JPH0657157B2 - Ｂ細胞分化因子の製造法 - Google Patents
Ｂ細胞分化因子の製造法Info
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- JPH0657157B2 JPH0657157B2 JP59235199A JP23519984A JPH0657157B2 JP H0657157 B2 JPH0657157 B2 JP H0657157B2 JP 59235199 A JP59235199 A JP 59235199A JP 23519984 A JP23519984 A JP 23519984A JP H0657157 B2 JPH0657157 B2 JP H0657157B2
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- Japan
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- bcdf
- cells
- medium
- human
- producing
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、人について活性を有するＢ細胞分化因子
（以下「ＢＣＤＦ」と記す）に関する。
（以下「ＢＣＤＦ」と記す）に関する。
従来の技術 抗原刺激を受けた活性化された成熟Ｂ細胞は、Ｔ細胞の
助けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗体産生細
胞にまで最終的に分化するには、１種またはそれ以上の
Ｔ細胞由来の分化誘導性の物質が必須であることが知ら
れている。この物質の存在はアール・ダブリュ・ダッド
ンら、トランスプランテーションレビュー(Transplant.
Rev.)23,66(1975)，エイ・シンプルとイー・ウェッカー
ら、ネイチャー・ニュー・バイオロジー(Nature N.Bio
l.)237,15(1972)，により明らかにされた。彼らはマウ
スのリンパ球混合物培養後の培養上清中または抗原やマ
イトゲンにより刺激を受けたマウスのリンパ球培養上清
中に存在する物質が、マウスのＴ細胞を除去されたリン
パ球細胞集団やヌードマウス由来のリンパ球のヒツジ赤
血球（ＳＲＢＣ）に対する１次免疫応答を増幅させるこ
とを見出し、そのような作用を有する活性物質にリンパ
球代替因子、すなわちＴＲＦという呼称を与えた。それ
以来ＴＲＦは、抗原非特異的に主要組織適合遺伝子複合
体（以下、ＭＨＣと略称する。）の一致を必要としない
様式でＢ細胞に作用し、Ｂ細胞の分裂増殖を誘導せず、
Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を誘導する液性因子であ
ると定義されている。
助けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗体産生細
胞にまで最終的に分化するには、１種またはそれ以上の
Ｔ細胞由来の分化誘導性の物質が必須であることが知ら
れている。この物質の存在はアール・ダブリュ・ダッド
ンら、トランスプランテーションレビュー(Transplant.
Rev.)23,66(1975)，エイ・シンプルとイー・ウェッカー
ら、ネイチャー・ニュー・バイオロジー(Nature N.Bio
l.)237,15(1972)，により明らかにされた。彼らはマウ
スのリンパ球混合物培養後の培養上清中または抗原やマ
イトゲンにより刺激を受けたマウスのリンパ球培養上清
中に存在する物質が、マウスのＴ細胞を除去されたリン
パ球細胞集団やヌードマウス由来のリンパ球のヒツジ赤
血球（ＳＲＢＣ）に対する１次免疫応答を増幅させるこ
とを見出し、そのような作用を有する活性物質にリンパ
球代替因子、すなわちＴＲＦという呼称を与えた。それ
以来ＴＲＦは、抗原非特異的に主要組織適合遺伝子複合
体（以下、ＭＨＣと略称する。）の一致を必要としない
様式でＢ細胞に作用し、Ｂ細胞の分裂増殖を誘導せず、
Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を誘導する液性因子であ
ると定義されている。
その後、このようなＢ細胞分化因子の存在を示す証拠が
蓄積されており、人においてもマウス同様の分化因子の
存在が示唆されている。現在では上述のように定義され
たＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子をＢＣＤＦと
総称するようになった。
蓄積されており、人においてもマウス同様の分化因子の
存在が示唆されている。現在では上述のように定義され
たＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子をＢＣＤＦと
総称するようになった。
このようにＢＣＤＦは人の体内でＢ細胞の抗体産生機能
に重要な働きをしている。ＢＣＤＦの臨床への応用は大
別して３つ考えられる。第１はＢＣＤＦによりＢＣＤＦ
抗体を作り、ＢＣＤＦと抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤＦ
のイムノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に用
いることが出来る。第２の応用は各種疾患の治療への応
用である。例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にともな
うＢ細胞抗体産生能低下による免疫不全症患者にＢＣＤ
Ｆ単独または他のリンホカインと共に投与することによ
り抗体産生機能を正常に戻すことが考えられる。
に重要な働きをしている。ＢＣＤＦの臨床への応用は大
別して３つ考えられる。第１はＢＣＤＦによりＢＣＤＦ
抗体を作り、ＢＣＤＦと抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤＦ
のイムノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に用
いることが出来る。第２の応用は各種疾患の治療への応
用である。例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にともな
うＢ細胞抗体産生能低下による免疫不全症患者にＢＣＤ
Ｆ単独または他のリンホカインと共に投与することによ
り抗体産生機能を正常に戻すことが考えられる。
さらにＢＣＤＦの応用として次のことが考えられる。Ｂ
細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）（ケイ・ヨシザキら、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー(J.of Immunol.)130,1241(19
83)）、その他のリンホカインを含むＴ細胞因子を培地
に加えることにより正常Ｂ細胞を長期培養できることが
報告されている（ビー・スレドニら、ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メディシン(J.Exp.Med),154,15
00(1981)参照）。これらの培養正常Ｂ細胞に対し、適当
な時期にＢＣＤＦを作用させることにより生体外で抗体
を産生させることが出来る。特定の抗体、例えば、病原
細菌、病原ウイルス、病原原虫、癌細胞などの表面にあ
る特定抗原を認識する抗体を産生するＢ細胞をモノクロ
ーン化し、クローン化正常Ｂ細胞をＢＣＤＦとその他の
リンホカインを組合せて培養し、有用なモノクローナル
抗体を産生させることが出来る。これら抗体は感染症や
癌の治療および診断に利用できる。
細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）（ケイ・ヨシザキら、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー(J.of Immunol.)130,1241(19
83)）、その他のリンホカインを含むＴ細胞因子を培地
に加えることにより正常Ｂ細胞を長期培養できることが
報告されている（ビー・スレドニら、ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メディシン(J.Exp.Med),154,15
00(1981)参照）。これらの培養正常Ｂ細胞に対し、適当
な時期にＢＣＤＦを作用させることにより生体外で抗体
を産生させることが出来る。特定の抗体、例えば、病原
細菌、病原ウイルス、病原原虫、癌細胞などの表面にあ
る特定抗原を認識する抗体を産生するＢ細胞をモノクロ
ーン化し、クローン化正常Ｂ細胞をＢＣＤＦとその他の
リンホカインを組合せて培養し、有用なモノクローナル
抗体を産生させることが出来る。これら抗体は感染症や
癌の治療および診断に利用できる。
従来ＢＣＤＦを得るには、人末梢血などより分離した正
常人Ｔ細胞をマイトーゲン刺激することによりＢＣＤＦ
を産生させる方法が採られてきた。この方法では、Ｔ細
胞を十分得ることが困難である点、マイトーゲンを用い
たため、ＢＣＤＦに有害なマイトーゲンが混入し、これ
を除去するのが困難である点、またＴ細胞培養にはウシ
胎児血清など血清成分を培地に添加する必要があり、こ
れら添加タンパク質とＢＣＤＦを十分分離することが出
来ず、ＢＣＤＦを医療に用いるには、純化ＢＣＤＦが得
られぬことが障害となっている点など問題が多く、工業
的にＢＣＤＦを産生することは出来なかった。また人Ｔ
細胞を人癌細胞と細胞融合して人Ｔ融合細胞を得、これ
によりＢＣＤＦを産生せしめる方法も報告されている
（オカダら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
メデイシン(J.Exp.Med.),157,583(1983)）。しかし、人
融合細胞は継代中、リンホカイン産生能が低下してゆく
ことが多く、実用的ＢＣＤＦ産生人融合細胞は未だな
い。
常人Ｔ細胞をマイトーゲン刺激することによりＢＣＤＦ
を産生させる方法が採られてきた。この方法では、Ｔ細
胞を十分得ることが困難である点、マイトーゲンを用い
たため、ＢＣＤＦに有害なマイトーゲンが混入し、これ
を除去するのが困難である点、またＴ細胞培養にはウシ
胎児血清など血清成分を培地に添加する必要があり、こ
れら添加タンパク質とＢＣＤＦを十分分離することが出
来ず、ＢＣＤＦを医療に用いるには、純化ＢＣＤＦが得
られぬことが障害となっている点など問題が多く、工業
的にＢＣＤＦを産生することは出来なかった。また人Ｔ
細胞を人癌細胞と細胞融合して人Ｔ融合細胞を得、これ
によりＢＣＤＦを産生せしめる方法も報告されている
（オカダら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
メデイシン(J.Exp.Med.),157,583(1983)）。しかし、人
融合細胞は継代中、リンホカイン産生能が低下してゆく
ことが多く、実用的ＢＣＤＦ産生人融合細胞は未だな
い。
発明が解決しようとする問題点 従ってこの発明の目的は、ＢＣＤＦのより効率のよい製
造法を見い出すことにある。
造法を見い出すことにある。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、人Ｔ細胞白血病ウイルス（以下「ＨＴＬ
Ｖ」と記す）により形質転換された人Ｔ細胞が高い効率
でＢＣＤＦを生産することを見い出した。即ち、この発
明は、ＨＴＬＶにより形質転換された人Ｔ細胞を培養
し、生成したＢ細胞分化因子を採取し、精製することを
特徴とする下記の性質を有するＢ細胞分化因子の製造法
である。
Ｖ」と記す）により形質転換された人Ｔ細胞が高い効率
でＢＣＤＦを生産することを見い出した。即ち、この発
明は、ＨＴＬＶにより形質転換された人Ｔ細胞を培養
し、生成したＢ細胞分化因子を採取し、精製することを
特徴とする下記の性質を有するＢ細胞分化因子の製造法
である。
