FI81377B - Foerfarande foer framstaellning av maenniskocellinje och dess anvaendning vid produktion av tpa och pro-tpa. - Google Patents

Description

81 377

Menetelmä ihmisen solulinjan tuottamiseksi ja sen käyttö TPA:n ja pro-TPA:n tuotannossa - Förfarande för framställ-ning av människocellinje och dess användning vid produktion av TPA och pro-TPA

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä ihmisen solulinjan tuottamiseksi, joka kykenee toisiintuvasti ja riippumattomasti lisääntymään viljelmässä ilman seerumin ja eksogeenis-ten makromolekulaaristen kasvutekijöiden läsnäoloa ja joka tuottaa TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta. Keksinnön kohteena on myös menetelmä TPA:n, pro-TPA:n tai niiden seosten tuottamiseksi.

Yhdistelmä-DNA-teknologia ja soluviljelytekniikan viime vuosina tapahtuneen tulon myötä on hyödyllisten ja farmakologisesti mielenkiintoisten yhdisteiden, erityisesti proteiinien, kuten interferonin, insuliinin ja antigeenien kontrolloitu biologinen valmistus tullut mahdolliseksi. On olemassa lisääntyvää tarvetta sellaisten biologisten järjestelmien kehittämiseksi, jotka takaisivat muiden, biologisesti, erityisesti farmakologisesti mielenkiintoisten proteiinien laajamittaisen tuotannon.

Edellä ja jäljempänä käytetty termi "proteiini" tarkoittaa suurimolekyylipainoisia polypeptideitä, esim. yli n. 34000, ja myös pienempimolekyylipainoisia polypeptideitä, esim. alle n. 34000, ja niiden johdannaisia, kuten glykosy-loituja, fosfatoituja ja sulfatoituja johdannaisia.

Edistysaskeleet yhdistelmä-DNA-teknologiassa tekevät mahdolliseksi haluttua proteiinia koodaavan geenin liittämiseksi mikro-organismeihin ja sitten mikro-organismien indusoi-misen syntetisoimaan proteiinia. Monia biologisesti tärkeitä proteiineja ei kuitenkaan voida syntetisoida tällä teknologialla. Tämä pitää erityisesti paikkansa sellaisten proteiinien kohdalla, joiden rakenne ei ole vielä tunnettu. Useimmissa tapauksissa geneettisesti muunnettujen mikro-organismien erittämät proteiinit eivät ole tarkkoja kopioita autenttisista molekyyleistä vaan eroavat niistä aminohapposekvens- 2 81377 sin N- ja C-pääteryhmien suhteen. Tämä johtuu yhdistelmä-DNA-teknologiassa käytetystä koemenetelmästä. Edelleen glykosy-loituja proteiineja ei voida tuottaa mikro-organismeilla, kuten bakteereilla, eikä tietyssä määrin myöskään hiivoilla, 5 joilta puuttuvat välttämättömät solumekanismit. Monissa tapauksissa voidaan käyttää hyödyksi edullisesti solu- ja kudos-viljelmiä. Koska soluviljelmät ovat peräisin vahingoittumattomista organismeista, soluviljelmillä tuotetut proteiinit ovat kaikissa suhteissa verrattavissa luonnossa esiintyviin 10 proteiineihin.

Kuitenkin korkeampien organismien solujen, kuten nisä-kässolujen viljely on vaikea ongelma. Tällaisten solujen ra-vintoainevaatimukset ovat ankarammat kuin useimpien mikro-organismien, jotka kasvavat keinotekoisissa kasvatusliuok-15 sissa. Tähän mennessä esitettyjen useimpien nisäkässolujen kasvatusalustan on sisällettävä seerumia, joka on hyvin kallista. Seerumin hinta määrää laajalti soluviljelytekniikan toteuttamiskelpoisuuden ja saattaa rajoittaa sen sovellettavuutta sellaisten proteiinien tuotantoon, joita ei ole muu-20 toin saatavissa. Joitakin soluja voidaan viljellä seerumi- vapaissa kasvatusalustoissa, joihin on lisätty hormoneja tai kasvutekijöitä, kuten transferriiniä, insuliinia, epidermaa-lista, fibroplastista tai hermo-kasvutekijää. Useimmissa tapauksissa solut eivät kuitenkaan lisäänny rajoittamattomasti 25 näissä seerumivapaissa kasvualustoissa.

Seerumivapaassa kasvualustassa lisääntyvillä solulin-joilla on erityisen suuri merkitys sellaisten proteiinien tuotannossa, jotka herkästi tuhoutuvat tai kontaminoituvat seerumin tai ulkopuolisesti lisättyjen kasvutekijäiden vai-30 kutuksesta. Tällainen proteiini on esimerkiksi pro-kudos- plasminogeeniaktivaattori (pro-tissue plasminogen activator, pro-TPA).

Niin kutsutut plasminogeeniaktivaattorit ovat tulleet tieteellisen tutkimuksen kohteeksi, koska ne ovat osoittau-35 tuneet kliinisesti ilmeisen soveltuviksi verihyytymien hajottajina. Verihyytymät koostuvat fibriinistä, joka on muo- 3 81 377 dostunut liukoisesta prekursoristaan fibrinogeenista trora-biini-entsyymin vaikutuksesta. Ne ovat ihmisten sairastuvuuden ja kuolleisuuden pääasiallisia syitä ja niiden liuottaminen ilman sivuvaikutuksia on vaikea toteuttaa.

5 Nisäkkäiden plasmassa on entsymaattinen systeemi, jo ka kykenee liuottamaan fibriinin verihyytymissä. Fibrino-lyyttisen systeemin yksi osa muodostuu entsyymeistä, plasmi-nogeeniaktivaattoreista, jotka muuttavat plasminogeenin (plasmiinin inaktiivinen proentsyymimuoto) proteolyyttiseksi 10 plasmiinientsyymiksi. Plasmiini hajottaa sitten hyytymien fibriiniverkon muodostaen liukoisia tuotteita. Tapauksissa, joissa kehon trombolyyttinen potentiaali (veritukosten liuot-tamiskyky) on riittämätön poistamaan muodostuneet suonensisäiset tukokset, esimerkiksi tromboembolioista tai kirurgis-15 ten toimenpiteiden jälkeisistä komplikaatioista kärsivillä potilailla, saattaa olla välttämätöntä käyttää ulkoisesti annettuja trombolyyttisiä aineita.

On olemassa kaksi kaupallisesti saatavaa ihmisen plasminogeenin aktivaattoria trombolyyttiseen terapiaan: uroki-20 naasi, joka on ihmisen virtsasta tai viljellyistä munuais-soluista eristetty seriiniproteaasi, ja streptokinaasi, joka on streptokokeista saatava bakteeriproteiini. Koska kummallakaan näistä entsyymeistä ei ole spesifistä affiniteettia fibriiniin, näillä aineilla suoritettu trombolyysi liittyy 25 plasminogeenin systeemiseen aktivaatioon, mikä voi aiheuttaa koagulointiproteiinien umpimähkäisen hajoamisen ja lisätä merkitsevästi sisäisten verenvuotojen (hemorrhage) vaaraa hoidon aikana. Urokinaasin toinen haittapuoli on sen hyvin lyhyt tehollinen puoliintumisaika, kun se on injektoitu ihmi-30 seen. Tästä syystä tarvitaan suuret urokinaasiannokset tehokkaan fibrinolyysin saavuttamiseksi. Streptokinaasi, joka on ihmiselle vieras proteiini, lisää neutraloivien vasta-aineiden tuotantoa, jotka estävät sen toiminnan, sekä allergisia reaktioita, jotka ovat vahingollisia ja mahdollisesti kuo-35 lettavia.

Toinen ryhmä plasminogeeniaktivaattoreita, joita kut- 4 81 377 sutaan kudos-plasminogeeniaktivaattoreiksi (tissue plasminogen activators, tästä tähtien "TPA:t") tiedetään esiintyvän useimmissa ihmisen kudoksissa. Eri kudoksista peräisin olevat TPA:t eroavat toisistaan mahdollisesti molekulaaristen 5 ominaisuuksiensa suhteen, mutta ne ovat immunologisesti samanlaisia. Ne eroavat urokinaasista kemiallisten ja immunologisten ominaisuuksien suhteen, niiden suuresti lisääntyneen fibrinolyyttisen vaikutuksen suhteen fibriinin läsnäollessa, samoin kuin niiden suuremman affiniteetin suhteen 10 fibriiniin (vrt. S.Thorsen et ai., Thromb.Diath.Haemorrh.

28, 65-74 (1972), D.C.Rijken ja D.Collen, J.Biol.Chem. 256 , 7035-7041 (1981)). Koska TPA:illa on suuri affiniteetti fibriiniin, niiden vaikutus rajoittuu hyytymän kohtaan vähentäen merkitsevästi kontrolloimattomien sisäisten veren-15 vuotojen vaaraa.

Seuraava kaavio osittaa plasminogeenin, plasmiinin, fibriinin ja eri plasminogeeniaktivaattorien väliset suhteet:

UROKINAASI

STREPTOKINAASI

Plasminogeeni--► Plasmiini - (inaktiivinen pre- t (Veressä oleva aktii- kursori veressä) vinen entsyymi, joka liuottaa verihyytymiä ja aktivoi pro-TPA:ta) KUDOS-PLASMINOGEENIAKTIVAATTORl (TPA) FIBRIINI -► - PRO-KUDOS-PLASMINOGEENIAKTIVAATTORI (pro-TPA) Äskettäin on kahta hyytymishäiriöistä kärsinyttä potilasta hoidettu menestyksellisesti ihmisen melanooma-solulin-20 jän viljelynesteestä eristetyllä TPA:lla (vrt. W.Weimar et ai., The Lancet (1981), 1018-1020). TPArta on olemassa kaksi molekyylimuotoa: aktiivinen kaksiketjuinen muoto ja inak- 5 81377 tiivinen yksiketjuinen muoto (prekursori-TPA eli "pro-TPA", viitteenä vertaa D.C.Rijken ja D.Collen, loc.cit.; D.C.Rijken et ai., J.Biol.Chem. 257, 2920-2925 (1 982) ja P.Wallen et ai., Progr .Fibrin. 5_, 16-23 (1982)). Pro-TPA voidaan muuttaa 5 aktiiviseksi TPA:ksi inkuboimalla fibriinin kanssa tai antamalla plasmiinin vaikuttaa siihen, joka plasmiini tällä kaskadityyppisellä reaktiolla laukaisee oman synteesinsä.

Ihmisen TPA:n lähteitä ovat ihmisen eri kudosten uutteet (joita ei ole kaupallisesti saatavana) ja ihmisen eri 10 kasvainsolut, joiden on osoitettu vapauttavan TPA:ita eri määriä (E.L.Wilson et ai., Cancer Research _40 , 933-938 (1980); E.L.Wilson et ai., Blood 61, 568-574 (1983)).

