JPS63152326A - 安定な顆粒球コロニ−刺激因子含有製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は顆粒球コロニー刺激因子含有製剤に関し、特に
容器壁土への吸着または、会合、重合、酸化等による活
性成分の損失、不活性化を有利に防止し、安定化された
顆粒球コロニー刺激因子含有製剤に関するものである。

従来の技術 最近では各種感染症の化学療法においては、耐性菌発生
、原因菌の交代現象、あるいは高い副作用などが臨床的
に重大な問題となっており、そのため、抗生物質、抗菌
剤等による上記の如き化学的療法とは別に感染菌宿主の
防禦機能を活性化するような物質を用いることにより、
上記化学療法の根本的な問題の解決を図ろうとする動き
がある。

即ち、例えば細菌感染の初期には宿主のもつ防禦機能の
うちで白血球の貧食殺菌作用が最も強く影響すると考え
られており、そこで好中球の増殖、分化成熟を促進する
ことにより宿主の感染防禦機能の亢進を図ることが重要
と考えられる。このような作用を示す極めて重要な物質
の一つとして顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ）が
あり、既にこれを用いた感染防禦剤が本出願人によって
別途特許出願されている（特願昭６０−２３７７７号）
。

発明が解決しようとする問題点 上記の如く、各種化学療法においては、各種の回避し得
ない問題があり、そのために被感染体即ち宿主の防禦機
能を賦活化し得るような物質を薬剤として用いる試みが
なされている。Ｇ−Ｃ３Ｆは、勿論それ自身に宿主の防
禦機能を賦活化する活性を有し、臨床上の治療効果をさ
らに十分に発揮すべく、上述した薬剤との併用の場合に
於ても、その目的を遂行する上で極めて有用であること
が判明した。

このＧ−Ｃ３Ｆは極めて微量で使用され、通常成人−人
当たり、０．１〜５００μｇ（好ましくは５〜５０、μ
ｇ）の（、Ｃ３Ｆを含有する製剤を１〜７回／週の割合
で投与する。

しかしながら、このＧ−Ｃ３Ｆは例えば注射用アンプル
、注射器等の器壁に対し吸着性を示すことから、特にこ
の薬剤を水溶液等の注射薬として利用する場合には、ア
ンプル等の容器、注射器等の器壁に吸着されてしまい、
Ｇ−Ｃ３Ｆの医薬としての活性を十分有効に発揮させる
ことができず、あるいはこのような吸着に基く損失分を
予め見積って余分に医薬中に添加しておかねばならない
。

その上、Ｇ−Ｃ３Ｆは不安定で、外的因子の影響を受は
易く、温度、湿度、酸素、紫外線等に起因して会合、重
合あるいは酸化などの物理的、化学的変化を生じ、大き
な活性の低下を招く。このことは、極めて微量の投与量
のＧ−ＣＳ　Ｆを極めて正確に投与しようとする治療行
為の完全な遂行を困難にする。

そこでこのような問題点を解決し、有効成分の活性の低
下を十分に防止できる製品を開発する必要が生じる。本
発明の目的は、このような点にあり、即ち安定なＧ−Ｃ
３Ｆ含有製剤を提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明者等は上記目的とするＧ−Ｃ８Ｆ含有製剤の安定
性を改善すべく種々検討・研究した結果、製薬上許容さ
れる蛋白質を添加することが有効であることを見出し、
本発明を完成した。

即ち、本発明の安定なＧ−Ｃ３Ｆ含有製剤は、Ｇ−ＣＳ
　Ｆと少なくとも１種の製薬上許容される蛋白質とを含
有することを特徴とする。

本発明におけるＧ−Ｃ８Ｆは、例えば既に出願されてい
る特願昭５９−１５３２７３号、同６０’−２６９４５
５号、同６（１−２６９４５６号、同６０−２７０８３
８号、同６０−２７０８３９号明細書に記載の各種方法
に従って得ることができ、例えばヒ）Ｇ−Ｃ３’Ｆは口
腔底癌患者の腫瘍細胞から採取した細胞株（ＣＮＣＭ受
託番号「ｌ−３１５」、同ｒＩ＝４８３Ｊ）の培養によ
り、あるいは更にヒ）　Ｇ−ＣＳ　Ｆをコードする遺伝
子を用いて組換体ＤＮＡを作製し、これを適当な宿主細
胞（例えば大腸菌、Ｃ１２７細胞、チャイニーズハムス
ターの卵巣細胞等）で発現させるなどによって得ること
ができる。