(1)分子量 3.5±0.5×104ダルトン（ゲル濾過法） 2.2±0.2×104ダルトン（ＳＤＳ・ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法） (2)Ｎ−末端部分のアミノ酸配列 Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Al
a 人ＢＣＤＦ産生人Ｔ細胞株の作製は以下のように行なう
ことが出来る。人の末梢血・扁桃・臍帯血などよりフイ
コールパックなどを用いた密度勾配遠心法等でリンパ球
を分離し、エヌ・ヤマモト、サイエンス(Science)217,7
37(1982)の方法に準じてＨＴＬＶを用いて人Ｔ細胞を形
質転換（トランスフォーメーション）する。たとえば下
記の方法を用いることができる。ウイルス産生細胞株Ｍ
Ｔ−２をＸ線照射（１２０００〜１４０００ラド）で不
活性化した細胞１×１０７／mlと、上述のようにして得
た人リンパ球１×１０７／mlを２０％ＦＣＳ，１００μ
ｇ／mlカナマイシン、２μｇ／ml NaHCO3、２５mMＮ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンス
ルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を
入れたプラスチックシャーレ（ファルコン＃３００８）
に接種し５％ CO2存在下３７℃で培養する。１週間に
２回、半分の培地を新鮮な培地と交換しつつ２〜３ヵ月
培養した後、リミティングダイリューション法により株
化する。株化した細胞の培養上清のＢＣＤＦ活性を測定
し、ＢＣＤＦ活性を有する株を得る。
ゲル電気泳動法） (2)Ｎ−末端部分のアミノ酸配列 Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Al
a 人ＢＣＤＦ産生人Ｔ細胞株の作製は以下のように行なう
ことが出来る。人の末梢血・扁桃・臍帯血などよりフイ
コールパックなどを用いた密度勾配遠心法等でリンパ球
を分離し、エヌ・ヤマモト、サイエンス(Science)217,7
37(1982)の方法に準じてＨＴＬＶを用いて人Ｔ細胞を形
質転換（トランスフォーメーション）する。たとえば下
記の方法を用いることができる。ウイルス産生細胞株Ｍ
Ｔ−２をＸ線照射（１２０００〜１４０００ラド）で不
活性化した細胞１×１０７／mlと、上述のようにして得
た人リンパ球１×１０７／mlを２０％ＦＣＳ，１００μ
ｇ／mlカナマイシン、２μｇ／ml NaHCO3、２５mMＮ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンス
ルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を
入れたプラスチックシャーレ（ファルコン＃３００８）
に接種し５％ CO2存在下３７℃で培養する。１週間に
２回、半分の培地を新鮮な培地と交換しつつ２〜３ヵ月
培養した後、リミティングダイリューション法により株
化する。株化した細胞の培養上清のＢＣＤＦ活性を測定
し、ＢＣＤＦ活性を有する株を得る。
この方法により株化した細胞としてたとえばＶＴ−１と
標識された人Ｔ細胞株を用いることが出来る。ＶＴ−１
を増殖させるための特別な条件はなく、一般に用いられ
ている培養条件を適宜採用して行なえばよい。また、Ｂ
ＣＤＦの産生も一般的な方法で行なえばよいが、好まし
くはタンパク質を含まない培地を用いて行なうべきであ
る。
標識された人Ｔ細胞株を用いることが出来る。ＶＴ−１
を増殖させるための特別な条件はなく、一般に用いられ
ている培養条件を適宜採用して行なえばよい。また、Ｂ
ＣＤＦの産生も一般的な方法で行なえばよいが、好まし
くはタンパク質を含まない培地を用いて行なうべきであ
る。
以下に、ＶＴ−１を用いてＢＣＤＦを製造する方法の１
例を示す。
例を示す。
ＶＴ−１を増殖させるのに好適な条件、たとえばウシ胎
児血清（ＦＣＳ）を含む培地にてＶＴ−１を培養し、Ｖ
Ｔ−１の細胞数を増やした後、細胞を分離洗浄してＢＣ
ＤＦ産生に最適な条件、たとえばＦＣＳなどのタンパク
質を含まぬ完全合成培地に細胞を移し、さらに培養する
ことにより夾雑タンパク質の少ないＢＣＤＦを得ること
ができる。
児血清（ＦＣＳ）を含む培地にてＶＴ−１を培養し、Ｖ
Ｔ−１の細胞数を増やした後、細胞を分離洗浄してＢＣ
ＤＦ産生に最適な条件、たとえばＦＣＳなどのタンパク
質を含まぬ完全合成培地に細胞を移し、さらに培養する
ことにより夾雑タンパク質の少ないＢＣＤＦを得ること
ができる。
ＶＴ−１を培養するのに用いる培地の主成分は市販の培
地でよい。例えばＲＰＭＩ１６４０培地、改良イーグル
培地（ＭＥＭ）、ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）またはクリック培地でよい。これらの培地に対する
添加物としてｉ）１ml当り約２０〜２５０単位、理想的
には１ml当り約１００単位のペニシリン、ii）１ml当り
１μｇ〜１００μｇ、理想的には１ml当り１０μｇのゲ
ンタマイシン、iii）１ml当り２０〜２５０μｇ、理想
的には１００μｇのストレプトマイシン、iv）１ml当り
約１００〜１０００μｇ、理想的には１ml当り約３００
μｇの新鮮Ｌ−グルタミン、ｖ）１０〜６０mM、理想的
には２５mMのヘペス緩衝液、vi）８〜２０mM、理想的に
は１６MmのNaHCO3、vii）５×１０−４〜５×１０−６
Ｍ、理想的には５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノ
ールなどを必要に応じて用いることが出来る。
地でよい。例えばＲＰＭＩ１６４０培地、改良イーグル
培地（ＭＥＭ）、ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）またはクリック培地でよい。これらの培地に対する
添加物としてｉ）１ml当り約２０〜２５０単位、理想的
には１ml当り約１００単位のペニシリン、ii）１ml当り
１μｇ〜１００μｇ、理想的には１ml当り１０μｇのゲ
