JPH0632607B2 - 血清非依存性セルラインの確立方法 - Google Patents

血清非依存性セルラインの確立方法

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JPH0632607B2
JPH0632607B2 JP58252491A JP25249183A JPH0632607B2 JP H0632607 B2 JPH0632607 B2 JP H0632607B2 JP 58252491 A JP58252491 A JP 58252491A JP 25249183 A JP25249183 A JP 25249183A JP H0632607 B2 JPH0632607 B2 JP H0632607B2
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Description

【発明の詳細な説明】 (発明の分野) この発明は、血清(serum)又は外来生巨大分子増殖因子
(exogenous macromolecular grouth factor)の非存在下
で増殖し得るヒトセルラインの製造方法を提供する。
(発明の背景) 最近における組換DNA技法及び細胞培養技法の出現に伴
って、有用で薬理学的に興味ある化合物、特に蛋白質、
例えばインターフェロン、インスリン及び抗原の制御さ
れた生物学的製造が可能となった。生物学的に、特に薬
理学的に興味ある種々の蛋白質の大規模製造を確実にす
る生物学的方式を開発する必要性が増加している。
この明細書において使用する「蛋白質」なる語は高分子
量、例えば約34,000より大きな分子量のポリペプチド、
及び低分子量、例えば約34,000より小さい分子量のポリ
ペプチド、並びにこれらの誘導体、グリコシル化、燐酸
化及び硫酸化された誘導体を含める意味に用いる。
組換DNA技法における利点は、目的蛋白質をコードする
遺伝子を微生物に導入し、そして次にこの微生物による
蛋白質の合成を誘導することが可能となることである。
しかしながら、多くの生物学的に重要な分子はこの技法
によって合成することができない。構造がまだ知られて
いない分子の場合、特にそうである。ほとんどの場合、
遺伝的に変性された微生物により分泌される蛋白質は真
正な分子の正確な複製ではなく、アミノ酸配列のN末端
及びC末端に関し真正な分子と異る。この事実は、組換
DNA技法における実験的過程に由来する。さらに、グリ
コシル化蛋白質を微生物、例えば細菌によって製造する
ことはできず、酵母についてもある程度そうである。こ
れらは必要な細胞機構を有しないからである。多くの場
合、細胞培養技法及び組織培養技法が有利に使用され
る。細胞培養物は手を加えてない生物(intact organis
m)に由来するから、この細胞培養物により生産される蛋
白質はすべての点において天然の蛋白質に相当する。
しかしながら、高等生物の細胞、例えば哺乳動物細胞の
培養には困難な問題が存在する。これらの細胞の栄養要
求は、人工培地中で増殖するほとんどの微生物のそれに
比べて厳格である。今まで記載されているほとんどの哺
乳動物細胞の増殖培地は、非常に高価な血清を含有しな
ければならない。血清の価格が細胞培養技法の経済的実
施可能性を大きく左右し、そして細胞培養以外の方法に
よっては製造し得ない蛋白質の製造へのこの方法の適用
を大きく限定するであろう。若干の細胞は、ホルモン又
は増殖因子、例えばトランスフェリン、インスリン、表
皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子又は神経生長因子を補
給した血清不含培地中で培養することができる。しかし
ながら、ほとんどの場合、細胞はこれらの血清不含培地
において無限に増殖することはないであろう。
血清不含培地において増殖するセルラインは、血清又は
外から添加された増殖因子による分解又は汚染に敏感な
蛋白質の製造のために特に重要である。このような蛋白
質は、例えばプロ−組織プラスミノーゲン活性化物質
(プロ−TPA)である。
いわゆるプラスミノーゲン活性化物質は科学的研究の対
象となり、この研究により血液凝塊(凝血)の溶解にお
いてこの物質が臨床的に適用可能であることが明らかに
示された。血液凝塊はフィブリンから成り、このフィブ
リンは酵素スロビンの作用のもとでその可溶性前躯体で
あるフィブリノーゲンから形成される。これらは、ヒト
の疾病及び死亡の主要な原因の1つであり、そして副作
用を伴わないでこれを溶解することは困難である。
哺乳動物の血漿は、血液凝塊中のフィブリンを溶解する
ことができる酵素系を含む。フィブリン分解系の1つの
成分は酵素、プラスミノーゲン活性化物質からなり、こ
の物質はプラスミノーゲン(プラスミンの不活性なプロ
