＣＤ３または疾患関連抗原を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してＣＤ３または疾患関連抗原の生産量を上昇させることもできる。
　生産したＣＤ３または疾患関連抗原は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
　ＣＤ３または疾患関連抗原が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、またはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離して得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、すなわち溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を、単独でまたは組み合わせて用いることで、精製タンパク質を得ることができる。　
　ＣＤ３または疾患関連抗原が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＣＤ３または疾患関連抗原の不溶体を回収する。回収した該ＣＤ３または疾患関連抗原の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、ＣＤ３または疾患関連抗原を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製タンパク質を得ることができる。
　ＣＤ３または疾患関連抗原またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＣＤ３または疾患関連抗原、またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養上清を上記と同様に遠心分離などの手法を用いて処理することにより、可溶性画分を取得し、該可溶性画分から上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製タンパク質を得ることができる。
　また、本発明において用いられるＣＤ３または疾患関連抗原は、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。具体的には、例えば、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製、または島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することができる。
（２）抗体産生細胞の調製工程
　マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ウシ、またはアルパカなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節または末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、動物としては、例えば、富塚らの文献［Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 97、722,（2000）］に記載されているヒト由来抗体を産生するトランスジェニックマウス、免疫原性を高めるためにＣＤ３または疾患関連抗原のコンディショナルノックアウトマウスなどが被免疫動物として挙げられる。
　免疫は、フロイントの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射または足蹠注射などいずれでもよいが、腹腔内注射、足蹠注射または静脈内注射が好ましい。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、またはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアタンパク質とのコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
　抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに５～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し上記の血清が十分な抗体価を示した動物を、融合用抗体の産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。
　抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞は、形質細胞およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾臓細胞が最も一般的に用いられる。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断してほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去することにより、融合用抗体産生細胞を取得する。
（３）ミエローマの調製工程
　ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることが出来るが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1（1978）］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）［European J. Immunology, 6, 511 （1976）］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Nature, 276, 269（1978）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［J. Immunology, 123, 1548 （1979）］、またはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature, 256, 495（1975）］などが用いられる。該細胞株は、適当な培地、例えば８－アザグアニン培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、ＦＣＳおよび８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ－１６４０培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地で継代培養する。細胞融合の３～４日前に上記の細胞株を正常培地（例えば、１０％　ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地）で継代培養し、融合を行う当日に２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
　（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られるミエローマ細胞を、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、融合用抗体産生細胞：ミエローマ細胞＝５：１～１０：１になるように混合し、遠心分離した後、上清を除く。沈澱した細胞集塊をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混合液を、３７℃にて攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除き、沈澱した細胞集塊を緩やかにほぐした後、ＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた正常培地］中に緩やかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて７～１４日間培養する。　
　また、以下の方法でも細胞融合を行うことができる。脾臓細胞とミエローマ細胞とを無血清培地（例えばＤＭＥＭ）、またはリン酸緩衝生理食塩液（以下「リン酸緩衝液」という）でよく洗浄し、脾臓細胞とミエローマ細胞の細胞数の比が５：１～１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞集塊をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００～４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液およびヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）を含む正常培地（以下、ＨＡＴ培地という）中に懸濁して培養用プレート（以下、プレートという）の各ウェルに分注し、５％炭酸ガス存在下、３７℃にて２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
（５）ハイブリドーマ群の選択
　融合に用いたミエローマ細胞が８－アザグアニン耐性株である場合、すなわちヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合は、融合しなかったミエローマ細胞およびミエローマ細胞同士の融合細胞は、ＨＡＴ培地中では生存することができない。一方、抗体産生細胞同士の融合細胞および抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは、ＨＡＴ培地中で生存することができるが、抗体産生細胞同士の融合細胞はやがて寿命に達する。したがって、ＨＡＴ培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを取得することができる。
　コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下、ＨＴ培地という）への培地交換を行う。その後、培養上清の一部を採取し、後述する抗体価測定法を用いて、抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。抗体価の測定方法としては、例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法および受身血球凝集反応法など種々の公知技術が挙げられるが、検出感度、迅速性、正確性および操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法が好ましい。
　抗体価を測定することにより、所望の抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、例えば、プレートの１ウェルに１個の細胞が含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個の細胞を単離する方法、セルソーターによって１個の細胞を単離する方法などが挙げられる。
　抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２～４回繰り返し、安定して抗体価の認められたものを、ＣＤ３または疾患関連抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。　
（６）モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（５）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡカラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行い、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。また、同系統のマウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ）若しくはＮｕ／Ｎｕマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹腔内で該ハイブリドーマを増殖させることにより、ＣＤ３または疾患関連抗原に結合するモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
　（５）で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、ＧＩＴ培地、または５％ダイゴＧＦ２１を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地等に懸濁し、フラスコ培養、スピナー培養またはバック培養などにより３～７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ　ＧＩＩキット；アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を利用することもできる。
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍＬ］より算出する方法により行うことができる。
（７）ＣＤ３または疾患関連抗原に対するモノクローナル抗体の結合アッセイ
　本発明の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体は、ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインを含んでおり、当該ＣＤ３結合ドメインは上記結合アッセイにおいて、コントロールとして抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４又はＫＭ１４を用いて確立することができる。
　例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ライブラリーから、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４又はＫＭ１４と比べて１０％以上アフィニティが低い抗体をスクリーニングすることで所望のＣＤ３結合ドメインを確立することができる。また、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４又はＫＭ１４のＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬのアミノ酸配列をもとに、ＣＤＲ又はＦＲ領域のアミノ酸配列にランダム変異を導入した抗体ライブラリーを作製し、当該ライブラリーから、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４又はＫＭ１４と比べて１０％以上アフィニティが低い抗体をスクリーニングすることで所望のＣＤ３結合ドメインを確立することができる。
　ＣＤ３または疾患関連抗原に対するモノクローナル抗体の結合活性は、オクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、フローサイトメトリー法（ＦＣＭ）または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などのバインディングアッセイ系により測定することができる。
　オクテルロニー法は簡便ではあるが、抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定すると共に、抗体の結合活性を測定することが可能である。
　手順の具体例としては、精製または部分精製した組換えＣＤ３または疾患関連抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によりブロッキングを行う。ＥＬＩＳＡプレートをｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）および０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ）などで洗浄後、段階希釈した第１抗体（例えばマウス血清、培養上清など）を反応させ、プレートに固定化された抗原へ抗体を結合させる。次に、第２抗体としてビオチン、酵素（ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ、ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰなど）、化学発光物質または放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して、プレートに結合した第１抗体に第２抗体を反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行い、標的抗原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
　ＦＣＭ法では、抗体の抗原発現細胞に対する結合活性を測定することができる［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)］。抗体が細胞膜上に発現している膜タンパク質抗原に結合することは、当該抗体が天然に存在する抗原の立体構造を認識し、結合することを意味する。
　ＳＰＲ法としては、Ｂｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析が挙げられる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００を用い、抗原と被験物質との間の結合におけるｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウェアで解析をする。手順の具体例としては、抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質を流して適当量を結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流して、結合および解離を測定する。次に、得られたデータについて、機器付属のソフトウェアを用いて１：１バインディングモデルによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。または、ＣＤ３または疾患関連抗原をセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流して、結合および解離を測定する。得られたデータについて、機器付属のソフトウェアを用いて１：１バインディングモデルまたはバイバレントバインディングモデルによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。
　また、本発明において、ＣＤ３または疾患関連抗原に対する抗体と競合してＣＤ３または疾患関連抗原に結合する抗体は、上述のバインディングアッセイ系に被験抗体を共存させて反応させることにより、選択することができる。すなわち、被験抗体を加えた時に抗原との結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＣＤ３または疾患関連抗原への結合について、前記で取得した抗体と競合する抗体を得ることができる。
（８）ＣＤ３または疾患関連抗原に対するモノクローナル抗体のエピトープの同定
　本発明において、抗体が認識し結合するエピトープの同定は以下のようにして行うことができる。
　例えば、抗原の部分欠損体、種間で異なるアミノ酸残基を改変した変異体、または特定のドメインを改変した変異体を作製し、該欠損体または変異体に対する抗体の反応性が低下すれば、欠損部位またはアミノ酸改変部位が該抗体のエピトープであることが明らかになる。このような抗原の部分欠損体および変異体は、適当な宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、植物細胞または哺乳動物細胞などを用いて、分泌タンパク質として取得してもよいし、宿主細胞の細胞膜上に発現させて抗原発現細胞として調製してもよい。膜型抗原の場合は、抗原の立体構造を保持したまま発現させるために、宿主細胞の膜上に発現させることが好ましい。また、抗原の１次構造または立体構造を模倣した合成ペプチドを作製し、抗体の反応性を確認することもできる。合成ペプチドは、公知のペプチド合成技術を用いて、その分子の様々な部分ペプチドを作製する方法等が挙げられる。
　例えば、ヒトおよびマウスのＣＤ３または疾患関連抗原の細胞外領域について、各領域を構成するドメインを適宜組み合わせたキメラタンパク質を作製し、該タンパク質に対する抗体の反応性を確認することで、抗体のエピトープを同定することができる。その後、さらに細かく、その対応部分のオリゴペプチド、または該ペプチドの変異体等を、当業者に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、該ペプチドに対する抗体の反応性を確認することでエピトープを特定することができる。多種類のオリゴペプチドを得るための簡便な方法として、市販のキット［例えば、ＳＰＯＴｓキット（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社製）、マルチピン合成法を用いた一連のマルチピン・ペプチド合成キット（カイロン社製）等］を利用することもできる。
　ＣＤ３または疾患関連抗原に結合する抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインディングアッセイ系で得た抗体のエピトープを同定し、該エピトープの部分的な合成ペプチド、該エピトープの立体構造を模した合成ペプチド、または該エピトープの組換え体等を作製し、免疫することで取得することができる。
　例えば、エピトープが膜タンパク質であれば、全細胞外領域または一部の細胞外ドメインを、適当なタグ、例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅタグ、ＧＳＴタンパク質または抗体Ｆｃ領域などに連結した組換え融合タンパク質を作製し、該組換えタンパク質を免疫することで、より効率的に該エピトープ特異的な抗体を作製することができる。
２．遺伝子組換え抗体の作製
　遺伝子組換え抗体の作製例として、P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P. Shepherd and C. Dean. Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESSおよびJ. W. Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESSなどに概説されているが、以下にキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体の作製方法を示す。また、遺伝子組換えマウス、ラット、ハムスターおよびラビット抗体についても、同様の方法で作製することができる。
（１）ハイブリドーマからのモノクローナル抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
　モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得は、例えば以下のようにして行うことができる。
　まず、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。次に、合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用いて、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。単離した組換えファージまたは組換えプラスミド内のＶＨまたはＶＬの全塩基配列を決定し、当該塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
　ハイブリドーマの作製に用いる非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギなどを用いるが、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
　ハイブリドーマからの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol., 154, 3 （1987）］、またはＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。　
　全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）］、またはＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）またはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いて、ｍＲＮＡを調製することもできる。
　ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons（1987-1997）］またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）若しくはＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーの作製の際に、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。
　例えば、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ［Strategies, 5, 58（1992）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［Nucleic Acids Research, 17, 9494（1989）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49（1985）］、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Mol. Cell. Biol., 3, 280（1983）］またはｐＵＣ１８［Gene, 33, 103（1985）］などを用いる。
　ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’［Strategies, 5, 81（1992）］、Ｃ６００［Genetics, 39, 440（1954）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Science, 222, 778（1983）］、ＮＭ５２２［J. Mol. Biol., 166, 1（1983）］、Ｋ８０２［J. Mol. Biol., 16, 118（1966）］、またはＪＭ１０５［Gene, 38, 275（1985）］などを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ若しくは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）］などを用いる。
　また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons（1987-1997）］を行うことにより、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
　選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。例えば、ジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463（1977）］などの反応を行った後、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いて解析する。
　決定した全塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが、分泌シグナル配列を含めて抗体のＶＨおよびＶＬ各々の完全なアミノ酸配列をコードしているか否かを確認する。
　分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬ各々の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］と比較することにより、
分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定することができ、さらにそれらが属するサブグループを同定することができる。
　また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列は、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］と比較することによって推定することができる。
　また、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列について、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴまたはＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースを用いてＢＬＡＳＴ法［J. Mol. Biol., 215, 403（1990）］などによる相同性検索を行うことで、当該ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものであるか否かを確認することができる。
（２）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬの少なくとも一方をコードするＤＮＡをクローニングすることにより構築することができる。
　ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができ、例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いることができる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとしてはｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
　動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組み込んで発現できるものであれば、いかなるものでも用いることができ、例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnol., 3, 133 （1990）］、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101, 1307（1987）］、ｐＨＳＧ２７４［Gene, 27, 223 （1984）］、ｐＫＣＲ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 （1981）］、pSG1bd2-4［Cytotechnol., 4, 173 （1990）］、またはｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Cytotechnol., 13, 79 （1993）］、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社製）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）、Ｎ５ＫＧ２ベクター（国際公開第２００３／０３３５３８号に記載）、トランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などを用いることができる。
　動物細胞用発現ベクターのプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーター［J. Biochem., 101, 1307 （1987）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987）］、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号明細書）または免疫グロブリンH鎖のプロモーター［Cell, 41, 479 （1985）］とエンハンサー［Cell, 33, 717（1983）］などを用いることができる。
　遺伝子組換え抗体の発現には、ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、細胞内における抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量の均衡性などの観点から、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の両遺伝子を搭載したベクター（タンデム型ベクター）［J. Immunol. Methods, 167, 271 （1994）］を用いるが、抗体Ｈ鎖とＬ鎖の各遺伝子を別々に搭載した複数のベクター（セパレート型ベクター）を組み合わせて用いることもできる。
　タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Hybridoma, 17, 559（1998）］、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）、Ｎ５ＫＧ２ベクター（国際公開第２００３／０３３５３８号に記載）、Ｔｏｌ２トランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などを用いる。
（３）キメラ抗体発現ベクターの構築
　（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター内のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする遺伝子の各々の上流に、（１）で得られる非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを各々クローニングすることで、キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