Äskettäin jätetyssä patenttihakemuksessa (EP 41766, keksijät D.Collen, D.C.Rijken ja O.Matsuo) esitetään TPA, 15 jonka molekyylipaino on 72000, ja joka on eristetty viljellystä ihmisen melanooma-solui injasta (Bowes) ja joka on luultavasti samanlainen kuin TPA, jonka on jo esittänyt Wilson et ai. (Cancer Research 40, 933-938 (1980)). Kuten muutkin tähän mennessä tunnetut solulinjat, tämä ihmisen melanooma-20 solulinja, Bowes, vaatii seerumin läsnäoloa kasvaakseen, esim. naudan sikiön seerumia. Seerumi on kuitenkin hyvin kallista ja sisältää proteiinikomponentteja, jotka kontaminoi-vat tuotetun TPA:n ja estävät pro-TPA:n suurien määrien eristämisen. Tämä saattaa johtaa vaivalloisiin ja työläisiin 25 TPA:n tai pro-TPA:n puhdistusoperaatioihin.

Tällä keksinnöllä voitetaan tähän mennessä tunnettujen solulinjojen haittapuolet, ja se tekee mahdolliseksi uusien ihmisen solulinjojen tuottamisen, jotka kasvavat ilman seerumia tai mitään eksogeenistä makromolekulaarista kasvuteki-30 jää. Tämän keksinnön kohteena on myös uusien farmakologisesti aktiivisten proteiinien tuottaminen, kuten tällaisen seerumista riippumattoman solulinjan erittämän ihmisen kudos-plasminogeeniaktivaattorin ja erityisesti pro-aktivaattorin tuottaminen.

35 Seerumista riippumattomien ihmisen solulinjojen tuottaminen Tämän keksinnön avulla tuotetaan uusia ihmisen solu-linjoja, jotka kasvavat ilman seerumia tai mitään eksogee- 6 81 377 nista makromolekulaarista kasvutekijää, kuten insuliinia, transferriiniä, epidermaalista kasvutekijää jne. Keksinnön mukaiset solut pystyvät tarttumaan kasvatusastiaan jopa ilman seerumia tai fibronektiiniä. Uusien solulinjojen pääasialliset edut ovat kustannusten suunnaton pieneneminen, koska seerumi, kuten naudan sikiöseerumi on hyvin kallista, uusilla solulinjoilla valmistettujen tuotteiden hyvin halpa ja yksinkertainen puhdistus, koska kasvatusalustassa ei ole seerumikontaminantteja, ja tuote voidaan helposti puhdistaa seerumivapaasta kasvatusalustasta, ja mahdollisuus tuottaa proteiineja, joita ei voida valmistaa (tai voidaan valmista vain hyvin pienillä saannoilla) seerumista riippuvaisilla solulinjoilla, koska seerumissa on läsnä proteaaseja.

Menetelmään uusien seerumista riippumattomien ihmisen solulinjojen valmistamiseksi kuuluu seuraavat vaiheet (a) muodostetaan TPA:ta tuottavan ihmisen Bowes-melanoo-masolulinjan viljelmä seerumia sisältävään viljelyalustaan, (b) poistetaan viljelmästä mainittu seerumia sisältävä kasvualusta ja korvataan se kasvualustalla, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, (c) syötetään kiinnittyneille tai ei-kiinnittyneille soluille kasvualustaa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, ja (d) viljellään soluja, kunnes ne lisääntyvät toisiintu-vasti ja riippumattomasti kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, jolloin muodostuu ihmisen solulinja, joka kykenee toisiintu-vasti ja riippumattomasti lisääntymään kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä ja joka tuottaa TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta.

Termi "seerumivapaa kasvatusliuos" käytettynä edellä ja jäljempänä tarkoittaa väliainetta, jossa ei ole seerumia eikä myöskään mitään makromolekulaarista kasvutekijää. Vastaavasti solulinjaa, joka kasvaa ilman sekä seerumia että eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, kutsutaan "seerumista riippumattomaksi solulinjaksi".

Yllämainitussa menetelmässä "lähtömateriaalina" käytetty ^ 81377 ihmisen seerumista riippuvainen solulinja on erityisesti jatkuva ja voi olla peräisin ihmisen kasvaimista, joita ovat melanooma, pahanlaatuinen teratooma, sarkooma, glioblastooma, meningiooma, neuroblastooma, lipooma, adenooma, rinta- ja rakkosyöpä. Edullisia solulinjoja ovat ne, jotka tuottavat TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta. Tämän keksinnön mukaisesti käytetään ihmisen melanooma-solulinjaa, erityisesti Bowes-melanoo-ma-solulinjaa (jota tästä lähin nimitetään "Bowes I"-solu-linjaksi). Normaalista ihmisen kudoksesta peräisin olevia solulinjoja voidaan myös käyttää "lähtömateriaalina", vaikkakin niillä on rajoitettu in vitro-elinaika (kasvu loppuu tavallisesti esim. n. 50 solunjakautumisen jälkeen), mutta ne ovat vähemmän tärkeitä tämän keksinnön kannalta.

Seerumivapaa ravintoainekasvatusliuos on esim. kaupallisesti saatava kasvatusalusta, kuten minimaalinen Eagle'n alusta (MEM), MEM-Spinners-alusta, Dulbecco'n modifioitu Eagle'n alusta (DMEM) tai Roswell Park Memorial Institute-viljelyalus-ta (RPMI)-1640. Muita samanlaisia kasvatusliuoksia voidaan käyttää yhtä hyvin. Seerumivapaa kasvatusliuos voi sisältää riittävän määrän puskuriainetta, kuten natriumvetykarbonaat-tia, stabiilin pH:n ylläpitämiseksi. Koska viljelmän soluilta puuttuu taidokas immuunisuojajärjestelmä, joka on olennainen osa vahingoittumatonta organismia, antibiootteja, kuten penisilliiniä, streptomysiiniä, tylosiinia ja vastaavia lisätään mielellään viljelmän infektoitumisen välttämiseksi.

Normaalit ihmisen solut kasvavat tavanomaisesti vain jos ne ovat kiinnittyneet pintaan, kun taas kasvainsolut usein mieluumminkin kasvavat suspensiossa. Kiinnittymisestä riippuvaisille soluille kehitetyt laboratorioastiat ovat alalla hyvin tunnettuja. Niitä on "mikrotitrauslevyistä" ja tasapohjaisista petrimaljoista erikokoisiin kudospulloihin tai sylinterin muotoisiin pulloihin, joita kutsutaan "pyöröpulloik-si" (roller bottles), jotka pyörivät jatkuvasti. Kiinnittymisestä riippumattomia soluja voidaan kasvattaa viljelyastiois-sa, joita liikutetaan mekaanisesti tai joissa pidetään yllä homogeenista suspensiota sekoittamalla kaasuvirralla.

Esimerkiksi tämän keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa kudosviljelypullossa, joka sisältää täyteen kasvaneen (confluent) tai lähes täyteen kasvaneen ihmisen solu-linjan yksisolukerroksen (mono-layer), esimerkiksi ihmisen s 81377 melanooma-solulinjan, erityisesti melanooma-Bowes I:n, joka on kasvanut seerumia sisältävässä ravintokasvatusliuoksessa. Menetelmä suoritetaan edelleen kosteassa atmosfäärissä, joka sisältää hiilidioksidia, esimerkiksi kosteassa atmosfää-5 rissä, jossa on n. 95 % ilmaa ja n. 5 % lämpötilassa välillä n. 35 - n. 40°C, erityisesti n. 37°C. Seerumia sisältävä kasvatusliuos heitetään pois ja korvataan seerumi-vapaalla liuoksella, esimerkiksi RPMI.1640:llä tai DMEM:llä. Muutaman päivän kuluttua solut alkavat irrota pullon pin-10 nasta ja uivat vapaina kasvatusliuoksessa. Muutaman viikon kuluttua suurin osa soluista on kuollut kasvatusliuoksessa, jossa ei ole seerumia eikä muita kasvutekijöitä. Solujen elinkelpoisuuden ylläpitämiseksi viljelmiin lisätään "vakioitua tai olosuhteistettua kasvatusliuosta" seerumivapaaseen 15 alustaan sopeutumisen aikana. Vakioitua liuosta voidaan kerätä rinnakkaisesta soluviljelmästä, jotka on pidetty tietyn ajan, esim. 24 tuntia, seerumivapaassa kasvatusliuoksessa. Vakioitua liuosta sisältävä seerumivapaa liuos on vaihdettava tietyin väliajoin, esimerkiksi 3-7 päivän vä-20 lein, kunnes solujen määrä on riittävästi lisääntynyt, so. kunnes n. yksi kolmasosa astian seinämistä on peittynyt.

Tässä vaiheessa vakioitua alustaa ei enää tarvita ja soluille syötetään pelkästään seerumivapaata kasvatusliuosta. Kun on muodostunut täyteen kasvanut yksisolukerros (monolayer), 25 solut täytyy tuorentaa (passage), esim. kopauttamalla astiaa voimakkaasti, jolloin suurin osa soluista irtoaa pinnasta, tai etyleenidiamiinitetraetikkahapolla (EDTA), pitäen huolta siitä, että uusiin viljelypulloihin siirrettävien solujen tiheys on tarpeeksi suuri eloonjäämisen takaamiseksi. Solu-30 jen kasvatusta ja tuorennusta konfluentiksi jatketaan kunnes solut kasvavat stabiileina ja hyvin kiinnittyvinä yksisolu-kerroksina. Tällä tavalla esimerkiksi 1-6 kuukaudessa, erityisesti 1-3 kuukaudessa on muodostunut seerumista riippumaton solulinja.

35 Vaihtoehtoisesti seerumista riippumaton solulinja voi daan saada aikaan lisäämättä rinnakkaisista seerumista riippuvaisten solujen viljelmistä kerättyä vakioitua kasvatus- 9 81377 liuosta, edellyttäen että solutiheys on tarpeeksi suuri. Tässä tapauksessa solut itse vakioivat oman alustansa. Solutiheys voidaan pitää suurena siten, ettei ei-kiinnittyviä soluja heitetä pois. Esimerkiksi muutaman päivän kuluttua 5 seerumivapaassa kasvatusliuoksessa suurin osa soluista irtoaa kudosviljelyastiasta ja ui vapaana liuoksessa, kuten yllä on selitetty. Irtoavat solut pysyvät elinkykyisinä niin kauan kun niiden tiheys pidetään tarpeeksi suurena. Jos seerumivapaa kasvatusliuos, jossa on ei-kiinnittyviä, mutta 10 elinkykyisiä soluja, sentrifugoidaan ja solusakka otetaan seerumivapaaseen kasvatusliuokseen ja lisätään takaisin pulloon, jossa on muutamia kiinnittyviä soluja, kiinnittyvät solut alkavat kasvaa. Tässä tapauksessa suspensiossa olevat solut yhdessä kiinnittyvien solujen kanssa vakioivat oman 15 kasvualustansa.

lähden tai kolmen viikon kuluttua ennen suspensiossa olleet solut alkavat kiinnittyä uudelleen viljelyastian pintaan, nämä solut tulevat ajan mittaan kiinnittyviksi ja ne voidaan tuorentaa kerran konfluenteiksi kopauttamalla voi-20 makkaasti tai EDTA:n avulla, kuten yllä on selitetty.