酵素形)を蛋白質分解性酵素プラスミンに転換する。次
に、プラスミンが凝塊中のフィブリンネットワームを破
壊して可溶性産物を生成する。体の血栓溶解能が、形成
される血管内血栓を除去するのに不十分な場合、例えば
血栓塞栓症又は手術後合併症の患者において、血栓溶解
剤を外部的に投与して使用することが絶対に必要であ
る。
血栓溶解治療のために商業的に入手し得るヒトプラスミ
ノーゲン活性化物質が2種類存在する。ヒトの尿又は培
養腎細胞から分離されるセリンプロテアーゼであるウロ
キナーゼ、及びストレプトコッカスから得られる細菌蛋
白質であるストレプトキナーゼである。いずれの酵素も
フィブリンに対して特異的に親和性ではないから、これ
らの物質による血栓溶解にはプラスミノーゲンの全身的
活性化が伴い、この活性化により凝固蛋白質の無差別的
消化が生ずる可能性があり、そして治療中における内出
血(ヘモラージ)の危険性が有意に上昇する。ウロキナ
ーゼのそのほかの欠点はヒトに注射した後の有効半減期
が非常に短いことである。このため、効果的なフィブリ
ン分解を達成するためには多量のウロキナーゼを投与す
る必要があり、このためにその作用を遮断する中和抗体
の生産が起こり、そして有害で死亡の可能性を伴うアレ
ルギー反応が生ずる。
組織プラスミノーゲン活性化物質(以後、「TPA」と称
する)と呼ばれるその他の種類のプラスミノーゲン活性
化物質がヒトのほとんどの組織に存在することが知られ
ている。おそらく、異る組織に由来するTPAは、その分
子的性質においては相互に異るが免疫的には類似してい
るであろう。これらは、その化学的及び免疫的性質の観
点から、フィブリンの存在下でフィブリン分解作用が非
常に強化される点において、そしてスロンビンに対する
親和性が非常に高い〔S.Thorsen等、Thromb.Diath.Haem
orrh.28,65〜74(1972);D.C.Rijken及びD.Collen,J.Bio
l.Chem.256,7035〜7041(1981)〕。これらの物質はフィ
ブリンに対する親和性が高いためにTPAの作用が凝血の
存在場所に限定され、このために制御されない出血の危
険が有意に低下する。
次の系統はプラスミノーゲン、プラスミン、フィブリン
及び種々のプラスミノーゲン活性化物質の関係を示す。
最近、凝固異常に罹患した2入の患者が、ヒト黒色腫セ
ルラインの培養液から分離したTPAにより成功裏に治療
された〔W.Weimar等、The Loncet(1981)1018〜1020〕。
TPAには2種類の分子形、すなわち活性2−鎖形及び不
活性1−鎖形がある〔前躯体TPA又はプロ−TPA;D.C.Ri
jken及びD.Collen,前記引用文;D.C.Rijken等、J.Bio
l.Chem.257,2920〜2925(1982);及びP.Wallen等、Progr
・Fibrin、5,16〜23(1982)〕。プロ−TPAは、フィ
ブリンとのインキュベーションにより、又はプラスミン
の影響で活性TPAに転換される。このプラスミンはこの
カスケード状反応により自らの合成を触発する。
ヒト−TPAの分離源には、種々のヒト組織(これらは商
業的利用のために入手することはできない)、及び種々
の程度でTPAを遊離することが知られている種々のヒト
腫瘍細胞が含まれる〔E.L.Wilson等、Cancer Research4
0,933〜938(1980);E.L.Wilson等、Blood61,568〜574(1
983)〕。
最近出願された特許出願(EP41766、発明者D.Collen,D.
C.Rijken及びO.Matsuo)において、分子量72,000のTPA
が開示されており、このTPAはヒト黒色腫セルライン
〔ボウエス(Bowes)〕から分離され、おそらくE.L.Wilso
n等〔Cancer Research40,933〜938(1980)〕によりすで
に記載されているTPAと同一であろう。今までに記載さ
れている他のセルラインと同様に、このヒト黒色腫セル
ライン、ボウエスは、増殖のために血清、例えばウシ胎
児血清の存在を必要とする。しかしながら、血清は非常
に高価であり、そして生産されたTPAを汚染しそしてプ
ロ−TPAの分離を妨げる多量の蛋白性成分を含有してい
る。このためTPA又はプロ−TPAを得るために退屈で面倒
な精製工程を必要とする。
(発明の目的) この発明は従来から知られているセルラインの欠点を克
服し、そして血清又は外来性巨大分子増殖因子の非存在
下で増殖する新規なヒトセルラインの製造を可能にす
る。このような血清非依存性セルラインにより分泌され
る新規な薬理学的に活性な蛋白質、例えばヒト組織プラ
スミノーゲン活性化物質及び特にプロ−活性化物質を提
供することも又この発明の目的である。