本発明における（、−ＣＳ　Ｆとしては高純度に精製さ
れたヒ）　Ｇ−ＣＳ　Ｆであれば全て使用できるが、ヒ
）Ｃ，−Ｃ３Ｆ産生細胞を培養して得られる培養上清か
ら単離して得られるもの及びヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆ活性を有す
るポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ組換え
ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体が産
生ずるヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペプチドまたは
糖蛋白質が好ましい。

具体的には、次の（ｉ）及び（ｉｉ）で示すヒトＧ−Ｃ
Ｓ　Ｆが特に好ましく用いられる。

（ｉ）次の理化学的性質を有するヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆ０■分
子量；ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による測定で 約１９．０００±１，０００゜ ■等電点：ｐＩ−５．５±０．１　、ｐ　Ｉ＝　５．８
±０，１、１＝６．１±０．１の三つの等電点のうち少
なくとも１つを有する。

■紫外部吸収：　２８０ｎｍに極大吸収を有し、２５０
ｎｍに極小値を持つ。

■Ｎ末端から２１残基目迄のアミノ酸配列が次の如くで
ある。

８２Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−しｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−八
１ａ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｎ−
３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌ
ｅｕ−Ｇ　］　ｕ−Ｇ　１ｎ−Ｖａ　Ｉ−（ｉｉ）下記
のアミノ酸配列またはその一部で表わされるヒト顆粒球
コロニー刺激因子活性を有するポリペプチド又はこれと
糖鎖部を有する糖蛋白質を含有するヒトＧ−ＣＳ　Ｆｏ （Ｍｅｔ）ｌ、Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ
　　Ｐｒｏ　　八ｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ
Ｐｒｏ　　Ｇｉｎ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　
Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　
ＧｌｎＶａｌ　　Ａｒｇ　　Ｌ、ｙｓ　　ｌｌｅ　　Ｇ
ｌｎ　　Ｇｌｙ　　八ｓｐ　　Ｇａｙ　　八ｌａ　　八
ｌａ　　ＬｅｕＧｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　　（
Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ）。Ｃｙｓ　Ａｌａ　ＴｈｒＴ
ｙｒ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　Ｈｉｓ　　Ｐ
ｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｌ
ｅｕＬｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｈｉｓ　　’Ｓｅｒ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｇａｙ　　Ｉｃｅ　　Ｐｒｏ　　Ｔｒｐ　　Ａｌ
ａ　　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｐｒｏ　　
Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ　　八ｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ、Ｌ
ｅｕ八ｌへ　　Ｇｌｙ　　Ｃｙｓ　　ｌ、ｅｕ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｈｉｓ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌ
ｙ　　ＬｅｕＰｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ
　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｈａ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＧ
ｌｙ　　Ｉｃｅ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｇａｙ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　八
５ｐＴｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ
　　Ｖａｌ　　Ａｈａ　　八ｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ａｈａ
　　ＴｈｒＴｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　
Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＬｅｕＧａｙ　ＭｅｔＡｌａ
　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　
Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｈａ　ＭｅｔＰｒｏ　　八ｌａ　　
Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　八ｌａ　　Ｐｈｅ　　
Ｇｌｎ　　Ａｒｇ　　八ｒｇ　　ＡｌａＧｌｙ　Ｇｌｙ
　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｈａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　
Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　５ｅｒＰｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　
　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ　
　Ｌｅｕ　　八ｒｇ　　Ｈｉｓしｅｕ　八ｌａ　Ｇｌｎ
　Ｐｒｏ（但しｍは０又は１を表わし、ｎはＯ又は１を
表わす）。

なおこれらのＧ−Ｃ３Ｆの詳細な製造方法については、
本出願人が先に出願した特願昭５９−１５３２７３号、
特願昭６０−２６９４５５号、特願昭６０−２６９４５
６号、特願昭６０−２７０８３８号、特願昭６０−２７
０８３９号明細書を参照されたい。