Toisessa menetelmässä "vakioidun kasvatusliuoksen" valmistamiseksi kiinnittyvien solujen läsnäollessa korvataan osa seerumivapaasta liuoksesta, n. puolet siitä, tuoreella see-rumivapaalla liuoksella ja toistetaan tämä prosessi joka 25 24.-72. tunti kunnes tarpeeksi suuri solutiheys on saavutet tu (n. 3 viikon kuluttua). Solut voidaan sen jälkeen tuorentaa, esim. EDTA:n avulla. Ensimmäisessä tuorennuksessa tuoretta seerumivapaata liuosta lisätään n. 40 % vakioituun kasvatusliuokseen, joka on otettu viljelmästä ennen EDTA-30 käsittelyä, jolloin solut jatkavat jakautumista ilman vakioitua liuosta. Solutiheys pitäisi olla tarpeeksi suuri, mikä on n. 30 % tai suurempi, mieluimmin n. 60-70 %:n konfluenssi.

Kun solutiheys on pieni, so. n. 20 %:n konfluenssilla 35 tai n. 1 x 105 solua/ml suspensioviljelmien tapauksessa, solut tarvitsevat vakioitua kasvatusliuosta kasvaakseen. Kun solutiheys on suuri, so. n. 60-70 %:n konfluenssi tai n.

10 81 377 2 x 105 - 5 x 105 tai enemmän soluja/ml suspensioviljelmien tapauksessa, solut kasvavat ja lisääntyvät seerumivapaassa alustassa ilman vakioidun kasvatusliuoksen lisäystä.

Seerumista riippumattomia solulinjoja voidaan kasvattaa kiinnittyvinä viljelminä, esimerkiksi laboratorioastian si-säseinämällä, tai suspensioviljelminä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan myös suorittaa lisävaihe, jossa kohdassa (d) muodostettua ihmisen solulin-jaa käsitellään mutageenilla tai saatetaan alttiiksi röntgensäteille tai ultraviolettisäteille, pysyvän mutanttisolu-linjan tuottamiseksi, joka kykenee toisiintuvasti ja riippumattomasti lisääntymään kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä ja joka tuottaa TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta. Edullisia mutageeneja ovat esimerkiksi N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiini ja sinappiöljyt.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetuilla uusilla ihmisen solulinjoilla ja niistä saatavilla mutanttisolulinjoilla on rajoitettu elinaika ja niitä voidaan käyttää samalla tavalla kuin alkuperäisiä seerumista riippuvaisia solulinjoja, esim. biologisesti aktiivisten tuotteiden, kuten proteiinien, esim. interferonien, antigeenien, angiogeenisten tekijöiden ja erityisesti plasminogeeniaktivaattoreiden kaupalliseksi tuottamiseksi seerumivapaissa olosuhteissa, tai hybridoma-solulinjojen valmistamiseksi.

Kuten yllä on selitetty, melanoomasolulinjaa Bowes I, joka tiedetään erittävän suuria määriä kudosplasminogeeniak-tivaattoria (vrt. EP 41766), käytetään "lähtömateriaalina" keksinnön mukaisessa menetelmässä. Näin saadaan seerumista riippumaton uusi solulinja, jota kutsutaan tästä lähtien "Bowes ll":ksi, ja erityisesti sen olennaisesti puhdas viljelmä.

n 81377

Uudet seerumista riippumattomat solulinjat eroavat vastaavista kantasolulinjöistä, jotka ovat seerumista riippuvaisia, monessa suhteessa. Bowes II-solut esim. eroavat kanta-Bowes i-melanoomasoluista morfologisen ulkomuotonsa perusteella. Kun niitä tutkitaan faasikontrastimikroskoopil-la, on ilmeistä että mitooseja havaitaan tiheämmin Bowes II-soluissa kuin Bowes I-soluissa, joiden kasvatusliuoksesta seerumi on poistettu. Seerumin lisääminen Bowes II-soluille saa aikaan merkittävän morfologisen muutoksen.

Keksinnön mukaisesti valmistettu seerumista riippumaton solulinja, so. Bowes ΙΙ-solulinja, tuottaa suuria määriä ku-dosplasminogeeniaktivaattoria, joka, päinvastoin kuin seerumista riippuvaisen ns. kantasolulinjan, Bowes I-solulinjan, tuottama, on valtaosaltaan pro-aktivaattorimuodossa. Paitsi TPA:ta ja pro-TPA:ta uusi solulinja tuottaa edelleen farmakologisesti arvokkaita aineita. Esimerkiksi Bowes II-solu-linja tuottaa omaa kasvutekijäänsä ja kasvainnekroositekijää (tumor necrotic factor).

Seerumista riippumattomien ihmisen solulinjojen viljely ja viljelyliuosten kerääminen

Seerumista riippumattomia ihmisen soluja voidaan kasvattaa oleellisesti kuten yllä on mainittu. Esimerkiksi Bowes II-soluja pannaan kasvamaan kudosviljelypulloihin siten, että niillä on riittävä solutiheys eloonjäämisen takaamiseksi, ja niiden annetaan kasvaa seerumivapaassa kasvatusliuokses-sa, esimerkiksi RPMI-1640:ssa, johon on lisätty antibiootteja, lämpötilassa välillä n. 35 - n. 40°C, erityisesti n.

12 81 377 37°C:ssa, kosteassa ilma-atmosfäärissä, jossa on n. 5 % CC^ia. Keräysliuosten otto voidaan aloittaa heti kun solut alkavat kiinnittyä ja voidaan toistaa, esim. 24 tunnin välein. Keräys-liuosten päivittäistä keräystä voidaan jatkaa kunnes yksiso-5 lukerrosten konfluenssi tekee välttämättömäksi tuorennuksen tuoreisiin viljelyastioihin. Koska seerumivapaassa kasvatus-liuoksessa viljeltyjen Bowes II-solujen kasvunopeus on hyvin pieni (kahdentumisaika on 6 päivää; verrattuna Bowes I-melanooma-kantasolujen kahdentunisaikaan, joka on 1 päivä) tuo-10 rennusta tarvitaan vain satunnaisesti (n. 4-6 viikon välein) ja keräysliuoksia voidaan koota yhdestä pullosta n. 3-6 kuukauden ajan, ja siten säästetään oleellisesti aikaa ja voimavaroja ja tehdään liuosten kerääminen yksinkertaiseksi.

Bowes II-solujen kasvunopeutta on myös mahdollista ajoittain 15 lisätä lisäämällä kasvutekijää, esim. insuliinia, kasvatus-liuokseen .

Laboratoriotyössä käyttökelpoisilla petrimaljoilla, kudosviljelypulloilla ja muilla astioilla ei voida saavuttaa tarpeeksi suurta pinta-ala-tilavuus-suhdetta käytännölliseen 20 laajaskaalaiseen seerumista riippumattomien pintaan kiinnittyvien solujen viljelyyn. Laajaskaalaista tuotantoa varten pinta-ala-tilavuus-suhdetta voidaan lisätä eri tavoilla, jotka ovat alalla tunnettuja. Esimerkiksi soluja voidaan kasvattaa sienimäisten polymeerien pinnalla, ohuiden levyjen 25 muodostamissa pinoissa, pienten lasihelmien pinnalla, ja vastaavilla alustoilla.

Vaihtoehtoisesti uusia seerumista riippumattomia solu-linjoja, kuten Bowes II, voidaan kasvattaa suspensiossa. Suuret fermentorit, jotka ovat sopivia suspensioviljelyyn, ovat 30 alalla hyvin tunnettuja ja niitä on kehitetty modifioimalla fermentoreita yksisoluisille mikro-organismeille. Solujen pitämiseksi tasaisesti suspendoituina kasvatusalustassa, ja jotta liuenneet kaasut (esim. happi) jakaantuisivat tasaisesti, tarvitaan sekoitusta. Tämä voidaan tehdä tavanomaisilla 35 turbiinisekoittajilla, potkurinmuotoisilla sekoittajilla, tärinäsekoittajilla, jotka heilahtelevat vaakasuoraan, ja vastaavilla. Edullisinta on hidas sekoitus solujen vahingoit 13 81 377 tumisen estämiseksi. Homogeenista sekoitusta voidaan myös ylläpitää johtamalla kaasuvirta viljelmän läpi.

Seerumista riippumattomista ihmisen soluista, kuten Bowes II-soluista saadut keräysliuokset on sentrifugoitava 5 irronneiden solujen ja solujätteiden poistamiseksi. On suositeltavaa lisätä ei-ionista detergenttiä kasvatusliuokseen, jotta estettäisiin TPA:n, pro-TPA:n ja muiden solujen erittämien arvokkaiden aineiden adsorptio astian pinnalle ja säilytettäsiin entsyymien aktiivisuus. Ei-ioninen detergent-10 ti, kuten Triton X-100 tai Tween 80 , lisätään mieluimmin siten, että sen lopullinen konsentraatio on n. 0,01-0,1 %. Koska suurin aktiivisuus saavutetaan pH-arvossa 5,5-6,0, keräysliuokset hapotetaan heikolla hapolla, kuten alempial-kaanihapolla, esim. etikkahapolla, tähän pH-arvoon ennen 15 säilytystä alhaisessa lämpötilassa, esimerkiksi n. 4°C:ssa 48 tuntia tai, pidemmän aikaa -20°C:ssa.

TPA:n, pro-TPA:n ja muiden arvokkaiden aineiden määrä keräysliuoksissa voidaan määrittää tavanomaisilla menetel- 125 millä. Esimerkiksi TPA-pitoisuus voidaan mitata I-fibrii- 20 ni-määrityksellä tai fluorometrisellä määrityksellä. Ensin- 125 nä mitataan se aikajakso, jona tapahtuu I-leimatusta fib-riinistä saatujen radioaktiivisten fibriinin hajoamistuotteina syntyneiden peptidien plasminogeenista riippuvainen vapautuminen, joka fibriini on saostunut liukenemattomaksi pääl-25 lysteeksi mikrotitrauslevyjen kaivojen pinnalle (vrt. E.L.

Wilson ja E.Dowdle, Int.J.Cancer 2_2, 390-399 (1978)). Toiseksi mitataan fluoresenssin kasvu, joka johtuu sopivan synteettisen substraatin, kuten Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC:n (AMC: amino-metyyli-kumariinitähde) tai Boc-Val-Gly-Arg-AMC:n amidolyy-30 sistä (vrt. M.Zimmerman et ai., Proc.Natl.Acad.Sei. USA 75, 750-753 (1978)). Kun 12^I-fibriini-analyysi antaa sekä TPA:n että pro-TPA:n kokonaisentsyymiaktiivisuuden, fluorometrinen määritys voidaan suorittaa siten, että ainoastaan TPA-aktii-visuus määritetään, tai vaihtoehtoisesti siten, että kun ke-35 räysliuos on käsitelty plasmiinilla, joka muuttaa pro-TPA:n TPArksi, sekä TPA että pro-TPA ovat mukana.

Käyttäen yllämainittuja TPA-määrityksiä voidaan osoit- 14 81 377 taa, että tämän keksinnön mukaisesti saatavat keräysliuok-set sisältävät pro-TPA:ta prosentuaalisesti suuren määrän. Tämä johtuu luultavasti siitä, että käytetyssä kasvatus-liuoksessa ei ole plasmiinia eikä muita proteaaseja, jotka 5 voivat muuttaa pro-TPA:n TPA:ksi. Pro-TPA:n valta-asema ke-räysliuoksissa, joita saadaan esimerkiksi viljellyistä Bowes II-soluista, muodostaa jyrkän vastakohdan Bowes I-melanooma-soluista saataville keräysliuoksille, jotka sisältävät pro-TPA:ta hyvin pienen määrän.