(発明の具体的な記載) 血清非依存性ヒトセルラインの製造 この発明は、血清、又は外来性巨大分子増殖因子、例え
ばインスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子等の非
存在下で増殖する新規なヒトセルラインを提供する。こ
の発明の細胞は、血清又はフィブロネクチンの非存在下
においても培養容器に付着することができる。この新規
なセルラインの大きな利点は、血清、例えばウシ胎児血
清は非常に高価であるが故にこれを使用しないことによ
りコストが大幅に低下すること;培地に血清の汚染がな
くそして生成物が血清不含培地から容易に精製され得る
のでこの新規なセルラインにより生産される生成物の精
製が非常に安価で且つ簡単であること;及び血清中にプ
ロテアーゼが存在するために血清依存性セルラインによ
っては得られない(又は低い収量でしか得られない)蛋
白質を製造することが可能であること;である。
この新規な血清非依存性ヒトセルラインの製造方法は、
次の段階すなわち、 (a)血清依存性ヒトセルラインの培養物から血清含有培
地を除去し、そしてこれを血清不含培地で置換し、 (b)付着細胞又は非付着細胞に血清不含培地を供給し、
そして (c)血清非依存性セルラインが確立されるまで細胞を増
殖せしめる、 段階を含んで成る。
この明細書において「血清不含培地」なる語は血清のみ
ならずいかなる巨大分子増殖因子も含有しない培地を示
称する。従って、血清及び外来性巨大分子増殖因子の両
者非存在下で増殖するセルラインを「血清非依存性セル
ライン」と称する。
前記の方法において「出発材料」として使用する血清依
存性ヒトセルラインは特に連続セルラインであり、そし
てヒト新生物、例えば黒色腫、悪性奇形腫、肉腫、膠
芽、髄膜腫、神経芽細胞腫、脂肪腫、腺腫、乳癌又は膀
胱癌に由来するものである。好ましいセルラインはTPA
及び/又はプロ−TPAを生産するものである。この発明
の好ましい態様においては、ヒト黒色腫セルライン、特
にボウエス黒色腫セルライン(以後、「ボウエスI」セ
ルラインと称する)が使用される。ヒトの正常組織から
誘導されたセルラインを「出発材料」として使用するこ
ともできるが、これらは試験管内で限られた寿命を有し
(例えば、約50回細胞分裂を行った後増殖を停止す
る)、この発明の観点からは重要ではない。
血清不含栄養培地は、例えば、商業的に入手し得る培
地、例えば最少イーグル培地(MEM)、MEM−スピンナー培
地、ドゥルベコ変形イーグル培地(DMEM)、又はロスウェ
ル・パーク・メモリアルインスティテュート(Roswell P
ark Memorial Institute)培地(RPMI)-1640である。他の
同等の培地を使用することもできる。血清不含培地は安
定pHを維持するために十分量の緩衝剤、例えば炭酸水素
ナトリウムを含有することができる。培養中の細胞は、
手を加えてない生物の一体部分である精巧な免疫防御系
を有しないので、抗生物質、例えばペニシリン、ストレ
プトマイシン、タイロシン等を加えて培養物の汚染を防
止するのが好ましい。
ヒト正常細胞は通常表面に付着した場合のみ増殖する
が、腫瘍細胞は、懸濁状態でもしばしば容易に増殖す
る。固定依存細胞用の実験室容器は当業界においてよく
知られている。これらには、「ミクロウェル」プレー
ト、平底ペトリ皿、種々の大きさのフラスコ、又はロー
ラーボルトを称され連続回転する円筒ビンがある。非依
存性細胞は、機械的に攪拌される、又は均一懸濁液が気
体流による混合によって維持される培養容器中に増殖せ
しめることができる。
例えば、この発明の方法は、コンフルエントの又はコン
フルエント近い単層のヒトセルライン、例えば黒色腫セ
ルライン、特に血清含有培地中で増殖する黒色腫ボウエ
スIを含有する組織培養フラスコ中で実施することがで
きる。その後の工程は、二酸化炭素を含有する湿潤雰囲
気中、例えば約95%の空気と約5%のCO2から成る湿
潤雰囲気中で、約35℃〜約40℃、特に約37℃にお
いて行う。血清含有培地を除去し、そして血清不含培
地、例えばRPMI-1640又はDMEMにより置換する。数日
後、細胞がフラスコの表面から離脱し始め、そして培地
中に自由浮遊する。数週間後、細胞の大多数が血清又は
いかなる増殖因子も含有しない培地中で死滅しているで
あろう。細胞の生存を維持するために、血清不含培地へ
の適応期間中、条件調節された培地を培養物に加える。
条件調節された培地は、例えば24時間血清不含培地に
保持された仲間細胞の培養物(companion cell culture)
から集収することができる。条件調節された培地を含有
する血清不含培地は、例えば3〜7日間隔で、細胞数が
十分に増加するまで、例えば容器表面の約3分の1が覆
われるまで取り替えなければならない。この段階におい