　まず、非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。次に、作製したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター内のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする遺伝子の各々の上流に、それらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、キメラ抗体発現ベクターを構築する。
　また、非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることで、キメラ抗体発現ベクターを構築することもできる。
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの作製
　ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして作製することができる。まず、（１）で得られる非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。
　選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであればいずれのものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるために、元の非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（６０％以上）を有するヒトＦＲのアミノ酸配列を選択する。
　次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、元の非ヒト抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を、抗体遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］を考慮してＤＮＡ配列に変換することで、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのｃＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
　設計したｃＤＮＡ配列に基づき、１００～１５０塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応における反応効率および合成可能なＤＮＡ長の観点から、好ましくはＨ鎖およびＬ鎖に対し各々４～６本の合成ＤＮＡを設計する。また、可変領域全長の合成ＤＮＡを合成して用いることもできる。
　さらに、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターに、容易にヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（１）に記載の方法と同様の方法により塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［BIO/TECHNOLOGY, 9, 266（1991）］。そのため、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列のうち、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下したヒト化抗体の抗原結合活性を上昇させることができる。　
　抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［J. Mol. Biol., 112, 535（1977）］またはコンピューターモデリング［Protein Engineering, 7, 1501（1994）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築および解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで、必要な抗原結合活性を有する改変ヒト化抗体を取得できる。
　ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変することができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について、（１）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的とする改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
　（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築したヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、（４）および（５）で得られるヒト化抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター内のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする各遺伝子の上流に、それらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
（７）ヒト抗体発現ベクターの構築
　ヒト抗体を産生する動物を被免疫動物として用いて、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した場合には、（１）において、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列を得ることができる。そこで、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、（１）で得たヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることで、ヒト抗体発現ベクターを構築することができる。
（８）遺伝子組換え抗体の一過性発現
　（３）、（６）および（７）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体を一過性に発現させ、得られた多種類の遺伝子組換え抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
　発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ－７細胞［American Type Culture Collection（ATCC）番号：CRL1651］を用いる。ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Methods in Nucleic Acids Res., CRC press（1991）］、またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413（1987）］などを用いる。
　発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性を、酵素免疫抗体法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third Edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。　
（９）遺伝子組換え抗体の安定的発現株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
　（３）、（６）および（７）で得られた遺伝子組換え抗体発現用ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定的に発現する形質転換株を得ることができる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入としては、例えば、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Cytotechnology, 3, 133（1990）］、カルシウムイオン方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などが挙げられる。また、後述の動物に遺伝子を導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションやリポフェクション法を用いて遺伝子を導入する方法、および核移植法などが挙げられる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８０）、チャイニーズハムスターＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ　Ｎｏ．１１６１９）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）が欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216（1980）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３細胞［Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55（1986）］、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
　また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースの合成に関与する酵素などのタンパク質、Ｎ－グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などのタンパク質、または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースのゴルジ体への輸送に関与するタンパク質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、例えばα１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）などを用いることもできる。
　発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定的に発現する形質転換株を、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２－２５７８９１号公報）。
　動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０２培地（ジェイアールエイチ社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３２５培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）若しくはＨｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、またはこれらの培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。得られた形質転換株を培地中で培養することで、培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現、蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定することができる。また、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２－２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換株の産生する遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
　遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過など、タンパク質の精製で用いられる方法を組み合わせて精製することもできる。
　精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖または抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Nature, 227, 680（1970）］、またはウェスタンブロッティング法［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］など用いて測定することができる。 
３．バイスペシフィック抗体の設計
　本発明のバイスペシフィック抗体は、ＣＤ３結合ドメイン、Ｆｃ領域又はＦｃ領域を含む定常領域、および疾患関連抗原結合ドメインをそれぞれ設計し、それらを連結させたバイスペシフィック抗体を設計することによって作製することができる。
３－１．ＣＤ３結合ドメインの設計
　CD3結合ドメインは、上記１．に記載の方法を用いて所望のＣＤ３結合ドメインを取得し、各結合ドメインに含まれるＣＤＲ又は可変領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を上記２．に記載の方法を用いて決定することができる。
３－２．Ｆｃ領域又はＦｃ領域を含む定常領域の設計
　本発明におけるＦｃ領域又はＦｃ領域を含む重鎖定常領域は、Ｃ末端側に１のＣＤ３結合ドメインが結合している。従って、Ｆｃ領域に含まれる２本のＦｃ鎖、又は重鎖定常領域に含まれる２本のＣＨ鎖において、それぞれいずれか一方のポリペプチドにｓｃＦｖ、ｄｓＦｖなどの１のＣＤ３結合ドメインが結合していても、各２本のポリペプチドにそれぞれＣＤ３結合ドメインのＶＨ又はＶＬを結合させることで、１のＣＤ３結合ドメインが結合していてもよい。
　前述ＣＤ３結合ドメインのアミノ酸配列が連結されたＦｃポリペプチド鎖又はＣＨ１－Ｆｃと、Ｆｃポリペプチド鎖又はＣＬ－Ｆｃがヘテロダイマー構造を形成できるように、一方のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗのアミノ酸残基置換を加えたアミノ酸配列、もう一方のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖのアミノ酸残基置換を加えたアミノ酸配列を作製する。
　また、ＣＤ３結合ドメインのアミノ酸配列が連結されたＣＨ１－Ｆｃと、ＣＬ－ＦｃとのヘテロＣＨ領域の場合、ＣＨ１－ＦｃにＣ２２０Ｓのアミノ酸残基置換を加えたアミノ酸配列、並びにＣＬ－Ｆｃに２１６-２２０のアミノ酸残基の欠損及びＣ２１４Ｓのアミノ酸残基置換を加えたアミノ酸配列を作製する。また、より効率的にヘテロＣＨ領域を形成させるために、更にＣＬ－ＦｃにＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆのアミノ酸残基置換を加えたり、前述ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基置換を適宜組合せて使用することができる。
　３－３．疾患関連抗原結合ドメインの設計
　３－２で作製したＦｃ領域またはＣＨ領域の各ポリペプチド鎖に、所望の疾患関連抗原に対する結合ドメインのアミノ酸配列を連結する。例えば、疾患関連抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨ／ＶＬ、ＶＨ－ＣＨ１／ＶＬ－Ｃκ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨのアミノ酸配列をそれぞれ第１又は第２のポリペプチドのＮ末端側に連結した場合、１価又は２価の疾患関連抗原結合ドメインを有する抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体が作製できる。また、第１又は第２のポリペプチドのＣ末端側にｓｃＦｖ、ＶＨＨのアミノ酸配列を連結すれば、Ｃ末端側に疾患関連抗原結合ドメインを１価で有するバイスペシフィック抗体、又はＮ末端の結合価数と合わせて２価又は３価の疾患関連抗原結合ドメインを有するバイスペシフィック抗体を作製することができる。疾患関連抗原結合ドメインが２価又は３価の場合、ぞれぞれの抗原結合ドメインは同じエピトープであっても、異なるエピトープであっても作製することができる。当該バイスペシフィック抗体は、ＣＤ３以外にバイスペシフィシティ又はトリスペシフィシティを有する。
４．バイスペシフィック抗体の作製
　上記設計により種々の分子型の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体を作製することができるが、以下にいくつか典型的なものを例示する。以下、ＶＨ／ＶＬ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂは特別記載がない場合、疾患関連抗原に特異的な抗体のＶＨ／ＶＬ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂを示す。
４－１．Ｆｃ領域のＮ末端に１価の疾患関連抗原結合ドメイン、Ｆｃ領域のＣ末端に１価の抗ＣＤ３結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体。
ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ＣＤ３ｓｃＦｖ及びＶＬ－ＣＬ－Ｆｃ
ＶＬ－ＣＨ１－Ｆｃ－ＣＤ３ｓｃＦｖ及びＶＨ－ＣＬ－Ｆｃ
ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ及びＶＬ－ＣＬ－Ｆｃ－ＣＤ３ｓｃＦｖ
ＶＬ－ＣＨ１－Ｆｃ及びＶＨ－ＣＬ－Ｆｃ－ＣＤ３ｓｃＦｖ
ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ＣＤ３ＶＨ及びＶＬ－ＣＬ－Ｆｃ－ＣＤ３ＶＬ
ＶＬ－ＣＨ１－Ｆｃ－ＣＤ３ＶＨ及びＶＨ－ＣＬ－Ｆｃ－ＣＤ３ＶＬ
ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ＣＤ３ＶＬ及びＶＬ－ＣＬ－Ｆｃ－ＣＤ３ＶＨ
ＶＬ－ＣＨ１－Ｆｃ－ＣＤ３ＶＬ及びＶＨ－ＣＬ－Ｆｃ－ＣＤ３ＶＨ
４－２．Ｆｃ領域のＮ末端に２価の疾患関連抗原結合ドメイン、Ｆｃ領域のＣ末端に１価の抗ＣＤ３結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体。
Ｆａｂ１－Ｆｃ－ＣＤ３ｓｃＦｖ及びＦａｂ２－Ｆｃ
Ｆａｂ１－Ｆｃ及びＦａｂ２－Ｆｃ－ＣＤ３ｓｃＦｖ
ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－Ｆｃ－ＣＤ３ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ２－ＣＬ－Ｆｃ
ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－Ｆｃ及びｓｃＦｖ２－ＣＬ－Ｆｃ－ＣＤ３ｓｃＦｖ
ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－Ｆｃ－ＣＤ３ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ２－ＣＬ－Ｆｃ
ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－Ｆｃ及びｓｃＦｖ２－ＣＬ－Ｆｃ－ＣＤ３ｓｃＦｖ
　上記アミノ酸配列にヘテロダイマー形成に必要なアミノ酸残基置換を加え、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターを動物細胞に導入し、発現させることで、バイスペシフィック抗体を作製する。また、前記ベクターをＦＵＴ８ＫＯ細胞に導入し、発現させることで、α１，６－フコースの無いバイスペシフィック抗体も作製できる。また、Ｆｃアミノ酸残基置換を加え高いＡＤＣＣ活性を有するバイスペシフィック抗体を作製することもできる。タンパク質発現及び精製は前記２項の方法で実施することができる。
５．本発明のバイスペシフィック抗体またはその抗体断片の活性評価
　精製したバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
　ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方を発現した細胞株に対する本発明のバイスペシフィック抗体の結合活性は、前述の１．（７）記載のバインディングアッセイ系を用いて測定することができる。
　ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方を発現した細胞に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373（1993）］により測定することができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体の細胞傷害活性は次の方法で測定することができる。例えば、疾患関連抗原を発現している標的細胞およびPBMCを専用プレートに播種し、バイスペシフィック抗体を添加して一定期間培養し、Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ｃｅｌｌ　ａｎａｌｙｚｅｒ　ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）などにより細胞数の変化を解析する。また、蛍光染色した標的細胞と非染色のＰＢＭＣを９６穴プレートに播種し、バイスペシフィック抗体を添加して一定期間培養し、死細胞染色を行い、フローサイトメトリーによって生存している標的細胞のみをカウントすることにより、細胞傷害活性を算出する。
　本発明のバイスペシフィック抗体のサイトカイン産生誘導能は次の方法で測定することができる。例えば、疾患関連抗原を発現している標的細胞およびＰＢＭＣを９６穴プレートに播種し、バイスペシフィック抗体を添加して一定期間培養した後に、培養上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ　サスペンションアレイシステム、またはＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ｂｅａｄ　Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キットを用いて測定する。
６．本発明のバイスペシフィック抗体またはその抗体断片を用いた疾患の治療方法
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくは疾患関連抗原の発現細胞が関与する疾患の治療に用いることができる。ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患としては、例えば、悪性腫瘍およびがんなどが挙げられる。
　悪性腫瘍およびがんとしては、例えば、大腸がん、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、グリオーマ、悪性黒色腫（メラノーマ）、甲状腺がん、腎細胞がん、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃がん、膵臓がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、卵巣がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、頭頚部がん、扁平上皮癌、皮膚がん、尿路がん、膀胱がん、前立腺がん、絨毛がん、咽頭がん、喉頭がん、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、膠芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫およびウィルムス腫瘍などが挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療薬は、有効成分としての該抗体若しくは該抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
　投与経路としては、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤などが挙げられる。各種製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤、および安定化剤などを用いて常法により製造することができる。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロース、滅菌水、エタノール、グリセロール、生理食塩水および緩衝液などが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、炭酸マグネシウムおよび合成ケイ酸マグネシウムなどが挙げられる。
　結合剤としては、例えば、メチルセルロースまたはその塩、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースおよびポリビニルピロリドンなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコールおよび硬化植物油などが挙げられる。
　安定化剤としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン、メチオニンなどのアミノ酸、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン４０、メチルセルロース、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
　その他の添加剤としては、例えば、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硝酸ソーダおよびリン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などが挙げられる。
　乳剤またはシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、またはストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造される。　
　カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、またはグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造される。
　非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤または噴霧剤などが挙げられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造される。
　座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造される。噴霧剤は、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造される。担体としては、例えば、乳糖またはグリセリンなどが挙げられる。また、エアロゾルまたはドライパウダーとして製造することもできる。さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
　本発明のバイスペシフィック抗体の有効量と適切な希釈剤および薬理学的に使用し得るキャリアとの組合せとして投与される有効量は、１回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ～１００ｍｇであり、２日から８週間間隔で投与される。
７．本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いた疾患の診断方法
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いて、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が発現した細胞を検出または測定することにより、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくは疾患関連抗原結合ドメインの発現細胞が関与する疾患を診断することができる。
　ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患である悪性腫瘍またはがんの診断は、例えば、以下のようにＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方を検出または測定して行うことができる。
　まず、複数の健常者の生体から採取した生体試料について、本発明のバイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を用い、下記の免疫学的手法を用いて、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方の検出または測定を行い、健常者の生体試料中のＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方の存在量を調べる。
　次に、被験者の生体試料中についても同様にＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方の存在量を調べ、その存在量を健常者の存在量と比較する。例えば、被験者の疾患関連抗原の存在量が健常者と比較して増加している場合には、該被験者はがんなどの疾患であると診断される。その他のＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患の診断についても、同様の方法で診断できる。
　免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
　放射性物質標識免疫抗体法としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法が挙げられる。
　酵素免疫測定法としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法が挙げられる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。
　酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知の酵素標識［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、またはビオチン標識などを用いる。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原に結合する抗体または抗体断片であって、抗原結合部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体または抗体断片をあらかじめプレート（例えば、９６穴プレート）に吸着させ、次に第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、またはビオチンなどで標識しておく。上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された細胞若しくはその破砕液、組織若しくはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、または眼液などを反応させた後、標識した抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）２などの抗体断片を用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープに結合するモノクローナル抗体または該抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体またはその抗体断片との組み合わせでもよい。
　蛍光免疫測定法としては、例えば、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition,Academic Press（1996）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の蛍光標識［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（１９８３）］を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣまたはＲＩＴＣなどを用いる。
　発光免疫測定法としては、例えば、文献［生物発光と化学発光　臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識が挙げられ、例えば、アクリジニウムエステルまたはロフィンなどを用いる。
　ウェスタンブロット法としては、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－ＰＡＧＥ［Antibodies - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原に結合する抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、またはビオチン標識などを施した抗ＩｇＧ抗体またはその抗体断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。
　まず、所望のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１～３０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により泳動する。次に、泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１～１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。ここで本発明のバイスペシフィック抗体を反応させ、０．０５～０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いて該抗体が結合したバンドを検出することにより、抗原を検出する。ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