ンタマイシン、iii）１ml当り２０〜２５０μｇ、理想
的には１００μｇのストレプトマイシン、iv）１ml当り
約１００〜１０００μｇ、理想的には１ml当り約３００
μｇの新鮮Ｌ−グルタミン、ｖ）１０〜６０mM、理想的
には２５mMのヘペス緩衝液、vi）８〜２０mM、理想的に
は１６MmのNaHCO3、vii）５×１０−４〜５×１０−６
Ｍ、理想的には５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノ
ールなどを必要に応じて用いることが出来る。
ＶＴ−１の細胞数を増やすのに最適な培地として、たと
えば上述の培地にさらに１〜３０％、好ましくは２０％
のＦＣＳを添加した培地を用いる。ＢＣＤＦ産生のため
の最適な培地としては、ＦＣＳを添加しない上述の培地
でよい。ＦＣＳを添加しない完全合成培地中で４８時間
培養後もＶＴ−１の生存率は７０％以上が保持されてい
る。
えば上述の培地にさらに１〜３０％、好ましくは２０％
のＦＣＳを添加した培地を用いる。ＢＣＤＦ産生のため
の最適な培地としては、ＦＣＳを添加しない上述の培地
でよい。ＦＣＳを添加しない完全合成培地中で４８時間
培養後もＶＴ−１の生存率は７０％以上が保持されてい
る。
Ｔ細胞よりＢＣＤＦを生産する場合、従来は培地にＦＣ
Ｓのようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることが必須であつた（ティ・テラニシら、ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー(J.of Immunol.)128,190
3(1982)，エイ・ムラグチら、ジャーナル・オブ・イム
ノロジー(J.of Immunol.)127,412(1981)参照）。これに
対してＶＴ−１を使用してＢＣＤＦを生産する場合、培
地にＦＣＳのような血清、血液中のタンパク質成分、そ
の他タンパク質成分を加える必要がなく、また通常用い
られているＴ細胞またはＢ細胞に対するマイトゲンも加
える必要がないことは特筆に値する。そのため高価はＦ
ＣＳを用いないで安価にＢＣＤＦを生産することが出来
るばかりでなく、人体に有害な異種タンパク質やマイト
ゲンを含まない安全なＢＣＤＦを容易に得ることが出来
る。
Ｓのようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることが必須であつた（ティ・テラニシら、ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー(J.of Immunol.)128,190
3(1982)，エイ・ムラグチら、ジャーナル・オブ・イム
ノロジー(J.of Immunol.)127,412(1981)参照）。これに
対してＶＴ−１を使用してＢＣＤＦを生産する場合、培
地にＦＣＳのような血清、血液中のタンパク質成分、そ
の他タンパク質成分を加える必要がなく、また通常用い
られているＴ細胞またはＢ細胞に対するマイトゲンも加
える必要がないことは特筆に値する。そのため高価はＦ
ＣＳを用いないで安価にＢＣＤＦを生産することが出来
るばかりでなく、人体に有害な異種タンパク質やマイト
ゲンを含まない安全なＢＣＤＦを容易に得ることが出来
る。
ＶＴ−１を用いてＢＣＤＦを生産する上記方法は種々の
環境的条件で行なわれる。しかし、好ましくはＶＴ−１
培養物は約３５〜３８℃の温度範囲において約５〜１０
％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に保持すべきであ
る。また、理想的には培地のpHは約７．０〜７．４と僅
かにアルカリ性の条件下に保持すべきである。ＶＴ−１
は平底ミクロプレートなど種々のタイプの培養器上１０
０μ単位などの種々の容量で接種される。ファルコン
・ラブウェア・ディヴィジョン、ベクトン・ディッキン
ソン・エンド・コーポレーション(Falcon Labware,Div.
Becton,Dickinson and Co.)から市販されているフラス
コNo.３０１３または３０２５のような組織培養フラス
コも使用できる。別法として上記ファルコン・ラブウェ
アから市販されているボトルNo.３０２７のような回転
びんも培養容器として使用できる。
環境的条件で行なわれる。しかし、好ましくはＶＴ−１
培養物は約３５〜３８℃の温度範囲において約５〜１０
％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に保持すべきであ
る。また、理想的には培地のpHは約７．０〜７．４と僅
かにアルカリ性の条件下に保持すべきである。ＶＴ−１
は平底ミクロプレートなど種々のタイプの培養器上１０
０μ単位などの種々の容量で接種される。ファルコン
・ラブウェア・ディヴィジョン、ベクトン・ディッキン
ソン・エンド・コーポレーション(Falcon Labware,Div.
Becton,Dickinson and Co.)から市販されているフラス
コNo.３０１３または３０２５のような組織培養フラス
コも使用できる。別法として上記ファルコン・ラブウェ
アから市販されているボトルNo.３０２７のような回転
びんも培養容器として使用できる。
ＶＴ−１を培養して細胞数を増やすための最適条件とし
て、細胞の当初密度は培地１mlあたり１×１０４細胞な
いし５×１０５細胞、好ましくは２×１０５細胞であ
る。上述の条件でＶＴ−１を培養すると、通常２〜７日
で培地１ml当り５×１０５細胞から２×１０６細胞程度
まで細胞密度が増加するので、再び新しい培地を加えて
培地１ml当り１×１０４〜５×１０５細胞にまで細胞密
度を下げ、再び培養を続ける。このようにして目的とす
る細胞数になるまでＶＴ−１の培養を続けた後、細胞を
遠心分離等で分離し、細胞をタンパク質を含まぬ完全合
成培地で洗ってから新しい完全合成培地に接種する。こ
の時の細胞の当初密度は培地１mlあたり約１×１０４細
胞ないし１×１０７細胞であることが好ましく、理想的
には培地１mlあたり１×１０６細胞である。
