JPS6181781A - 人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子産生細胞および人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子の製造法 - Google Patents
人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子産生細胞および人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子の製造法Info
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- JPS6181781A JPS6181781A JP59201944A JP20194484A JPS6181781A JP S6181781 A JPS6181781 A JP S6181781A JP 59201944 A JP59201944 A JP 59201944A JP 20194484 A JP20194484 A JP 20194484A JP S6181781 A JPS6181781 A JP S6181781A
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- human
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- cells
- differentiation
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、人1粒球減少症の治療に使用しうる人顆粒球
系前駆細胞の分化・増殖因子(ColonyStimu
lating Factor ;以下1” C5F J
ということもある)を産生ずる新規な細胞および人顆粒
球系前駆細胞の分化・増殖因子の製造法に関する。
系前駆細胞の分化・増殖因子(ColonyStimu
lating Factor ;以下1” C5F J
ということもある)を産生ずる新規な細胞および人顆粒
球系前駆細胞の分化・増殖因子の製造法に関する。
C5Fが頒粒球系前駆@胞を、顆粒球、卓球またはマク
ロファージに分化・増殖させることは、1n vttr
oにおける前駆細胞からのコロニーの形成によって広く
知られている。顆粒球の産生は、健康人では、骨髄中で
絶えず行なわれており、顆粒球が末梢血に放出されてか
らの寿命は、約1.5日といわれている。しかしながら
ガンの治療に採用される化学R法や放射@療法は、骨髄
の機能を抑制し、禰粒球の減少を生起する。このような
顆粒球の減少を防止するための治療薬として、C5Fの
有用性が期待され〔高久史歴;医学のあゆみ第95巻、
第2号、@41〜50頁(1975年)〕、さらにC3
Fは、骨髄性白血病患者の予後の検査試薬として最近注
目されている。
ロファージに分化・増殖させることは、1n vttr
oにおける前駆細胞からのコロニーの形成によって広く
知られている。顆粒球の産生は、健康人では、骨髄中で
絶えず行なわれており、顆粒球が末梢血に放出されてか
らの寿命は、約1.5日といわれている。しかしながら
ガンの治療に採用される化学R法や放射@療法は、骨髄
の機能を抑制し、禰粒球の減少を生起する。このような
顆粒球の減少を防止するための治療薬として、C5Fの
有用性が期待され〔高久史歴;医学のあゆみ第95巻、
第2号、@41〜50頁(1975年)〕、さらにC3
Fは、骨髄性白血病患者の予後の検査試薬として最近注
目されている。
C5Fは多種多様な組織および株化細胞から分泌され、
人尿にもその活性が認められている(浅野茂隆;細胞工
学第2巻、第1401〜1410頁(1983年)〕。
人尿にもその活性が認められている(浅野茂隆;細胞工
学第2巻、第1401〜1410頁(1983年)〕。
これらのうち、ヒトの株化細胞、 によるC5Fの産生
は、csp活性を有する培養液を安定、かつ大量に供給
することができるので、この方法はC5Fの多畷生産に
有望である。しかしながらこれまでのこれらの細胞を培
養するのに、血清を必須成分として培地に添加しており
、血清としてヒトの血清を使用する場合は、その製造コ
ストが高くなるという問題があり、また血清として牛血
清を使用する場合は、培地に添加された牛血溝の蛋白質
に起因する副作用の問題があった。
は、csp活性を有する培養液を安定、かつ大量に供給
することができるので、この方法はC5Fの多畷生産に
有望である。しかしながらこれまでのこれらの細胞を培
養するのに、血清を必須成分として培地に添加しており
、血清としてヒトの血清を使用する場合は、その製造コ
ストが高くなるという問題があり、また血清として牛血
清を使用する場合は、培地に添加された牛血溝の蛋白質
に起因する副作用の問題があった。
Lus i sらはhairy cell leuke
miaに由来するM 細胞を20%牛血清含有α−@@
4こおいて培養し、m宿を増殖させた後、α−培龜を血
清を含まない培地と交換し、史に7日間培谷し、その上
澄を3FIUiAのカラムに通液して精製した結果、得
らしt、= C5F ノ比活性カ3.5 X 106U
/# ffl白!、およびその収率が31%(重上)
であったと報告している( B1ood+第57巻、1
3〜21頁、1981年)。Wuらは、ヒトの膵臓がん
細胞から分離した細胞を、lO%牛血清および2.5%
馬血清を加えたダルベコ改変培1i1 (Dulbac
eo sa+odified mediu++ )
(In Vitro、 第6巻、第89〜108頁、(
1970年)〕において増殖させ、細j121が培養面
に満ちた後、細胞を3回塩溶液で洗浄し、無血清のダル
ベコ改変培咄で細胞を培養した。
miaに由来するM 細胞を20%牛血清含有α−@@
4こおいて培養し、m宿を増殖させた後、α−培龜を血
清を含まない培地と交換し、史に7日間培谷し、その上
澄を3FIUiAのカラムに通液して精製した結果、得
らしt、= C5F ノ比活性カ3.5 X 106U
/# ffl白!、およびその収率が31%(重上)
であったと報告している( B1ood+第57巻、1
3〜21頁、1981年)。Wuらは、ヒトの膵臓がん
細胞から分離した細胞を、lO%牛血清および2.5%
馬血清を加えたダルベコ改変培1i1 (Dulbac
eo sa+odified mediu++ )
(In Vitro、 第6巻、第89〜108頁、(
1970年)〕において増殖させ、細j121が培養面
に満ちた後、細胞を3回塩溶液で洗浄し、無血清のダル
ベコ改変培咄で細胞を培養した。
培谷孜を2種類のカラムで3回l′i′!J製し、電気
泳動で車−バンドを得、MII8!度が1000倍、回
収率が11%C屯”n ) 、比活性が7−OX 10
σ/1rLgm白賞であったと報告している( J
ournal ofBiological Chemi
stry、 254巻、6226〜6228頁、197
9年)。また、Dtpersioらは、OCT細胞(m
alignant histiocytomaからのも
の)を10%牛血清含有マツコイ5Aj3a’??増殖
さセ、0.01%(重′@)ポリエチレングリコールを
含むマツコイ5A培地でC5Fを含む@養上澄を回収し
、3種のカラムを用いてN製した段階で(いくつかの精
製方法を用いているが)、M製度300倍、収率32%
(重量)、比活性3XIOU/mg蛋白質であったと述
べている( Blood、56巻、717〜7271.