　物理化学的手法としては、例えば、抗原であるＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方と本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片とを結合させることにより、凝集体を形成させて、該凝集体を検出する。この他に物理化学的手法として、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などを用いることもできる。
　ラテックス免疫比濁法では、抗体または抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより、被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
　一方、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方が発現している細胞の検出または測定には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、好ましくは免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などを用いる。
　免疫沈降法としては、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方を発現した細胞などを本発明のバイスペシフィック抗体またはその抗体断片と反応させた後、プロテインＧセファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて、抗原抗体複合体を沈降させる。
　または、以下のような方法によっても行なうことができる。まず、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ－ＰＢＳによりブロッキングする。次に、ＢＳＡ－ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方を発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより、免疫沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。
　免疫細胞染色法または免疫組織染色法とは、抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の透過性を良くするために界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明のバイスペシフィック抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体またはその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フローサイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition,Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］により検出を行うことができる。特に、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、蛍光抗体染色法により、細胞膜上に発現しているＣＤ３および疾患関連抗原の少なくとも一方を検出することができる。
　また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体－抗原複合体と、抗体－抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定できる。　　　　　　
　以下に具体的な実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］抗ＨＥＲ２一価抗体およびＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の動物細胞用発現ベクターの作製
（１）抗ＨＥＲ２一価抗体の動物細胞用発現ベクターの作製
　国際公開第２０１４／０５４８０４号に記載される方法に準じて、それぞれＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体およびＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型ＨＥＲ２一価抗体［それぞれｍｖＧ１，ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）と表記する。図２（Ａ）の構造を有する］の動物細胞用発現ベクター（それぞれｐＫＡＮＴＥＸ９３ｍｖＧ１およびｐＫＡＮＴＥＸ９３ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）と記載する）を作製した。
　一価抗体は２本の異なるポリペプチドからなるヘテロダイマーであり、ＶＨを含むポリペプチドを第１ポリペプチド（ＶＨ－ＣＨ１－ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ、ポリペプチド１とも言う）、ＶＬを含むポリペプチドを第２ポリペプチド（ＶＬ－ＣＬ－ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ、ポリペプチド２とも言う）と記載する。
　表1に、それぞれの一価抗体の作製に使用した、第１ポリペプチドのＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ部分のアミノ酸配列および塩基配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型は、ＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２８番目のＳｅｒ残基をＰｒｏに、２３５番目のＬｅｕ残基をＧｌｕに、および４０９番目のＡｒｇ残基をＬｙｓにそれぞれ置換した定常領域を有しており、ＡＤＣＣ活性を有さない。
　また、上記抗Ｈｅｒ２一価抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列並びに塩基配列については、いずれも抗Ｈｅｒ２抗体ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列並びに塩基配列（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285, 1992に記載）を使用した。
（２）ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の動物細胞発現ベクターの作製　
上記のＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体、およびＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型抗ＨＥＲ２一価抗体を基にして、各一価抗体の第１ポリペプチドのＣ末端に、リンカーを介して抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させた、ヘテロダイマー型のＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体［図２（Ｂ）］を作製するために、その動物細胞発現ベクターを以下に記載する方法で作製した。
　制限酵素サイトを利用して、上記（１）で作製したＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３ｍｖＧ１の第１ポリペプチドのＨ鎖定常領域のＣ末端部分の一部をコードする塩基配列を、Ｈ鎖定常領域Ｃ末端部分の一部＋ペプチドリンカー＋抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをコードする塩基配列に置き換えた。これにより、ＩｇＧ１型ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａを得た。
　ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、［ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１４３）］３を使用した。抗ＣＤ３　ｓｃＦｖのアミノ酸配列および塩基配列は、ＵＳ７５７５９２３Ｂ２に記載される抗ＣＤ３　ｓｃＦｖのアミノ酸配列および塩基配列を用いた。抗ＣＤ３　ｓｃＦｖのアミノ酸配列は配列番号９に示す。この配列を、以下ｓｃＴ３ａと称する。
　同様の方法で、上記（１）で作製したＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）　型抗ＨＥＲ２一価抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）からＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａを得た。
　上記（１）および本項で作製した抗体発現用ベクターは、いずれも大腸菌Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｑｕｉｃｋ　ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ）を宿主として、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて調製し、以降の実験で使用した。
［実施例２］抗ＨＥＲ２一価抗体およびＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の発現および精製
　実施例１にて調製した各種抗体発現用ベクターを用いて、以下に記載する方法で、高ＡＤＣＣ　ＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）、ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型ＨＥＲ２抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ４　ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）、高ＡＤＣＣ　ＩｇＧ１型ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）およびＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）を得た。
　表２に各抗体の名称と、対応する発現ベクター、使用した宿主細胞、Ｆｃの糖鎖の構造および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖの有無を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表中のＣＨＯ／ＤＧ４４は、Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ由来のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（Somatic Cell Mol Genet 12; 555, 1986）を、ＦＵＴ８ＫＯ　ＣＨＯは、α１，６フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８）をノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（米国特許第６，９４６，２９２号明細書）を示す。
　４×１０６個の上記宿主細胞に、８　μｇの各種発現ベクターを加え、エレクトロポレーション法（Cytotechnology. 3: 133, 1990）により遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、各細胞は、1０％透析牛血清（以下、ｄＦＢＳと略記する）　を含むＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）で２日間培養後、さらに０．５　ｍｇ／ｍＬのＧ４１８硫酸塩を含む上記培地で２週間程度培養を続け、Ｇ４１８　耐性株を取得した。Ｇ４１８　耐性株を、Ｅｘｃｅｌｌ３０２培地（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて培養し、発現タンパク質を含む培養上清を回収した。
　プロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ：ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を充填したカラムを用い、培養上清１Ｌを流速０．５～１．０ｍＬ／ｍｉｎで通過させた。当該カラムを１０ｍＬのｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で２回洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）を用いて抗体を溶出した。得られた溶出液を、２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）により直ちに中和した後、１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）で透析することにより緩衝液を置換した。
　上記の抗体溶液は、さらにゲルろ過クロマトグラフィーを用いて多量体あるいは分解物の除去を行った。ＡＫＴＡ　ｅｘｐｌｏｒｅ　１０Ｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００　１０／３００　ＧＬ　カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を接続し、流路を１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）に置換した。調製した抗体溶液を該カラムに添加して、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで通過させ、フラクションコレクターで０．５ｍＬずつ回収した。回収した各画分のうち、ＯＤ２８０のメインピークを示す画分を、目的の抗体の単量体を含む画分として回収し、抗体溶液を０．２２　μｍフィルターを通して滅菌して保存した。得られた抗体サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析に供した結果、いずれも予想された分子量サイズを示し、目的の抗体を取得できたことを確認した。また比較対照サンプルとして、抗ＨＥＲ２抗体ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂのＮ結合型糖鎖中のα１，６フコースを除去した抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＤＦ）を、Clin Cancer Res. 13: 1875-1882, 2007に記載の方法に準じて作製し、一部の実験で使用した。
さらに陰性対照としてＩｇＧ１型抗２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ（ＤＮＰ）　抗体を、Clin Cancer Res. 11(8): 3126-3135, 2005に記載の抗２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ（ＤＮＰ）　ＩｇＧ１抗体をコードするＤＮＡ断片（クローン名ＤＮＰ２）を用いて、実施例１および２に記載の方法に準じて作製し、一部の実験で使用した。
［実施例３］抗ＨＥＲ２一価抗体およびＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の抗原結合活性の評価
（１）ＨＥＲ２結合活性の評価
　実施例２で取得した各種抗体のＨＥＲ２結合活性は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂに対する結合阻害実験により評価した。まず、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｒｏｃｈｅ社）をＡｌｅｘａ４８８で標識して、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ＿Ａｌｘを作製した。次に、ＨＥＲ２陽性ヒト乳癌細胞株ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ－３０）を用いてフローサイトメーターによる結合阻害解析を行った。
　終濃度２．０μｇ／ｍＬのＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ＿Ａｌｘと、終濃度１０５、２１、４．２、および０．８４　ｎＭの非標識ＩｇＧ１抗体、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、各種抗ＨＥＲ２一価抗体またはＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体をそれぞれ添加して、４℃で１．５時間反応させた。陰性対照には、同濃度のヒト血清由来ＩｇＧ１／ｋａｐｐａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を加えた。洗浄後、フローサイトメーターＣｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ　５００　ＭＰＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で、ＳＫ－ＢＲ－３細胞に結合したＭｅａｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）を測定した。結果を図４に示す。
　図４に示すように、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、各種抗ＨＥＲ２一価抗体、および各種ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体は、抗体濃度依存的にＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ＿Ａｌｘの結合を阻害し、Ｈｅｒ２特異的な結合活性を有することが確認された。抗ＨＥＲ２一価抗体、およびＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の４つに関して、ＨＥＲ２に対する結合活性は同程度であることが明らかになった。
（２）ＣＤ３結合活性の評価
　実施例２で取得した各種抗体のＣＤ３結合活性は、市販凍結Ｔ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社）に対する結合活性で評価した。各種抗体を終濃度１０μｇ／ｍＬでＴ細胞に加え、４℃で１時間反応させた。洗浄後、３０μｇ／ｍＬに希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ）２－ＦＩＴＣ（Ａｃｒｉｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）を加え、４℃で１時間反応させた。
　なお、陽性対照として、一次抗体に３０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ－３（ａｂｃａｍ社）を、二次抗体にＧｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ｆ（ａｂ）２－ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ社）を使用した。洗浄後、フローサイトメーターＣｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ　５００　ＭＰＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で、Ｔ細胞に結合した抗体のＭＦＩを測定した。結果を図５に示す。
　図５に示すように、評価した抗体の内、ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）は、いずれも同程度にＴ細胞に結合した。一方で、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、ならびに抗ＨＥＲ２一価抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）はＴ細胞に結合しなかった。以上より、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥＲ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）は、同程度の強さでＣＤ３に結合できることが明らかになった。
［実施例４］抗ＨＥＲ２一価抗体およびＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の細胞傷害活性の評価
　実施例２で作製した各種抗体について、Ｆｃ領域を介したＡＤＣＣ活性およびＣＤ３と結合することによるＡＤＴＣ活性の両方を含む細胞傷害活性を、プレートに付着したがん細胞の細胞量を経時的に検出するＲｅａｌ　ｔｉｍｅ　ｃｅｌｌ　ａｎａｌｙｚｅｒ　ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて以下に記載する方法で測定した。プレート上の細胞量が変化することにより、電気抵抗値が変化することを利用している。すなわちこの測定によって得られるＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値は、プレート上の細胞量と正の相関を示す。
　ＡＤＣＣ活性は主にＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡを発現するＮＫ細胞が、ＡＤＴＣ活性はＣＤ３を発現するＴ細胞がそれぞれ主なエフェクター細胞であることが知られるため、その双方を含むヒト末梢血由来の単核球（ＰＢＭＣ）をエフェクターに、ＨＥＲ２陽性がん細胞株をターゲットに用いることによって、各種抗体のＡＤＣＣ活性およびＡＤＴＣ活性の両方を含む細胞傷害活性を測定できる。
　まず、Ｅ－ｐｌａｔｅ　ＶＩＥＷ　１６（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にＲＰＭＩ１６４０培地（１０％　ＦＢＳ添加）を加えベースライン補正を行った。ＨＥＲ２中陽性乳がん細胞株ＢＴ－２０細胞（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ－１９）またはＨＥＲ２低発現ＭＣＦ－７細胞（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ－２２）を０．０２％ＥＤＴＡ（ナカライテスク社）でフラスコから剥離してＰＢＳで洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０（１０％　ＦＢＳ、１０μｇ／ｍＬ　Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）でそれぞれ２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈して上記プレートに５０μＬ／ウェルずつ加えた。
　前記プレートを、ＣＯ２インキュベーターで３０分間保温した後にＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値の測定を開始した。およそ２０時間後に、健常人末梢血より密度勾配法にて採取したＰＢＭＣを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈して、上記プレートに５０μＬ／ウェルずつ加え、更に終濃度の４倍濃度に調製した各種抗体を５０μＬ／ウェルずつ加えて再び測定を開始した。最終データは抗体を添加する直前のがん細胞量の値でノーマライズを行った。得られた結果を図６～８に示す。
　図６はＢＴ－２０細胞のみ、ＢＴ－２０細胞にＰＢＭＣを添加した場合、またはさらにそこにＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）（終濃度５０ｎＭ）、ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ４＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）（終濃度５０ｎＭ）、もしくはこれらの混合液（終濃度２５ｎＭずつの混合液）を添加した場合のＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘを示す。
　図６では、ターゲット細胞とＰＢＭＣを添加したときのがん細胞量と、更に抗体を添加したときのがん細胞量の差が、その抗体が有する細胞傷害活性となる。図６に示すように、４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）が、それぞれ中程度の細胞傷害活性を有すること、およびこれらの半量ずつの混合物が、各４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）又は４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）の単独の細胞傷害活性を上回る、高い細胞傷害活性を有することが明らかになった。
　表２に示すように、ＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）はα１，６フコースが欠損したＮ－結合型糖鎖が結合したＩｇＧ１型の定常領域を有し、国際公開第２０１４／０５４８０４号に記載のとおりＦｃγＲＩＩＩＡ結合活性を介した高いＡＤＣＣ活性を有する一方で、ＣＤ３結合部位を持たないため、ＡＤＴＣ活性を有さない。
　表２に示すように、ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ４（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）はα１，６フコースが付加したＩｇＧ４型の定常領域を有し、かつエフェクター活性を低減するアミノ酸残基改変の導入が行われているため、ＡＤＣＣ活性を惹起する能力はないか、非常に低いが、ＣＤ３を介したＡＤＴＣ活性を有する分子構造を持つ。
　これら二種の抗体を２５ｎＭずつ添加した群の細胞傷害活性は、４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）のみ、または４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）のみを５０ｎＭ添加した群のいずれの細胞傷害活性よりも高く、ＡＤＣＣ活性のみを有する分子とＡＤＴＣ活性のみを有する分子を混合することにより、相乗的な細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。
　従って、この結果はＡＤＣＣ活性のみを有する抗体、またはＡＤＴＣ活性のみを有する抗体のいずれかを単独でがん細胞に対して作用させるよりも、それらを半量ずつ同時にがん細胞に対して作用させる方がより抗腫瘍効果が高いことを示している。
　また、４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）の細胞傷害活性はいずれも中程度であり、その一方の活性が同一濃度において飽和していないことは、この実験においてＡＤＣＣ活性とＡＤＴＣ活性の有効濃度域が大きく乖離していない事を示す。
　図７はＢＴ－２０細胞のみ、ＢＴ－２０細胞にＰＢＭＣを添加した場合、さらにそこに４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）と４Ｄ５＿ｍｖＧ４＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）の混合液（０．３ｎＭずつの混合液）、またはＩｇＧ１型ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）（０．６ｎＭ）を添加した場合のＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘを示す。
　４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）の混合（０．３ｎＭずつ）と、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）（０．６ｎＭ）の細胞傷害活性を比較した結果を図７に示す。
　図７に示す通り、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）は４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）を同時に添加するよりもさらに高い抗腫瘍効果を示した。
　表２に示すように、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）はα１，６フコースが欠損したＮ－結合型糖鎖が結合したＩｇＧ１型の定常領域に起因する高いＡＤＣＣ活性、かつＣＤ３を介したＡＤＴＣ活性を有する分子構造を持つ。
　よって、図６で示されたＡＤＣＣ活性のみを有する分子およびＡＤＴＣ活性のみを有する分子の併用による高い抗腫瘍効果は、同一分子にＡＤＣＣおよびＡＤＴＣの両方の活性を持たせることによってさらに増強され、相乗効果が高まることが示された。
　図８（Ａ）～（Ｅ）は、ＭＣＦ－７細胞のみ、ＭＣＦ－７細胞にＰＢＭＣを添加した場合、またはさらにそこに抗ＨＥＲ２抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＤＦ）、ＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）、ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）、もしくはＩｇＧ１型ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）（いずれも終濃度５０ｎＭ）を添加した場合のＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘを示す。
　図８（Ａ）～（Ｅ）に示すように、ＭＣＦ－７細胞に対して、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＤＦ）、４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）、および４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）はいずれもほとんど細胞傷害活性を示さない一方で、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）は非常に高い細胞傷害活性を示すことが明らかになった。
　この結果より、ＡＤＣＣ活性のみを有する抗体またはＡＤＴＣ活性のみを有する抗体が細胞傷害活性を殆ど示さないがん細胞に対しても、一分子でＡＤＣＣ活性およびＡＤＴＣ活性を有する抗体は、きわめて高い抗腫瘍効果を発揮できることが示された。
［実施例５］ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体のリンカー配列の検討
　本項では、ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）について、第１ポリペプチドのＣＨ３のＣ末端と、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖの間をつなぐペプチドリンカーの配列の種類・長さを変化させたバイスペシフィック抗体を作製し、該ペプチドリンカーの生物活性への影響を検討した。
　表３に、作製した各ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の名称と、ペプチドリンカーのアミノ酸配列およびその構造について示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に記載する抗体のうち、Ｈ１、Ｈ３はそれぞれαへリックスを１もしくは３ターン、Ｐｒｏはプロリンを含むペプチドリンカーを有するバイスペシフィック抗体である。これらの抗体が有するペプチドリンカーは、いずれも［ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１４３）］ｎ（ｎは１～３）リンカーと比較して硬い構造を有する（Chen X, et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 65: 1357-1369, 2013）。従って上記の異なるペプチドリンカーを有する各種バイスペシフィック抗体の生物活性を比較することにより、リンカー部分の硬さ、長さがＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の細胞傷害活性に与える影響を知ることができる。
　実施例１にて作製したバイスペシフィック抗体発現ベクター　ｐＫＡＮＴＥＸ９３ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａの制限酵素サイトＥｃｏＴ２２Ｉ－ＢａｍＨＩを利用して、第１ポリペプチドのＣ末端－［ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ(配列番号１４３)］３リンカー－抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含む遺伝子断片を、第１ポリペプチドのＣ末端－表３に記載するペプチドリンカー－抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含む遺伝子断片に置き換え、表３に記載する各種バイスペシフィック抗体の動物細胞用発現ベクターを作製した。