10 Seerumista riippumattomien solujen erittämien proteiinien eristäminen ja puhdistus

Haluttujen proteiinien eristys seerumista riippumattomista soluista, kuten Bowes II-soluista saatavista viljely-liuoksista ja niiden puhdistus voidaan suorittaa periaattees-15 sa millä tahansa sopivalla, proteiinikemiassa tavallisella tavalla, kuten jakosaostuksella, esim. epäorgaanisten suolojen kanssa, geelisuodatuksella, esimerkiksi ristikytketyillä dekstraaneilla tai agaroosilla, geelielektroforeesilla tai kromatografioiden avulla, kuten esimerkiksi adsorptiokroma-20 tografialla, ioninvaihtokromatografiällä tai affiniteetti- kromatografiällä. TPA:n ja pro-TPA:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi soveltuvia menetelmiä ovat esimerkiksi seuraavat: - Kromatografia sinkki-kelaattiagaroosilla, konkanavaliini A-agaroosilla ja Sephadex G-150 :llä (vrt. D.C.Rijken ja 25 D.Collen, J.Biol.Chem. 256, 7035-7041 (1981)). Keräysliuos valutetaan sinkkikelaattiagaroosipylvään läpi. Adsorboitunut entsyymi eluoidaan imidatsolia sisältävällä puskurilla. Saatu liuos pannaan konkanavaliini A-agaroosipylvääseen. Eluu-tio voidaan suorittaa metyylimannosidilla ja KSCN:llä. Vii-30 meisessä vaiheessa entsyymi geelisuodatetaan Sephadex G-150 -pylvään läpi.

- Kromatografia Affi-Gel Blue :11a ja aminobentsamidiini-Sepharose :11a (vrt. L.C.Gilbert ja J.T.Wachsman, Biochim. Biophys. Acta 704, 450-460 (1982)). Entsyymi adsorboidaan 35 peräkkäin Affi-Gel Blue :en ja aminobentsamidiini-Sepharose : iin. Desorptio voidaan suorittaa arginiinia sisältävällä puskuri 11a.

is 81377 - ΤΡΔ:η ja pro-TPA-n selektiivinen adsorptio käyttäen hyväksi niiden spesifistä affiniteettia liukoisiin fibriinifrag-mentteihin, jotka ovat kovalenttisesti kiinnittyneet liukenemattomaan matriisiin, esim. dekstraaniin (vrt. eurooppa- 5 lainen patentti n:o 23860). Adsorboitu entsyymi voidaan eluoida etikkahappopuskurilla, jonka pH on 4,2.

- Kromatografia immunoaffiniteettipylväässä, joka sisältää anti-TPA-vasta-aineita, erityisesti monoklonaalisia anti-TPA-vasta- aineita, sitoutuneena liukenemattomaan matriisiin, kuten ® © 10 Affi-Gel tai Sephadex-4B .

© - Affiniteettikromatografia DE-3 Sepharose :11a. Erythrina latissima-palkokasvin siemenet sisältävät DE-3:ksi kutsuttua trypsiini—inhibiittoria (ks. F.J.Joubert et ai., Hoppe-Seyler's Zeitschr. Physiol.Chem. 302, 531-538 (1981)}. On 15 havaittu, että DE-3 pystyy inhiboimaan myös TPA-aktiivisuut-ta. Siten puhdistettu DE-3-inhibiittori voidaan kytkeä liukenemattomaan matriisiin käyttäen standardimenetelmiä. TPA: ta ja pro-TPA:ta sisältävä kasvatusliuos adsorboituu ja voidaan eluoida kaotrooppista ainetta, esim. KSCN:a sisältäväl-20 lä puskurilla.

- Elektroforeesi SDS:ää sisältävillä polyakryyliamidigeeleil-lä (SDS-PAGE). Tätä menetelmää käytetään erityisesti analyyttisiin tarkoituksiin ja molekyylipainojen määrityksiin.

Riittävän puhtaan tuotteen saamiseksi voidaan valita 25 yksittäinen menetelmä tai peräkkäisiä puhdistusvaiheita.

Edelleen lisäpuhdistusvaiheet, esimerkiksi dialyysi sopivassa puskuriseoksessa, käänteisfaasi-HPLC ja vastaavat, saattavat olla tarpeen.

Keräysliuokset voidaan esimerkiksi kromatografoida 30 sinkkikelaatti-agaroosilla, konkanavaliini-A-agaroosilla ja

Sephadex G-150 :llä ensimmäisenä eristysvaiheena (jonka avulla voidaan myös konsentroida haluttu proteiini, joka on ke-räysliuoksessa, jonka tilavuus on suuri) ja saatu rikastettu proteiini voidaan lopullisesti puhdistaa affiniteetti-35 kromatografiällä.

Tämän keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa keräysliuos, joka on saatu seerumista riippumattomista ihmi- 16 81 377 sen soluista, kuten Bowes II-soluista, ja joka sisältää TPA: ta ja pro-TPA:ta, sentrifugoidaan kokonaisten solujen ja so-lujäännösten poistamiseksi ja valutetaan sitten huoneen lämmössä pylvään läpi, joka koostuu liukenemattomasta matrii-5 sista, johon on kytketty TPA:lie ja pro-TPA:lle selektiivinen affiniteettireagenssi, esimerkiksi BrCN-aktivoitu Sepha-rose , johon on kytketty DE-3-inhibiittori. Pylvään pesemisen jälkeen adsorboitunut TPA ja pro-TPA desorboidaan käsittelemällä pylväs puskuriliuoksella, esim. fosfaattipuskuroi- 10 dulla suolaliuoksella, jonka pH on n. 5,5-6,0, ja joka sisältää kaotrooppista ainetta, kuten KSCN, jonka suhteen liuos on n. 1,4- -n, 2,0 molaarinen, mieluimmin 1,6-molaarinen. Vaihtoehtoisesti desorboivaksi aineeksi voidaan valita bents-amidiini tai arginiini.

15 Vaihtoehtoisesti TPA ja pro-TPA eristetään kromatogra- fiällä monoklonaalisen vasta-aineen sisältävässä pylväässä, joka on valmistettu kytkemällä monoklonaalisia anti-TPA-vasta-aineita esim. Affi-Gel ':iin.

Edullisesti lisätään detergenttiä, erityisesti ei-ionis- © ® 20 ta detergenttiä, kuten Triton X-100 :aa tai Tween 80 :a, kaikkiin puhdistusvaiheessa käytettyihin puskuriliuoksiin, jotta estettäisiin TPA:n ja pro-TPA:n adsorptio astian pinnoille, ja stabiilisuuden parantamiseksi. Detergenttiä voidaan lisätä siten, että sen lopullinen konsentraatio on 0,01-0,1 %.

25 Näin saatava puhdistettu liuos sisältää TPA:n ja pro- TPA:n. TPA:n valmistamiseksi, jossa ei ole lainkaan pro-TPA: ta, pro-TPA muunnetaan entsymaattisesti TPA:ksi, esim. siten, että plasmiini tai jokin vastaavan vaikutuksen omaava entsyymi vaikuttaa pro-TPA:hän.

30 Tämän keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa pro-TPA eristetään olennaisesti puhtaassa muodossa, vapaana TPA:sta. Pro-TPA on todellinen proentsyymi, so. se on TPA:n entsymaattisesti inaktiivinen muoto. Pro-TPA adsorboituu fib-riiniin suuremmassa määrin kuin TPA ja se on sentähden selek- 35 tiivisempi kuin TPA fibrinolyysin aiheuttajana, koska se ensin liittyy fibriiniin ja muutetaan vasta sitten TPA:ksi, kun taas TPA:n yhteydessä on rajoitettu mahdollisuus, että i7 81 377 se aktivoi jonkin plasminogeenin veressä mieluummin kuin fib-riinin kohdalla, johon vaikutus halutaan paikallistaa, olennaisesti TPA:sta vapaan pro-TPA:n valmistamiseksi käytetään puhdistusmenetelmässä edullisesti proteaasi-inhibiittoria, kuten aprotiniinia tai emäksistä haiman trypsiini-inhibiit-toria, jotta inhiboitaisiin pienet määrät proteaaseja, joita voi olla läsnä ja jotka voivat aiheuttaa pro-TPA:n (osittaista) muuttumista TPA:ksi. Lopullinen puhdistus suoritetaan sitten kromatografialla pylväässä, joka sisältää selektiivistä affiniteettireagenssia, kuten DE-3:a, selektiivisesti vain TPA:ta eikä pro-TPA:ta sitovan inhibiittorin, kuten esim. di-isorpopyylifluorifosfaatin tai nitrofenyyli-guanidinobent-soaatin läsnäollessa. Nämä reagenssit estävät TPA:n adsorption affiniteettipylvääseen. Sen vuoksi sitoutunut TPA kulkee DE-3-pylvään läpi kun taas pro-TPA adsorboituu pylvääseen ja voidaan eluoida kuten yllä on selitetty.

Vastaavasti tämän keksinnön kohteena on lisäksi menetelmä TPA:n, pro-TPA:n tai niiden seosten valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista se, että seerumista riippumattomia ihmisen soluja tai niiden mutantteja, kuten Bowes II-soluja, jotka pystyvät tuottamaan TPA:ta, pro-TPA:ta tai niiden seoksia, viljellään seerumivapaassa kasvatusliuoksessa ja halutut proteiinit eristetään keräysliuoksesta ja, haluttaessa saatu proteiinien seos erotetaan ja muunnetaan yksityisiksi komponenteiksi. Spesifisesti tässä keksinnössä esitetään menetelmä pro-TPA:sta vapaan TPA:n valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista se, että saadusssa seoksessa oleva pro-TPA muunnetaan entsymaattisesti TPA:ksi. Erityisesti tässä keksinnössä esitetään menetelmä TPA:sta vapaan pro-TPA:n valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista se, että proteaasi-inhibiittori on mukana eristyksessä ja puhdistusprosessin aikana ja lopullinen puhdistus suoritetaan sellaisen inhibiittorin läsnäollessa, joka selektiivisesti inhiboi TPA:ta.

Yllämainitun menetelmän mukaisesti Bowes II-soluista saadut TPA:n ja pro-TPA:n seokset sekä TPA ja pro-TPA ovat olennaisesti puhtaassa muodossa.

TPA:lla ja pro-TPA:lla, joita saadaan viljellyistä Bowes II-soluista tämän keksinnön mukaisesti, on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia. Siten Bowes II-soluista saatuja TPA:ta ja pro-TPA:ta voidaan käyttää analogisesti tunnettu ie 81377 jen plasminogeeni-aktivaattoreiden kanssa ihmisissä verisuonitukosten ehkäisyyn ja hoitoon tai muiden tilojen, joissa halutaan saada aikaan paikallinen fibrinolyyttinen tai pro-teolyyttinen aktiivisuus plasminogeeniaktivaatiomekanismin kautta, kuten arterioskleroosiksen, sydän- ja aivoinfarktin, laskimotukosten, tromboembolia, kirurgisten toimenpiteiden jälkeisten verisuonitukosten, laskimon tukkotulehduksen (thrombophlebitis) ja diabeteksen yheydessä esiintyvien verisuonisairauksien ehkäisemiseen tai hoitoon.