1980年)。
泳動で車−バンドを得、MII8!度が1000倍、回
収率が11%C屯”n ) 、比活性が7−OX 10
σ/1rLgm白賞であったと報告している( J
ournal ofBiological Chemi
stry、 254巻、6226〜6228頁、197
9年)。また、Dtpersioらは、OCT細胞(m
alignant histiocytomaからのも
の)を10%牛血清含有マツコイ5Aj3a’??増殖
さセ、0.01%(重′@)ポリエチレングリコールを
含むマツコイ5A培地でC5Fを含む@養上澄を回収し
、3種のカラムを用いてN製した段階で(いくつかの精
製方法を用いているが)、M製度300倍、収率32%
(重量)、比活性3XIOU/mg蛋白質であったと述
べている( Blood、56巻、717〜7271.
1980年)。
以上のように従来高力価のC5Fを得るためには、細胞
をまず血清を含む培地で増殖させた後、回収用培地に換
えて、上澄を4縮、精製する方法が採用されていたので
ある。しかし、従来の方法では培地交換の前に#i]]
胞を充分に洗浄しても、培地中の血清が残存する場合が
多く、アルブミン等の混在によりraa!度が低くなり
、比活性を増加すれば、C5Fの収率が低下するという
欠点があった。
をまず血清を含む培地で増殖させた後、回収用培地に換
えて、上澄を4縮、精製する方法が採用されていたので
ある。しかし、従来の方法では培地交換の前に#i]]
胞を充分に洗浄しても、培地中の血清が残存する場合が
多く、アルブミン等の混在によりraa!度が低くなり
、比活性を増加すれば、C5Fの収率が低下するという
欠点があった。
一方、無血清培地で増殖する株化細胞は、多数知られて
いる( David Barnes及びcoraon
5ato ;Analytical Biochemi
stry、 第102巻、第255〜270頁(198
0年)〕が、従来これらの@胞を培地で培養する場合、
補助的占白質としてホルモン等の成長因子を必要とする
ことが多い。
いる( David Barnes及びcoraon
5ato ;Analytical Biochemi
stry、 第102巻、第255〜270頁(198
0年)〕が、従来これらの@胞を培地で培養する場合、
補助的占白質としてホルモン等の成長因子を必要とする
ことが多い。
以上のように無l′lTln5無成長因子及び煎蛋白質
培地で増殖し、かつ高力価のC5Fを項生ずるヒトの株
化細胞は従来全く知られていなかった。
培地で増殖し、かつ高力価のC5Fを項生ずるヒトの株
化細胞は従来全く知られていなかった。
本発明者らは、開力111ftのC3Fを得ることおよ
びきょう雑物の少ない培養物を得ることを企図して研究
を改ね、その研完において、血清および2白臀を含まな
い組織培養用培地で増殖しうる@胞を得ることができ、
この細胞から高活性のC5Fを産生する細胞を分離する
ことに成功して、本発明に到達した。
びきょう雑物の少ない培養物を得ることを企図して研究
を改ね、その研完において、血清および2白臀を含まな
い組織培養用培地で増殖しうる@胞を得ることができ、
この細胞から高活性のC5Fを産生する細胞を分離する
ことに成功して、本発明に到達した。
本発明の目的は、血清および蛋白質を含まない培地にお
いて増殖しうる人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子産
生細胞を提供することにある。
いて増殖しうる人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子産
生細胞を提供することにある。
本発明のもう1つの目的は、**aが容易で、人tm粒
球減少症の治療に1史用しうる高活性の人願粒球系前駆
細胞の分化・増殖因子の製造法を提供することにあるっ 本発明は、人の組織から分離された細胞のクローンであ
って、血清および蛋白質を含まない組織培養用培地で増
殖し、かつ人顆粒球系前駆III胞の分化・増殖促進物
質を項生しうることを特徴とする人顆粒球系前駆細胞の
分化・増殖因子産生細【であり、そして、この細胞を、
血清および蛋白質を含まない組織培養用培地で培養し、
培地中にへ輌粒球系前駆4吃の分化・増殖因子を産生せ
しめ、培養物から人頼数球系前駆細胞の分化・増殖因子
を採取することを特徴とする人頼数球系前駆細胞の分化
・増殖因子の製偕法である。
球減少症の治療に1史用しうる高活性の人願粒球系前駆
細胞の分化・増殖因子の製造法を提供することにあるっ 本発明は、人の組織から分離された細胞のクローンであ
って、血清および蛋白質を含まない組織培養用培地で増
殖し、かつ人顆粒球系前駆III胞の分化・増殖促進物
質を項生しうることを特徴とする人顆粒球系前駆細胞の
分化・増殖因子産生細【であり、そして、この細胞を、
血清および蛋白質を含まない組織培養用培地で培養し、
培地中にへ輌粒球系前駆4吃の分化・増殖因子を産生せ
しめ、培養物から人頼数球系前駆細胞の分化・増殖因子
を採取することを特徴とする人頼数球系前駆細胞の分化
・増殖因子の製偕法である。
本明細書における「単位」は、次の方法により測定され
る生物活性である。
る生物活性である。
20%(容量、特にことわらない限り、以下同じ)の牛
胎児血清、0.3%(@@)の寒天および1×10 個
のC57BI / 6Jマウス骨髄細胞を含むマツコイ
5A培地(Mceoy s 5 A mediu+n
) 1 mlに、被験各fi O,1rrbllを加