　これら発現ベクターを、実施例２に記載の方法にてＦＵＴ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞に導入してタンパク質を発現させ、精製した。作製したバイスペシフィック抗体のうち、Ｇ１、Ｇ２、Ｈ１、Ｈ３、およびＰｒｏについては得られた精製タンパク質はＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析で予想通りの分子量サイズを示し、目的の抗体が得られたことが確認できた。
　作製した各種バイスペシフィック抗体のＨＥＲ２およびＣＤ３結合活性を、実施例３に記載の方法にて測定した。得られた結果を図９および図１０に示す。図９より、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）、Ｇ１、Ｇ２、Ｈ１、Ｈ３、およびＰｒｏは、いずれも同等のＨＥＲ２結合活性を有すること、および図１０より、抗体間でややばらつきは認められるもののいずれの抗体も大きく変わらないＣＤ３結合活性を有することが明らかとなった。
　また、上記バイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を、実施例３に記載の方法にて測定した（終濃度は０．６１７ｎＭ）。比較対照は標的細胞のみ、あるいは標的細胞とＰＢＭＣのみ（抗体非添加）とした。得られた結果を図１１及び図１２に示す。
　図１１及び図１２に示すように、ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体Ｇ１、Ｇ２、Ｈ１、Ｈ３、およびＰｒｏは、いずれも４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）と同等かそれ以上の細胞傷害活性を示すことが明らかになった。この結果より、ＩｇＧ１型ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）が有する高い細胞傷害活性は、リンカー部分の構造に依存しないことが示された。
［実施例６］ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の胃がん細胞株への細胞傷害活性
　表４に示す各ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、Ｐｒｏｍｅｇａ社ｐＣＩベクターを改変して作製した抗体発現用ベクターに挿入した。ここで、例えばＤＮＰ２と記載されている抗体に関しては、がん抗原側可変領域としてＤＮＰに結合する抗体の可変領域を使用している陰性対照抗体を示す。抗体名の末尾に記載した（Ｆ）はｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ、（ＤＦ）はｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄの略称であり、Ｆｃ領域の糖鎖に付加されるα１，６フコースの有無を示す。
　遺伝子配列は、重鎖側（第１ポリペプチド側）はＣＡＧプロモーター、軽鎖側（第２ポリペプチド側）はＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。このベクターと、発現系としてＦｒｅｅｓｔｙｌｅ　ＣＨＯ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＣＨＯ－Ｓ細胞またはα１，６フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８）をノックアウトした浮遊ＣＨＯ細胞［以下ＣＨＯ（ＦＵＴ８　ＫＯ）と表記］を用いて一過性発現を行った。もしくは発現系としてＥｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞またはＦＵＴ８をノックアウトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（以下Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（ＦＵＴ８　ＫＯ）と表記）を用いても同様の抗体群を作製できる。
　α１，６フコースを有する抗体分子はＣＨＯ－Ｓ細胞もしくはＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、α１，６フコースが欠損した抗体分子はＣＨＯ（Ｆｕｔ８　ＫＯ）細胞もしくはＥｘｐｉ２９３Ｆ（ＦＵＴ８　ＫＯ）細胞を用いて作製した。
　細胞培養液の遠心分離を行い、０．２μｍフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を通して培養上清を回収した。培養上清からＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたアフィニティ精製により、粗精製抗体を取得した。具体的には、カラムに充填したレジンをＰＢＳで平衡化した後、当該カラムに培養上清を添加し、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４を終濃度で０．１％含むＰＢＳ、およびＰＢＳで１ずつ回洗浄後、溶出バッファー（１００ｍＭ　クエン酸－ＮａＯＨ、ｐＨ３．９または２０ｍＭ　酢酸－ＮａＯＨ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ３．９）を用いて抗体を溶出した。
　得られた抗体溶液に中和バッファー（１Ｍ　リン酸－ＮａＯＨ、ｐＨ７．０）を１／１０量加えて中和し、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔｓ（ミリポア社）を用いて限外濾過による濃縮を行った。粗精製抗体は一定割合の会合体を含むため、単量体のみを分離するために、ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステムおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００　Ｉｎｃｒｅａｓｅ　１０　３００　ＧＬカラム（ともにＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたゲル濾過クロフィーを行った。
　移動相としてはクエン酸バッファー（１０ｍＭ　クエン酸－ＮａＯＨ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）を用いた。単量体画分のみを分離し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して吸光度Ａ２８０を測定し、抗体溶液の濃度の測定および調製を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記バイスペシフィック抗体のＨｅｒ２中陽性であるヒト胃癌細胞株ＭＫＮ－７細胞（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ　ＲＣＢ０９９９）に対する細胞傷害活性を、実施例３に記載の方法にて測定した（終濃度は５０ｎＭ）。比較対照は標的細胞のみ、あるいは標的細胞とＰＢＭＣのみ（抗体非添加）とした。得られた結果を図１３に示す。可変領域をＤＮＰ２としたものはいずれの抗体も細胞傷害活性を示さなかった。
　一方、ＡＤＣＣ　活性のみを有する抗体（４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）および４Ｄ５＿ＩｇＧ１（ＤＦ））は、細胞傷害活性はみられるものの、ＡＤＴＣ　活性のみを有する抗体（４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ））に比べると活性は弱かった。４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）を半量ずつ混合して５０ｎＭとしたものは、上記抗体群よりも高い活性を示した。更には、ＡＤＣＣ活性およびＡＤＴＣ活性を１つの分子型で発揮することのできる４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）は、すべての抗体群の中で最も高い細胞傷害活性を示した。
　同様にして、Ｈｅｒ２中陽性であるヒト胃がん細胞株ＭＫＮ－４５細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク　ＪＣＲＢ０２５４）に対しても細胞傷害活性を測定した結果を図１４に示す。ネガティブコントロールである可変領域がＤＮＰ２である抗体は、いずれも細胞傷害活性を示さなかった。可変領域が４Ｄ５である抗体は、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）のみが明確な細胞傷害活性を示した。以上の結果より、本技術はＢＴ－２０細胞以外のＨＥＲ２陽性細胞株に関しても、相乗的作用により高い細胞傷害活性を発揮することが明らかとなった。
［実施例７］ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の細胞傷害活性と培養上清中サイトカイン産生
　背景技術に記載したような代表的な抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体と、本発明において作製したバイスペシフィック抗体の性状について比較するために、比較対照分子を作製して細胞傷害活性および、細胞傷害時の培養上清中のサイトカイン産生を測定した。比較対照分子としては、公知の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体（国際公開第２０１６／０７１００４号に記載の配列番号１６０、３５９および３９９で示されるアミノ酸配列を有する抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体）を作製した。以降、ＣＤ３／ＨＥＲ２　Ｆａｂ×ｓｃＦｖとも記載する。
　実施例６で示した方法と同様にして発現ベクターを作製し、Ｅｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて抗体を発現させた。以降の精製手順は実施例６に記載した方法に準じて行った。
　作製した比較対照バイスペシフィック抗体および４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を、実施例４に記載の方法にて測定した。被験物質を添加しないウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を活性０％、被験物質の代わりに０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を添加したウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を活性１００％として、Ｄａｙ２（抗体添加後４８時間）時点でのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値から各抗体の細胞傷害活性値を計算した。
　同時点で培養上清を回収し、ＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ｂｅａｄ　Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）　Ｈｕｍａｎ　Ｔｈ１／Ｔｈ２　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｋｉｔ　ＩＩ（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いてサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６）濃度を測定した。各濃度における細胞傷害活性とサイトカイン濃度を同一グラフ上にプロットした結果を図１５に示す。最大の細胞傷害活性は４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）、対照抗体ともに同程度であった。一方で、サイトカイン産生の程度は両者で大きく異なっていた。すなわち、対照抗体は抗体濃度依存的な細胞傷害活性の上昇とともにサイトカイン産生の上昇が観察されており、細胞傷害活性が出る濃度域とサイトカイン産生が誘導される濃度域の乖離が小さいことが明らかになった。一方、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）は細胞傷害活性の上昇に伴ったサイトカイン産生の上昇はほとんど観察されなかった。
［実施例８］ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の様々な分子型の設計
　実施例１～７では、ＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体を基にして、その第１ポリペプチドのＣ末端に抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させたヘテロダイマー型のＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体［図２（Ｂ）］の作製過程、および活性評価の結果を示した。その結果から、ＡＤＣＣ活性およびＡＤＴＣ活性を１分子で発揮することにより、サイトカイン産生誘導能は低いままに、相乗的に高い細胞傷害活性を発揮することが初めて見出された。
　このようなＡＤＣＣ活性とＡＤＴＣ活性の相乗作用が得られる分子型についてより精査するため、図１６（Ａ）～（Ｆ）に示す各分子型を設計した。図１６（Ａ）は既実施例で使用していた分子を示す。図１６（Ｂ）は、２価型抗体の片側の重鎖のＣ末端に抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させた分子であり、がん抗原側Ｆａｂが２価となっている。ヘテロ重鎖を作製するためにＣＨ３部分にはＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓ改変（Nature Biotechnology. vol 16: 677-681, 1998）を導入している。
図１６（Ｃ）は図１６（Ａ）と同一のアミノ酸配列を有しているが、発現細胞を通常のＣＨＯ細胞とすることにより、α１，６フコースが付加された糖鎖を有している分子である。図１６（Ｄ）は一価型抗体の第２ポリペプチド（ＶＬ－ＣＬ－ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ）のＣ　末端に抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させた分子である。図１６（Ｅ）はがん抗原側Ｆａｂと抗ＣＤ３　ｓｃＦｖが両方ともＮ末端側に位置する分子であり、ヘテロ重鎖を作製するために上記図１６（Ｂ）と同様にＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓ改変を導入している。図１６（Ｆ）は一価型抗体の第１、第２ポリペプチドそれぞれのＣ　末端に１つずつ抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを結合させた分子であり、結果として１分子内に２つの抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを有する。
［実施例９］各種分子の作製および細胞傷害活性評価
（１）設計したバイスペシフィック抗体分子の作製
　実施例８で設計した分子を、実施例６で示した方法と同様にして作製した。表５に、作製した抗体およびそのアミノ酸配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５における「分子型」は図１６（Ｂ）～（Ｆ）に対応している。それぞれの分子型を評価する際に陰性対照として使用したｓｃＦｖを有さない分子については、ｓｃＦｖを有する分子と同一の分子型として分類している。
　表５における「抗体名」は、（１）がん抗原側の抗体クローン名、（２）定常領域の抗体サブクラスの由来および構造、（３）ＣＤ３クローン名、及び（４）フコースの有無の順番で分子の特徴を表している。ｍｖＧ１、ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）等の抗体名における「ｍｖ」とはがん抗原側が１価結合型の抗体を示す。ｍｖＧ１、ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）等の抗体名における「Ｇ１」とは、ＩｇＧ１由来のＦｃを有することを、「Ｇ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）」とはＩｇＧ４由来のＦｃにＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、およびＲ４０９Ｋ変異を加えたＦｃを有することを示す。
　表５における（Ｆ）はフコースを有することを、（ＤＦ）はフコースを有さないことを示す。抗体名に（ＤＦ）と表記したものはＣＨＯ（ＦＵＴ８　ＫＯ）で、（Ｆ）と表記したものはＣＨＯ－Ｓで発現させた。ｓｃＴ３ａ、ｓｃＳＰ３４などの抗体名における「ｓｃ」とはｓｃＦｖの略称であり、ｓｃＳＰ３４とはＳＰ３４由来のＶＨ、ＶＬを用いたｓｃＦｖを示す。（ＬＣ）とは、図１４（Ｄ）に示すようにｓｃＦｖがＣＬ－Ｆｃからなる第２ポリペプチドに結合していることを示す。
　分子型（Ｅ）におけるＳＰ３４とは文献 (EMBO J. 1985. 4(2):337-344; J. Immunol. 1986, 137(4):1097-100; J. Exp. Med. 1991, 174:319-326; J. Immunol. 1991, 147(9):3047-52) に記載された抗ＣＤ３モノクローナル抗体であり、そのアミノ酸配列は米国特許第１０，０６６，０１５号明細書における配列番号５および配列番号１０などで公開されている。
　ＳＰ３４（Ｈ０５’）とはＳＰ３４の可変領域配列をアミノ酸改変することによってＣＤ３に対するアフィニティを低下させた抗ＣＤ３抗体の配列を示す（後述する実施例１１において作製した）。表５において、「４Ｄ５ｍｕｔ」とは、Ｔｒａｔｓｕｚｕｍａｂの重鎖可変領域のＣＤＲに２アミノ酸残基の改変を導入することで、ＨＥＲ２への結合性を完全に消失させた抗体の可変領域を示す。
（２）ＣＤ３／ＨＥＲ２およびＣＤ３／ＧＭ２バイスペシフィック抗体のがん抗原側結合価数と細胞傷害活性
　表５に示される分子型（Ｂ）のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を、実施例４に記載の方法により測定した。４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）、４Ｄ５＿ＩｇＧ１（ＤＦ）、４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）、及び４Ｄ５＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）は、それぞれ終濃度５０ｎＭとなるように添加した。比較のため、分子型（Ａ）の４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）も同様の条件で細胞傷害活性を測定した。結果を図１７（Ａ）および（Ｂ）に示す。
　図１７（Ａ）に示すように、４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）はエフェクター活性を有さず、ＨＥＲ２に結合することによってのみでは、細胞傷害活性は観察されなかった。図１７（Ｂ）に示すように、４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）および４Ｄ５＿ＩｇＧ１（ＤＦ）は、いずれも細胞傷害活性が観察され、４Ｄ５＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）は、４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）と比べて高い細胞傷害活性を有することが明らかとなった。がん抗原結合ドメインのＦａｂが２価である４Ｄ５＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）の活性は、がん抗原結合ドメインのＦａｂが１価である４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）と同程度の強さであった。
　以上より、１抗体分子がＡＤＴＣ活性およびＡＤＣＣ活性を有することによる細胞傷害活性の相乗効果は、がん抗原結合ドメインが１価だけでなく、２価の場合にも観察されることが明らかとなった。
　同様にして、分子型（Ｂ）の抗がん特異的抗原（ＴＳＡ）抗体を、抗ガングリオシドＧＭ２モノクローナル抗体とした分子の、ヒト小細胞肺がん細胞株ＳＢＣ－３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク　ＪＣＲＢ０８１８）に対する細胞傷害活性を測定した。８９６２＿ＩｇＧ１（ＤＦ）、８９６２＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）及び８９６２＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）をそれぞれ終濃度５０ｎＭとなるように添加した。結果を図１８（Ａ）および（Ｂ）に示す。
　抗ＴＳＡ抗体可変領域のネガティブコントロールとして、抗ＤＮＰ抗体の可変領域を含む抗体分子の活性を図１８（Ａ）、被験物質である抗ＧＭ２モノクローナル抗体の可変領域を含む抗体分子の活性を図１８（Ｂ）に示す。この条件においては、２価型ＡＤＣＣ抗体である８９６２＿ＩｇＧ１（ＤＦ）は細胞傷害活性が観察されなかったが、２価型でＡＤＣＣとＡＤＴＣの両活性を有する８９６２＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）は高い細胞傷害活性が観察された。
（３）ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体のα１，６フコースの有無と細胞傷害活性
　表５に示される分子型（Ｃ）のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を、実施例４に記載の方法にて測定した。４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）、４Ｄ５＿ｍｖＧ１（Ｆ）、４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）及び４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）は、それぞれ終濃度５０ｎＭとなるように添加した。
　結果を図１９（Ａ）に示す。４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）は細胞傷害活性を示さなかった（ｄａｔａ　ｎｏｔ　ｓｈｏｗｎ）。４Ｄ５＿ｍｖＧ１（Ｆ）および４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）は弱いながらも細胞傷害活性を示した。さらに４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）は前述の２つの分子よりも高い細胞傷害活性を有することが明らかとなった。α１，６フコースを有する場合においても、ＡＤＣＣ活性とＡＤＴＣ活性を１分子で発揮することにより活性の上昇を示すことが明らかとなった。
　しかしながら、図１９（Ｂ）に示すようにα１，６フコースを除去した分子との比較によれば、高ＡＤＣＣ活性抗体である４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）の方が４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）よりも細胞傷害活性が強く、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）は更に細胞傷害活性が強かった。以上の結果より、ＡＤＣＣとＡＤＴＣを１分子で発揮することで細胞傷害活性が相乗的に上昇する現象は、α１，６フコースの有無によらない一般性を有することが明らかになった。更に、α１，６フコース除去による高いＡＤＣＣ活性とＡＴＤＣ活性を１分子で発揮する方が、より高い細胞傷害活性を与えることが明らかとなった。
（４）ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の抗ＣＤ３　ｓｃＦｖの融合位置と細胞傷害活性
　表５に示される分子型（Ｄ）のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を、実施例４に記載の方法にて測定した。４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）、４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）、４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（ＬＣ）（Ｆ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＬＣ）（ＤＦ）はそれぞれ終濃度５０ｎＭとなるように添加した。結果を図２０（Ａ）に示す。
　４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（ＬＣ）（Ｆ）は４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）と同程度の細胞傷害活性を示し、それらよりも４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＬＣ）（ＤＦ）は高い細胞傷害活性を示した。また、分子型（Ａ）と分子型（Ｄ）の活性を、同様にして比較した結果を図２０（Ｂ）に示す。４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）（ＬＣ）と４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）、および４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）（ＬＣ）と４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）の組み合わせで比較したとき、どちらの組み合わせもほぼ同程度の細胞傷害活性を示した。
　すなわち、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖが第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドいずれのＣ末端に付加されていても、抗ＣＤ３バイスぺシフィック抗体のＡＤＴＣ活性、又はＡＤＴＣ活性及びＡＤＣＣ活性の相乗効果、いずれの活性増加にも影響を与えないことが明らかとなった。
　表５に示される分子型（Ｅ）のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を、実施例４に記載の方法にて測定した。４Ｄ５＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）及び４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）はそれぞれ終濃度５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭとなるように添加した。結果を図２１に示す。
　４Ｄ５＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）はいずれの濃度においても高い細胞傷害活性を示した。４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）は上記の通りＨＥＲ２に結合しないが、いずれの濃度においても非特異的な細胞傷害活性を示した。
　同様にして、４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４＿ＩｇＧ１（ＤＦ）および４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）＿ＩｇＧ１（ＤＦ）についても活性を測定し、４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）と比較した結果を図２２Ａ～図２２Ｃに示した。いずれの抗体も非特異的な細胞傷害活性を示したが、４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）＿ＩｇＧ１（ＤＦ）および４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４＿ＩｇＧ１（ＤＦ）は、４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）より高い細胞傷害活性を示した。
　これらの抗体のＣＤ３に対する結合性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によって測定した。具体的には、ＣＭ５センサーチップ上にアミンカップリングキット（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用してａｎｔｉ－ｔｅｔｒａ　Ｈｉｓマウス抗体（ＱＩＡＧＥＮ社）を８０００　ＲＵを目安に固相化した。カップリングバッファーには、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を使用した。リガンドとして、ＨＢＳ－ＥＰ（＋）バッファーに５μｇ／ｍＬとなるように溶解したＨｉｓタグ融合ヒトＣＤ３Ｄ＆Ｅタンパク質（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を５μＬ／ｍｉｎで１２０秒間キャプチャーさせた。
　次いで、アナライトとして１０μｇ／ｍＬより５回の段階希釈で２倍ずつ希釈したバイスペシフィック抗体溶液を３０μＬ／ｍｉｎ分の流速で添加し、各抗体とアナライトとの結合反応を２分間、解離反応を５分間測定した。測定はシングルサイクルカイネティクス法で行った。得られたセンサーグラムは、Ｂｉａ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて解析し、各抗体の速度論定数を算出した。
　結果を図２２Ｄ～図２２Ｇに示す。４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４＿ＩｇＧ１（ＤＦ）のＫＤ値は１．２６×１０－８Ｍ、４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）＿ＩｇＧ１（ＤＦ）のＫＤ値は１．０８×１０－７Ｍであった。４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）のＫＤ値は算出不可であったが、センサーグラム上での結合性は観察され、最高濃度添加時に６ＲＵ程度で結合解離平衡状態に達していた。４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）＿ＩｇＧ１（ＤＦ）は最高濃度添加時に１００ＲＵ程度で結合解離平衡状態に達していることから、４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）のＫＤ値はこれより大きく、ＫＤ＞１．０８×１０－７Ｍであると判断できる。
　すなわち、Ｆｃ領域または定常領域のＣ末端側ではなく、Ｎ末端側に抗ＣＤ３　ｓｃＦｖが結合することによって、ＣＤ３結合ドメインのアフィニティがＫＤ＞１．０８×１０－７Ｍの弱い抗ＣＤ３ｓｃＦｖを用いた場合でも、疾患関連抗原への特異的な結合に関係ない望ましくない非特異的傷害活性が生じることが示された。
（５）ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の抗ＣＤ３　ｓｃＦｖの価数と細胞傷害活性
　表５に示される分子型（Ｆ）のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を、実施例４に記載の方法にて測定した。細胞傷害活性の陽性対照として、４Ｄ５ｍｕｔ＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）を５０ｎＭとなるように添加した。４Ｄ５ｍｕｔ＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）、ＤＮＰ２＿ｍｖＧ１＿（ｓｃＴ３ａ）２（ＤＦ）は終濃度５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭとなるように添加した。結果をそれぞれ図２３（Ａ）および（Ｂ）に示す。
　これらの分子はすべてＨＥＲ２へ結合しないが、４Ｄ５ｍｕｔ＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ　（ＤＦ）はどの濃度においても細胞傷害活性は観察されなかった一方で、ＤＮＰ２＿ｍｖＧ１＿（ｓｃＴ３ａ）２（ＤＦ）は５０ｎＭ、５ｎＭにおいて抗体濃度依存的な細胞傷害活性が観察された。すなわち、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを２価にすることによって、非特異的な細胞傷害活性が生じることが示された。
　以上、上記（４）および（５）の結果から、ＡＤＣＣ活性とＡＤＴＣ活性を有する１分子の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体は、相乗的に高い細胞傷害活性を発揮し、かつ抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体の非特異的な細胞傷害活性を生じさせないためには、ＣＤ３結合ドメインが抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体のＦｃのＣ末端側に１価で付加することが必要であることが示された。
［実施例１０］強いアフィニティの抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを有するＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の作製および細胞傷害活性、サイトカイン産生の評価