て、細胞の当初密度は培地１mlあたり１×１０４細胞な
いし５×１０５細胞、好ましくは２×１０５細胞であ
る。上述の条件でＶＴ−１を培養すると、通常２〜７日
で培地１ml当り５×１０５細胞から２×１０６細胞程度
まで細胞密度が増加するので、再び新しい培地を加えて
培地１ml当り１×１０４〜５×１０５細胞にまで細胞密
度を下げ、再び培養を続ける。このようにして目的とす
る細胞数になるまでＶＴ−１の培養を続けた後、細胞を
遠心分離等で分離し、細胞をタンパク質を含まぬ完全合
成培地で洗ってから新しい完全合成培地に接種する。こ
の時の細胞の当初密度は培地１mlあたり約１×１０４細
胞ないし１×１０７細胞であることが好ましく、理想的
には培地１mlあたり１×１０６細胞である。
ＶＴ−１を培養することによって生産されるＢＣＤＦ量
は経時的に変化する。例えば１ml当り１×１０６初発細
胞密度でＶＴ−１をＲＰＭＩ１６４０培地（１ml当りペ
ニシリン１００単位、ストレプトマイシン１００μｇ、
ゲンタマイシン１０μｇおよびNaHCO3１６μＭを含む）
で培養すると、ＢＣＤＦ活性は４８時間後にピークレベ
ルに達する。さらに、次の２４時間に存在するＢＣＤＦ
活性は僅かに減少する。このようにＲＰＭＩ１６４０培
地中のＶＴ−１でＢＣＤＦを生産する至適培養時間は約
２４〜７８時間である。
は経時的に変化する。例えば１ml当り１×１０６初発細
胞密度でＶＴ−１をＲＰＭＩ１６４０培地（１ml当りペ
ニシリン１００単位、ストレプトマイシン１００μｇ、
ゲンタマイシン１０μｇおよびNaHCO3１６μＭを含む）
で培養すると、ＢＣＤＦ活性は４８時間後にピークレベ
ルに達する。さらに、次の２４時間に存在するＢＣＤＦ
活性は僅かに減少する。このようにＲＰＭＩ１６４０培
地中のＶＴ−１でＢＣＤＦを生産する至適培養時間は約
２４〜７８時間である。
ＢＣＤＦの精製 ＢＣＤＦは塩析、真空透析、限外濾過、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシン
グ、逆相クロマトグラフィー、焦点電気泳動およびゲル
電気泳動等の種々の方法によって上述の培養物上清から
濃縮して精製できる（実施例１参照）。
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシン
グ、逆相クロマトグラフィー、焦点電気泳動およびゲル
電気泳動等の種々の方法によって上述の培養物上清から
濃縮して精製できる（実施例１参照）。
ＢＣＤＦの物理化学的性質 上述の方法でＶＴ−１より生産されるＢＣＤＦは以下の
性質を有する。
性質を有する。
(1)分子量 前もってＰＢＳで平衡化したＡｃＡ３４カラム（L.K.
B.，スウェーデン）にＢＣＤＦを含む、濃縮されたＶＴ
−１培養上清を流し、ＰＢＳで溶出すると、分子量３．
５±０．５×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦ
が溶出する。上述の方法で精製したＢＣＤＦを上述の方
法でＨＰＬＣ用ＴＳＫ−２０００ＳＷＧ（東洋曹達工業
（株））を用いてゲル濾過すると、分子量３．５±０．
５×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦが溶出す
る。又ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ・ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動）にて泳動すると２．２±０．２×１０４
ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦが溶出される。
B.，スウェーデン）にＢＣＤＦを含む、濃縮されたＶＴ
−１培養上清を流し、ＰＢＳで溶出すると、分子量３．
５±０．５×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦ
が溶出する。上述の方法で精製したＢＣＤＦを上述の方
法でＨＰＬＣ用ＴＳＫ−２０００ＳＷＧ（東洋曹達工業
（株））を用いてゲル濾過すると、分子量３．５±０．
５×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦが溶出す
る。又ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ・ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動）にて泳動すると２．２±０．２×１０４
ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦが溶出される。
(2)等電点 前述の方法でＶＴ−１より得たＢＣＤＦを含む培養液を
限外濾過により濃縮し、ＡｃＡ３４カラムにより分離精
製したＢＣＤＦをpH７〜４の範囲でファルマシアＭｏｎ
ｏＰカラムを用いてクロマトフォーカシンングを行なう
と、pH４．９〜５，１の位置にＢＣＤＦが溶出する。こ
れよりＢＣＤＦの等電点はpH４．９〜５．１と推定され
る。
限外濾過により濃縮し、ＡｃＡ３４カラムにより分離精
製したＢＣＤＦをpH７〜４の範囲でファルマシアＭｏｎ
ｏＰカラムを用いてクロマトフォーカシンングを行なう
と、pH４．９〜５，１の位置にＢＣＤＦが溶出する。こ
れよりＢＣＤＦの等電点はpH４．９〜５．１と推定され
る。
(3)Ｎ−末端部分のアミノ酸配列 Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Al
a ＢＣＤＦ活性測定法 人ＢＣＤＦに反応してＩｇＧを産生する人Ｂ細胞株ＣＥ
ＳＳ（ケイ・ヨシザキら、ジャーナル・オブ・イムノロ
ジー(J.of Immunol.),132,2948(1984)）を用いてＢＣＤ
Ｆ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を測定する検液と６×