えて、径35龍のプラスチックシャーレに入れ、7.5
%のCOの通気の下で、37℃において7日間培養し、
倒置顕微鏡によって観察し、50個以上の@略からなる
集塊をコロニーとしてttj則し、1個のコロニーを形
成させる被倹溶液の生物活性を1単位と定める。
胎児血清、0.3%(@@)の寒天および1×10 個
のC57BI / 6Jマウス骨髄細胞を含むマツコイ
5A培地(Mceoy s 5 A mediu+n
) 1 mlに、被験各fi O,1rrbllを加
えて、径35龍のプラスチックシャーレに入れ、7.5
%のCOの通気の下で、37℃において7日間培養し、
倒置顕微鏡によって観察し、50個以上の@略からなる
集塊をコロニーとしてttj則し、1個のコロニーを形
成させる被倹溶液の生物活性を1単位と定める。
(K、 Motoyoshiら; Blood、 第6
0巻、第1378〜1386頁(1982年)〕 人顆粒球前駆細胞に対する活性は、10〜14日間lo
]様に培養してi′を側することができる。
0巻、第1378〜1386頁(1982年)〕 人顆粒球前駆細胞に対する活性は、10〜14日間lo
]様に培養してi′を側することができる。
人の骨髄@胞を用いて計測した単位数は、マウスの骨@
@胞を用いてit測した単位数の約1.5倍であり、両
者の間に強い相関関係が認められたので、不明[7では
、マウスの骨@4@を用いて計測された測定結果を使用
している。以下の記述において、この「小位」をrUJ
と略記する。
@胞を用いてit測した単位数の約1.5倍であり、両
者の間に強い相関関係が認められたので、不明[7では
、マウスの骨@4@を用いて計測された測定結果を使用
している。以下の記述において、この「小位」をrUJ
と略記する。
本発明の人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子(C5F
)を産生ずる細胞は、以下のようにして得ることができ
る。
)を産生ずる細胞は、以下のようにして得ることができ
る。
人の組織から得たC5Fを産生ずる細胞を組織培産する
ときに、血f?I儂度および蛋白質濃度を少しずつ低下
させた1′111iXIl培養用培地を頓次、使用して
、長期間継代培養を行ない、血nおよび出口質を含まな
い培地に馴化した細胞を得るつその後、希釈方法を用い
て、血清および出口質を含まない培地において良好に増
殖し、かつ高力価のC5Fを産生ずる細胞のクローニン
グを行なう。
ときに、血f?I儂度および蛋白質濃度を少しずつ低下
させた1′111iXIl培養用培地を頓次、使用して
、長期間継代培養を行ない、血nおよび出口質を含まな
い培地に馴化した細胞を得るつその後、希釈方法を用い
て、血清および出口質を含まない培地において良好に増
殖し、かつ高力価のC5Fを産生ずる細胞のクローニン
グを行なう。
人の組織から得たC3Fを産生する細胞としては、C5
Fを産生ずる性質を有する限り、人めいかなる組織から
得られたものであってもよいが、このような@胞として
は、人の甲状腺ガン細胞に由来するT3M5細胞が知ら
れており(0Kabeら薯JNCI+第69巻、第12
35〜1243頁(1978年)〕、このT3M5細胞
を使用するのが好ましい。
Fを産生ずる性質を有する限り、人めいかなる組織から
得られたものであってもよいが、このような@胞として
は、人の甲状腺ガン細胞に由来するT3M5細胞が知ら
れており(0Kabeら薯JNCI+第69巻、第12
35〜1243頁(1978年)〕、このT3M5細胞
を使用するのが好ましい。
本発明において、へ顆82球系前駆紹胞の分化・増殖因
子(C5F )を製造するには、1)υ述のクローニン
グにおいて得られた血清および蛋白質を含まない@池に
おいて良好に増殖し、かつ高力価のC5Fを産生する株
化細胞(r、csF産生株化細胞」という)を、組織培
養用培地において、培地の表面にfill 1121が
a5集するまで、増殖し、増殖したC5F産生株化1t
lllδを回収し、これを別の培a器の培地に植え継ぎ
、培地を交換しながらS%co の下で培養を読ける
。回収した培′a液はcsFを含んでおり、これを集め
て、醐過または遠心分離によって細胞片または他の浮遊
物を除去した後、真空m縮あるいは限外濾過などによっ
てnl媚し、C3F活性の高い濃縮液を得る。この濃縮
液を、塩析−1吸着−1逆相−、ゲル濾過−1または高
速−などのクロマトグラフィーあるいは4気泳唾などの
常法によって精製し、C5F活性の高い精製C5F溶液
を得る。得られたcsp 溶液の活性を正確に測定した
後、血清アルブミンまたはマンニトールなどの安定剤を
醪解し、凍結乾燥して、試薬あるいは医桑品を得る。
子(C5F )を製造するには、1)υ述のクローニン
グにおいて得られた血清および蛋白質を含まない@池に
おいて良好に増殖し、かつ高力価のC5Fを産生する株
化細胞(r、csF産生株化細胞」という)を、組織培
養用培地において、培地の表面にfill 1121が
a5集するまで、増殖し、増殖したC5F産生株化1t
lllδを回収し、これを別の培a器の培地に植え継ぎ
、培地を交換しながらS%co の下で培養を読ける
。回収した培′a液はcsFを含んでおり、これを集め
て、醐過または遠心分離によって細胞片または他の浮遊
物を除去した後、真空m縮あるいは限外濾過などによっ
てnl媚し、C3F活性の高い濃縮液を得る。この濃縮
液を、塩析−1吸着−1逆相−、ゲル濾過−1または高