Keksinnön mukaisesti valmistetuista TPA:sta ja pro-TPA: sta saadaan farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät terapeuttisesti tehokkaan määrän aktiivista aineosaa, TPA:ta, pro-TPA:ta tai niiden seoksia, yhdessä orgaanisten tai epäorgaanisten, kiinteiden tai nestemäisten farmaseuttisesti hyväksyttävien kantoaineiden kanssa, jotka ovat sopivia pa-renteraaliseen, so. lihaksensisäiseen, ihonalaiseen tai vat-saontelonsisäiseen antoon, ja jotka eivät vaikuta vahingollisesti aktiivisiin aineosiin.

On olemassa sopivia, erityisesti infuusioliuoksia, mie-luumin vesiliuoksia tai -suspensioita, joita on mahdollista valmistaa ennen käyttöä, esimerkiksi lyofilisoiduista valmisteista, jotka sisältävät aktiivista aineosaa yksinään tai yhdessä kantoaineen, kuten mannitolin, laktoosin, glukoosin, albumiinin tai vastaavien kanssa. Farmaseuttiset valmisteet voidaan steriloida, ja haluttaessa sekoittaa apuaineiden, esim. säilöntäaineiden, liukoiseksi tekevien aineiden, puskureiden ja/tai suolojen kanssa osmoottisen paineen säätämiseksi. sterilointi voidaan suorittaa steriilisuodatuksella sellaisten suodattimien läpi, joilla on pieni huokoskoko (0,45 ym halkaisija, tai pienempi), minkä jälkeen valmiste voidaan lyofilisoida haluttaessa. Antibiootteja voidaan myös lisätä, jotta steriiliys säilyisi paremmin.

Farmaseuttiset valmisteet jaetaan yksikköannosmuotoihin, esimerkiksi ampulleihin, jossa on 1-2000 mg farmaseuttisesti hyväksyttävää kantoainetta yksikköannosta kohti ja n. 1-20 mg, mieluimmin n. 3-15 mg aktiivista aineosaa (TPA, pro-TPA tai niiden seokset) yksikköannosta kohti.

Riippuen sairauden laadusta ja potilaan iästä ja tilasta, päivittäinen annos n. 70 kg painavan potilaan hoitamiseksi on välillä 3-15 mg, mieluimmin 5-10 mg 24 tuntia kohti.

i9 81 377 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut TPA:t käyttävät aktiivisuuttaan myös in vitro. Vastaavasti niitä voidaan käyttää fibrinolyyttisinä aineina myös yhdessä plasminogee-nin kanssa pesuliuoksissa ja puhdistusaineissa.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä rajoittamatta sitä kuitenkaan millään tavoin.

Esimerkeissä käytetyt lyhenteet: BPTI emäksinen haiman trypsiini-inhibiittori (basic pancreatic trypsin inhibitor) BSA naudan seerumialbumiini (bovine serum albumin) DFP di-isopropyylifluorifosfaatti DMEM Dulbecco'n modifioitu Eagle'n kasvatusliuos DTT 1,4-ditiotreitoli EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo FCS naudan sikiöseerumi (foetal calf serum) PBS fosfaattipuskuroitu suolaliuos (8 mM Na2HP04; 1,5 mM KH2P04; 1,14 M NaCl; 2,7 mM KCl) RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute'n soluviljelyliuos 1640 SDS natriumdodekyylisulfaatti TCA trikloorietikkahappo

Tris tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani T-T (0,1) 0,1M Tris-HCl pH 8,2, sisältää 0,1 % Triton X-100:aa. Esimerkki 1:

Seerumista riippumattoman Bowes II-solulinjan valmistaminen, a. Bowes II-solulinjan valmistamiseksi Bowes I-soluista kerätyn vakioidun kasvatusliuoksen avulla.

Ihmisen melanooma-solulinja [Bowes-RPMI 7272; kuvannut D.C.Rijken ja D.Collen., J.Biol.Chem. 256, 7035-7041 (1981)] saatiin Dr. E.Reich'ilta Rockefeller-yliopistosta, New York' ista. Solulinjaa viljellään kudosviljelypulloissa (150 cm^, Costar) 37°C:ssa kosteassa, 95 % ilma/5 % C02-atmosäärissä. Solut kasvavat kiinnittyneenä yksisolukerroksena Roswell Park Memorial Institute'n (RPMI) soluviljelyliuoksessa-1640 (Gibco), johon on lisätty natriumbikarbonaattia (2 g/1), antibiootteja (300 pg/ml penisilliiniä; 200 pg/ml streptomysiiniä; 10 yg/ml tylosiinia), ja 10 % kuumassa inaktivoitua (56°C, 30 min) naudan sikiöseerumia (FCS).

2" 81377

Valitaan yksi kudosviljelypullo, joka sisältää solujen kiinnittyneen yksisolukerroksen. Kun kasvusto on kasvanut täyteen (confluent) seerumia sisältävä kasvatusliuos poistetaan ja korvataan 50 ml :11a RPMI-1640 kasvatusliuosta, johon 5 on lisätty antibiootteja (ks. yllä). Tässä kasvatusliuokses-sa ei ole mitään muita lisäaineita. Soluja pidetään kosteassa 37°C:ssa ilma-atmosfäärissä, johon on lisätty 5 % CC^ta. Kasvatusliuosta vaihdetaan 24 tunnin välein. Aluksi solut näyttävät terveiltä ja pysyvät kiinnittyneinä. 12 päivän ku-10 luttua solut alkavat irrota viljelyastian pinnalta ja uivat vapaasti liuoksessa. 14 päivän kuluttua suurin osa soluista on irronnut ja pieni erä elinkykyisiä soluja on yhä kiinnittyneenä pulloon. Irronneet solut sisältävä kasvatusliuos poistetaan. Melanooma-solujen niukka, kiinnittynyt viljelmä, 15 jonka kasvuliuoksesta on puuttunut seerumi jo pitkän aikaa, peitetään 50 ml :11a uutta kasvatusliuosta, joka sisältää "vakioitua kasvatusliuosta" ("conditioned medium") laimennettuna yhtä suurella tilavuudella RPMI-1640:a. "Vakioitu kasvatusliuos" saadaan seuraavasti: 20 Seerumia sisältävä kasvatusliuos poistetaan täyteen kasvaneista seerumista riippuvaisista melanoomasoluista Bowes-RPMI 7272 ja korvataan pelkällä RPMI-1640-kasvatusliuoksella. 24 tuntia myöhemmin tämä liuos kerätään, sentrifugoidaan 2000 rpm, 5 min. ja suodatetaan 0,45 pm Millipore-suodatti-25 mella. Näin saatua liuosta kutsutaan "vakoiduksi kasvatus-liuokseksi" ja se laimennetaan välittömästi yhtä suurella tilavuudella RPMI-1640:a.

Tuoreella RPMI-1640:llä laimennettua "vakioitua kasvatusliuosta" lisätään viljelmään 4-5 päivän välein 3 kk ajan.

30 Tämän ajan kuluttua solujen määrä on lisääntynyt huomattavasti ja seerumivapaa viljelmä ei enää tarvitse "vakioitua kasvatusliuosta". Viljelmään lisätään sitten pelkkään RPMI-1640-alustaa.

Näin saatuja seerumista riippumattomia soluja viljel- 2 35 lään kudosviljelypulloissa (150 cm , Costar) ja ympin tiheyden on oltava n. 10° solua/ml kasvatusliuosta elinkelpoisuuden takaamiseksi. Soluja ympätään tavallisesti 5 x 10^ solua/

II

2 21 81377 50 ml RPMI-1640/150 cm :n pullo. Solut kasvavat hyvin hitaasti seerumivapaassa kasvatusliuoksessa ja niiden generaatio-aika on n. 6 päivää (kun verrataan seerumista riippuvaisen solulinja Bowes-RPMI 7272:n n. 24 tunnin generaatioaikaan).

5 Kun konfluenssi on saavutettu, solut tuorennetaan kopauttamalla pulloa voimakkaasti kiinnittyneiden solujen irrottamiseksi liuokseen. Tällä tavoin mekaanisesti irrotetut solut suspendoidaan RPMI-1640:een konsentraatiossa n. 10^ so-lua/ml ja käytetään tuoreiden kudosviljelypullojen ymppäämi-10 miseksi. Soluille, jotka eivät irtoa kopauttamalla, lisätään tuoretta RPMI-1640-liuosta. Tällä tavoin 5 kuukauden koko-naisajan kuluessa seerumista riippumattoman Bowes II-solu-linjan viljelmä on muodostunut.

b. Bowes II-solulinjän valmistaminen ilman Bowes I-soluista 15 kerättyä vakioitua kasvatusliuosta 4 ml pakastevarastoitua seerumista riippuvaista melanooma-solui in ja Bowes-RPMI 7272 (2,5 x 106 solua/ml DMEM: ssä), joka sisältää 15 % naudan sikiöseerumia ja 10 % DMSO: ta sulatetaan ja lisätään 15 ml:aan seerumivapaata, esiläm- 2 20 niitettyä DMEM:tä 75 cm :n kudosviljelypullossa. Soluja inku-boidaan yli yön 37°C:ssa kosteassa ilma-atmosfäärissä, johon on lisätty 5 % CC^ta. Tämän jakson jälkeen koko kasvatus-liuos, kiinnittymättömät solut mukaanlukien, poistetaan ja korvataan seerumivapaalla DMEMillä. Inkubointia jatketaan 25 kunnes solut esiintyvät granuloituina mikroskoopilla tarkasteltaessa (24-72 tuntia), jolloin 50 % kasvatusliuoksesta poistetaan ja korvataan seerumivapaalla DMEM:llä. Tämä mene-telmävaihe toistetaan joka toinen - kolmas päivä tarpeen vaatiessa (solujen ulkomuoto mikroskoopissa, kasvatusliuoksen 30 pH-muutos), lisäämällä vähitellen liuoksen kokonaistilavuus 30 ml:ksi. Kun 60-70 %:n konfluenssi on saavutettu (n. 3 viikkoa) solut tuorennetaan kahteen uuteen samankokoiseen pulloon käyttäen 0,02 % EDTArta solujen irrottamiseksi viljely-astian pinnalta. Ensimmäisessä tuorennuksessa seerumivapaa-35 seen DMEMrään lisätään 40 % kasvatusliuosta, joka on poistettu viljelmästä ennen EDTA-lisäystä. Tällöin on muodostunut seerumivapaa solulinja ja solut jatkavat jakaantumista ilman 2?. 81377 vakioitua kasvatusliuosta, jos ylläpidetään riittävän korkeata solutiheyttä, so. ainakin 30 %:n konfluenssi (pullo on kasvanut 30 %:sesti täyteen).