て条件調節された培地はもはや必要ではなく、細胞に血
清不含培地のみを供給する。コンフルエント単層が形成
されたとき、容器を激しくたたくことにより、又はエチ
レンジアミン四酢酸(EDTA)を用いてほとんどの細胞を表
面から離脱させ、そして生存を保証するのに十分に高い
細胞濃度において新たな培養フラスコに再接種するよう
に留意しながらパッセージ(passage)を行う。細胞の増
殖、及びコンフルエンスにおける細胞のパッセージを、
細胞が安定な付着性単層として増殖するようになるまで
継続する。このようにして、例えば1〜6箇月、特に1
〜3箇月かかって血清非存在性セルラインが確立され
る。
前記の方法に代えて、細胞密度が十分に高い場合には、
仲間の血清依存性細胞培養物から集収した条件調節され
た培地を加えることなく血清非依存性セルラインを確立
することができる。この場合には、細胞が自らの培地を
条件調節する。非付着細胞を除去しないことにより細胞
密度を高く維持することができる。例えば前記のごと
く、数日後、血清不含培地中で大多数の細胞が組織培養
容器から離脱し、そして培地中に自由浮遊する。離脱し
た細胞は、それらが十分に高い密度に維持される際り生
存し続ける。付着はしていないが生存している細胞を含
有する血清不含培地を遠心分離し、そして細胞ペレット
を新鮮な血清不含培地に入れ、そしてまばらな付着細胞
を含有するフラスコに返却すれば付着細胞が増殖を開始
するであろう。この場合、懸濁細胞は付着細胞と一緒に
なってそれ自体の培地を条件調節する。
2〜3週間後、すでに懸濁状態にある細胞は培養容器表
面への付着を開始し、やがてこれらの細胞は付着状態と
なり、そして一旦コンフルエント状態になった後、前記
のごとく激しくたたくか又はEDTAを用いてパッセージす
ることができるであろう。
付着細胞の存在下で「条件調節された培地」を調製する
他の方法は、血清不含培地の一部分、その約半分を新鮮
な血清不含培地により置換し、そしてこの操作を24〜
72時間毎に、十分に高い細胞密度が得られる(約3週
間後)まで反復することから成る。次にこの細胞を、例
えばEDTAを用いて、パッセージする。第1パッセージに
おいて、新鮮な血清不含培地に、EDTA処理に先立って培
養物から取り出した約40%の条件調節された培地を補
給する。この後、細胞は条件調節された培地の非存在下
で分裂を続けるであろう。細胞密度は十分に高く、約3
0%、好ましくは約60〜70%のコンフルエンシーで
あるべきである。
細胞密度が低い場合、例えば約20%のコンフルエンシ
ーの場合、又は懸濁培養の場合には約1×105細胞/m
lの場合、細胞は増殖のために条件調節された培地を必
要とする。細胞密度が高い場合、例えば約60〜約70
%のコンフルエンシーの場合、又は懸濁培養の場合には
約2×105〜5×105細胞/ml又はこれ以上の場合、
条件調節された培地を添加しないで血清不含培地中で成
育しそして増殖するであろう。
血清非依存性セルラインは、例えば実験室容器の内壁に
おいて付着培養物として、又は懸濁培養物として増殖す
ることができる。
この発明はさらに、血清不含培地において、特にこの発
明の方法によって調製された場合に、増殖が可能である
新規なヒトセルライン、特にヒト黒色腫セルラインに関
する。
この発明はさらに、この発明のセルラインから得られ、
そして血清不含培地において増殖することが可能な変異
セルラインに関する。変異体は自然に形成され、又はそ
れ自体公知の方法によって製造することができる。例え
ば、変異体は化学的な手段、例えば変異剤、例えばN−
メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジンもしく
はマスタード油により、又は照射、例えば紫外線もしく
はX線の照射により得られる。
この発明の好ましい血清非依存性セルライン及び変異セ
ルラインは、TPA及び/又はプロ−TPAを生産するセルラ
インである。
この発明の新規なヒトセルライン及び該セルラインから
得られる変異セルラインは、無限の寿命を有し、そして
もとの血清依存性セルラインと同様にして、例えば、生
物学的に活性な化合物、例えば蛋白質、例えばインター
フェロン、抗原、脈管形成因子(angiogenic factor)そ
して特にプラスミノーゲン活性化物質の商業的製造のた
めに、血清不含条件下で、あるいはハイブリドーマセル
ラインの製造のために使用することができる。
すでに述べたように、組織プラスミノーゲン活性化物質
を高レベルで分泌することが知られている黒色腫セルラ
イン・ボウエスI(EP 41766参照)を、この発明の方法
の「出発材料」として使用するのが好ましい。得られる
血清非依存性の新規なセルライン(以後、「ボウエスI
I」と称する)、特にその実質的に純粋な培養物、及び