速−などのクロマトグラフィーあるいは4気泳唾などの
常法によって精製し、C5F活性の高い精製C5F溶液
を得る。得られたcsp 溶液の活性を正確に測定した
後、血清アルブミンまたはマンニトールなどの安定剤を
醪解し、凍結乾燥して、試薬あるいは医桑品を得る。
C5F産生株化細胞の培養に使用する培地は、それぞれ
のnoが増殖する培地であれば、いかなる培地であって
も、これを(受用することができるが、C5F産生株化
細胞の4類によって適宜選択される。
のnoが増殖する培地であれば、いかなる培地であって
も、これを(受用することができるが、C5F産生株化
細胞の4類によって適宜選択される。
たとえば、前記のT3M5@胞から馴化された細胞を培
養する場合、ダルベコ改変培地とハムFIO培Qll
(Ham s FIOmedium) (Exper
imentalCall Re5earch ;
第29巻 第515〜5261′i(1963年)〕の
2対1〜1対2 (特に好ましくは1対1)の混合培地
、ロスウェル・パーク・メモリアル・インスティチュー
ト培M (RoswellPark Memorial
In5titute media) (中井準之助
ら編;組織培養、第12頁、朝食書店(1978年)〕
またはマツコイ5A培地(McCoy s 5A me
dium )(H,J、 Morton ; In V
itro+ Wr 6巻筒89頁(1970年)〕を使
用することができる。
養する場合、ダルベコ改変培地とハムFIO培Qll
(Ham s FIOmedium) (Exper
imentalCall Re5earch ;
第29巻 第515〜5261′i(1963年)〕の
2対1〜1対2 (特に好ましくは1対1)の混合培地
、ロスウェル・パーク・メモリアル・インスティチュー
ト培M (RoswellPark Memorial
In5titute media) (中井準之助
ら編;組織培養、第12頁、朝食書店(1978年)〕
またはマツコイ5A培地(McCoy s 5A me
dium )(H,J、 Morton ; In V
itro+ Wr 6巻筒89頁(1970年)〕を使
用することができる。
培養に使用する培養器は、通常の培養に使用されるもの
であれば、いかなるものであっても、これを使用するこ
とができるが、フラスコ、ローラーボトルまたはマイク
ロキャリアーを使用するのが好ましい。ローラーボトル
またはマイクロキャリアーを使用する場合は、密閉系と
し、必ずしもCOの送入を要しない。
であれば、いかなるものであっても、これを使用するこ
とができるが、フラスコ、ローラーボトルまたはマイク
ロキャリアーを使用するのが好ましい。ローラーボトル
またはマイクロキャリアーを使用する場合は、密閉系と
し、必ずしもCOの送入を要しない。
以下において、本発明の実施の一例を示す参考例および
実施例を説明するが、本発明は必ずしも、これらの例に
限定されるものではない。
実施例を説明するが、本発明は必ずしも、これらの例に
限定されるものではない。
参考例1
人の甲状腺ガン@胞から得たT3M5細胞(4,0ka
be et al ;JNCI+第69巻、$ 123
5〜1243頁(1978年)〕の@養において、血清
濃度および蛋白質4度を少しずつ低下しながら6ケ月継
代培養して、血清および蛋白質を含まない培地において
生育しうるT3M5細胞(「馴化T3M5細咽」という
)を得た。
be et al ;JNCI+第69巻、$ 123
5〜1243頁(1978年)〕の@養において、血清
濃度および蛋白質4度を少しずつ低下しながら6ケ月継
代培養して、血清および蛋白質を含まない培地において
生育しうるT3M5細胞(「馴化T3M5細咽」という
)を得た。
この511化r3M5[IJlをトリプシンおよびED
TAで処理した後、ダルベコ改変培地とハムPlOr3
曲のl対lの混合培地に、細胞4度が5個/nLlにな
るように浮遊したつ得られた細胞浮遊液を、96穴培界
プレートの各穴に、細胞が平均1藺/穴ずつ入るように
、0.2aeずつ分注した。37℃において8日111
1L合養した後、@立顕微鏡により倹唖し、各穴の培養
上澄のC5F活性を測定し、そのうちC5F生産能が高
く、生育の良好な!+1化T3M5細抱を選抜した。選
抜された馴化13M5細胞について同様のクローニング
を2回行ない、これによりT 3 N+ 5細胞と同等
のC3F(500〜5000 u/ml!、)を産生ず
るクローン(r Blanche −−1jという)を
得た。
TAで処理した後、ダルベコ改変培地とハムPlOr3
曲のl対lの混合培地に、細胞4度が5個/nLlにな
るように浮遊したつ得られた細胞浮遊液を、96穴培界
プレートの各穴に、細胞が平均1藺/穴ずつ入るように
、0.2aeずつ分注した。37℃において8日111
1L合養した後、@立顕微鏡により倹唖し、各穴の培養
上澄のC5F活性を測定し、そのうちC5F生産能が高
く、生育の良好な!+1化T3M5細抱を選抜した。選
抜された馴化13M5細胞について同様のクローニング
を2回行ない、これによりT 3 N+ 5細胞と同等
のC3F(500〜5000 u/ml!、)を産生ず
るクローン(r Blanche −−1jという)を
得た。
このBlanche−1は以下の特徴を何していた。
a)細胞は上皮様形態を何し、その増殖は接着依存性で
ある。IIB胞は単層を形成して増殖するが、培養面に
密につまるまで増殖した後は、培#細胞上に細胞の塊を