又、その他の方法としてＧ−Ｃ３Ｆ産生細胞と自己増殖
能を有する悪性腫瘍細胞とを細胞融合して得られるハイ
ブリドーマをマイトジェンの存在下または不在下で培養
することによって得ることもできる。

これ等の方法で得られたヒ）（、−Ｃ３Ｆ含有液は必要
により公知の手段でさらに精製、濃縮した後凍結保存と
するかまたは凍結乾燥などの手段により水分を除去して
保存することができる。

このようにして得たヒ）　Ｇ−ＣＳ　Ｆは全て本発明に
よって安定なＧ−Ｃ３Ｆ含有製剤とすることができる。

本発明の安定なＧ−ＣＳ　Ｆ含有製剤を得るのに使用す
る蛋白質としては、ヒト血清アルブミン、ヒト血清グロ
ブリン、ゼラチン、酸処理ゼラチン（平均分子量７．０
００ないし１００．０００）、アルカリ処理ゼラチン（
平均分子量７．０００ないし１００．０００）、コラー
ゲンなどを典型的な例として挙げることができる。これ
らは勿論、単独であるいは２種以上の混合物として使用
できる。

これらの蛋白質は一般にＧ−Ｃ３ＦＩ重量部に対し、１
重量部〜２０．０００重量部の範囲内で使用することが
好ましい。

本発明のＧ−ＣＳ　Ｆ含有製剤はその製剤化の目的に応
じて希釈剤、溶解補助剤、等張化剤、賦形剤、ｐＨ調整
剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含
有してもよい。例えば、含硫還元剤としては、Ｎ−アセ
チルシスティン、Ｎ−アセチルホモシスティン、チオク
ト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオ
グリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸お
よびその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルクチオン、並び
に炭素原子数１〜７のチオアルカン酸などのスルフヒド
リル基を有するものなどを例示できる。

また、酸化防止剤としてはエリソルビン酸、ジブチルヒ
ドロキシトルエン、プチルヒドロキシアニソーノヘα−
トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸およびその塩、Ｌ
−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ス
テアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム
、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチ
レンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）　、ピロ
リン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウムの如きキレー
ト剤などを例示できる。

あるいはまた賦形剤として、グリシン、システイン、ス
レオニン、シスチン、トリプトファン、メチオニン、リ
ジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニンなど
のアミノ酸を添加してもよい。

本発明の安定化されたＧ−Ｃ３Ｆ含有製剤は経口、各種
注射などの非経口等各種の投与形式で使用でき、該投与
形式に応じた様々な剤層で実現できる。例えば、投与剤
形としては錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤等
の経口投与剤、あるいは静注、筋注、皮下性、史的注用
等の溶液、懸濁注射剤、凍結乾燥製剤、あるいは全開、
経鼻剤、膣剤等の経粘膜投与剤形を典型的なものとして
例示できる。

作用 上記の如（、感染症等の化学的療法においては、抗生物
質、抗菌剤等の薬剤の他、患者の抵抗力、活性などとい
った免疫応答力にもとすいた防禦機能自体をも同時に改
善するために、この目的で有効な成分を添加併用するこ
とが臨床上極めて有用な手段であることが判明してきた
。

この種の成分の一つであるＧ−Ｃ３Ｆは極めて微量で使
用される。従って、極低濃度の水溶液等としてこれを取
扱う場合には、例えば注射器等に入れたり、アンプル等
の容器に収容して使用されることが多いが、このような
場合に、上記の如き成分の容器、注射器等の器壁に対す
る吸着性が高いことから、これらの器壁等に吸着してし
まい、薬液中での有効濃度を、あるいは所定単位用量中
の成分の目的とする活性を維持することが困難であると
いった問題がみられた。従って、有効量以上の量を、吸
着により失われる量を考慮して、予め添加しておく必要
があった。

更に、特にＧ−Ｃ３Ｆについてみると、これは不安定な
ものであり、温度、湿度、酸素、紫外線等の外的因子に
よって大きな影響を受け、会合、重合あるいは酸化分解
などにより物理的、化学的変化を生じ、活性の低下を招
く。