１０３個のＣＥＳＳを２００μの１０％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ１６４０培地（１ml当りプニシリン１００単
位、ストレプトマイシン１００μｇ、ゲンタマイシン１
０μｇおよびNaHCO3１６mMを含む）に入れる。この混合
物を９６穴マイクロプレート中で３日間、５％ CO2存
在下、３７℃で培養し、培養上清のＩｇＧ量を酸素免疫
測定法により、測定する。この条件において最大のＩｇ
Ｇ生産量（最高のＣＥＳＳの反応）の５０％を示すＢＣ
ＤＦの活性を１Ｕ／mlとした。
a ＢＣＤＦ活性測定法 人ＢＣＤＦに反応してＩｇＧを産生する人Ｂ細胞株ＣＥ
ＳＳ（ケイ・ヨシザキら、ジャーナル・オブ・イムノロ
ジー(J.of Immunol.),132,2948(1984)）を用いてＢＣＤ
Ｆ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を測定する検液と６×
１０３個のＣＥＳＳを２００μの１０％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ１６４０培地（１ml当りプニシリン１００単
位、ストレプトマイシン１００μｇ、ゲンタマイシン１
０μｇおよびNaHCO3１６mMを含む）に入れる。この混合
物を９６穴マイクロプレート中で３日間、５％ CO2存
在下、３７℃で培養し、培養上清のＩｇＧ量を酸素免疫
測定法により、測定する。この条件において最大のＩｇ
Ｇ生産量（最高のＣＥＳＳの反応）の５０％を示すＢＣ
ＤＦの活性を１Ｕ／mlとした。
作用 一方、本発明におけるＨＴＬＶをＴ細胞に感染させるこ
とにより得た形質転換された人Ｔ細胞株は、前述のＢＣ
ＤＦ産生方法に比べ、大量のＢＣＤＦを培地中に産生す
る点、この細胞株は継代培養が出来、継代中にＢＣＤＦ
産生能力が低下することがない点、又、この細胞株は、
蛋白質をまったく含まない完全合成培地中で、マイトー
ゲンのような刺激剤をまったく加えることなくＢＣＤＦ
と産生し、混入蛋白質の少ないＢＣＤＦを得、比較的容
易な精製方法で、純化したＢＣＤＦを得られる点などの
特徴をもち、本発明によりはじめて人ＢＣＤＦの工業的
生産が可能となった。
とにより得た形質転換された人Ｔ細胞株は、前述のＢＣ
ＤＦ産生方法に比べ、大量のＢＣＤＦを培地中に産生す
る点、この細胞株は継代培養が出来、継代中にＢＣＤＦ
産生能力が低下することがない点、又、この細胞株は、
蛋白質をまったく含まない完全合成培地中で、マイトー
ゲンのような刺激剤をまったく加えることなくＢＣＤＦ
と産生し、混入蛋白質の少ないＢＣＤＦを得、比較的容
易な精製方法で、純化したＢＣＤＦを得られる点などの
特徴をもち、本発明によりはじめて人ＢＣＤＦの工業的
生産が可能となった。
実施例１ ＶＴ−１によるＢＣＤＦの製造 ２容プラスチックローラー培養器（ファルコン＃３０
２７）（以下ローラーと称する）中の１の２０％ＦＣ
Ｓ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２mMグルタミン、５×１
０−５Ｍ ２ME、１００単位／mlペニシリン、１００μ
ｇ／mlストレプトマイシン、２０μｇ／mlゲンタマイシ
ン、１６mM NaHCO2を含有）に２×１０５／ml細胞数に
ＶＴ−１を接種し、８rpmで回転させつつ３日間、３７
℃で培養した。培養後、培養物を遠心分離して細胞を集
めＲＰＭＩ１６４０培地で２回細胞を洗った後、細胞を
２容ローラー中１のＲＰＭＩ１６４０培地に１×１
０６／ml細胞濃度に懸濁した。ローラーを８rpmで回転
させつつ２日間、３７℃で培養する。培養後培養物を遠
心分離して、培養上清を得た。
２７）（以下ローラーと称する）中の１の２０％ＦＣ
Ｓ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２mMグルタミン、５×１
０−５Ｍ ２ME、１００単位／mlペニシリン、１００μ
ｇ／mlストレプトマイシン、２０μｇ／mlゲンタマイシ
ン、１６mM NaHCO2を含有）に２×１０５／ml細胞数に
ＶＴ−１を接種し、８rpmで回転させつつ３日間、３７
℃で培養した。培養後、培養物を遠心分離して細胞を集
めＲＰＭＩ１６４０培地で２回細胞を洗った後、細胞を
２容ローラー中１のＲＰＭＩ１６４０培地に１×１
０６／ml細胞濃度に懸濁した。ローラーを８rpmで回転
させつつ２日間、３７℃で培養する。培養後培養物を遠
心分離して、培養上清を得た。
上述のように、ＶＴ−１を培養して得たＢＣＤＦを含む
培養上清よりＢＣＤＦを以下の方法で精製した。無細菌
上清１０を限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０、アミコ
ン・コーポレーション、マサチューセッツ、米国）を装
着した限外濾過装置（アミコン大量処理用セル２０００
型、アミコン・コーポレーション、マサチューセッウ、
米国）を用いて窒素ガスにより４kg/cm2の圧力をかけ濾
過した。濾過膜上部に残った１００mlの濃縮液をさらに
限外濾過膜（アミコン・ＹＭ−１０）を装着した限外濾
過装置（アミコン、スタンダードセル５２型）を用い窒
素ガスにより４kg/cm2の圧力をかけて濾過した。濾過膜
上部に残った５mlの濃縮液を採取した。
培養上清よりＢＣＤＦを以下の方法で精製した。無細菌
上清１０を限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０、アミコ
ン・コーポレーション、マサチューセッツ、米国）を装
着した限外濾過装置（アミコン大量処理用セル２０００
型、アミコン・コーポレーション、マサチューセッウ、
米国）を用いて窒素ガスにより４kg/cm2の圧力をかけ濾
過した。濾過膜上部に残った１００mlの濃縮液をさらに
限外濾過膜（アミコン・ＹＭ−１０）を装着した限外濾
過装置（アミコン、スタンダードセル５２型）を用い窒
素ガスにより４kg/cm2の圧力をかけて濾過した。濾過膜
上部に残った５mlの濃縮液を採取した。
上述の濃縮した上清をＡｃＡ３４ゲル濾過カラム（L.K.