形成し、上方にも増殖する。
ある。IIB胞は単層を形成して増殖するが、培養面に
密につまるまで増殖した後は、培#細胞上に細胞の塊を
形成し、上方にも増殖する。
b)継代培養は限界なく可能である。
c)10%のジメチルスルホキシドを含む組織培養用培
地に、106〜108個/ rrLilの割合で、浮遊
させると、液体窒素中において長期間保存することがで
きる。
地に、106〜108個/ rrLilの割合で、浮遊
させると、液体窒素中において長期間保存することがで
きる。
d)ダルベコ改変培地とハムFIO培地の1対1の混合
五&地におけるm Illの倍加時間は18〜24時間
である。
五&地におけるm Illの倍加時間は18〜24時間
である。
第2図は、直径35朋のプラスチックシャーレにおいて
、1×10個の細胞を、血清および蛋白質を含まないダ
ルベコ改変培地とハムFIO培地のl対lの混合培地4
mJに加え、37°Cにおいて、COの存在下に培養
したときの細胞の増殖細礫である。図中の欠口は培地の
交換を示す。8日間の培養において、wlI12I数は
40 X 10 個に増加し、細胞倍加時間は約19
時間であった。前記の0kabeらは、lO%牛血清を
含む培地において13M5細胞を培養したときの細胞倍
加時間を22時間と報告しているから、Blanche
−1は、血清および蛋白質を含まない培地における培
養でも、その細胞倍加時間は13M5細胞より短い。
、1×10個の細胞を、血清および蛋白質を含まないダ
ルベコ改変培地とハムFIO培地のl対lの混合培地4
mJに加え、37°Cにおいて、COの存在下に培養
したときの細胞の増殖細礫である。図中の欠口は培地の
交換を示す。8日間の培養において、wlI12I数は
40 X 10 個に増加し、細胞倍加時間は約19
時間であった。前記の0kabeらは、lO%牛血清を
含む培地において13M5細胞を培養したときの細胞倍
加時間を22時間と報告しているから、Blanche
−1は、血清および蛋白質を含まない培地における培
養でも、その細胞倍加時間は13M5細胞より短い。
e)培養上澄中にC5F活性を有し、その活性は前記の
73M5細qとほぼ同等である。
73M5細qとほぼ同等である。
第1図は、前記の13M5細胞を、1%牛脂児血清を含
むダルベコ改変培地とハムPLO培地の1対lの混合培
地において、培養面に細胞が密集するまで培養した後、
培地を、血清を含まないダルベコ改変培地とハムFIO
培地の1対1の混合培地と交換して、培養を行なったと
きに培養液中に産生するC5Fの経日変化(0−0)、
およびBlanche lを、血清を含まないダルベ
コ改変培地とハムFIO培旭の1対1の混合培地におい
て、前記と同様に培養を行なったときに培養液中Gこ産
生するC5Fの経日変化(・−・)を示す。
むダルベコ改変培地とハムPLO培地の1対lの混合培
地において、培養面に細胞が密集するまで培養した後、
培地を、血清を含まないダルベコ改変培地とハムFIO
培地の1対1の混合培地と交換して、培養を行なったと
きに培養液中に産生するC5Fの経日変化(0−0)、
およびBlanche lを、血清を含まないダルベ
コ改変培地とハムFIO培旭の1対1の混合培地におい
て、前記と同様に培養を行なったときに培養液中Gこ産
生するC5Fの経日変化(・−・)を示す。
第1図の結果によると、l:1lanche −1のC
5F活性は、T3λI5細胞のそれに比べて、1日目、
3日目および5日目において1.やや低い値を示すが、
7日目において高い値を示す。C5Fの製造では、7日
以上細胞の培養を続けるので、Blanche−1は、
73M5細胞と比較して、はとんど変らない高力価のC
3Fを産生ずる。
5F活性は、T3λI5細胞のそれに比べて、1日目、
3日目および5日目において1.やや低い値を示すが、
7日目において高い値を示す。C5Fの製造では、7日
以上細胞の培養を続けるので、Blanche−1は、
73M5細胞と比較して、はとんど変らない高力価のC
3Fを産生ずる。
実施例1
ダルベコ改変培地(Flow Laboratorie
s社製)とハムFIO培地(Flow Laborat
ories社製)の1対1の混合培地2!に炭酸水素ナ
トリウムを添加するため7%(重ff1)注射用液(万
有製薬社)をll当り35〜加え、ストレプトマイシン
(明治製菓社)を1100rrL/iペニシリンGカリ
ウム(万有製藁社)を100000 Ik位/lのそれ
ぞれの割合で加えた。この混合培地にBlanche
−1を接種し、175cItプラスチツクフラスコ (
Fa 1con社製)に密集するまで増殖培養し、トリ
プシン0.25%(屯:11)−EDT八混へ危(Gi
bco社製)を用いて約1×lO7個のBLanche
−tを回収し、約6oocJスクウエアデイツシユ(
Nunc社製)に前記混合培地200 rnfiと、と
もに加え、37°CN5%CO↓音養器で培養した。3
日目に培地を交換し、7日目に細胞がシャーレ−面に広
がったので、(に培地を交換し、前記と同一条件で更に
6日間培養し、培養液を回収した。前記と同様の操作を
5枚の約600cJスクウエアデイツシユについて行な
い、培養液約27!を得た。培養液を遠心分離(200
0G 、 20分)して浮遊物を除き、NaN を0
.02%(重電)、トウイーン20を0.02%(重電
)の割合で加え、限外?慮過膜Y%+ 10 (Am
lcon社製)を用いてl0alに濃縮した。この時の
比活性は、5XlOU/TLg蛋白質であった。前記濃