これらの製造方法も又この発明の対象である。
この発明はさらに、ボウエスIIセルラインから得られそ
して組織プラスミノーゲン活性化物質を分泌することが
できる血清非依存性変異セルライン、及びその製造方法
にも関する。
この新規な血清非依存性セルラインは、血清に依存性で
ある対応する親セルラインと多くの点で異る。例えば、
ボウエスII細胞は、親細胞であるボウエスI黒色腫細胞
とその形態学的外観において異る。異相差顕微鏡で観察
した場合、ボウエスII細胞においては血清を奪われたボ
ウエスI細胞における場合に比べて有糸分裂が顕著に頻
繁である。ボウエスII細胞に血清を加えることにより顕
著な形態学的変化が生ずる。
この発明の好ましい血清非依存性セルライン、特にボウ
エスIIセルラインは、組織プラスミノーゲン活性化物質
を高レベルで分泌し、この物質は、親である血清依存性
セルライン、例えば特にボウエスIセルラインに比べて
プロ−活性化物質として多く存在する。TPA及びプロ−T
PAのほかに、この新規なセルラインは他の薬理学的に価
値ある物質を生産する。例えばボウエスIIセルラインは
それ自体の増殖因子及び腫瘍壊死因子を生産する。これ
らの蛋白質及びその製造、並びに新規な血清非依存性セ
ルライン、特にボウエスIIセルラインから得られる収得
液も又この発明の対象である。
血清非依存性ヒト細胞の培養及び培養液の収得 血清非依存性ヒト細胞は本質上上記のようにして増殖せ
しめることができる。例えばボウエスII細胞を、生存を
保証するのに十分な細胞密度において組織培養フラスコ
に接種し、そして抗生物質を補給した血清不含培地、例
えばRPMI-1640中で、約35℃〜約40℃、特に約37
℃の温度において、約5%のCO2を含有する空気の湿潤
雰囲気下で増殖せしめる。収得液の回収を、細胞が付着
するとすぐに開始し、そして例えば24時間の間隔で反
復する。毎日の収得液の回収を、単層がコンフルエンス
となり新鮮な培養容器へのパッセージが必要となるまで
継続することができる。
血清不含培地に培養されたボウエスII細胞の増殖速度が
非常に低く(親細胞であるボウエスI黒色腫細胞の倍化
時間が約1日であるのに対してボウエスII細胞の倍化時
間は6日である)、そして1本のフラスコから収得液を
約3〜6箇月間にわたって集収することができ、このた
め相当な時間と努力が節約でき、そして液の集収作業が
容易になる。場合によっては、増殖因子、例えばインス
リンを培地に加えることによりボウエスII細胞の増殖速
度を上昇せしめることもできる。
ペトリ皿、組織培養フラスコ及び実験室的研究に有用な
他の容器は、表面に付着した血清非依存性細胞の実際的
な大規模培養のために十分大きな表面積対容積の比率を
もたらさない。大規模製造のために、当業界において知
られている種々の手段により面積対容積の比率を増加せ
しめることができる。例えば、細胞をスポンジ状ポリマ
ー、薄層重層体、小粒ビーズ等の上で増殖せしめること
ができる。
上記の方法に代えて、新規な血清非依存性セルライン、
例えばボウエスIIは懸濁して増殖せしめることもでき
る。懸濁培養に適する大型発酵槽は当業界においてよく
知られており、そして単細胞微生物用の発酵槽に変更を
加えることによって開発された。細胞を培地中に均一に
懸濁保持し、そして溶存ガス(例えば酸素)を均等に分
布せしめるために攪拌が必要である。この攪拌は、常用
のタービン攪拌機、海中プロペラ型攪拌機、垂直に振動
する振動ミキサー等を用いて行うことができる。細胞が
損傷を受けるのを防止するために低速で攪拌するのが好
ましい。気体流を培養液に通すことによっても均一攪拌
を維持することができる。
血清非依存性ヒト細胞、例えばボウエスII細胞から得ら
れた収得液は、離脱した細胞及び細胞破片を除去するた
めに、遠心分離しなければならないだろう。細胞により
分必されたTPA、プロ−TPA及びそのほかの価値ある物質
が容器の表面に吸着するのを防止し、そして酵素活性を
保存するために培地に非イオン性洗剤を加えるのが好ま
しい。好ましくは、非イオン性洗剤、例えばトリトン(T
riton)X-100(商標)又はトゥイーン(Tween)80(商標)
を、最終濃度が約0.01〜0.1%になるように加える。pH
5.5〜6.0において最も高い活性が維持されるので、収得
液を弱酸、例えば低級アルカン酸、例えば酢酸により前
記のpHに酸性化し、その後で低温、例えば約4℃におい
て48時間貯蔵し、又は−20℃において長時間貯蔵す
ることができる。
収得液中のTPA、プロ−TPA及びその他の価値ある物質の
含量は、常用の技法を用いて測定することができる。例
えばTPA含量は125I−フィブリン測定、又は螢光測定に
より測定することができる。第1に、プラスチックウエ