B.，スウェーデン、２．６×９０cm）で処理した。な
お、ゲル濾過カラムはあらかじめＰＢＳ（ホスフェート
・バッファー・セイライン、０．１５Ｍ食塩を含む０．
０１Ｍホスフェート・バッファー、pH７．０）で平衡化
した。濃縮上清をＰＢＳで溶出し、溶出液を５mlずつ分
取し、分取液のＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性
を有する分画は分子量（３．５±０．５×１０４ダルト
ンに相当するフラクションにＢＣＤＦが含まれているこ
とがわかった。ゲル濾過カラムは次の分子量マーカーで
検定した。ブルーデキストラン２０００（ファルマシア
・ファインケミカルス、スウェーデン）２×１０６、フ
ェリチン４．５×１０５、アルドラーゼ１．５８×１０
５、オブアルブミン４．５×１０４、キモトリプシノー
ゲン２．５×１０４、チトクロームＣ１．１７×１０４
また、ＢＣＤＦを含むフラクションを集め、限外濾過膜
（アミコンＹＭ−１９）を装置した限外濾過装置を用い
て２５mMピペラジン−塩酸緩衝液（pH６．３）に置換し
た。
B.，スウェーデン、２．６×９０cm）で処理した。な
お、ゲル濾過カラムはあらかじめＰＢＳ（ホスフェート
・バッファー・セイライン、０．１５Ｍ食塩を含む０．
０１Ｍホスフェート・バッファー、pH７．０）で平衡化
した。濃縮上清をＰＢＳで溶出し、溶出液を５mlずつ分
取し、分取液のＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性
を有する分画は分子量（３．５±０．５×１０４ダルト
ンに相当するフラクションにＢＣＤＦが含まれているこ
とがわかった。ゲル濾過カラムは次の分子量マーカーで
検定した。ブルーデキストラン２０００（ファルマシア
・ファインケミカルス、スウェーデン）２×１０６、フ
ェリチン４．５×１０５、アルドラーゼ１．５８×１０
５、オブアルブミン４．５×１０４、キモトリプシノー
ゲン２．５×１０４、チトクロームＣ１．１７×１０４
また、ＢＣＤＦを含むフラクションを集め、限外濾過膜
（アミコンＹＭ−１９）を装置した限外濾過装置を用い
て２５mMピペラジン−塩酸緩衝液（pH６．３）に置換し
た。
クロマトフォーカシング ＡｃＡ−３４カラムクロマトグラフィーで分画されたＢ
ＣＤＦ画分をあらかじめ２５mMピペラジン−塩酸緩液
（pH６．３）で平衡化したＭｏｎｏＰカラム（ファルマ
シア・ファインケミカルス、スウェーデン）に通した。
このカラムを２５mMピペラジン−塩酸緩液で洗った後、
塩酸でpH４．５に調製した４０mlの1/10希釈ポリバッフ
ァー７４（ファルマシア・ファインケミカルス、スウェ
ーデン）で溶出した。カラム操作はファースト・プロテ
イン・リキッド・クロマトグラフィー、ＦＰＬＣ（ファ
ルマシア・ファインケミカルス、スウェーデン）を用
い、流速は毎分０．５mlで行なった。溶出液を１mlずつ
分取し、ＢＣＤＦ活性とpHを測定した。ＢＣＤＦ活性は
pH４．９〜５．１の位置に溶出された。
ＣＤＦ画分をあらかじめ２５mMピペラジン−塩酸緩液
（pH６．３）で平衡化したＭｏｎｏＰカラム（ファルマ
シア・ファインケミカルス、スウェーデン）に通した。
このカラムを２５mMピペラジン−塩酸緩液で洗った後、
塩酸でpH４．５に調製した４０mlの1/10希釈ポリバッフ
ァー７４（ファルマシア・ファインケミカルス、スウェ
ーデン）で溶出した。カラム操作はファースト・プロテ
イン・リキッド・クロマトグラフィー、ＦＰＬＣ（ファ
ルマシア・ファインケミカルス、スウェーデン）を用
い、流速は毎分０．５mlで行なった。溶出液を１mlずつ
分取し、ＢＣＤＦ活性とpHを測定した。ＢＣＤＦ活性は
pH４．９〜５．１の位置に溶出された。
ＭｏｎｏＰカラムより得たＢＣＤＦ活性画分を０．１％
ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化した逆相ク
ロマトグラフィー用カラムＰｒｏＲＰＣＨＲ5/10（ファ
ルマシア・ファインケミカルズ）にかけ、溶出液、０．
１％ＴＦＡ中のアセテトニトリル濃度を０から６０％ま
で直線的に増加させＢＣＤＦを溶出した。アセトニトリ
ル５０〜５５％で溶出される。Ｏ．Ｄ．280のピークは
他のＯ．Ｄ．280のピークとは完全に分離しており、こ
のピークに対応してＢＣＤＦ活性が検出された。このピ
ークを凍結乾燥して精製ＢＣＤＦを得た。
ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化した逆相ク
ロマトグラフィー用カラムＰｒｏＲＰＣＨＲ5/10（ファ
ルマシア・ファインケミカルズ）にかけ、溶出液、０．
１％ＴＦＡ中のアセテトニトリル濃度を０から６０％ま
で直線的に増加させＢＣＤＦを溶出した。アセトニトリ
ル５０〜５５％で溶出される。Ｏ．Ｄ．280のピークは
他のＯ．Ｄ．280のピークとは完全に分離しており、こ
のピークに対応してＢＣＤＦ活性が検出された。このピ
ークを凍結乾燥して精製ＢＣＤＦを得た。
ＶＴ−１のＦＣＳ無添加培養上清１．８から精製した
ＢＣＦは、第１表に示すごとく活性の回収率１８％で蛋
白量当りの活性は約１，０００倍に上がった。
ＢＣＦは、第１表に示すごとく活性の回収率１８％で蛋
白量当りの活性は約１，０００倍に上がった。
実施例２ 人末梢血よりＢ細胞を調製し、これよりブラスト化Ｂ細
胞を分離した（ケイ・ヨシザキら、ジャーナル・オブ・
イムノロジー(J.of Immunol.)132,2948(1984)参照）。
すなわち、人Ｂ細胞をパーコールのグラージェント（５
０％〜７０％）中で遠心分離（４℃、４００Ｇ、１５
分）し、ブラスト化した低比重Ｂ細胞（パーコールＰＢ
Ｓ溶液５０％〜５５％）又、高比重休止期Ｂ細胞（パー
コールＰＢＳ溶液６０％〜７０％）を各々集めた。
胞を分離した（ケイ・ヨシザキら、ジャーナル・オブ・
イムノロジー(J.of Immunol.)132,2948(1984)参照）。
すなわち、人Ｂ細胞をパーコールのグラージェント（５
０％〜７０％）中で遠心分離（４℃、４００Ｇ、１５
分）し、ブラスト化した低比重Ｂ細胞（パーコールＰＢ
Ｓ溶液５０％〜５５％）又、高比重休止期Ｂ細胞（パー
コールＰＢＳ溶液６０％〜７０％）を各々集めた。