縮液10rrLgをo、 I M Tris −HCI
44ti(pH7)llに対してl IN 4°Cで
透析し、同一の緩衝液で平台化したDEA[E−セルロ
ースカラム(2XlO0cm)にかけ、0〜1.ONa
clの0度勾配を有する0、I M Tris −HC
I (pH7) 緩amfPiにより40rrLl
/ hrのl痛速で1谷出し、6 rnlづつ分1収し
て合@f 1400 ntllの溶出αをfυた。活性
を有する分画18ffLJ!を4rrL71!にθコ縮
し、TSK −Gel 3000 sv(21,5關X
600+u+) (東洋曹達社製)カラムを装着した
高速液体クロマトグラフィーにかけた。
s社製)とハムFIO培地(Flow Laborat
ories社製)の1対1の混合培地2!に炭酸水素ナ
トリウムを添加するため7%(重ff1)注射用液(万
有製薬社)をll当り35〜加え、ストレプトマイシン
(明治製菓社)を1100rrL/iペニシリンGカリ
ウム(万有製藁社)を100000 Ik位/lのそれ
ぞれの割合で加えた。この混合培地にBlanche
−1を接種し、175cItプラスチツクフラスコ (
Fa 1con社製)に密集するまで増殖培養し、トリ
プシン0.25%(屯:11)−EDT八混へ危(Gi
bco社製)を用いて約1×lO7個のBLanche
−tを回収し、約6oocJスクウエアデイツシユ(
Nunc社製)に前記混合培地200 rnfiと、と
もに加え、37°CN5%CO↓音養器で培養した。3
日目に培地を交換し、7日目に細胞がシャーレ−面に広
がったので、(に培地を交換し、前記と同一条件で更に
6日間培養し、培養液を回収した。前記と同様の操作を
5枚の約600cJスクウエアデイツシユについて行な
い、培養液約27!を得た。培養液を遠心分離(200
0G 、 20分)して浮遊物を除き、NaN を0
.02%(重電)、トウイーン20を0.02%(重電
)の割合で加え、限外?慮過膜Y%+ 10 (Am
lcon社製)を用いてl0alに濃縮した。この時の
比活性は、5XlOU/TLg蛋白質であった。前記濃
縮液10rrLgをo、 I M Tris −HCI
44ti(pH7)llに対してl IN 4°Cで
透析し、同一の緩衝液で平台化したDEA[E−セルロ
ースカラム(2XlO0cm)にかけ、0〜1.ONa
clの0度勾配を有する0、I M Tris −HC
I (pH7) 緩amfPiにより40rrLl
/ hrのl痛速で1谷出し、6 rnlづつ分1収し
て合@f 1400 ntllの溶出αをfυた。活性
を有する分画18ffLJ!を4rrL71!にθコ縮
し、TSK −Gel 3000 sv(21,5關X
600+u+) (東洋曹達社製)カラムを装着した
高速液体クロマトグラフィーにかけた。
0.01%(重量)ポリエチレングリコールを含む0.
2Mリン酸塩緩衝液(pit 7.0 )を6 rrL
J / winの流速で通液し、6alづつ分取し、比
活性1.2×10U/igi白質のC5F活性分画約2
4 nLe jE−得た。
2Mリン酸塩緩衝液(pit 7.0 )を6 rrL
J / winの流速で通液し、6alづつ分取し、比
活性1.2×10U/igi白質のC5F活性分画約2
4 nLe jE−得た。
実施例2
ダルベコ改変培地とハムFIO培地の2対lの混合培地
20Aに炭酸水素ナトリウム粉末を2.86jj/l
、ストレプトマイシンをtoomg//!、ペニシリン
Gカリウムを1ooooo m位/lおよびファンギゾ
ン(三共株式会社)を1.5 rnfi / lのそれ
ぞれの割合で加えた。実施例1と同一条件で回収したB
lanche −1細胞l×10個と混合培地200
rallを+10 X 285 menローラーボトル
(Wheaton社製)に入れ、回転数3drpm、3
7℃で培養し、3日目に前記と同一培地と交換し、7日
目でほぼ細胞が密集したので、更に培地を交換し、前記
と同一条件で更に7日間培養を行ない培養液を回収した
。次に新しい培地200 rrLJを入れ、同様の操作
をくりかえし、合tt5回の回収を行ない、ローラーボ
トル1本当り約12の培養液を得た。前記操作を同時に
20本のローラーボトルで行ない、合計的201の回収
液を得た。この回収液をガラス繊錐濾紙Ac too
(東洋科学産業社a!iりを用いて吸引直過し、Na
N とトウイーン20をそれぞれ0.02%(重量)
の割合で加え、限外濾過ホロファイバー5IP−101
3(旭化成社製)及びYM 10を用いて約30m、l
に+IB縮した。濃縮液は価白質含4600 mg、総
活性3 X 107U 、比活性は6×lOU/叫蛋白
質であった。前記濃縮液約30n2を1%(重量)グリ
シン溶液21に対して1晩透析した後2回に分けて調製
用等電点電気泳動を行なった。 LKB社製フラットベ
ッド泳動装置を用い、アンフオライン(LKB社製)
pH3,5−5とpH4−6のものを70rILlゲ
ル当りそれぞれ2.5rILgづつ加えた。4°Cで3
0時間泳動し、泳動電圧が1300 Vに上昇したとこ
ろで泳動を停止し、ただちにステンレスのフレームを差
し込み、No、 15〜20の活性分画のゲルを0.0
1 M Tris −HCI(pH7)緩衝)夜にて抽
出した。2回の泳動の活性区分を集め、1OiJにt濃
縮し、01OI MTris −HCI (pH7)
till衝液IJに対して透析し、セファデックスG
100 (6X45cm)カラムにかけた。0.