そこで、本発明ではＧ−Ｃ３Ｆ含有製剤に蛋白質を添加
することにより、上記諸問題点を解決し冊 た。このものの安定化および／または吸着防止効果の詳
細な機構は不明であるが、蛋白質の存在下においては、
Ｇ−Ｃ３Ｆ分子各々が蛋白質中に分散され、その結果、
（、−Ｃ３Ｆの分子間の相互作用は高度に緩和され、会
合、重合等の確率が大幅に減じられ、また同時に、蛋白
質が容器壁表面上へのＧ−ＣＳ　Ｆの吸着を競合的に阻
害することにより吸着サイトを減じ、これらの総合的な
効果として安定性が著しく向上するものと考える。

このような問題は注射用溶液、懸濁剤などにおいて顕著
なものであるが、その他の錠剤等の製剤過程においても
同様にみられる問題であり、上記の如き蛋白質の使用は
このような場合にも有効である。

即ち、蛋白質の添加によってＧ−Ｃ３Ｆは大巾に安定化
され、以下の実施例で実証するように長期に亘りＧ−Ｃ
３Ｆの活性を有効に維持することができる。

このような理由から、蛋白質の添加量は、特にその下限
は臨界的であり、Ｇ−Ｃ３ＦＩ重量部に対し１重量部〜
２０．０００重量部の範囲内の量で含有することが望ま
しい。

上記の如く、効果的に器壁等への吸着が防止でき、更に
安定性を向上させ得ることは、微量成分としてのＧ−Ｃ
３Ｆの有効利用を可能とし、更に高価な成分の浪費が防
止されることから、製品コストの低下を図ることにもつ
ながる。

実施例 以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する。

しかしながら、本発明は以下の例によって何隻制限され
るものではない。

尚、以下の実施例においてＧ−Ｃ３Ｆの残存活性の測定
は以下の如〈実施した。

（ａ）　　マウス骨髄細胞を用いる軟寒天法ウマ血清Ｑ
、４ｍｌ、被検体Ｑ、　１ｍｌ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（メス
）マウスの骨髄細胞浮遊液０．１＋＋＋１　（０，５〜
１×１０５有核細胞）、寒天を領７５％含む改変マツコ
イ５Ａ培養液Ｑ、４ｍｌを混合し、直径３５ｍｍの組織
培要用プラスチックディツシュに入れて固まらせた後、
３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気、１００％湿度の条
件にて５日間培養し、形成されたコロニー数（５０個以
上の細胞からなる集落を１コロニーとする）を数え、１
個のコロニーを形成する活性を１単位（Ｕｎｉｔ）とし
た。

尚、上記（ａ）の方法において用いた「改変マツコイ５
Ａ培養液」は次の如くして作製した。

「改変マツコイ５Ａ培養液（２倍濃度）」マツコイ５Ａ
培養液〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製〕１２ｇＳＭＥＭア
ミノ酸ビタミン培地（田水製薬社製）２、５５　ｇ　、
重炭酸ナトリウム２．１８ｇ、’ペニシリンＧカリウム
５００００単位を２回蒸溜水５００ｍ１に溶解後、０．
２２μｍのミリポアフィルタ−にて濾過滅菌を行った後
使用した。

（ｂ）　　逆相系高速液体クロマトグラフィー法Ｃ８逆
相カラム（４，６＋＋ｒｎ＋　Ｘ３ＱＱｍｍ、　５１１
　ｍ）を用い、ｎ−プロパツール、トリフルオロ酢酸を
移動相に使用し、（、−Ｃ３Ｆとして１μｇ相当量以上
を注入し、以下のグラジェント条件で残存活性の測定を
する。

時間　溶媒（Ａ）　　溶媒（Ｂ）　　グラジェント条件
溶媒（八）：３０％ｎ−プロパツール。

０．１％トリフルオロ酢酸 溶媒（Ｂ）　：　６０％ｎ−プロパツール、０．１％ト
リフルオロ酢酸 測定波長＋　２１０ｎｍ 本性で測定されたＧ−Ｃ３Ｆの残存量は、上記（ａ）の
マウス骨髄細胞を用いる軟寒天法の測定結果と極めて高
い相関性を示した。