Esimerkki 2: 5 Bowes II-solujen viljely uppoviljelmässä

Bowes II-solut, jotka ovat kasvaneet täyteen (confluence) kudosviljelypulloissa seerumivapaassa kasvatusliuoksessa RPMI-1640, irrotetaan kopauttamalla pulloja voimakkaasti käsin, yhdistetään, jolloin saadaan 0,6 1 suspensiota, joka sisäl-10 tää 2x10“* solua/ml ja siirretään 3 1 höyry steriloituun lasi-astiaan. Solususpensiota sekoitetaan hitaasti mekaanisella sekoittajalla (40 rpm). Lämpötila säädetään 37 i 0,1°C:seen ja viljelmälle annetaan happea pintailmastuksen avulla ilmalla, joka sisältää 5 % CC^, nopeudella 0,1 1/min. Pidetään 15 huoli siitä, että pH ei laske alle arvon 6,9 vaihtamalla takaisin puhtaaseen ilmaan. Aiku-sopeutumisjakson aikana, joka kestää n. viikon, lisätään tuoretta seerumivapaata kasvatus-liuosta glukoosin loppuunkulumisen estämiseksi. Viljelmän lopullinen tilavuus on 1 litra. Kun solutiheys on saavutta-20 nut arvon 3-4 x 105 solua/ml, aloitetaan viljelyliuoksen ajoittainen poisottaminen. Joka 2-4 päivä sekoitus keskeytetään kolmeksi tunniksi, jotta useimmat elinkykyiset solut sedimentoituisivat ja ylempi puoli (50 %) käytetystä kasva-tusliuoksesta otetaan pois ja korvataan tuoreella seerumiva-25 paalia liuoksella. Keräysliuokset sentrifugoidaan 2000 rpm (^ 300 g) 5 min. kokonaisten solujen ja solujäännösten pois- (p) tamiseksi. Liuokset stabiloidaan Triton X-100':lla, jonka lopullinen konsentraatio liuoksessa on 0,1 % ja hapotetaan etik-kahapolla pH-arvoon 5,5-6,0 ennen säilytystä -20°C:ssa.

30 Esimerkki 3:

Bowes II-solujen kasvatus kudosviljelypulloissa ja keräys-liuosten kokoaminen

Seerumista riippumaton solulinja Bowes II ympätään 5 x 7 2 10 solua/150 cm kudosviljelypullo (Costar) 50 ml:ssa RPMI-35 1640:stä, johon on lisätty antibiootteja (vrt. esimerkki 1) 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, jossa on ilmaa 95 % ja CC^a 5 %. Kun solut ovat kiinnittyneet, kasvatusliuos kerä 23 81 377 tään solujen päältä ja korvataan tuoreella RPMI-1640:11a, johon on lisätty antibiootteja. Seerumivapaiden keräysliuosten ottaminen toistetaan 24 tunnin välein kunnes yksisolukerrok-sen täyteen kasvaminen tekee tuorennuksen välttämättömäksi.

5 Konfluessi saavutetaan n. 5 viikon kuluttua. Tuorennus suoritetaan kuten esimerkissä 1 on selitetty. Keräysliuosta käsitellään kuten esimerkissä 2 on selitetty.

Esimerkki 4; TPA- ja pro-TPA-pitosuuden määritys keräysliuoksissa 10 TPA:ta ja pro-TPA:ta sisältävät keräysliuokset käsitel- 3

lään H-DFP:llä (di-isopropyylifluorif osfaatti), jonka spesifinen aktiivisuus tunnetaan. Inkubaation jälkeen leimatut entsyymit otetaan talteen ja vapautetaan reagoimattomasta radioaktiivisesta DFP:stä saostamalla ja pesemällä trikloo-15 rietikkahapolla käyttäen seriiniproteaaseille kirjallisuudessa suositeltuja menetelmiä (j.A.Cohen et ai., Methods in Enzymology, Voi. XI, s. 868 (1967)). Tämä aktivaattorin ak-tiivikohtatitraus osoittaa, että seerumista riippumattomista Bowes II-soluista kootut keräysliuokset sisältävät n. 10-20 20 nmoolia kokonais-TPA:ta litraa kohti. Kokonais-TPA:n (TPA

ja pro-TPA) vapautuminen Bowes I- ja Bowes II-soluista neljänä peräkkäisenä päivänä voidaan määrittää seuraavasti: 2 5 2 75 cm :n kudosviljelypulloissa (1,3 x 10 solua/cm ; 20 ml/pullo) kasvaneista Bowes I-melanoomasoluista tai 150 2 5 2 25 cm :n pulloissa (4 x 10 solya(cm ; 50 ml/pullo) kasvaneista Bowes II-soluista saadut keräysliuokset otetaan joka 24.

tunti neljän päivän ajan. Plasminogeeniaktivaattori-aktiivi-1 25 suus mitataan I-fibriinimäärityksellä (ks. alla). Bowes II-soluilla TPA:n vapautuminen pysyy vakiona mainitun neljän 30 päivän ajan, kun taas Bowes I-melanoomasoluilla TPA-aktii-visuus lisääntyy hieman ensimmäisten kolmen päivän aikana, mutta vähenee sitten neljäntenä päivänä. Tänä aikana monet soluista olivat irroneet pinnasta ja kiinnittymisen palauttamiseksi on lisättävä RPMI:tä, johon on lisätty 10 % FCS:ää 35 (vrt. taulukko 1).

125 , I-fibriinimäärityksessä (E.L.Wilson ja E.Dowdle,

Int.J.Cancer 22, 390-399 (1978)) kiinteätaasisubstraattiin 24 81 377 125 kiinnitetään radioaktiivista I-fibrinogeeni/fibriiniä, joka on saostunut ohueksi kerrokseksi muovisten kudosviljely-levyjen kaivojen sisäpohjapinnoille. Analysoitavat keräys-liuosnäytteet lisätään kaivoihin ja TPA-aktiivisuus mitataan 5 radioaktiivisuuden plasminogeenista riippuvaisena liukenemi- 125 sena ajan funktiona. Koska I-fibriinimääritys mittaa sekä TPA- että pro-TPA-aktiivisuuden, taulukossa 1 annetut tulokset TPA-aktiivisuudelle tarkoittavat kokonaisentsyymiä. Taulukko 1; Kokonais-TPA:n vapautuminen seerumista riippu-10 vaisista Bowes I-melanoomasoluista ja seerumista riippumattomista Bowes II-soluista kudosviljelypulloissa, esitettynä kansainvälisinä urokinaasi (UK) yksikköinä.

Solutyyppi_Aika (pv) Kokonais-TPA (UK-yksikköä)

Bowes melanooma I 1 1154 15 2 1254 3 1380 4 976

Bowes II 1 3560 2 3660 20 3 3950 4 3850

Lisäksi sekä seerumista riippuvaisten Bowes-melanooma-solujen että seerumista riippumattomien Bowes II-solujen vil-jelynesteistä määritetään erillinen TPA- ja pro-TPA-pitoisuus: 5 25 Bowes I-melanoomasoluja maljataan 5 x 10 solua 35 mm:n maljaa kohti, joita on useita rinnakkaisia, 2 mlrssa RPMI:tä, joka sisältää 10 % FCS:ää. 24 tunnin kuluttua kasvatusliuos korvataan seerumivapaalla RPMI:lla ja 24 tunnin keräysliuok-set kerätään kolmena peräkkäisenä päivänä. Jokaisen 24 tunnin 30 ajanjakson lopussa solujen lukumäärä maljaa kohti lasketaan.

g

Bowes II-solut maljataan 3 x 10 solua 35 mm:n maljaa kohti 2 ml:ssa RPMI:tä.

Plasminogeeniaktivaattoriaktiivisuus määritetään käyttämällä fluorometristä määritystä, käyttäen substraattina 35 Gbz-Gly-Gly-Arg-AMC:tä. TPA:n suora amidolyyttinen vaikutus 25 81377 mitataan fluorometrisesti seuraamalla fluoresenssin lisääntymisnopeutta 455 nm:ssä, mikä johtuu aminometyylikumariinin (AMC) amidolyyttisestä vapautumisesta fluorogeenisestä substraatista (vrt. M.Zimmerman et ai., Proc .Natl .Acad . Sei . US/i 5 7_5, 750-753 (1978)). 1 FU vastaa sitä entsyymimäärää, joka hydrolysoi 10 pmoolia substraattia yhdessä minuutissa amido-lyyttisessä määrityksessä. Tulokset on kuvattu taulukossa 2. Taulukko 2: TPA:n ja pro-TPA:n vapautuminen seerumista riippuvaisista Bowes I-melanoomasoluista ja seerumista riippumat-10 tornista Bowes II-soluista.

Plasminogeeniaktivaattorin vapautuminen Solu- vilie- (FU/106 solua^24 h) tyYPpi lyssä--------1-----

Solutiheys (solua χΚΓχοιΓ2 aktiivisuus TPA(%) pro-TPA(%r '

Bowes me- l . 1,04 46,62 87,5 12,4 lanooma 1 2 I/22 51,96 92,1 7,9 3 M3 64,86 83,9 16,1

Bowes 11 1 3,88 26,06 12,7 87,3 2 3,88 25,10 12,4 87,5 3 4,01 24,40 10,9 88,9 (a) Kokonais-TPA-aktiivisuus määritetään, kun 295 ui keräys-liuosta on inkuboitu 5 μ1:η kanssa plasmiinia (0,1 mg(ml) 60 min. huoneen lämmössä. Määritystä varten plasmiini inhiboidaan Trasylole:11a.

15 (b) Proaktivaattorin (pro-TPA) määrä arvioidaan vähentämällä kokonaisaktiivisuudesta ilman plasmiiniaktivaatiota mitattu aktiivisuus.

Kuten taulukosta 2 voidaan nähdä, n. 10 % seerumista riippumattomien Bowes II-solujen erittämästä TPA:sta on aktiivi-20 sen entsyymin muodossa ja n. 90 % pro-entsyymin (pro-TPA) muodossa. Päinvastoin seerumista riippuvaisten Bowes I-melanoomasoluista kerätyt kasvatusliuokset sisältävät 90 % TPA:ta 26 81 377 ja n. 10 % pro-TPA:ta.

Esimerkki 5: TPA:n ja pro-TPA:n talteenotto ja puhdistus a. DE-3-Sepharose -pylvään valmistus 5 26 mg puhdistettua DE-3-inhibiittoria Erythrina latissi- ma-palkokasvista (f.J.Joubert et ai., Hoppe-Seyler's Zeitschr.

Physiol.Chem. 302, 531-538 (1981)) kytketään 5 ml:aan syano- ® geenibromidilla aktivoitua Sepharose 4b :a (Pharmacia) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Matriisi tasapainotetaan fos- 10 faattipuskuroidulla suolaliuoksella ("PBS") pH 7,4, joka si- ® sältää 0,4 M NaCl, 0,1 % Triton X-100 ja 0,02 % natriumat-sidia. Matriisi pakataan sitten 5 ml:n pylvääseen.

b. TPA:ta ja pro-TPA:ta sisältävien keräysliuosten kromato-grafinen puhdistus DE-3-Sepharose 4b :llä.

15 Kaksi litraa seerumista riippumattomista Bowes II-so- luista saatua keräysliuosta (ks. esimerkki 3) tehdään 0,4 mo-laariseksi NaCl:n suhteen ja 0,1 %:seksi Triton X-100 :n suhteen ja suodatetaan 0,45 gm membraanin läpi (Millipore). Ke-raysliuos imeytetään sitten DE-3-Sepharose -pylvääseen (ks.

20 yllä) virtausnopeudella 45 ml/h huoneen lämmössä ja effluent-ti heitetään pois. Kun koko keräysliuostilavuus on valunut läpi, pylväs pestään n. 50 ml :11a PBS:ää, joka sisältää 0,4 M NaCl ja 0,1 % Triton X-100 :aa. Adsorboituneet proteiinit eluoidaan sitten käyttäen PBS:ää, joka sisältää 1,6 M KSCNrää, 25 0,4 M NaClra ja 0,1 % Triton X-100°:aa ja kerätään 2 ml:n fraktioita 4°C:ssa. Jokaisen fraktion proteiinipitoisuus määritetään mittaamalla UV-absorbanssi 280 nm:ssä. Adsorboituneen proteiinin havaitaan eluoituneen terävänä huippuna.