02 M NaC1を含む0.01 NI Tris
−oCl(pH7)を20 we / hrの流速で通
液し、5、OiAづつ分取し、比活性7×10U/ig
i臼質のC5F活性分画約20m1を得た。
20Aに炭酸水素ナトリウム粉末を2.86jj/l
、ストレプトマイシンをtoomg//!、ペニシリン
Gカリウムを1ooooo m位/lおよびファンギゾ
ン(三共株式会社)を1.5 rnfi / lのそれ
ぞれの割合で加えた。実施例1と同一条件で回収したB
lanche −1細胞l×10個と混合培地200
rallを+10 X 285 menローラーボトル
(Wheaton社製)に入れ、回転数3drpm、3
7℃で培養し、3日目に前記と同一培地と交換し、7日
目でほぼ細胞が密集したので、更に培地を交換し、前記
と同一条件で更に7日間培養を行ない培養液を回収した
。次に新しい培地200 rrLJを入れ、同様の操作
をくりかえし、合tt5回の回収を行ない、ローラーボ
トル1本当り約12の培養液を得た。前記操作を同時に
20本のローラーボトルで行ない、合計的201の回収
液を得た。この回収液をガラス繊錐濾紙Ac too
(東洋科学産業社a!iりを用いて吸引直過し、Na
N とトウイーン20をそれぞれ0.02%(重量)
の割合で加え、限外濾過ホロファイバー5IP−101
3(旭化成社製)及びYM 10を用いて約30m、l
に+IB縮した。濃縮液は価白質含4600 mg、総
活性3 X 107U 、比活性は6×lOU/叫蛋白
質であった。前記濃縮液約30n2を1%(重量)グリ
シン溶液21に対して1晩透析した後2回に分けて調製
用等電点電気泳動を行なった。 LKB社製フラットベ
ッド泳動装置を用い、アンフオライン(LKB社製)
pH3,5−5とpH4−6のものを70rILlゲ
ル当りそれぞれ2.5rILgづつ加えた。4°Cで3
0時間泳動し、泳動電圧が1300 Vに上昇したとこ
ろで泳動を停止し、ただちにステンレスのフレームを差
し込み、No、 15〜20の活性分画のゲルを0.0
1 M Tris −HCI(pH7)緩衝)夜にて抽
出した。2回の泳動の活性区分を集め、1OiJにt濃
縮し、01OI MTris −HCI (pH7)
till衝液IJに対して透析し、セファデックスG
100 (6X45cm)カラムにかけた。0.
02 M NaC1を含む0.01 NI Tris
−oCl(pH7)を20 we / hrの流速で通
液し、5、OiAづつ分取し、比活性7×10U/ig
i臼質のC5F活性分画約20m1を得た。
実施例3
実施例1に記載の混合培地を使用したウシリコンコーテ
ィングしたマイクロキャリアー用容器マブナフレックス
3β用(Wheaton社製)4個それぞれにベントレ
ゲル(Ventrex Biotechnology社
gJ) tsom7HとBlanche−1を:lX
10 個、そして混合培地を17!加え、37°C,5
%CO培養器に1日静置後、さらに培1t!!2Jを加
え32とし、容器の撹拌を開始し、37℃にて細胞の増
殖を行なった。ここで接種したBlanche −1細
胞は、スフウェアディツシュ約600 crlt 5枚
に密集するまで培養したものをトVプシンーEDTA処
理で回収したものを使用したう培地は毎日1.5βづつ
交換し、撹拌開始後7日目にマイクロキャリアーの培養
表面に細胞が密集したので、1日22づつ培地の回収を
行ない、新しい培地と交換した。前記4個の容器から1
日約82の培養上澄を回収し、この操作をつづけること
で、約120 Aの培養上澄を回収した。得た回収液は
ガラスma濾紙を用いて吸引濾過い粗大浮遊物、沈殿物
を除き、NaN3とトウイーン20をそれぞれ0.02
%の割合で加え、ホロファイバーSIP −1013と
YMIOを用い、150 TLl ニtT’AI@bり
、総活性2X10U、ffl白質含t、la、tgであ
った。F1a液を0.01 M Tris−HCI緩衝
液(pH7,4)に1晩透析し、同様の緩衝液で洗浄し
であるDEAE −5epharose CL −6B
(60×75M)カラムに板葺させ、0〜0.2MNa
C1を含む0−01 M Tris −ICI 援J7
液による母度勾配溶出法により、吸イクし1こ蛋白質を
溶出せしめた。その流速は、60 rrLil / h
rとし、20rnl!、づつ分取した。そして、流出し
た活性分画160rIL/:をYM 10を用いてto
mgに濃縮した。これを0.01 M Tris −H
CI 4衝液(pH7,4)IAに対して1晩透析し、
同溶液で洗浄しであるセファデックスG−75カラム(
4X50Ci)にかけた。
ィングしたマイクロキャリアー用容器マブナフレックス
3β用(Wheaton社製)4個それぞれにベントレ
ゲル(Ventrex Biotechnology社
gJ) tsom7HとBlanche−1を:lX
10 個、そして混合培地を17!加え、37°C,5
%CO培養器に1日静置後、さらに培1t!!2Jを加
え32とし、容器の撹拌を開始し、37℃にて細胞の増
殖を行なった。ここで接種したBlanche −1細
胞は、スフウェアディツシュ約600 crlt 5枚
に密集するまで培養したものをトVプシンーEDTA処
理で回収したものを使用したう培地は毎日1.5βづつ
交換し、撹拌開始後7日目にマイクロキャリアーの培養
表面に細胞が密集したので、1日22づつ培地の回収を
行ない、新しい培地と交換した。前記4個の容器から1
日約82の培養上澄を回収し、この操作をつづけること
で、約120 Aの培養上澄を回収した。得た回収液は
ガラスma濾紙を用いて吸引濾過い粗大浮遊物、沈殿物
を除き、NaN3とトウイーン20をそれぞれ0.02
%の割合で加え、ホロファイバーSIP −1013と
YMIOを用い、150 TLl ニtT’AI@bり
、総活性2X10U、ffl白質含t、la、tgであ
った。F1a液を0.01 M Tris−HCI緩衝
液(pH7,4)に1晩透析し、同様の緩衝液で洗浄し
であるDEAE −5epharose CL −6B
(60×75M)カラムに板葺させ、0〜0.2MNa
C1を含む0−01 M Tris −ICI 援J7
液による母度勾配溶出法により、吸イクし1こ蛋白質を
溶出せしめた。その流速は、60 rrLil / h
rとし、20rnl!、づつ分取した。そして、流出し
た活性分画160rIL/:をYM 10を用いてto
mgに濃縮した。これを0.01 M Tris −H
CI 4衝液(pH7,4)IAに対して1晩透析し、
同溶液で洗浄しであるセファデックスG−75カラム(
4X50Ci)にかけた。
0−15 M NaC1を含む0.01 M Tris
−HCI (pH7−4)!衝液を20 rrLJ
g / hrの流速で通液し、5rrLlづつ分取し、
比活性1.2X10 u/71L9?Ji白nのC3
F活性分画約25m/!を得た。
−HCI (pH7−4)!衝液を20 rrLJ
g / hrの流速で通液し、5rrLlづつ分取し、
比活性1.2X10 u/71L9?Ji白nのC3
F活性分画約25m/!を得た。
本発明によって奏せられる効果は次のとおりである。
H)血清および蛋白質を含まないs池で細胞を培養する