　抗ＣＤ３　ｓｃＦｖのアフィニティの影響が、バイスペシフィック抗体の活性に与える影響について検証した。抗ＣＤ３　ｓｃＦｖとして配列番号７３で示されるアミノ酸配列（米国特許公開第２０１１／０２７５７８７号明細書に記載のクローンＩ２ＣのＶＨおよびＶＬを有するｓｃＦｖ、ＫＤ値は１×１０－８前後）を使用し、実施例６の手順と同様にして、表５に示される分子型（Ａ）の構造を持つＤＮＰ２＿ｍｖＧ１＿ｓｃＩ２Ｃ（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＩ２Ｃ（ＤＦ）を作製した。これらの分子（終濃度５０ｎＭ）のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を、実施例４に記載の方法にて測定した。結果を図２４Ａに示す。
　図２４Ａに示すように、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖとしてｓｃＴ３ａを使用した分子（実施例６で作製）に関しては、ＨＥＲ２特異的に結合しないＤＮＰ２＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）は細胞傷害活性が観察されず、ＨＥＲ２特異的に結合する４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）では観察された。一方、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖとしてクローンｓｃＩ２Ｃを使用した分子は、ＨＥＲ２特異的な結合の有無に関わらず、ＤＮＰ２＿ｍｖＧ１＿ｓｃＩ２Ｃ（ＤＦ）及び４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＩ２Ｃ（ＤＦ）の両方で高い細胞傷害活性が観察された。よって、同じ分子型であっても、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖにクローンｓｃＩ２Ｃを用いた場合には非特異的な細胞傷害活性が生じることが明らかとなった。
　次に、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）または４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＩ２Ｃ（ＤＦ）とヒトＰＢＭＣをインキュベートし、サイトカイン産生量を測定した。具体的には、ヒトＰＢＭＣ（１×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／チューブ）と抗体（終濃度１００，１０，１μｇ／ｍＬ）をＸ－ＶＩＶＯ（登録商標）　１５無血清造血細胞培地と混合し、３７℃で２４時間培養した。培養後の上清を回収し、実施例７で示した手法に準じてサイトカイン量を測定した。結果を図２４Ｂに示す。
　図２４Ｂに示すように、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）添加群では、１００μｇ／ｍＬにおいて産生量が上昇しているサイトカインも見られるものの、１０μｇ／ｍＬ，１μｇ／ｍＬではほとんど観察されなかった。一方、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＩ２Ｃ（ＤＦ）では低濃度から顕著なサイトカイン産生が観察された。以上により、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖとしてアフィニティの強いクローンＩ２Ｃを用いた場合には、非特異的な細胞傷害活性が生じ、かつ顕著なサイトカイン産生が起こることが明らかとなった。
［実施例１１］抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ部分のアフィニティが調整されたＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の作製および活性評価
（１）アミノ酸改変の設計
　実施例１０より、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ部分のアフィニティを適切に制御することが重要であることが明らかとなった。実施例９（１）で示した抗ＣＤ３モノクローナル抗体であるＳＰ３４を用いて、ＣＤＲにアミノ酸改変を導入することでそのアフィニティを適切な範囲まで低下させることを試みた。ｓｃＦｖ型として使用したｓｃＳＰ３４の塩基配列、アミノ酸配列、およびＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７４、７５、７６～８１に示す。
　ＳＰ３４のアミノ酸配列からMｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　２０１６．０８（モルシス社）を用いた立体構造モデリングにより、抗体のモデル構造を作製した。表面に存在して結合に寄与している可能性の高いアミノ酸残基を改変候補残基として選抜し、種々のアミノ酸改変ＣＤＲを設計した。図２５（Ａ）に１アミノ酸改変導入の設計を、図２５（Ｂ）に２アミノ酸残基以上の改変導入の設計をそれぞれ示す。表中のアミノ酸配列における太字のアミノ酸残基が、改変したアミノ酸残基である。また、国際特許公開第２０１９／０１７４０１号明細書の実施例１５（１）に記載の方法と同様の手順により、ＳＰ３４　のＣＤＲ改変体のヒト化抗体のアミノ酸配列を設計し、そのＶＬおよびＶＨのフレームワークのアミノ酸配列を、それぞれ図２６（Ａ）（Ｃ）および（Ｂ）（Ｄ）に示す。
（２）抗体の作製とアフィニティ測定
　（１）において設計したアミノ酸配列の一部を、実施例６に記載した方法と同様にして、実際にＨＥＲ２／ＣＤ３バイスペシフィック抗体として作製してその結合活性を調べた。発現細胞としてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を使用した。アフィニティ測定は実施例９（４）に示した方法に準じて行った。結果を図２７に示す。親クローンＳＰ３４から作製した抗ＣＤ３　ｓｃＦｖであるｓｃＳＰ３４と比較して、１アミノ酸残基以上のアミノ酸残基改変を導入することによりアフィニティをＫＤ＝１０－７のオーダーにまで低下させられることが明らかとなった。
（３）細胞傷害活性及び細胞傷害時サイトカイン産生
　（２）において見いだされたｓｃＳＰ３４　ＣＤＲ改変体ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’）およびｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）を有するＨＥＲ２／ＣＤ３バイスペシフィック抗体である、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’）（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）を、ＦＵＴ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞を使用して作製した。これらの抗体に関して、ＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性（抗体の終濃度：４００ｐＭ）および細胞傷害時のサイトカイン産生を実施例７で示した手法に準じて測定した。結果をそれぞれ図２８（Ａ）～（Ｃ）および図２９（Ａ）～（Ｄ）に示す。
　図２８（Ａ）～（Ｃ）に示すように、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）の細胞傷害活性は４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）より多少高いが、あまり差はなかった。一方、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’）（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）は、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（ＤＦ）よりは多少低いが、高い傷害活性を有することが明らかとなった。
　図２９（Ａ）～（Ｄ）に示すように、培養上清中のサイトカイン量は、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（ＤＦ）で極めて多く、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’）（ＤＦ）では顕著に少なくなっており、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）では更に低いことが明らかとなった。特にＩＬ－２およびＩＦＮ－γについては、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’）（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）添加群では今回の実験条件ではほとんど産生が認められなかった。
　以上の結果より、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖにアミノ酸残基改変を導入してアフィニティを調整することで、細胞傷害活性およびサイトカイン産生を制御できることが明らかとなった。アフィニティが調整された抗ＣＤ３　ｓｃＦｖであるｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’）のアミノ酸配列を配列番号１１７に、重鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を配列番号１１８～１２０に、軽鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を配列番号１２１～１２３に、ＶＨ、ＶＬのアミノ酸配列を配列番号１２４、１２５にそれぞれ示している。同様に、ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）のアミノ酸配列を配列番号８２に、重鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を配列番号８３～８５に、軽鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を配列番号８６～８８に、ＶＨ、ＶＬのアミノ酸配列を配列番号１１５、１１６にそれぞれ示している。
（４）非特異的サイトカイン産生
　実施例１０に記載の方法と同様にして、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（ＤＦ）、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’）（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）等の非特異的サイトカイン産生誘導能を測定した。非特異的サイトカイン産生を誘導しないネガティブコントロールとして４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）を、非特異的サイトカイン産生を誘導するポジティブコントロールとして４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＩ２Ｃ（ＤＦ）を用いた。結果を図３０に示す。
　測定した４種類のサイトカイン全てにおいて、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（ＤＦ）添加群では低濃度から顕著なサイトカイン産生が見られたが、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’）（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）ではサイトカイン産生誘導能が低下しており、またその低下度合いは抗ＣＤ３　ｓｃＦｖのアフィニティの低下と相関することが明らかとなった。
［実施例１２］ヒト抗体産生マウスからの抗ＣＤ３モノクローナル抗体の取得およびアフィニティを調整したＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の作製および活性評価
（１）動物への免疫と抗ＣＤ３モノクローナル抗体産生細胞の調製
　ヒト抗体産生マウス［Ishida & Lonberg, IBC’s 11th Antibody Engineering, Abstract 2000;Ishida, I. et al., Cloning & Stem Cells 4, 91－102 (2002)及び石田功(2002) 実験医学20,6,846－851］に、免疫原としてＫＬＨタンパク質とコンジュゲートしたヒトＣＤ３εのＮ末端側非アセチル化ペプチド：Ｈ２Ｎ－ＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣ－ＫＬＨ（配列番号１４６）（スクラム社）を、４０μｇ／匹で計６回投与した。初回免疫時のみ、アジュバントとして抗原溶液２０μＬに対して等量のＴｉｔｅｒＭａｘ　Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ　ＵＳＡ）もしくはＳｉｇｍａ　ａｄｊｕｖａｎｔ　ｓｙｓｔｅｍ（シグマアルドリッチ社）を添加した。
　最終免疫から４日後に解剖してリンパ節あるいは脾臓を外科的に摘出した。摘出したリンパ節あるいは脾臓をホモジナイズした後、セルストレイナー（ファルコン社）を通して細胞をチューブへ移し、遠心分離して細胞を沈殿させた。得られた脾臓細胞は、赤血球除去試薬（シグマアルドリッチ社）と混和し、３７℃の湯浴で１分間反応させた後、ＭＥＭ培地で希釈を行った後、更に遠心分離を行った。得られた脾細胞またはリンパ球は、ＭＥＭ培地で２回洗浄した後、細胞融合に供した。
（２）抗ＣＤ３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
　８－アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｕ１（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１，　ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１５９７，European Journal of Immunology. 6: 511, 1976）をＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ＦＢＳと抗生物質を添加した培地で培養し、細胞融合時に必要な細胞数（３×１０７ｃｅｌｌｓ以上）となるまで拡大培養した。（１）で得られたマウス脾細胞またはリンパ球と、骨髄腫細胞を２：１になるように混合し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分間）した。細胞をほぐした後、ＧｅｎｏｍＯＮＥ－ＣＦ（石原産業社製）を用いて細胞融合を行った。氷上で５分間反応させたのち、３７℃で１５分間インキュベートした。
　その後、クローニングメデュームＣＭ－Ｂ（積水メディカル社）に１０％ＦＢＳ、ＨＡＴ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）および抗生物質を添加した培地を加え、２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／１８ｍＬとなるように懸濁し、９６ウェルプレートに２００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で８～１０日間培養し、その培養上清を用いて、以下に記載するハイブリドーマのスクリーニングを行い、目的の抗原に特異的な反応性を示す抗体を産生するウェルを選択してセルソーターＳＨ８００（ソニー社）によるシングルセルソーティングを行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立した。
（３）抗ＣＤ３抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
　抗ＣＤ３抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングはフローサイトメトリーにより行った。浮遊細胞培養用フラスコにて培養された細胞を回収してＰＢＳにて２回洗浄した後、染色用バッファー（０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）に懸濁させ、生細胞数を２．０～５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬとなるように調製した。ヒトＣＤ３発現細胞としてヒトＴリンパ腫細胞株ＨｕＴ－７８細胞（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ－１６１）を、サルＣＤ３発現細胞としてＨＳＣ－Ｆ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク　ＪＣＲＢ１１６４）を用い、それぞれＣＦＳＥ（シグマアルドリッチ社、終濃度０．２　μＭ）、ＶＰＤ４５０（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、終濃度１μＭ）で染色した。陰性対照細胞としては無染色のＫＨＹＧ－１細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク　ＪＣＲＢ１５６）を用いた。
　これら３種の細胞を等量ずつ混合し、５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに分注して氷上で３０分間インキュベートした後、等量のハイブリドーマ上清原液を添加して混和し４℃で３０分間反応させた。細胞の遠心分離と染色用バッファーによる洗浄を１～２回行った後、染色用バッファーを用いて２μｇ／ｍＬに調製したＡｌｅｘａ　６４７　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を５０μＬ添加し、遮光下にて４℃で３０分間反応させた。細胞の遠心分離と染色用バッファーによる洗浄を２回行った後、染色用バッファーに懸濁してフローサイトメーター　ＣｙＡｎ　ＡＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社）により蛍光強度の測定を行った。
　以上の（１）～（３）の手順により、ヒトＣＤ３およびカニクイザルＣＤ３を特異的に認識するハイブリドーマクローンであるＫＭ１４を樹立した。
（４）ハイブリドーマＫＭ１４の抗体遺伝子クローニング
　ハイブリドーマＫＭ１４からＱＩＡＧＥＮ　Ｒｎｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’Ｋｉｔ（タカラバイオ社）用いて５’ＲＡＣＥ法による１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを合成した。キットに添付のユニバーサルプライマーと、配列番号８９、９０で示されるプライマーを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（タカラバイオ社）　によるＰＣＲを行い、軽鎖および重鎖可変領域の塩基配列をもつ遺伝子断片を増幅した。得られたＰＣＲ断片について、軽鎖は次世代シーケンサーＩｏｎ　ＰＧＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、重鎖はサンガーシーケンサー３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて配列を決定し、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＫＭ１４の抗体遺伝子の塩基配列を取得した。
　抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＫＭ１４の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、それぞれ配列番号９１および９２に記載する。また、それらの塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９３および９４に、軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９５～９７、９８～１００に記載する。また、ｓｃＦｖとしたｓｃＫＭ１４の塩基配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０１および１０２に示す。
（５）抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＫＭ１４を基にしたアミノ酸残基改変の設計
　抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＫＭ１４の可変領域を用いて作製したｓｃＫＭ１４は、ＣＤ３に対するアフィニティが、これまでの実施例で使用した抗ＣＤ３ｓｃＦｖであるｓｃＴ３ａやｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）と比較して強く、ＡＤＣＣ活性と組み合わせることで非特異的な細胞傷害活性が発現する可能性が考えられた。そのため、実施例１１（１）に記載した方法に準じて、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＫＭ１４のＣＤＲのアミノ酸残基改変を設計した。その設計の一部を図３１に示す。表中のアミノ酸配列の太字のアミノ酸残基が、改変したアミノ酸残基を表す。
（６）バイスペシフィック抗体の作製とアフィニティ測定
　（５）において設計したアミノ酸配列を、実施例６に記載した方法と同様にして、実際にバイスペシフィック抗体として作製してその結合活性を調べた。発現系として、Ｅｘｐｉ２９３（商標）　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を使用した。本細胞を用いて発現させると抗体分子はα１，６フコースが付加されているが、ＣＤ３へのアフィニティの測定、およびＡＤＴＣ活性を主とした細胞傷害活性、細胞傷害時のサイトカイン産生の測定を行うことは可能である。
　アフィニティ測定は実施例９（４）に示した方法に準じた。結果を図３２に示す。親抗体クローンＫＭ１４から作製した抗ＣＤ３　ｓｃＦｖであるｓｃＫＭ１４と比較して、１アミノ酸残基以上のアミノ酸残基改変を導入することによりアフィニティをＫＤ＝１０－７のオーダーまで低くできることが明らかとなった。
（７）細胞傷害活性及び細胞傷害時サイトカイン産生
　実施例３および実施例７に記載した方法と同様にして、作製した抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性および細胞傷害時のサイトカイン産生量を測定した。被験物質の終濃度は細胞傷害活性測定では４００ｐＭ、サイトカイン産生量測定では１０ｎＭとした。細胞傷害活性においては、４Ｄ５＿ｍｖＧ１（Ｆ）より強く４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）以下であるものを＋、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）より強く４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（Ｆ）以下であるものを＋＋、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（Ｆ）より強く４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（Ｆ）以下であるものを＋＋＋と分類した結果の概要を（６）で示した図３２に記載した。
　ｍｕｔ１－０３、ｍｕｔ１－０４、ｍｕｔ１－１８、ｍｕｔ１－２２、ｍｕｔ１－２５、およびｍｕｔ１－２６の６種類の改変体に関しては、ｓｃＦｖのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０３～１０８に記載し、細胞傷害活性およびサイトカイン産生量の詳細な結果をそれぞれ図３３（Ａ）および（Ｂ）並びに図３４（Ａ）および（Ｂ）に示す。図３３（Ａ）より、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２５）（Ｆ）の細胞傷害活性は、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）よりも少し低いことが明らかになった。
　また、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０３）（Ｆ）、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０４）（Ｆ）、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８）（Ｆ）、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２２）（Ｆ）の細胞傷害活性は、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）よりも強く、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（Ｆ）よりも低いことが明らかになった。また図３３（Ｂ）より、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２６）（Ｆ）の活性は４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（Ｆ）と同等であった。図中では、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（Ｆ）は最も活性が高いことが明らかになった。
　親抗体である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＫＭ１４および、ｍｕｔ１－０３、ｍｕｔ１－０４、ｍｕｔ１－１８、ｍｕｔ１－２２、ｍｕｔ１－２５、およびｍｕｔ１－２６の６種類の改変体に関しては、ＶＨ、ＶＬ、およびＣＤＲのアミノ酸配列を表６に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　図３４（Ａ）および（Ｂ）より、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（Ｆ）は細胞傷害時に高いサイトカイン産生を示すことが分かった。アフィニティを調整したＫＭ１４改変体を用いたバイスペシフィック抗体では、もとのＫＭ１４を用いたものよりもサイトカイン産生が減少していた。各バイスペシフィック抗体を添加した時のＩＦＮ－γおよびＩＬ－６の産生量は、図３３（Ａ）および（Ｂ）に示される細胞傷害活性の強さと相関関係にあった。
　次に、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（ＤＦ）、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－ＸＸ）（ＤＦ）（ＸＸ：０３、０４、１８、２２、２５、２６）、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）および４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）について、実施例３に記載した方法と同様にして、作製した抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性を測定した。被験物質の終濃度は５０、５、０．５ｎＭとし、被験物質を添加しないウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を活性０％、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加したウェルのＣｅｌｌ　ｉｎｄｅｘ値を活性１００％として、被験物質添加後４８時間および１２０時間における細胞傷害活性を計算した。被験物質添加後４８時間の結果を図３５（Ａ）に、および被験物質添加後１２０時間の結果を図３５（Ｂ）に示す。
　図３５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、どちらの時間においても、抗体濃度依存的な細胞傷害活性の強度は図３３（Ａ）および（Ｂ）に示された改変クローン間の順と相関していた。
（８）９６ウェルプレートを使用した系での細胞傷害活性測定等
　作製したバイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性および細胞傷害時のサイトカイン産生量を、多数の被験抗体に関して測定するために、９６ウェルプレートを使用する実験系を構築して使用した。
　まずＢＴ－２０細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％　ＦＢＳ、１０μｇ／ｍＬ　Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）で２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製して９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルずつ加えた。次に、ＲＰＭＩ培地で４ｍｇ／ｍＬに調製したヒト免疫グロブリン（日本血液製剤機構）、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で調製した健常人末梢血由来ＰＢＭＣを、上記プレートに５０μＬ／ウェルずつ加えた。最後に終濃度の４倍に調製した各種バイスペシフィック抗体を５０μＬ／ウェルずつ加えて３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間インキュベートした。
　細胞傷害活性の測定には、生細胞を検出する細胞増殖/細胞毒性アッセイキットＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ―８（同仁化学研究所）を使用した。反応後の９６ウェルプレートから培養上清を除き、ＰＢＳで２回洗浄した後に、発色試薬を添加して呈色反応を行い、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　細胞のみを播種して被験物質を添加しないウェルの吸光度を活性０％、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加して細胞を溶解させたウェルの吸光度を活性１００％として、細胞傷害活性の値を計算した。サイトカイン産生量の測定は、４８時間インキュベーション後の培養上清を用いて、実施例７に記載した方法と同様に実施した。
　４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－ＸＸ）（ＤＦ）（ＸＸ：０３、０４、１８、２２、２５、２６）、および実施例７において作製した抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体であるＣＤ３／ＨＥＲ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖについて、上記の方法によりＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性およびサイトカイン産生量を測定した。細胞傷害活性の結果を図４１（Ａ）に、サイトカイン産生量の結果を図４１（Ｂ）および（Ｃ）に示す。
　図４１（Ａ）に示すように、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－ＸＸ）（ＤＦ）（ＸＸ：０３、０４、１８、２２、２５、または２６）に関して、各バイスペシフィック抗体を添加した時の抗体濃度依存的な細胞傷害活性は、図３５（Ａ）および（Ｂ）に示された改変クローン間の活性順と相関した。
　また、図４１（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、これらのバイスペシフィック抗体のＩＦＮ－γおよびＩＬ－６の産生量は、ＣＤ３／ＨＥＲ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖと比較して非常に少なかった。これらのバイスペシフィック抗体のサイトカイン産生量は、図３５（Ａ）および（Ｂ）、図４１（Ａ）に示される細胞傷害活性の強さ、図３４（Ａ）および（Ｂ）に示されるサイトカイン産生量と相関していた。フコース除去型のバイスペシフィック抗体においても、サイトカイン産生量はフコース付加型の場合と同様に低い値を示すことが分かった。
　以上（６）～（８）より、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＫＭ１４のＣＤＲにアミノ酸残基改変を導入することによってＣＤ３に対するアフィニティを適当な範囲に調整することで、細胞傷害時のサイトカイン産生を低く抑えつつ、高い細胞傷害活性を発揮できることが明らかとなった。
［実施例１３］種々の血液がん抗原に対するＣＤ３／がん抗原バイスペシフィック抗体の作製および活性評価
（１）ＣＤ３／ＣＣＲ４バイスペシフィック抗体およびＣＤ３／ＣＤ１２３バイスペシフィック抗体の作製
　血液がん抗原に対する抗体の可変領域を有するバイスペシフィック抗体を作製し、血液がん由来細胞株に対する細胞傷害活性を調べた。表７に示すバイスペシフィック抗体を、実施例６に記載した方法に準じて作製した。
　ＣＣ－ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４（ＣＣＲ４）に結合するモノクローナル抗体として抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体ＫＭ２１６０のＶＬ及びＶＨのアミノ酸配列を用いてＣＤ３／ＣＣＲ４バイスペシフィック抗体を作製した。
　ＣＤ１２３に関しては、汎用的な抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体と比較検証することを目的とし、国際特許公開第２０１７／２１０４４３号の配列番号１～３のアミノ酸配列をもとに、比較対照としてＣＤ３／ＣＤ１２３バイスペシフィック抗体ＸＥＮＰ１４０４５を作製した。