Ｂ細胞を１mlあたり２×１０５細胞に９６穴プラスチッ
クマイクロプレート中の２００μのＲＰＭＩ１６４０
倍に懸濁した。培地には１単位／mlのＢＣＤＦを含むＶ
Ｔ−１培養上清、１０−％ＦＣＳ、１mlあたり１００単
位のペニシリン、１mlあたり１００μｇのストレプトマ
イシン、１mlあたり１０μｇのゲンタマイシン、１６mM
のNaHCO3を含有させた。
クマイクロプレート中の２００μのＲＰＭＩ１６４０
倍に懸濁した。培地には１単位／mlのＢＣＤＦを含むＶ
Ｔ−１培養上清、１０−％ＦＣＳ、１mlあたり１００単
位のペニシリン、１mlあたり１００μｇのストレプトマ
イシン、１mlあたり１０μｇのゲンタマイシン、１６mM
のNaHCO3を含有させた。
培養物を空気中５％炭酸ガス含有の湿度調節環境下３７
℃に保ち、２日後培養上清を集めた。この培養上清中の
ＩｇＧ濃度をＢＣＤＦ活性検定の項に記述した通り検定
した。第２表に示すように、ＢＣＤＦの添加によって低
比重Ｂ細胞にのみＩｇＧ産生が誘導された。
℃に保ち、２日後培養上清を集めた。この培養上清中の
ＩｇＧ濃度をＢＣＤＦ活性検定の項に記述した通り検定
した。第２表に示すように、ＢＣＤＦの添加によって低
比重Ｂ細胞にのみＩｇＧ産生が誘導された。
実施例３ 前述の活性測定方法に従い、ＣＥＳＳの抗体産生に対す
る精製ＢＣＤＦの作用を調べた結果を下表に示す。
る精製ＢＣＤＦの作用を調べた結果を下表に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 特許法第30条第１項適用申請有り 日本癌学会第43回総 会記事（昭和59年８月25日）日本癌学会発行第24，104 ページに発表 特許法第30条第１項適用申請有り 昭和59年10月４，５ 日福岡市において開催された第43回日本癌学会総会にお いて発表
Claims (1)
- 【請求項１】人Ｔ細胞白血病ウイルスにより形質転換さ
れた人Ｔ細胞を培養し、生成したＢ細胞分化因子を採取
し、精製することを特徴とする下記の性質を有するＢ細
胞分化因子の製造法。 (1)分子量 3.5±0.5×104ダルトン（ゲル濾過法） 2.2±0.2×104ダルトン（ＳＤＳ・ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法） (2)Ｎ−末端部分のアミノ酸配列 Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Al
a
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59235199A JPH0657157B2 (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | Ｂ細胞分化因子の製造法 |
| JP2325865A JPH03184997A (ja) | 1984-11-09 | 1990-11-29 | Ｂ細胞分化因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59235199A JPH0657157B2 (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | Ｂ細胞分化因子の製造法 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60025301A Division JPH0657720B2 (ja) | 1985-02-14 | 1985-02-14 | Ｂ細胞分化因子 |
| JP2325865A Division JPH03184997A (ja) | 1984-11-09 | 1990-11-29 | Ｂ細胞分化因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61115024A JPS61115024A (ja) | 1986-06-02 |
| JPH0657157B2 true JPH0657157B2 (ja) | 1994-08-03 |
Family
ID=16982539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59235199A Expired - Lifetime JPH0657157B2 (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | Ｂ細胞分化因子の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0657157B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2648860B2 (ja) * | 1986-05-08 | 1997-09-03 | イエダ リサーチ アンド デベロップメント コンパニー リミテッド | ヒトインターフエロン−β２Ａ及びヒトインターフエロン−β２Ｂ、該インターフエロンをコードする遺伝子を含むベクター、該インターフエロンを産生するセルライン及び該インターフエロンの医薬品としての用途 |
| CA1341588C (en) * | 1988-01-26 | 2009-01-06 | Michel Revel | Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use |
| US8093351B2 (en) * | 2006-08-24 | 2012-01-10 | Cornell Research Foundation, Inc. | Copolymerization of propylene oxide and carbon dioxide and homopolymerization of propylene oxide |
-
1984
- 1984-11-09 JP JP59235199A patent/JPH0657157B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61115024A (ja) | 1986-06-02 |
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