実施例１ （、Ｃ３Ｆ３μｇに第１表に示す蛋白質を添加したｃ−
Ｃ３Ｆ５μｇ／ｍＩ！含有製剤（２０ｍ　Ｍリン酸緩衝
液、１００　ｍＭ塩化ナトリウム含有、ｐＨ７，４）を
無菌的に調製し、次いで凍結乾燥製剤を製造した。（、
−Ｃ３Ｆ活性の経時変化は上記（ａ）マウス骨髄細胞を
用いる軟寒天法で測定した。結果は第１表に示す。尚、
表中活性（％）とは、初期単位に対する相対割合であり
、以下の式で定義される。

凍結乾燥条件は以下の通りである： 安定化剤を添加したＧ−Ｃ３Ｆ溶液を無菌サルファ処理
ガラスバイアルに入れ、−４０℃以下で４時間凍結し、
−４０℃から０℃、真空度０．０３から０．１Ｔｏｒｒ
で、４８時間−次乾燥した。次いで０℃から２０℃、真
空度０．０３から０．０８Ｔｏｒｒで１２時時間法乾燥
し、バイアル内部を無菌乾燥窒素ガスで大気圧になるま
で置換する。次いで凍結乾燥用ゴム栓で打栓し、アルミ
ニウムキャップで密封する。

第１表 実施例２ （、−Ｃ３ＦＩＯμｇに第２表に示す蛋白質を添加した
Ｇ−Ｃ３Ｆ１０μｇ／ｍＩ！含有製剤（２０ｍＭリン酸
緩衝液、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有、ｐＨ７、４）
を無菌的に調製し、サルファ処理ガラスバイアル内に無
菌的に充填、密封して（、−Ｃ３Ｆ溶液製剤を製造した
。これらの溶液製剤について、Ｇ−Ｃ３Ｆ活性の経時変
化を実施例１と同様の方法で測定し、その結果を第２表
に示した。

実施例３ Ｇ−Ｃ３ＦＩＯμｇに第３表に示す蛋白質を添加したＧ
−Ｃ３Ｆとｌｌｚｇ／ｉｆ含有製剤（２０ｍＭリン酸緩
衝液、１００　ｍ　Ｍ塩化す）　ＩＪウム含有、＋１）
１７．４）を無菌的に調製し、サルファ処理シリコーン
コーティングガラスバイアル中に１ｍｌ充填し、４℃で
放置し、Ｄ、５．２および２４時間後の溶液中の（、Ｃ
３Ｆの残存活性を上記（ｂ）の逆相系高速液体クロマト
グラフィー法により測定し残存率（％）を求め、蛋白質
の（、−Ｃ３Ｆ吸着防止効果を評価した。その結果を第
３表に示す。

！１ 発明の効果 以上詳しく述べたように、本発明によれば、製薬上許容
される蛋白質を所定量で用いたことにより、製剤中に極
微量で存在するＧ−Ｃ３Ｆの、温度、湿度、酸素、紫外
線等の外的因子にもとすく会合、重合あるいは酸化もし
くは容器壁等への吸着の結果として生ずる、有効成分の
損失、活性の低下等に関する問題点を効果的に解決する
ことが可能となった。

従って、患者に対する（、−Ｃ３Ｆの投与量を極めて正
確に投与、管理することが可能になり、しかも高価なＧ
−ＣＳ　Ｆの有効利用ができ、Ｇ−Ｃ３Ｆ含有製剤のコ
スト節減をも図ることが可能となる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）顆粒球コロニー刺激因子と少なくとも一種の製薬
   上許容される蛋白質とを含むことを特徴とする、安定な
   顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
2. （２）上記蛋白質を顆粒球コロニー刺激因子１重量部に
   対し１重量部〜２０，０００重量部の範囲内の量で含有
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の安定
   な顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
3. （３）上記蛋白質が、ヒト血清アルブミン、ヒト血清グ
   ロブリン、ゼラチン、平均分子量７，０００ないし１０
   ０，０００の酸処理ゼラチンまたはアルカリ処理ゼラチ
   ン、及びコラーゲンからなる群から選ばれた少なくとも
   １種であることを特徴とする特許請求の範囲第１項また
   は第２項に記載の安定な顆粒球コロニー刺激因子含有製
   剤。