Fraktiot, joilla on suurin UV-absorbanssi ja suurin fibrino- 125 30 lyyttinen aktiivisuus, joka mitataan I-fibriinimäärityk- sellä, yhdistetään, jolloin saadaan 8 ml liuosta, joka säilytetään -20°C:ssa. Tämä vastaa n. 70-80 % pylvääseen pannusta kokonaisaktiivisuudesta. Alhaisemman aktiivisuuden omaavat fraktiot yhdistetään erikseen. Aktiivisuuden kokonaistalteen-35 ottoprosentti molemmissa yhdistetyissä erissä nousee yleensä 90-100 %:iin.

Yhdistetyistä fraktioista otetaan näyte. Proteiini saos- 27 81 377 tetaan lisäämällä trikloorietikkahappoa, siten, että sen lopullinen konsentraatio liuoksessa on 10 %, ja sille suoritetaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi. Elektroforeto-grairunissa nähdään yksi proteiini juova, jonka molekyylipaino 5 on n. 73 000 daltonia, määritettynä Weverin ja Osbornen mukaan (J.Biol.Chem. 244 , 4406-4412 (1969)) käyttäen ko-elektro-foroituja merkkiproteiineja, joiden molekyylipaino tunnetaan.

Yhdistettyjen fraktioiden TPA- ja pro-TPA-pitoisuus määritetään käyttämällä fluorometristä määritystä käyttäen 10 substraattina Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC:a (vrt. esimerkki 4). Koko- nais-TPA-aktiivisuus mitataan, kun on inkuboitu plasmiinin 0 kanssa, joka on inhiboitu Trasylol :11a määritystä varten. Pro-TPA:n määrä arvioidaan vähentämällä kokonaisaktiivisuu-desta ilman plasmiiniaktivaatiota määritetty aktiivisuus.

15 Voidaan todeta, että plasminogeeniaktivaattorin puhdistus Bowes II-solujen kasvatusliuoksesta antaa saaliiksi TPA:n ja pro-TPA:n seoksen, jossa näitä molempia on suunnilleen yhtä paljon. Siten pro-TPA muuttuu osittain aktiiviseksi entsyymiksi eristysprosessin aikana, koska Bowes II-soluista ke-20 rätyissä käsittelemättömissä keräysliuoksissa TPA:n osuus on 10 % ja pro-TPA:n 90 % (vrt. esimerkki 4, taulukko 2).

Seerumista riippumattomasta Bowes II-solulinjasta saatujen keräysliuosten käsittely pienillä määrillä naudan si-kiöseerumia (0,01 %) johtaa pro-TPA:n muuttumiseen TPAtksi.

25 Tämä johtuu luultavasti siitä, että naudan sikiöseerumissa on läsnä plasmiinia.

c. TPA:ta ja pro-TPA:ta sisältävien keräysliuosten kromatografinen puhdistus DE-3-Sepharose 4b:llä proteinaasi-inhi-biittorin läsnäollessa.

30 Seerumista riippumattomista Bowes II-soluista saatujen keräysliuosten kromatografia suoritetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 5 b on selitetty, paitsi että menetelmään sisällytetään emäksistä haiman trypsiini-inhibiittoria (BPTI) 0,1 KIU/ml. Käyttäen fluorometristä määritystä, substraattina 35 Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC (ks. yllä), määritetään puhdistetun liuoksen TPA- ja pro-TPA-pitoisuus, 90 % TPA:sta on proentsyymi-muodossa ja 10 % aktiivisessa muodossa. Siten BPTI inhiboi 28 81 377 pro-TPA:n muuttumista TPA:ksi puhdistusprosessin aikana. Esimerkki 6:

Osoitus yksiketjuisen pro-TPA:n läsnäolosta puhdistetuissa TPA-preparaateissa 5 Seerumista riippumattomista Bowes II-solulinjasta saa dut keräysliuokset puhdistetaan affiniteettikromatografial-la DE-3-Sepharose :11a, kuten esimerkissä 5 c on selitetty. Näin saatavassa puhdistetussa liuoksessa n. 90 I TPA:sta on proentsyymimuodossa ja n 10 % on aktiivisen entsyymin ποιοι 0 dossa, määritettynä amidolyyttisellä analyysillä ennen ja jälkeen plasmiinikäsittelyn. Liuos dialysoidaan T-T (0,1): een. Näytteet tästä liuoksesta sekoitetaan yhtä suurien tilavuuksien kanssa PBS:ää tai PBS:ää, joka sisältää 5 yg/ml plasmiinia. Kun on inkuboitu 16 g 20°C:ssa, lisätään SDS:ää 15 siten, että sen lopullinen konsentraatio liuoksessa on 0,1 % ja proteiinit saostetaan 6 %:sella TCA:lla. Sakat 200 μ1:η näytteistä alkuperäistä entsyymiliuosta pestään asetonissa ja liuotetaan uudelleen 20 yl:aan 0,06 M Tris-HCl:ää, pH 6,8, joka sisältää 1 % SDS:ää ja 10 % glyserolia. Mikäli tarpeel-20 lista, nämä näytteet pelkistetään tässä vaiheessa lisäämällä 2 yl 1-molaarista DTT:tä ja inkuboidaan 37°C:ssa 30 min. Kaikkia näytteitä keitetään sitten 1 min. ja 2 yl:sta jokaista näytettä ajetaan elektroforeesi 5-15 %:sessa polyakryyliami-digeelissä (levy, slab), joka sisältää 0,1 % SDS:ää. Elektro-25 foreesin jälkeen geeli värjätään Coomassie brilliant blue : : 11a ja ylimääräinen väri poistetaan kuten tavallisesti. Elek- troforeettiset vyöhykkeet sisältävät (a) molekyylipainomerk-kiaineet, (b) käsittelemättömän ja pelkistämättömän TPA-liuok-sen, (c) käsittelemättömän ja pelkistetyn TPA-liuoksen, ja 30 (d) plasmiinilla käsitellyn ja pelkistetyn TPA-liuoksen.

Vyöhykkeellä (b) nähdään ainoastaan yksi proteiinijuova, jonka molekyylipaino on n. 73 000. Pelkistävissä olosuhteissa (vyöhyke c) suurin osa TPA:sta kulkee 73 000 daltonin alueella. Kuitenkin ylimääräisiä heikkoja juovia voidaan ha-35 väitä 35 000 daltonin alueella. Plasmiinikäsittely ja pelkistys DTTrllä muuntaa 73 000:n daltonin proteiinin kahdeksi alayksiköksi, joiden molekyylipaino on ilmeisesti 35 000 29 81 377 daltonia ja 38 000 daltonia, vastaavasti. Nämä kokeet osoittavat, että yksiketjuinen pro-TPA, jonka molekyylipaino on 73 000 daltonia, muuttuu plasmiinikäsittelyllä kaksiketjui-seksi muodoksi (TPA), jossa on S-S-sidos. TPA hajoaa sitten 5 pelkistävissä olosuhteissa, jolloin saadaan kaksi alayksikköä. Esimerkki 7: pro-TPA:n entsyymiaktiivisuuden määritys TPA-preparaattinäytteitä (500 ui), joka sisältävät n.

20 FU/ml kokonaisaktivaattoria (TPA ja pro-TPA) T-T (0,1): 10 ssä, inkuboidaan 5 mM DFP:n läsnäollessa (a ja b) tai ilman sitä (c ja d) 60 min. 20°C:ssa. Vapaa DFP poistetaan H.S. Penefskyn esittämän menetelmän mukaisesti (j.Biol.Chem. 252, 2891-2899 (1977)) sentrifugoimalla 100 yl:n näytteitä reak-tioseoksista 1 ml:n pylväiden läpi, joka sisältävät Sephadex 15 G25 :a (fine), jotka on tasapainotettu T-T(0,1):llä. 3 yl plasmiinia (0,5 mg/ml) (b ja d) tai 3 yl PBS:ää (a ja c) lisätään näihin näytteisiin ja niitä inkuboidaan 30 min. 20°C:ssa. 50 mikrolitraa jokaista näytettä otetaan sitten liuoksesta ja lisätään 10 yl:aan BPTI:tä (1000 KIU/ml) plasmiiniaktii-20 visuuden inhiboimiseksi. Jokaisen näytteen amidolyyttinen aktiivisuus määritetään käyttämällä fluorometristä määritystä. Tulokset on kuvattu taulukossa 3.

Taulukko 3: DFP-resistentin pro-TPA:n aktivointi plasmiinilla Käsittely Aktivisuus (FU/ml) DFP Pjasmiini a) + - 0,00 b) + + 8,23 c) - - 6,25 d) + 17,48 Näytteen kokonais-TPA-pitoisuus on 17,48 FU/ml (d), jossa 6,25 25 FU/ml on läsnä aktiivisen entsyymin muodossa (c). Aktiivinen entsyymi inhiboituu havaitsemattomiin pitoisuuksiin DFP-kä-sittelyllä (a). DFP-käsittelyn jälkeen aktiivinen entsyymi voidaan generoida inkuboimalla plasmiinin kanssa 2 (b), mikä osoittaa, että pro-TPA on resistentti DFP-käsittelylle 30 81 377 eikä siinä ole mitattavaa entsyymiaktiivisuutta.

Esimerkki 8;

Pro-TPA:n erottaminen TPAista

Esimerkissä 5 c esitetyllä tavalla saadun TPA:n (10 %)

5 ja pro-TPA:n (90 %) liuoksen pH säädetään arvoon 8,0 0,1 M

Tris-HCl:llä, joka sisältää 0,1 % Triton X-100 Saa ja tehdään 1-molaariseksi DFP:n suhteen. Kun on inkuboitu 37°C:ssa 4 tuntia, seos valutetaan 5 ml:n DE-3-Sepharose -pylvään läpi (vrt. esimerkki 5 a). Irreversiibelisti inhiboituneen TPA:n 10 sisältävä effluentti heitetään pois. Pylväs pestään kuudella pylvään tilavuudella PBS:ää, joka sisältää 0,4 M NaCl ja 0,1 (p % Triton X-100 ja eluoidaan sen jälkeen PBS:llä, joka sisältää 1,6 M KSCN, 0,4 M NaCl ja 0,1 % Triton X-100®, kuten esimerkissä 5 b on selitetty. Suurimman UV-absorbanssin osoitta-15 vat fraktiot yhdistetään. Tämä liuos sisältää pro-TPA:n olennaisesti puhtaassa muodossa, koska minkäänlaista amidolyyt-tistä aktiivisuutta ei ole havaittavissa fluorometrisellä määrityksellä, kun käytetään substraattina Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC:tä. Amidolyyttinen, samoin kuin fibrinolyyttinen aktii-20 visuus saadaan uudelleen esille käsittelemällä plasmiinilla, joka muuttaa pro-TPA:n aktiiviseksi entsyymiksi.