ので、得られるC5F含有培善液に人の組織から分屋さ
れた細胞由来の蛋白質以外のきよう雑出口質が少ない。
ので、得られるC5F含有培善液に人の組織から分屋さ
れた細胞由来の蛋白質以外のきよう雑出口質が少ない。
(2)培−a液からのC3Fのg唖が容易である。
(3)高力価のC5Fを得ることができるう(4)培養
液中のC5F活性が一定している(血清を用いる場合は
血清のロットによりC5F活性が変励する)っ (5)使用する培地に人にとって異種の蛋白質が含まれ
ていないので、医薬品として安全である。
液中のC5F活性が一定している(血清を用いる場合は
血清のロットによりC5F活性が変励する)っ (5)使用する培地に人にとって異種の蛋白質が含まれ
ていないので、医薬品として安全である。
(6)局側な血清または補助的蛋白質を使用しないので
、製造コストが安価である。
、製造コストが安価である。
m1図は、T 3 %+ 5細胞及びBlanche
−1の培養蔽中のC5F活性の経日変化を示す図表、お
よび第2図は、Blanche −1の細胞増殖曲線を
示す図表である。 出頭人 森永乳業株式会社
−1の培養蔽中のC5F活性の経日変化を示す図表、お
よび第2図は、Blanche −1の細胞増殖曲線を
示す図表である。 出頭人 森永乳業株式会社
Claims (6)
- (1)人の組織から分離された細胞のクローンであって
血清および蛋白質を含まない組織培養用培地で増殖し、
かつ人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖促進物質を産生す
る性質を有することを特徴とする人顆粒球系前駆細胞の
分化・増殖因子産生細胞。 - (2)人の組織から分離された細胞が人の甲状線の株化
細胞であることを特徴とする特許請求の範囲第1項に記
載の人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子産生細胞。 - (3)1×10^5個/cm^2の人の組織から分離さ
れた細胞を血清および蛋白質を含まないダルベコ改変培
地とハムF10培地とのほば1対1の混合培地にて37
℃で5%(容量)炭酸ガスの存在下で培養したとき、培
地上澄1ml当り少なくとも500単位の人顆粒球系前
駆細胞の分化・増殖因子産生能を有することを特徴とす
る特許請求の範囲第1項又は第2項のいずれかに記載の
人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子産生細胞。 - (4)人の組織から分離された細胞のクローンであって
血清および蛋白質を含まない培地で増殖し、かつ人顆粒
球系前駆細胞の分化・増殖因子を産生する性質を有する
細胞を、血清および蛋白質を含まない組織培養用培地で
培養し、培地中に人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子
を産生せしめ、培地から人顆粒球系前駆細胞の分化・増
殖因子を採取することを特徴とする人顆粒球系前駆細胞
の分化・増殖因子の製造法。 - (5)人の組織から分離された細胞が人の甲状腺の株化
細胞であることを特徴とする特許請求の範囲第4項に記
載の人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子の製造法。 - (6)組織培養用培地が血清および蛋白質を含まないダ
ルベコ改変培地とハムF10培地とのほぼ1対1の混合
培地であることを特徴とする特許請求の範囲第4項又は
第5項のいずれかに記載の人顆粒球系前駆細胞の分化・
増殖因子の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59201944A JPS6181781A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子産生細胞および人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59201944A JPS6181781A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子産生細胞および人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子の製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6181781A true JPS6181781A (ja) | 1986-04-25 |
Family
ID=16449361
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59201944A Pending JPS6181781A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子産生細胞および人顆粒球系前駆細胞の分化・増殖因子の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6181781A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62174026A (ja) * | 1985-10-04 | 1987-07-30 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 白血球減少症治療剤 |
JPS63146827A (ja) * | 1986-07-18 | 1988-06-18 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 安定な顆粒球コロニ−刺激因子含有製剤 |
JPS63152326A (ja) * | 1986-07-18 | 1988-06-24 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 安定な顆粒球コロニ−刺激因子含有製剤 |
-
1984
- 1984-09-28 JP JP59201944A patent/JPS6181781A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62174026A (ja) * | 1985-10-04 | 1987-07-30 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 白血球減少症治療剤 |
JPS63146827A (ja) * | 1986-07-18 | 1988-06-18 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 安定な顆粒球コロニ−刺激因子含有製剤 |
JPS63152326A (ja) * | 1986-07-18 | 1988-06-24 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 安定な顆粒球コロニ−刺激因子含有製剤 |
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