　ＸＥＮＰ１４０４５は、アミノ酸改変によりＦｃ受容体への結合活性を欠損したＦｃ（サイレントＦｃ）を有するＣＤ３／ＣＤ１２３バイスペシフィック抗体であり、ＡＤＴＣ活性のみによってがん細胞を傷害する。ＸＥＮＰ１４０４５の抗ＣＤ１２３抗体部分のＶＬおよびＶＨのアミノ酸配列を配列番号１０９および１１０に示す。これらの配列を用いて、ＸＥＮＰ１４０４５の抗ＣＤ１２３抗体部分のＶＨ、ＶＬを有するバイスペシフィック抗体であるＣＤ１２３－２＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（２）ＣＤ３／ＣＣＲ４バイスペシフィック抗体の細胞傷害活性およびサイトカイン産生の評価
　作製したＣＤ３／ＣＣＲ４バイスペシフィック抗体の細胞傷害活性を、ＣＣＲ４陽性Ｔ細胞リンパ腫由来細胞株であるＰＥＥＲ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク　ＪＣＲＢ０８３０）を用いてフローサイトメトリーによって測定した。ＰＥＥＲ細胞をＣｅｌｌＶｕｅ（登録商標）　Ｃｌａｒｅｔ　Ｆａｒ　Ｒｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｋｅｒ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社）で事前に蛍光ラベルし、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈して９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルずつ加えた。次に、ＲＰＭＩ培地で４ｍｇ／ｍＬに調製したヒト免疫グロブリン（日本血液製剤機構）、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で調製した健常人末梢血由来ＰＢＭＣを、上記プレートに５０μＬ／ウェルずつ加えた。
　最後に終濃度の４倍濃度に調製した各種バイスペシフィック抗体を５０μＬ／ウェルずつ加えて３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて保温した。抗体添加から４８時間後に、当該プレートを遠心して培養上清を除去し、染色用バッファー（実施例１２で使用したものと同一）で１／１０００に希釈したＳＹＴＯＸ（登録商標）死細胞染色試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１００μＬ／ウェルで添加して室温で５～１０分間静置した。細胞を染色用バッファーで２回洗浄した後、フローサイトメーターＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によりＡＰＣとＢＶ４２１のチャネルの蛍光強度を測定した。
　ＦＳＣ、ＳＳＣによりＰＥＥＲ細胞画分を選択し、ＡＰＣ（＋）、ＢＶ４２１（－）の画分を生細胞としてカウントし、被験物質無添加の生細胞数を基準として各バイスペシフィック抗体添加による生細胞数の減少の割合を細胞傷害活性（％）として算出した。また同時点で培養上清を回収し、実施例７に記載した方法に準じてサイトカイン濃度を測定した。細胞傷害活性の測定結果を図３６（Ａ）～（Ｃ）に示す。
　図３６（Ａ）～（Ｃ）に示すように、エフェクター活性を有さないＫＭ２１６０＿ｍｖＧ４（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）、およびＡＤＣＣ、ＡＤＴＣ活性を有するがＰＥＥＲ細胞株に結合しない抗ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体である４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）では細胞傷害活性は観察されなかった。ＡＤＣＣ活性のみを有するＫＭ２１６０＿ｍｖＧ１（ＤＦ）、ＡＤＴＣ活性のみを有するＫＭ２１６０＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＸＸ（Ｆ）［ＸＸ：Ｔ３ａ、ＳＰ３４（Ｈ０５’）、ＫＭ１４（ｍｕｔ１－０４）、ＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８）］では細胞傷害活性が観察され、ＫＭ２１６０＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＸＸ（Ｆ）よりもＫＭ２１６０＿ｍｖＧ１（ＤＦ）の方が活性は高い傾向にあった。
　更に、ＡＤＣＣ活性およびＡＤＴＣ活性を有するＫＭ２１６０＿ｍｖＧ１＿ｓｃＸＸ（ＤＦ）（ＸＸ：Ｔ３ａ、ＳＰ３４（Ｈ０５’）、ＫＭ１４（ｍｕｔ１－０４）、ＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８））は上記の抗体を大きく上回る細胞傷害活性を示した。強いＡＤＣＣ活性を有し、２価で結合するＩｇＧ１型抗体であるＫＭ２１６０＿ＩｇＧ１（ＤＦ）と比較しても、ＫＭ２１６０＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）の方が高い細胞傷害活性を示した。
　サイトカイン（ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ）産生量の測定結果を図３７（Ａ）および（Ｂ）に示す。図３７（Ａ）に示すように、上記で高い細胞傷害活性を示したＫＭ２１６０＿ｍｖＧ１＿ｓｃＸＸ（ＤＦ）（ＸＸ：Ｔ３ａ、ＳＰ３４（Ｈ０５’）、ＫＭ１４（ｍｕｔ１－０４）、ＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８））は、ＩＬ－２産生量の増加はほとんど観察されなかった。図３７（Ｂ）に示すように、ＩＦＮ－γ産生量に関しては、最高濃度である５０ｎＭにおいてのみ、ＫＭ２１６０＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）、ＫＭ２１６０＿ｍｖＧ１＿ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８）（ＤＦ）で増加がみられた。
　以上より、ＣＤ３／ＣＣＲ４バイスペシフィック抗体においても、ＡＤＣＣ活性とＡＤＣＣ活性の両方を１分子で併せ持つことによって、顕著なサイトカイン産生の増加を伴わずに高い細胞傷害活性を発揮できることが明らかとなった。
（３）ＣＤ３／ＣＤ１２３バイスペシフィック抗体の細胞傷害活性およびサイトカイン産生の評価
　作製したＣＤ３／ＣＤ１２３バイスペシフィック抗体の細胞傷害活性およびサイトカイン産生を、ＣＤ１２３陽性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）由来細胞株であるＭＯＬＭ１３細胞（ＤＳＭＺ　ＡＣＣ　５５４）およびＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞（ＤＡＭＺ　ＡＣＣ　５８２）を用いて、実施例１３（２）に記載した方法に準じてフローサイトメトリーによって測定した。可変領域としてＣＤ１２３－１を有する分子のＭＯＬＭ１３細胞に対する細胞傷害活性の測定結果を図３８（Ａ）に、サイトカイン産生を図３８（Ｂ）に示す。
　図３８（Ａ）に示すように、陰性対照として使用した４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）では細胞傷害活性は観察されなかった。ＡＤＣＣ活性を有するＣＤ１２３－１＿ｍｖＧ１（ＤＦ）、ＣＤ１２３－１＿ｈＩｇＧ１（ＤＦ）、ＡＤＴＣ活性を有するＣＤ１２３－１＿ｍｖＧ４（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）の順に細胞傷害活性は高くなり、更にＡＤＣＣ活性とＡＤＴＣ活性の両方を有するＣＤ１２３－１＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）分子が最も細胞傷害活性が高くなった。また、図３８（Ｂ）に示すように、この時のサイトカイン産生に関して、各分子間で顕著な差は観察されなかった。
　可変領域としてＣＤ１２３－２を有するＣＤ１２３－２＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）、および比較対照である自社作製ＸＥＮＰ１４０４５のＭＯＬＭ１３、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞に対する細胞傷害活性の測定結果をそれぞれ図３９（Ａ）および（Ｂ）に、対応するサイトカイン産生をそれぞれ図４０（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、および（Ｄ）に示す。
　図３９（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＸＥＮＰ１４０４５はＣＤ１２３－２＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）と比較して、どちらの細胞株においても１／１０程度低い濃度から細胞傷害活性を示した。両方の分子で、細胞傷害活性の最大値は８０％以上を示した。陰性対照として使用した４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）では細胞傷害活性は観察されなかった。
　図４０（Ａ）～（Ｄ）に示すように、ＸＥＮＰ１４０４５はどちらの細胞株においても抗体濃度依存的にサイトカイン産生の上昇が観察された。一方ＣＤ１２３－２＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）は、抗体濃度が上昇してもＩＬ－２産生量はほとんど変化せずに低いままであり、ＩＦＮ－γ産生量もＸＥＮＰ１４０４５と比較して非常に低く、抗体濃度依存的に大幅な増加はなかった。
　以上より、ＣＤ３／ＣＤ１２３バイスペシフィック抗体においても、ＡＤＴＣ活性とＡＤＣＣ活性の両方を１分子で併せ持つことによって、顕著なサイトカイン産生を伴わずに高い細胞傷害活性を発揮できることが明らかとなった。従って、本発明の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体は、ＣＤ３へのアフィニティが強くＡＤＴＣ活性の作用機序のみを有する抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体と比べて、顕著なサイトカイン産生を伴わず、かつ同等の細胞傷害活性を発揮できることが明らかとなった。
［実施例１４］ＣＨ３領域および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ領域を改変した抗ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の設計
　バイスペシフィック抗体の生産において、そのＣＨ３領域にＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓ（ＫＩＨ）改変を導入することにより目的分子の割合が増加することが知られている。実施例８および９ではがん抗原側のＦａｂが２価である抗ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体にＫＩＨ改変を導入したが、本実施例ではがん抗原側のＦａｂが1価である抗ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体にＫＩＨ改変を導入した。
　がん抗原側のＦａｂが1価である抗ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体には、ポリペプチド１(ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｓｃＦｖ)とポリペプチド２(ＶＬ－ＣＬ－Ｆｃ)が存在するため、どちらのポリペプチド側にＫｎｏｂｓ型またはＨｏｌｅｓ型アミノ酸改変を導入することもできる。また、実施例８および９で導入したＫＩＨ改変では２つのＣＨ３部分に分子間ジスルフィド結合が導入されているが、このジスルフィド結合を有さないＫＩＨ改変も本発明のＣＤ３バイスペシフィック抗体に適用できる。ジスルフィド結合を有さないＫＩＨ改変では、２本のＦｃポリペプチド鎖のうち一方にＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗのアミノ酸残基置換を加え、もう一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖのアミノ酸残基置換を加える。
　また、ｓｃＦｖに理化学的な安定性を高めるための改変を加えた抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体を作製した。具体的には、Nat. Biotechnol. 14, 1239-45, 1996に記載の方法を参考に、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの相互作用面のアミノ酸を改変してジスルフィド結合を導入した。具体的には、ｓｃＦｖのＶＨの４４番目（Ｋａｂａｔナンバリングによる）のアミノ酸をＣｙｓに、ＶＬの１００番目（Ｋａｂａｔナンバリングによる）のアミノ酸をＣｙｓにそれぞれ置換した。この改変を（ＣＣ）またはＣＣ改変と記載する。他にも、ＶＨの４４番目のアミノ酸をＳｅｒに、ＶＬの１００番目のアミノ酸をＧｌｕにそれぞれ置換したｓｃＦｖを作製した。この改変を（ＳＥ）またはＳＥ改変と記載する。
　がん抗原側のＦａｂが１価の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体において、ＣＨ３領域および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに導入するアミノ酸改変の設計例および構造上の位置を図４２に示す。図４２に示す改変はがん抗原側のＦａｂが２価の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体にも適用できる。
　実施例１～１３では、顕著なサイトカイン産生を伴わず細胞傷害活性を増強できる抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの具体的な配列を複数示し、更にそれらのｓｃＦｖを有する抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体の例を示した。前述のＣＨ３領域および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ領域に導入するアミノ酸改変に関しては、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖの配列に依存せず導入することが可能である。
　さらにｓｃＦｖは、Ｎ末端側からＶＨ、リンカー、ＶＬの順で結合したもの（ＶＨ－リンカー－ＶＬ型、ＨＬ型とも記載する）だけでなく、ＶＬ、リンカー、ＶＨの順で結合したもの（ＶＬ－リンカー－ＶＨ型、ＬＨ型とも記載する）も知られている。
　よって、本発明における抗ＣＤ３　ｓｃＦｖも、実施例１～１３で作製したＶＨ－リンカー－ＶＬ型に限定されることなく、ＶＬ－リンカー－ＶＨ型でも設計することができ、両者とも図４２に示したアミノ酸改変を導入することが可能である。
　以上より、本発明の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体に導入した改変に関して、ＣＨ３部分の改変、ｓｃＦｖクローン名、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの順序、およびｓｃＦｖに導入するアミノ酸改変を表にした（図４３）。ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）に関しては、図２６に示したＦＲ配列を使用したアミノ酸配列も同様に使用することができる。例として、配列番号１５９で表されるＶＨ（ＨＶ３）、配列番号１６０で表されるＶＨ（ＨＶ５）、および、配列番号１６５で表されるＶＬ（ＬＶ８ａ）などが挙げられる。なお、がん抗原側が２価の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体にも図４３の改変を適用できる。
［実施例１５］ＣＨ３領域および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ領域を改変した抗ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の作製、細胞傷害活性およびサイトカイン産生の評価
（１）バイスペシフィック抗体の作製
　実施例１４で設計したＫＩＨ改変を導入した４組のＦｃ領域（ＫＩＨ－１～ＫＩＨ－４）のアミノ酸配列を配列番号１４７～１５４に示す。また、これらの４種類のＫＩＨ改変および／またはｓｃＦｖのＣＣ改変もしくはＳＥ改変を有するｓｃＦｖを有する各種バイスペシフィック抗体を、実施例６に記載した方法に準じた方法により作製した。作製した各種バイスペシフィック抗体およびその構成要素のアミノ酸配列の配列番号を表８および表９に示した。表８のバイスペシフィック抗体のｓｃＦｖであるｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）のアミノ酸配列は、配列番号８２で示される。
　ＣＣ改変またはＳＥ改変を導入したｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの具体的なアミノ酸配列を、配列番号１５５～１９１に示す。これらのＶＨおよびＶＬから構成される抗ＣＤ３　ｓｃＦｖの具体的なアミノ酸配列の具体例を、ＶＨ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ型の配列を配列番号１９２～２０５に、ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型の配列を配列番号２０６～２１７に示す（ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型の配列は、ＣＣ改変またはＳＥ改変を導入していない配列に関しても示した）。
　また、これらのｓｃＦｖ配列を使用し、実施例６に記載した方法に準じて作製した抗ＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体の具体例およびその抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ配列を表９に示した。バイスペシフィック抗体の名称に、バイスペシフィック抗体の各構成要素（導入したＫＩＨ改変の種類、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖクローン名、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの順序、およびｓｃＦｖに導入した改変）を順に表記する。
　具体的には、例えば４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＫＩＨ－１）＿ｓｃＸＸ（ＹＹ）（ＺＺ）（ＤＦ）はＦａｂのクローンが４Ｄ５であることを示し、ｍｖＧ１はがん抗原側が1価でありＦｃ領域がＩｇＧ１ベースであることを示し、ＫＩＨ－１はＦｃ（ＣＨ３）部分の改変パターンがＫＩＨ－１型であることを示し、ｓｃＸＸは抗ＣＤ３　ｓｃＦｖのクローンがＸＸであることを示し、（ＹＹ）の部分に（ＬＨ）と記載したものはＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型を示し（この部分の記載がないものはＶＨ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ型）、（ＺＺ）の部分に（ＣＣ）と記載したものはｓｃＦｖにＣＣ改変したことを示し、（ＺＺ）の部分に（ＳＥ）と記載したものはｓｃＦｖにＳＥ改変したことを示し、（ＤＦ）はフコースを有さないことを示している。
　表１０には各種ＣＤ３　ｓｃＦｖに含まれるＶＨ、ＶＬ、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号で示した。なお、ｓｃＦｖがＨＬ型であってもＬＨ型であっても表１０はあてはまる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（２）作製したバイスペシフィック抗体のＣＤ３に対するアフィニティ測定
　作製したバイスペシフィック抗体のＣＤ３に対するアフィニティを、実施例９（４）の方法に準じて測定した。結果を図４４に示す。Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入した分子、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にした分子および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入した分子においても、可溶型ＣＤ３へ結合活性が保持されていることが分かった。また、そのアフィニティは、実施例１１－（２）および実施例１２－（６）で示したバイスペシフィック抗体と同様に、ほとんどのＫＤ値が１０－７のオーダーであり、すべてのＫＤ値が８×１０－８以上であった。
（３）細胞傷害活性及び細胞傷害時サイトカイン産生
　作製したバイスペシフィック抗体のＢＴ－２０細胞に対する細胞傷害活性および細胞傷害時のサイトカイン産生量を、実施例１２－（８）に記載した方法に準じて測定した。ＢＴ－２０細胞の播種時の細胞密度は５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。細胞傷害活性およびサイトカイン産生量の結果をそれぞれ図４５Ａ～Ｄおよび図４６Ａ～Ｆに示す。
　図４５Ａより、４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＤＦ）のＦｃ（ＣＨ３）にＫＩＨ－１からＫＩＨ－４の４通りのＫＩＨ改変を導入したバイスペシフィック抗体は、改変前と同等の細胞傷害活性を示した。よって、ＫＩＨ改変の有無、およびそのパターンは、本発明におけるバイスペシフィック抗体の活性に影響を及ぼさないことが明らかとなった。
　図４５Ｂ～Ｄより、ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にしたバイスペシフィック抗体、ｓｃＦｖにＣＣ改変またはＳＥ改変を導入したバイスペシフィック抗体においても、ｓｃＦｖを有さない４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）よりも高い細胞傷害活性を有しており、ＣＤ３　ｓｃＦｖの機能が保持されていた。ｓｃＭ１４（ｍｕｔ１－２５）のみ、ＬＨ型にすることにより活性が低下していた。それらの活性は、改変前の抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを有するバイスペシフィック抗体の活性（実施例１１および実施例１２）と同程度のものが複数得られていた。ｓｃＦｖがＳＰ３４（Ｈ０５’）の場合、ＣＣ改変を入れると細胞傷害活性が低下する傾向が見られた。
　また、図４５Ｂより、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖとしてｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）を有するバイスペシフィック抗体は、ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＳＥ）、ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’＿ＨＶ３ＬＶ８ａ）、またはｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’＿ＨＶ５ＬＶ８ａ）を有するバイスペシフィック抗体と同程度の細胞傷害活性を示すことが分かった。ｓｃＦｖとしてｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）（ＣＣ）を有するバイスペシフィック抗体は、ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’＿ＨＶ３ＬＶ８ａ）（ＣＣ）、またはｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’＿ＨＶ５ＬＶ８ａ）（ＣＣ）を有するバイスペシフィック抗体と同程度の細胞傷害活性を示すことが分かった。これらのバイスペシフィック抗体は、（ＬＨ）においても同等の細胞傷害活性を示したことから、バイスペシフィック抗体の活性はｓｃＦｖがＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ型であるか、ＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型であるかに影響されないことが分かった。
　図４６Ａ～Ｆより、Ｆｃ（ＣＨ３）に改変を導入したバイスペシフィック抗体、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖをＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型にしたバイスペシフィック抗体および抗ＣＤ３　ｓｃＦｖに改変を導入したバイスペシフィック抗体において、細胞傷害時のサイトカイン産生量は、強いアフィニティの抗ＣＤ３　ｓｃＦｖを有するＣＤ３／ＨＥＲ２バイスペシフィック抗体（ＣＤ３／ＨＥＲ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ）と比較して低く抑えられることが分かった。また、図４５Ｂ～Ｄに示した各バイスペシフィック抗体の細胞傷害活性の序列と、対応する図４６のサイトカイン産生量の序列は同じようになっていた。
　以上より、本発明の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体は、Ｆｃ（ＣＨ３）へのＫＩＨ改変導入にかかわらず、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖがＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ型とＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ型のどちらであっても、また、抗ＣＤ３　ｓｃＦｖにＣＣ改変またはＳＥ改変を導入しても、ＣＤ３へのアフィニティが適切な範囲である場合には、ＡＤＴＣ活性とＡＤＣＣ活性の両方を１分子で併せ持つことによって、顕著なサイトカイン産生を伴わずに高い細胞傷害活性を発揮できることが明らかとなった。
　本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。本出願は、２０２０年２月１４日付けで出願された日本特許出願（特願２０２０－０２３８５５）に基づいており、その全体が引用により援用される。
配列番号１：ＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体　第１ポリペプチドのＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ部分の塩基配列
配列番号２：ＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体　第１ポリペプチドのＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ部分のアミノ酸配列
配列番号３：ＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体　第２ポリペプチドのＣＬ－Ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ部分の塩基配列
配列番号４：ＩｇＧ１型抗ＨＥＲ２一価抗体　第２ポリペプチドのＣＬ－Ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ部分のアミノ酸配列
配列番号５：ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型抗ＨＥＲ２一価抗体　第１ポリペプチドのＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ部分の塩基配列
配列番号６：ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型抗ＨＥＲ２一価抗体　第１ポリペプチドのＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ部分のアミノ酸配列
配列番号７：ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型抗ＨＥＲ２一価抗体　第２ポリペプチドのＣＬ－Ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ部分の塩基配列
配列番号８：ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）型抗ＨＥＲ２一価抗体　第２ポリペプチドのＣＬ－Ｈｉｎｇｅ－Ｆｃ部分のアミノ酸配列
配列番号９：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＴ３ａ）のアミノ酸配列
配列番号１０：ＤＮＰ２＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号１１：ＤＮＰ２＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号１２：ＤＮＰ２＿ｍｖＧ１（ＤＦ）　ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号１３：ＤＮＰ２＿ｍｖＧ１（ＤＦ）　ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号１４：ＤＮＰ２＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号１５：ＤＮＰ２＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号１６：ＤＮＰ２＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号１７：ＤＮＰ２＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号１８：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号１９：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号２０：４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号２１：４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号２２：４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号２３：４Ｄ５＿ｍｖＧ１（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号２４：４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号２５：４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号２６：４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号２７：４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号２８：４Ｄ５＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号２９：４Ｄ５＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号３０：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号３１：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号３２：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号３３：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号３４：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）ポリペプチド３のアミノ酸配列
配列番号３５：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号３６：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号３７：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号３８：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号３９：ＤＮＰ２＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド３のアミノ酸配列
配列番号４０：４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号４１：４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）（Ｆ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号４２：４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号４３：４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号４４：４Ｄ５＿ＩｇＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（Ｆ）ポリペプチド３のアミノ酸配列