Esimerkki 9: TPA:n ja pro-TPA:n sitominen saostettuun fibriiniin

Viisi näytettä, jotka sisältävät TPA:ta ja pro-TPA:ta 25 eri suhteissa, saadaan kuten esimerkissä 5 c on esitetty, tai osittain muuntamalla pro-TPA TPA:ksi sellaisessa liuoksessa. Niiden aktiivisen TPA:n ja pro-TPA:n määrät määritetään fluorimetrisen analyysin tuloksista ennen ja jälkeen plasmiinikäsittelyn, kuten esimerkissä 4 on selitetty. Nämä 30 näytteet laimennetaan sitten T-T(0,1):llä siten, että 0,2 ml, 2 ug:n plasmiinia läsnäollessa, vapauttaisi yhdessä tun- 125 nissa n. 30-50 S I-fibriinistä, joka peittää Linbro-kai- vojen pohjan.

Näyte-erät (0,2 ml) lisätään sitten neljänä rinnakkai- 125 35 sena Linbro-kaivoihin, jotka on peitetty I-fibriinillä (30 ug; 100 000 cpm). Yhden tunnin inkuboinnin jälkeen 0°C: ssa kaksi kaivoa jokaisesta neljästä rinnakkaismäärityksestä 31 81377 pestään kolme kertaa T-T(0,1):llä sitoutumattomien TPA-pro-teiinien poistamiseksi.

1 2 5

Sitoutunut aktiivisuus mitataan I-fibriinin määränä, joka liukenee yhdessä tunnissa sen jälkeen kun on lisätty 0,3 5 ml Tris-HCl:ää, pH 8,1, joka sisältää 2 yg plasminogeenia ja 80 yg BSA:ta. Kaivoihin lisätty kokonais-TPA-aktiivisuus mi-1 25 tataan I-fibriinin määränä, joka liukenee yhdessä tunnissa sen jälkeen kun on lisätty 2 yg plasminogeenia ja 80 yg BSA:ta (0,3 mlrssa samaa puskuria) kaivoihin, joita ei ole 10 pesty.

Tulokset on kuvattu taulukossa 4.

Taulukko 4: Pro-TPA:n sitoutuminen saostettuun fibriiniin

! ' 1 I

Näyte - pro-TPA Fibrinolyyttinen aktiivisuus (" 1 iniä liuennut 60 minuutissa)

Kokonais- Aktiivisuus aktiivisuus pesun jälkeen ^ sitoutunut 1 88,7 29,83 29,48 98,8 2 34,0 45,90 37,52 81,7 3 64,0 56,56 41,53 73,4 i 4 87,0 48,88 48,76 99,8 i 5 i 88,0 53,85 52,49 97,5 !______________________.j_____________J____________1_________________________

Taulukko 4 osoittaa, että suurempi prosenttiosuus ko-konais-TPA-entsyymiä sitoutuu saostettuun fibriiniin kun 15 TPA-preparaatti on pro-aktivaattorimuodossa.

Esimerkki 10:

Farmaseuttinen valmiste parenteraaliseen antoon

Esimerkkien 5 b, 5 c tai 8 mukaisesti saatu, TPA:ta ja pro-TPA:ta sisältävä liuos dialysoidaan 0,3-molaarista 20 natriumkloridiliuosta vastaan, joka sisältää 0,01 % Tween 80@:tä ja säilytetään -80°C:ssa. Ennen antoa konsentraatio säädetään arvoon 75 yg/ml, kokonais-TPA:ta (so. TPA tai pro-TPA, tai TPA + pro-TPA) ja 0,3-molaariseksi NaCl:n suhteen.

32 81377

Liuos steriloidaan suodattamalla 0,22 um:n membraanisuodat-timen läpi.

Tämä menetelmä on sopiva TPA-, pro-TPA- tai TPA + pro-TPA-liuosten valmistamiseksi parenteraaliseen, kuten laski-5 monsisäiseen antoon.

Esimerkki 11:

Sellaisen mutantin valitseminen seerumista riippumattomasta Bowes II-solulinjasta, joka kykenee tuottamaan suuria määriä TPA:ta.

10 5 % naudan sikiöseerumia lisätään seerumista riippu mattoman Bowes II-solulinjan petrimaljaviljelmälle solujen kasvunopeuden lisäämiseksi ja sen takaamiseksi, että useammat solut ovat s-vaiheessa tiettynä ajankohtana. Kun solut jakautuvat nopeasti ja ovat eksponentiaalisessa kasvuvaihees-15 sa, ja kun n. 70 %:n konfluenssi on saavutettu, viljelmään lisätään 0,1 M N-metyyli-N-nitro-N'-nitrosoguanidiinia (MNNG). Tämä konsentraatio aiheuttaa sen, että n. 70-80 % soluista kuolee. 36 tunnin kuluttua jäljellä olevat elinkykyiset solut poistetaan petrimaljalta trypsiinikäsittelyllä. Solut 20 ympätään uudelleen tiheydellä 1 x 105 solua/60 mm petrimalja. Kahden viikon kuluttua solurykelmiä tarkastellaan maljan pohjasta, jokaisen rykelmän vastatessa mutageneesissa eloonjääneen yksittäisen solun jälkeläisiä. Nämä rykelmät peitetään sitten 1 ml :11a peiteliuosta, joka sisältää 25 50 μ 1 plasminogeenia (1 mg/ml) , 300 μΐ 8 % kaseiinia isotonisessa suolaliuoksessa, 600 ui 2,5 % agaria isotonisessa suolaliuoksessa ja 800 ui RPMI-1640-kasvatusliuosta.

Hajoamisalueet kehittyvät TPA:ta tuottavien kloonien 30 ympärille ja suurimmat hajoamisalueet havaitaan niiden kloonien ympärillä, jotka tuottavat eniten TPA:ta. Suurimman määrän TPA:ta tuottava mutanttiklooni eristetään ja levitetään petrimaljalle.

Claims (9)

33 81 377

1. Menetelmä ihmisen solulinjan tuottamiseksi, joka kykenee toisiintuvasti ja riippumattomasti lisääntymään viljelmässä ilman seerumin ja eksogeenisten makromolekulaaristen kasvutekijöiden läsnäoloa ja joka tuottaa TPArta ja/tai pro-TPA:ta, tunnettu siitä, että (a) muodostetaan TPA:ta tuottavan ihmisen Bowes-mela-noomasolulinjan viljelmä seerumia sisältävään viljelyalus-taan, (b) poistetaan viljelmästä mainittu seerumia sisältävä kasvualusta ja korvataan se kasvualustalla, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, (c) syötetään kiinnittyneille tai ei-kiinnittyneille soluille kasvualustaa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, ja (d) viljellään soluja, kunnes ne lisääntyvät toisiintuvasti ja riippumattomasti kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, jolloin muodostuu ihmisen solulinja, joka kykenee toisiintuvasti ja riippumattomasti lisääntymään kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä ja joka tuottaa TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suoritetaan lisävaihe, jossa kohdassa (d) muodostettua ihmisen solulinjaa käsitellään mutageenil-la tai saatetaan alttiiksi röntgensäteille tai ultraviolettisäteille, pysyvän mutanttisolulinjan tuottamiseksi, joka kykenee toisiintuvasti ja riippumattomasti lisääntymään kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä ja joka tuottaa TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohtien (a) ja (b) suorittamisen jälkeen (c) poistetaan määräajoin mainitusta viljelmästä olen- 81377 naisesti koko kasvualusta ja kaikki ei-kiinnittyneet solut, erotetaan ei-kiinnittyneet solut kyseisestä poistetusta kasvualustasta ja viljelmässä jäljellä oleviin kiinnittyneisiin soluihin lisätään takaisin mainitut ei-kiinnittyneet solut ja tuoretta kasvualustaa, jossa ei ole seerumia eikä ekso-geenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, ja (d) toistetaan vaiheen (c) poisto-, erotus- ja takai-sinlisäysvaiheet kunnes viljelmässä olevat kiinnittyneet solut lisääntyvät toisiintuvasti ja riippumattomasti tuoreessa kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, jolloin muodostuu ihmisen solulinja, joka kykenee toisiintuvasti ja riippumattomasti lisääntymään kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä ja joka tuottaa TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohtien (a) ja (b) suorittamisen jälkeen (c) poistetaan määräajoin mainitusta viljelmästä ainakin osa ko. kasvualustasta ja korvataan se tuoreella kasvualustalla, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, ja (d) toistetaan vaiheen (c) poisto- ja korvausvaiheet, kunnes viljelmässä saavutetaan kiinnittyneiden solujen ainakin 30 %:n konfluenssi, ja (e) erotetaan kiinnittyneet solut ja viljellään niitä kasvualustassa, jossa on osa kasvualustasta, joka poistettiin viljelmästä ennen kiinnittyneiden solujen erottamista, ja tuoretta alustaa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, sellaisen ihmisen solu-linjan tuottamiseksi, joka kykenee toisiintuvasti ja riippumattomasti lisääntymään kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä ja joka tuottaa TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kyseinen kiinnittyneiden solujen erot- II 35 8 1 377 taminen suoritetaan sen jälkeen kun ainakin 60 %:n konfluens-si on saavutettu.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohtien (a) ja (b) suorittamisen jälkeen (c) lisätään viljelmään määräajoin kasvualustaa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, ja joka on kasvualustaa, joka on otettu talteen Bowes-solujen soluviljelmästä sen jälkeen kun tällaisessa viljelmässä on seerumia sisältävä kasvualusta korvattu kasvualustalla, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, ja (d) jatketaan vaiheessa (c) mainittua ajoittaista lisäämistä, kunnes saadaan pysyvä solulinja, joka kykenee toi-siintuvasti ja riippumattomasti lisääntymään kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä ja joka tuottaa TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta.

7. Menetelmä TPA:n, pro-TPA:n tai niiden seosten tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistetun ihmisen solulinjan soluja, joka solulinja on peräisin TPA:ta tuottavasta ihmisen Bowes-melanoomasolulin-jasta, jotka solut kykenevät toisiintuvasti ja riippumattomasti lisääntymään kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä ja jotka tuottavat TPArta ja/tai pro-TPA:ta, otetaan mainitusta viljelmästä neste talteen ja eristetään aktivaattori tai aktivaattoriseos kyseisestä liuoksesta.

8. Menetelmä TPArsta olennaisesti vapaan pro-TPA:n valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettuja soluja tai ihmisen solulinjaa, joka on peräisin TPA:ta tuottavasta ihmisen Bowes-melanoomasolu-linjasta, jotka solut kykenevät toisiintuvasti ja riippumat- 36 81 377 tomasti lisääntymään viljelmässä kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, ja jotka tuottavat TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta, mainitusta viljelmästä otetaan talteen neste, jolle suoritetaan proteiinipuhdistus proteaasi-inhibiittorin läsnäollessa ja mainittu puhdistettu, talteenotettu neste puhdistetaan lopullisesti sellaisen inhibiittorin läsnäollessa, joka selektiivisesti inhiboi TPA:ta.

9. Menetelmä pro-TPA:sta olennaisesti vapaan TPA:n valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettuja soluja tai ihmisen solulinjaa, joka on peräisin TPA:ta tuottavasta ihmisen Bowes-melanoomasolu-linjasta, jotka solut kykenevät toisiintuvasti ja riippumattomasti lisääntymään viljelmässä kasvualustassa, jossa ei ole seerumia eikä eksogeenisia makromolekulaarisia kasvutekijöitä, ja jotka tuottavat TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta, mainitusta viljelmästä otetaan talteen neste, joka käsitellään entsyymillä, joka kykenee muuttamaan pro-TPA:n TPA:ksi ja sen jälkeen eristetään TPA.