ルの表面上の不溶性被覆物として付着せしめた125I−
標識フィブリンからの放射性フィブリン分解ペプチドの
プラスミノーゲンに依存する放出を経時的に測定する
〔E.L.Wilson及びE.Bowdle,Int.J.Cancer22,390
〜399(1978)参照〕。第2に、適当な合成基質、例え
ばCbz-Gly-Gly-Arg-AMC(AMCはアミノメチルクマリン残
基である)又はBoc-Val-Gly-Arg-AMCのアミド分解によ
り生ずる螢光の増加を測定する〔M.Zimmerman等、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA75,750〜753(1978)参
照〕。125I−フィブリン測定によりTPA及びプロ−TPA
の両者の総酵素活性が得られるのに対して、螢光測定に
よりTPA活性のみを測定することができ、あるいはこれ
とは異り、収得液をプラスミンで処理してプロ−TPAをT
PAに転換した後TPA及びプロ−TPAの両者を測定すること
ができる。
上記のTPA測定を用いて、この発明に従って得られる収
得液はプロ−TPAを高い比率で含有することを示すこと
ができる。これはおそらく、使用した培地にプロ−TPA
をTPAに転換するプラスミン又は他のプロテアーゼが欠
けているためであろう。例えばボウエスIIの培養により
得られた収得液中にプロ−TPAが多いことは、ボウエス
I黒色腫細胞から得られる収得液にプロ−TPAが少量含
まれていることと対照的である。
血清非依存性細胞から分泌された蛋白質の分離と精製 血清非依存性細胞、例えばボウエスII細胞から得られた
培養液からの所望の蛋白質の分離、及びその精製は、原
則として蛋白質化学において共通な任意の適当な方法に
より、例えば、無機塩等を用いる分別沈澱、ゲル過、
例えば架橋デキストランもしくはアガロース上でゲル
過、ゲル電気泳動又はクロマトグラフ的手段、例えば吸
着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
もしくはアフィニティークロマトグラフィーにより行う
ことができる。TPA及びプロ−TPAの分離及び精製のため
に、例えば次のような方法が用いられる。
◎亜鉛−キレート−アガロース、コンカナバリンA−ア
ガロース及びセファデックスG−150(商標)によるク
ロマトグラフィー〔D.C.Rijken及びD.Collen,J.Biol.Ch
em.256,7035-7041(1981)参照〕。収得液を亜鉛−キレー
ト−アガロースカラムに通す。吸着された酵素をイミダ
ゾール含有緩衝液により溶出する。得られた溶液をコン
カナバリンA−アガロースカラムに適用する。溶出をメ
チルマンノシド及びKSCNで行うことができる。最後の段
階において、酵素をセファデックスG−150(商標)カ
ラムによりゲル過する。
◎アフィ−ゲル・ブルー(Affi-Gel Blue)(商標)及び
アミノベンズアミジン−セファロース(商標)によるク
ロマトグラフィー〔L.C.Gilbert及びJ.T.Wachsman,Bioc
him.Biophys.Acta704,450〜460(1982)参照〕。酵素を、
アフィ−ゲル・ブルー(商標)及びアミノベンズアミジ
ン−セファロース(商標)に次々と吸着せしめる。アル
ギニンを含有する緩衝液により脱着を行う。
◎不溶性マトリクス、例えばデキストランに共有結合的
に固定された可溶性フィブリン断片からなる支持体上で
の、TPA及びプロ−TPAの特異的親和性に基く選択吸着
〔ヨーロッパ特許出願No.23860参照〕。吸着された酵素
はpH4.2の酢酸塩緩衝液により溶出することができる。
◎不溶性マトリクス、例えばアフィ−ゲル(商標)又は
セファデックス(商標)に結合した抗−TPA抗体、モノ
クローナル抗−TPA抗体のイムノアフィニティーカラム
によるクロマトフラフィー。
◎DE-3セファロース(商標)によりアフィニティークロ
マトグラフィー。豆科植物エリスリナ・ラティシマ(Ery
thrina latissima)の種子はDE-3と称されるトリプシン
阻害物質を含有する〔F.J.Toubert等、Hoppe-Seyler's
Ziitshr.Physiol.Chem.302,531〜538(1981)〕。DE-3も
又TPA活性を阻害することができることが見出されてい
る。精製したDE-3阻害物質を、標準的方法を用いて不溶
性マトリクスに結合せしめることができる。媒体中のTP
A及びプロ−TPAを吸着せしめそしてチャオトロピック・
エーゼント(chaotropic agent)例えばKSCNを含有する緩
衝液により溶出することができる。
◎SDSを含有するポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)に