配列番号４５：４Ｄ５＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号４６：４Ｄ５＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号４７：４Ｄ５＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド３のアミノ酸配列
配列番号４８：８９６２＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号４９：８９６２＿ＩｇＧ１（ＤＦ）　ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号５０：８９６２＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）　ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号５１：８９６２＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）　ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号５２：８９６２＿ＩｇＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）　ポリペプチド３のアミノ酸配列
配列番号５３：４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（ＬＣ）（Ｆ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号５４：４Ｄ５＿ｍｖＧ４ＰＥ（Ｒ４０９Ｋ）＿ｓｃＴ３ａ（ＬＣ）（Ｆ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号５５：４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＬＣ）（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号５６：４Ｄ５＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＬＣ）（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号５７：４Ｄ５＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号５８：４Ｄ５＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号５９：４Ｄ５＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド３のアミノ酸配列
配列番号６０：４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号６１：４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号６２：４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＴ３ａ＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド３のアミノ酸配列
配列番号６３：４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号６４：４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号６５：４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’）＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド３のアミノ酸配列
配列番号６６：４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号６７：４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号６８：４Ｄ５ｍｕｔ＿ｓｃＳＰ３４＿ＩｇＧ１（ＤＦ）ポリペプチド３のアミノ酸配列
配列番号６９：４Ｄ５ｍｕｔ＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号７０：４Ｄ５ｍｕｔ＿ｍｖＧ１＿ｓｃＴ３ａ（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号７１：ＤＮＰ２＿ｍｖＧ１＿（ｓｃＴ３ａ）２（ＤＦ）ポリペプチド１のアミノ酸配列
配列番号７２：ＤＮＰ２＿ｍｖＧ１＿（ｓｃＴ３ａ）２（ＤＦ）ポリペプチド２のアミノ酸配列
配列番号７３：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＩ２Ｃ）のアミノ酸配列
配列番号７４：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４）の塩基配列
配列番号７５：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４）のアミノ酸配列
配列番号７６：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４）ＣＤＲ　Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号７７：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４）ＣＤＲ　Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号７８：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４）ＣＤＲ　Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号７９：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４）ＣＤＲ　Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号８０：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４）ＣＤＲ　Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号８１：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４）ＣＤＲ　Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号８２：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’））のアミノ酸配列
配列番号８３：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’））ＣＤＲ　Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号８４：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’））ＣＤＲ　Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号８５：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’））ＣＤＲ　Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号８６：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’））ＣＤＲ　Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号８７：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’））ＣＤＲ　Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号８８：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５’））ＣＤＲ　Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号８９：抗体遺伝子クローニング用プライマー（ＶＬ）の塩基解列
配列番号９０：抗体遺伝子クローニング用プライマー（ＶＨ）の塩基解列
配列番号９１：抗ＣＤ３抗体ＫＭ１４　ＶＬの塩基配列
配列番号９２：抗ＣＤ３抗体ＫＭ１４　ＶＨの塩基配列
配列番号９３：抗ＣＤ３抗体ＫＭ１４　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号９４：抗ＣＤ３抗体ＫＭ１４　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号９５：抗ＣＤ３抗体ＫＭ１４　ＣＤＲ　Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号９６：抗ＣＤ３抗体ＫＭ１４　ＣＤＲ　Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号９７：抗ＣＤ３抗体ＫＭ１４　ＣＤＲ　Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号９８：抗ＣＤ３抗体ＫＭ１４　ＣＤＲ　Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号９９：抗ＣＤ３抗体ＫＭ１４　ＣＤＲ　Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１００：抗ＣＤ３抗体ＫＭ１４　ＣＤＲ　Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号１０１：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＫＭ１４）の塩基配列
配列番号１０２：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＫＭ１４）のアミノ酸配列
配列番号１０３：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０３））のアミノ酸配列
配列番号１０４：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０４））のアミノ酸配列
配列番号１０５：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８））のアミノ酸配列
配列番号１０６：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２２））のアミノ酸配列
配列番号１０７：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２５））のアミノ酸配列
配列番号１０８：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２６））のアミノ酸配列
配列番号１０９：ＸＥＮＰ１４０４５抗ＣＤ１２３抗体　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１１０：ＸＥＮＰ１４０４５抗ＣＤ１２３抗体　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１１１：ＫＭ２１６０抗ＣＣＲ４抗体　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１１２：ＫＭ２１６０抗ＣＣＲ４抗体　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１１３：抗ＣＤ１２３抗体（ＣＤ１２３－１）　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１１４：抗ＣＤ１２３抗体（ＣＤ１２３－１）　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１１５：ＳＰ３４（Ｈ０５’）　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１１６：ＳＰ３４（Ｈ０５’）　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１１７：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’））のアミノ酸配列
配列番号１１８：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’））　ＣＤＲ　Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号１１９：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’））　ＣＤＲ　Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１２０：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’））　ＣＤＲ　Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号１２１：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’））　ＣＤＲ　Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号１２２：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’））　ＣＤＲ　Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号１２３：抗ＣＤ３　ｓｃＦｖ（ｓｃＳＰ３４（Ｈ０４’））　ＣＤＲ　Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号１２４：ＳＰ３４（Ｈ０４’）　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１２５：ＳＰ３４（Ｈ０４’）　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１２６：ｍｕｔ１－０３　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１２７：ｍｕｔ１－０４　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１２８：ｍｕｔ１－１８　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１２９：ｍｕｔ１－２２　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１３０：ｍｕｔ１－２５　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１３１：ｍｕｔ１－２６　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１３２：ｍｕｔ１－０３　ＣＤＲ　Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号１３３：ｍｕｔ１－０４　ＣＤＲ　Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号１３４：ｍｕｔ１－１８　ＣＤＲ　Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１３５：ｍｕｔ１－２２　ＣＤＲ　Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１３６：ｍｕｔ１－２５　ＣＤＲ　Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１３７：ｍｕｔ１－２６　ＣＤＲ　Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１３８：ヒトＣＤ３タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３９：サルＣＤ３タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４０：ヒトＣＤ３タンパク質細胞外領域のアミノ酸配列
配列番号１４１：ヒトＣＤ３タンパク質の塩基配列
配列番号１４２：サルＣＤ３タンパク質の塩基配列
配列番号１４３：ペプチドリンカーのアミノ酸配列
配列番号１４４：ペプチドリンカーのアミノ酸配列
配列番号１４５：ペプチドリンカーのアミノ酸配列
配列番号１４６：ヒトＣＤ３εのＮ末端側非アセチル化ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１４７：Ｆｃ部分のＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓのパターン１（ＫＩＨ－１）のアミノ酸配列
配列番号１４８：Ｆｃ部分のＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓのパターン１（ＫＩＨ－１）のアミノ酸配列
配列番号１４９：Ｆｃ部分のＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓのパターン２（ＫＩＨ－２）のアミノ酸配列
配列番号１５０：Ｆｃ部分のＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓのパターン２（ＫＩＨ－２）のアミノ酸配列
配列番号１５１：Ｆｃ部分のＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓのパターン３（ＫＩＨ－３）のアミノ酸配列
配列番号１５２：Ｆｃ部分のＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓのパターン３（ＫＩＨ－３）のアミノ酸配列
配列番号１５３：Ｆｃ部分のＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓのパターン４（ＫＩＨ－４）のアミノ酸配列
配列番号１５４：Ｆｃ部分のＫｎｏｂｓ　ｉｎｔｏ　Ｈｏｌｅｓのパターン４（ＫＩＨ－４）のアミノ酸配列
配列番号１５５：ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＣＣ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１５６：ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＳＥ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１５７：ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＣＣ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１５８：ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＳＥ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１５９：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＶＨ（ＨＶ３）のアミノ酸配列
配列番号１６０：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＶＨ（ＨＶ５）のアミノ酸配列
配列番号１６１：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＣＣ改変ＶＨ（ＨＶ３）のアミノ酸配列
配列番号１６２：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＣＣ改変ＶＨ（ＨＶ５）のアミノ酸配列
配列番号１６３：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＳＥ改変ＶＨ（ＨＶ３）のアミノ酸配列
配列番号１６４：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＳＥ改変ＶＨ（ＨＶ５）のアミノ酸配列
配列番号１６５：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＶＬ（ＬＶ８ａ）のアミノ酸配列
配列番号１６６：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＣＣ改変ＶＬ（ＬＶ８ａ）のアミノ酸配列
配列番号１６７：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）のＳＥ改変ＶＬ（ＬＶ８ａ）のアミノ酸配列
配列番号１６８：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０３）のＣＣ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１６９：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０４）のＣＣ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７０：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８）のＣＣ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７１：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２２）のＣＣ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７２：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２５）のＣＣ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７３：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２６）のＣＣ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７４：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０３）のＳＥ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７５：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０４）のＳＥ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７６：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８）のＳＥ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７７：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２２）のＳＥ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７８：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２５）のＳＥ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７９：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２６）のＳＥ改変ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１８０：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０３）のＣＣ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１８１：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０４）のＣＣ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１８２：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８）のＣＣ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１８３：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２２）のＣＣ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１８４：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２５）のＣＣ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１８５：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２６）のＣＣ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１８６：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０３）のＳＥ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１８７：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０４）のＳＥ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１８８：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８）のＳＥ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１８９：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２２）のＳＥ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１９０：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２５）のＳＥ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１９１：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２６）のＳＥ改変ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１９２：ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）＿ＣＣ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号１９３：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´＿ＨＶ３ＬＶ８ａ）＿ＣＣ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号１９４：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´＿ＨＶ５ＬＶ８ａ）＿ＣＣ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号１９５：ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）＿ＳＥ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号１９６：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０３）＿ＣＣ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号１９７：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０４）＿ＣＣ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号１９８：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８）＿ＣＣ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号１９９：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２２）＿ＣＣ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２００：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２５）＿ＣＣ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２０１：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２６）＿ＣＣ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２０２：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８）＿ＳＥ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２０３：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２２）＿ＳＥ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２０４：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２５）＿ＳＥ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２０５：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２６）＿ＳＥ改変型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２０６：ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）＿ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２０７：ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´）＿ＣＣ改変ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２０８：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´＿ＨＶ３ＬＶ８ａ）＿ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２０９：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´＿ＨＶ５ＬＶ８ａ）＿ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２１０：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´＿ＨＶ３ＬＶ８ａ）＿ＣＣ改変ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２１１：ヒト化ｓｃＳＰ３４（Ｈ０５´＿ＨＶ５ＬＶ８ａ）＿ＣＣ改変ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２１２：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０３）＿ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２１３：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－０４）＿ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２１４：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－１８）＿ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２１５：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２２）＿ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２１６：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２５）＿ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列
配列番号２１７：ｓｃＫＭ１４（ｍｕｔ１－２６）＿ＬＨ型のｓｃＦｖ全長のアミノ酸配列

Claims (55)