よる電気泳動。この方法は特に分析目的に、又は分子量
の測定のために使用される。
十分に純粋な生成物を得るために、単一の方法又幾つか
の逐次精製段階を選択することができる。さらに、追加
の精製段階、例えば適当な緩衝液合物中での透析、逆相
HPLC等を必要とする場合があろう。
例えば、第1段階として、収得液を亜鉛−キレート−ア
ガロース、コンカナバリンA−アガロース及びセファデ
ックスG−150(商標)を用いるクロマトグラフィーで
処理し(この段階は大容量の収得液中に存在する目的蛋
白質を濃縮するためにも役立つ)、そして最後に、得ら
れた濃縮蛋白質をアフィニティークロマトグラフィーに
より精製することができる。
この発明の好ましい態様においては、血清非依存性ヒト
細胞、例えばボウエスII細胞から得られた、TPA及びプ
ロ−TPを含有する収得液を遠心分離して完全細胞及び細
胞破片を除去し、そして次に室温において、TPA及びプ
ロ−TPAに対して選択的なアフィニティ試薬が結合して
いる不溶性マトリクス、例えばDE-3阻害物質が結合して
いるBrCN活性化セファロース(商標)から成るカラムに
通す。このカラムを洗浄した後、約5.5〜6.0のpHを有し
そして約1.4〜約20モル、好ましくは1.6モルのチャオ
トロピック・エーゼント(chaotropic agent)、例えばKS
CNを含有する緩衝液、例えば燐酸緩衝塩溶液によりカラ
ムを処理することにより、吸着されたTPA及びプロ−TPA
を溶解する。この方法に代えて、ベンズアミジン又はア
ルギニンを脱着剤として選択することもできる。
他の方法においては、モノクロナール抗TPA抗体を例え
ばアフィ−ゲル(商標)に結合せしめることによって調
製したモノクロナール抗体カラムを用いてクロマトグラ
フ処理することによりTPA及びプロ−TPAを分離する。
得られた精製溶液はTPA及びプロ−TPAを含有する。プロ
−TPAを全く含有しないTPAを製造するために、プロ−TP
Aを酵素的に、例えばプラスミン又はプロ−TPAに対して
これと同等の作用をする酵素の作用により、TPAに転換
する。
この発明の好ましい態様においては、プロ−TPAを、TPA
を含有しない実質上純粋な形で分離する。プロ−TPAは
真のプロ−酵素である。すなわちこのものはTPAの酵素
的に不活性な形である。プロ−TPAはTPAよりよくフィブ
リンに吸着し、そしてそのために、フィブリン分解を行
う場合にTPAより選択的である。なぜならプロ−TPAはま
ずフィブリンに結合し、そしてそのあとでのみTPAに転
換されるのに対して、TPAは、局在した作用が望まれる
フィブリンにおいてではなく血流中で若干のプラスミノ
ーゲンを活性化する可能性が多少存在するからである。
実質上TPAを含有しないプロ−TPAを製造するためには、
精製過程において、プロテアーゼ阻害物質、例えばアプ
ロチニン又は塩基性膵臓トリプシン阻害物質を存在せし
めることにより、存在しそしてプロ−TPAを(部分的
に)TPAに転換するであろう少量のプロテアーゼを阻害
するのが好ましい。次に、選択的アフィニティー試薬、
例えばDE-3を含有するカラム上で、TPAのみに選択的に
結合しそしてプロ−TPAには結合しない阻害剤、例えば
ジイソプロピルフルオロホスフェート又はニトロフェニ
ルグアニジノベンゾエートの存在下で最終精製を行う。
これらの試薬は、TPAがアフィニティーカラムに吸着す
るのを防止する。従って、結合TPAはDE-3カラムを通過
し、他方プロ−TPAはカラムに吸着し、そして前記のよ
うにして溶出され得る。
従って、TPA、プロ−TPA又はこれらの混合物を生産する
ことができる血清非依存性ヒト細胞、又はその変異体、
例えばボウエスII細胞を血清不含培地中で培養し、そし
て所望の蛋白質を収得液から分離し、そして所望によ
り、蛋白質の混合物を個々の化合物に分離し、又は個々
の化合物に転換することを特徴とする、TPA、プロ−TPA
又はこれらの混合物を製造する方法を提供することもこ
の発明の目的である。特にこの発明は、得られた混合物
中に存在するプロ−TPAを酵素的にTPAに転換することを
特徴とする、プロ−TPAを含有しないTPAの製造方法を提
供する。特にこの発明は、分離及び精製過程にプロテア
ーゼ阻害物質を存在せしめ、そして最終精製をTPAを選
択的に阻害する阻害物質の存在下で行うことを特徴とす
る、TPAを含有しないプロ−TPAの製造方法を提供する。
例えば前記の方法に従って、血清非依存性ヒト細胞、特
にボウエスII細胞から得られるTPAとプロ−TPAとの混合
物、並びに実質上純粋な形のTPA及びプロ−TPAは、新規
でありそしてこの発明の対象である。
医薬製剤 この発明に従って、例えば培養したボウエスII細胞から
得られる新規な蛋白質、特にTPA及びプロ−TPAは、価値