  1. 　Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域を含み、該Ｆｃ領域のＣ末端側にＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインが１つ結合し、さらに疾患関連抗原結合ドメインを含む、抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  2. 　Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域を含み、該Ｆｃ領域のＣ末端側にＣＤ３結合ドメインが１つ結合し、さらに疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片であって、ＣＤ３陽性Ｔ細胞及び疾患関連抗原陽性細胞の存在下で、抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４を用いた抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体と比較して、サイトカイン産生誘導能が低下している抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  3. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数（ＫＤ）が６×１０－８以上である、請求項１又は２に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  4. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数が比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４よりも大きい、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  5. 　前記ＣＤ３結合ドメインのアミノ酸配列が、比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４のＣＤ３結合ドメインのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつ該抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４と比べてＣＤ３に対するアフィニティが１０％以上低下している、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  6. 　前記疾患関連抗原結合ドメインを１又は２つ含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  7. 　前記ＣＤ３結合ドメイン及び前記疾患関連抗原結合ドメインがそれぞれｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨから選ばれるいずれか１である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  8. 　前記ＣＤ３結合ドメイン及び／又は前記疾患関連抗原結合ドメインが、リンカーを介して前記Ｆｃ領域に結合している、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  9. 　前記ＣＤ３結合ドメインが、抗体重鎖の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲと略記する）１～３を含む重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ；ＶＨと略記する）および抗体軽鎖のＣＤＲ１～３を含む軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ；ＶＬと略記する）を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  10. 　前記ＣＤ３結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  11. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨのＣＤＲ１～３（ＨＣＤＲ１～３）およびＶＬのＣＤＲ１～３（ＬＣＤＲ１～３）のアミノ酸配列が、下記（ａ）～（ｈ）から選ばれるいずれか１のＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列とそれぞれ９０％以上の相同性を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
    （ａ）それぞれ配列番号１１８～１２０で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１２１～１２３で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｂ）それぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号８６～８８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｃ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３２、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｄ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３３、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｅ）それぞれ配列番号９８、１３４、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｆ）それぞれ配列番号９８、１３５、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｇ）それぞれ配列番号９８、１３６、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｈ）それぞれ配列番号９８、１３７、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
  12. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列が、下記（ａａ）～（ｒｒ）から選ばれるいずれか１のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列とそれぞれ８０％以上の相同性を有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
    （ａａ）配列番号１２４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｂｂ）配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｃｃ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｄｄ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｅｅ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｆｆ）配列番号１２９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｇｇ）配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｈｈ）配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｉｉ）配列番号１５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｊｊ）配列番号１６０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｋｋ）配列番号１６１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｌｌ）配列番号１６２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｍｍ）配列番号１６８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｎｎ）配列番号１６９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｏｏ）配列番号１７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｐｐ）配列番号１７１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｑｑ）配列番号１７２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｒｒ）配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
  13. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、下記（ａ）～（ｈ）から選ばれるいずれか１である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
    （ａ）それぞれ配列番号１１８～１２０で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１２１～１２３で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｂ）それぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号８６～８８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｃ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３２、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｄ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３３、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｅ）それぞれ配列番号９８、１３４、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｆ）それぞれ配列番号９８、１３５、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｇ）それぞれ配列番号９８、１３６、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｈ）それぞれ配列番号９８、１３７、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
  14. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列が、下記（ａａ）～（ｒｒ）から選ばれるいずれか１である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
    （ａａ）配列番号１２４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｂｂ）配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｃｃ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｄｄ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｅｅ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｆｆ）配列番号１２９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｇｇ）配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｈｈ）配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｉｉ）配列番号１５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｊｊ）配列番号１６０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｋｋ）配列番号１６１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｌｌ）配列番号１６２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｍｍ）配列番号１６８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｎｎ）配列番号１６９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｏｏ）配列番号１７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｐｐ）配列番号１７１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｑｑ）配列番号１７２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｒｒ）配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
  15. 　前記Ｆｃ領域がＦｃ受容体への結合活性が増強したＦｃ領域である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  16. 　前記Ｆｃ受容体への結合活性が増強したＦｃ領域が、アミノ酸残基改変及び／または糖鎖改変を含むＦｃ領域である、請求項１５に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  17. 　前記Ｆｃ受容体への結合活性が増強したＦｃ領域が、アミノ酸残基改変及び糖鎖改変の両方を含むＦｃ領域である、請求項１５又は１６に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  18. 　前記アミノ酸残基改変が、Ｆｃ受容体への結合活性を増強させるアミノ酸残基改変を少なくとも１つ含むアミノ酸残基改変である、請求項１６又は１７に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  19. 　前記糖鎖改変が、Ｆｃ領域のＥＵナンバリング２９７番目のＡｓｎに結合するＮ結合型糖鎖の還元末端のＮ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅにα１，６－結合するｆｕｃｏｓｅを欠損させた糖鎖改変である、請求項１６又は１７に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  20. 　前記疾患関連抗原結合ドメインとしてＦａｂを２つ含み、それぞれのＦａｂの重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）のＣ末端が、前記Ｆｃ領域と直接またはリンカーを介して結合している、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  21. 　前記疾患関連抗原結合ドメインとしてＦａｂを１つ含み、Ｆａｂの重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）のＣ末端が、前記Ｆｃ領域と直接またはリンカーを介して結合している、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  22. 　前記疾患関連抗原結合ドメインとしてＦａｂを１つ含み、Ｆａｂの重鎖（ＶＨ－ＣＨ１）と結合している側のＦｃ鎖に前記ＣＤ３結合ドメインが直接またはリンカーを介して結合している、請求項１～１９または２１のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  23. 　前記疾患関連抗原結合ドメインとしてＦａｂを１つ含み、Ｆａｂの軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）と結合している側のＦｃ鎖に前記ＣＤ３結合ドメインが直接またはリンカーを介して結合している、請求項１～１９または２１のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  24. 　前記リンカーが、ヒンジまたはその改変体である、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体又は該バイスペシフィック抗体断片。
  25. 　請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ。
  26. 　請求項２５に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
  27. 　請求項２６に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
  28. 　請求項２７に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産蓄積させ、該培養物から該抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を採取することを特徴とする請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法。
  29. 　請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を有効成分として含有する、前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断薬。
  30. 　前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである、請求項２９に記載の治療および／または診断薬。
  31. 　請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いる、前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断方法。
  32. 　前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである、請求項３１に記載の治療および／または診断方法。
  33. 　前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断に使用するための、請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  34. 　前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである、請求項３３に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  35. 　前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断剤の製造のための、請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の使用。
  36. 　前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである、請求項３５に記載の使用。
  37. 　請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む、前記ＣＤ３および前記疾患関連抗原の少なくとも一方を検出または測定するための試薬。
  38. 　ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインをＦｃ領域に結合させることを特徴とする、Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域及び疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を製造する方法。
  39. 　ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインを使用することを特徴とする、Ｆｃ受容体への結合能を有するＦｃ領域及び疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片のサイトカイン産生誘導を抑制する方法。
  40. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数（ＫＤ）が６×１０－８以上である、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する解離定数が比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４よりも大きい、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 　前記ＣＤ３結合ドメインのアミノ酸配列が、比較対照である抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４のＣＤ３結合ドメインのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつ抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４またはＫＭ１４と比べてアフィニティが１０％以上低下している、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 　前記抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が疾患関連抗原結合ドメインを１又は２つ含む、請求項３８～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 　前記ＣＤ３結合ドメイン及び前記疾患関連抗原結合ドメインがそれぞれｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨから選ばれるいずれか１である、請求項３８～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 　前記ＣＤ３結合ドメイン及び／又は前記疾患関連抗原結合ドメインが、リンカーを介してＦｃ領域に結合している、請求項３８～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 　前記ＣＤ３結合ドメインが、抗体重鎖のＣＤＲ１～３を含むＶＨおよび抗体軽鎖のＣＤＲ１～３を含むＶＬを含む、請求項３８～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 　前記ＣＤ３結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項３８～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨのＣＤＲ１～３（ＨＣＤＲ１～３）およびＶＬのＣＤＲ１～３（ＬＣＤＲ１～３）のアミノ酸配列が、下記（ａ）～（ｈ）から選ばれるいずれか１のＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列とそれぞれ９０％以上の相同性を有する、請求項３８～４７のいずれか１項に記載の方法。
    （ａ）それぞれ配列番号１１８～１２０で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１２１～１２３で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｂ）それぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号８６～８８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｃ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３２、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｄ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３３、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｅ）それぞれ配列番号９８、１３４、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｆ）それぞれ配列番号９８、１３５、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｇ）それぞれ配列番号９８、１３６、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｈ）それぞれ配列番号９８、１３７、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
  49. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列が、下記（ａａ）～（ｒｒ）から選ばれるいずれか１のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列とそれぞれ８０％以上の相同性を有する、請求項３８～４８のいずれか１項に記載の方法。
    （ａａ）配列番号１２４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｂｂ）配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｃｃ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｄｄ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｅｅ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｆｆ）配列番号１２９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｇｇ）配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｈｈ）配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｉｉ）配列番号１５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｊｊ）配列番号１６０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｋｋ）配列番号１６１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｌｌ）配列番号１６２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｍｍ）配列番号１６８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｎｎ）配列番号１６９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｏｏ）配列番号１７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｐｐ）配列番号１７１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｑｑ）配列番号１７２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｒｒ）配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
  50. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、下記（ａ）～（ｈ）から選ばれるいずれか１である、請求項３８～４９のいずれか１項に記載の方法。
    （ａ）それぞれ配列番号１１８～１２０で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１２１～１２３で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｂ）それぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号８６～８８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｃ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３２、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｄ）それぞれ配列番号９８～１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１３３、９６、９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｅ）それぞれ配列番号９８、１３４、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｆ）それぞれ配列番号９８、１３５、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｇ）それぞれ配列番号９８、１３６、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
    （ｈ）それぞれ配列番号９８、１３７、１００で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１～３
  51. 　前記ＣＤ３結合ドメインのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列が、下記（ａａ）～（ｒｒ）から選ばれるいずれか１である、請求項３８～５０のいずれか１項に記載の方法。
    （ａａ）配列番号１２４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｂｂ）配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｃｃ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｄｄ）配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１２７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｅｅ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｆｆ）配列番号１２９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｇｇ）配列番号１３０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｈｈ）配列番号１３１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｉｉ）配列番号１５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｊｊ）配列番号１６０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｋｋ）配列番号１６１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｌｌ）配列番号１６２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｍｍ）配列番号１６８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｎｎ）配列番号１６９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｏｏ）配列番号１７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｐｐ）配列番号１７１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｑｑ）配列番号１７２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
    （ｒｒ）配列番号１７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ
  52. 　前記Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体への結合活性が増強したＦｃ領域である、請求項３８～５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 　Ｆｃ領域及び疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を製造するための、ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメイン。
  54. 　Ｆｃ領域及び疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片のサイトカイン産生誘導を抑制するための、ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメイン。
  55. 　Ｆｃ領域及び疾患関連抗原結合ドメインを含む抗ＣＤ３バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を製造するための、ＣＤ３に対するアフィニティが減弱したＣＤ３結合ドメインの使用。
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