ある薬理学的性質を示す。すなわち、ボウエスII細胞か
らのTPA及びプロ−TPAは、公知のプラスミノーゲン活性
化物質と同様に、ヒトにおいて、血栓症、又はプラスミ
ノーゲンの活性化を介して局所的フィブリン分解活性又
は蛋白質分解活性を得ることが好ましい他の状態、例え
ば動脈硬化、心筋硬塞又は脳硬塞、静脈血栓症、血栓塞
栓症、手術後血栓症、血栓性静脈炎、及び糖尿病性血管
疾患の予防及び治療に使用することができる。
この発明はさらに、医薬として有効な量の活性成分(特
にTPA、プロ−TPA又はこれらの混合物)を、非経口的、
例えば筋肉内、皮下又は腹腔内投与に適し、そして活性
成分と有害な相互作用を行わない無機又は有機の固体又
は液体の医薬として許容される担体と共に含んで成る医
薬に関する。
これらは特に注入溶液、好ましくは水性溶液又は懸濁液
であり、使用前に、例えば、活性成分のみを、又は担
体、例えばマンニトール、ラクトール、グルコース、ア
ルブミン等と共に含有する凍結乾燥品から調製すること
ができる。この医薬は無菌化することができ、そして所
望により、助剤、例えば防腐剤、安定剤、乳化剤、溶解
剤、緩衝剤及び/又は浸透圧調整塩を含有することがで
きる。無菌化は小孔サイズ(0.45μm以下の直径)の
材を通す無機過により行い、所望によりこの後で凍結
乾燥することができる。無菌貯蔵を助けるために抗生物
質を加えることもできる。
この発明の医薬は単位投与型、例えば単位投与量当り1
〜2000mgの医薬として許容される担体及び単位投与当り
約1〜20mg、好ましくは約3〜15mgの活性成分(TP
A、プロ−TPA、又はこれらの混合物)を含んで成る単位
投与型に配合する。
病気のタイプ並びに患者の年齢及び状態に依存して、約
70kgの患者の治療のための日用量は、24時間当り3
〜15mg、好ましくは5〜10mgである。
この発明はさらに、この発明の生物学的に活性な蛋白質
を医薬として許容される担体と混合することを特徴とす
る医薬の製造方法に関する。
ヒトの予防的及び治療的処置のための新規な蛋白質の使
用もこの発明の対象である。
凝血をこの発明に従って得られたTPA、プロ−TPA、又は
これらの混合物に暴露することから成る、ヒトにおける
凝血溶解方法もこの発明の対象である。
この発明のTPAは又、試験管内においてもその活性を表
わす。従ってこれらは、例えば洗浄剤又は浄化剤におい
て、プラスミノーゲンと共にフィブリン分解剤として使
用することができる。
この発明は又、この発明の方法によって製造されるすべ
ての蛋白質に関する。
この発明はまた、この明細書に記載した方法に従って製
造されるすべての血清非依存性ヒトセルライン、例えば
黒色腫セルラインに関する。
この発明はさらに、この明細書に記載した血清非依存性
ヒトセルライン、例えば黒色腫セルラインから得られた
すべての生物学的に活性な化合物に関する。
この発明はさらに、この明細書に記載した血清非依存性
ヒトセルラインの、血清不含条件下での生物学的に活性
な化合物の製造のための使用に関する。
この発明は又、血清不含条件下で生物学的に活性な化合
物を製造するためのボウエスII培養物の使用に関する。
この発明は特に、例に記載した蛋白質及びその製造方法
に関する。
次に例によりこの発明をさらに詳細に説明するが、これ
によりこの発明の範囲を限定するものではない。
実験の部 実験の部で使用する略号は次の意味を有する。
BPTI 塩基性膵臓トリプシン阻害物質 BSA ウシ血清アルブミン DEP ジイソプロピルフルオロホスフェ-ト DMEM ドゥブレコ変性イ-グル培地 DTT 1,4-ジチオスレイト-ル EDTA エチレンジアミン四酢酸 FCS ウシ胎児血清 PBS 燐酸緩衝塩溶液(8mM Na2HPO4;1.5mM KH2PO
4;0.14M NaCl;2.7mM KCl) RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute培地
1640 SDS ドデシル硫酸ナトリウム TCA トリクロロ酢酸 Tris トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン T-T(0.1) 0.1M Tris・HCl pH8.1(0.1%トリトンX-100含
有) 例1.血清非依存性セルラインボウエス(Bowes)IIの確立 (a)ボウエスI細胞から収集した条件調節された培地を
用いるボウエスIIセルラインの確立 ヒト黒色腫セルライン〔Bowes-RPMI 7272;D.C.Rijken
及びD.Collen,J.Biol.Chem.256,7035〜704
1(1981)に記載〕を、ニューヨーク、ロックフェ
ラー大学Dr.E.Reichより得た。このセルラインを、組織
培養フラスコ(150cm2、コスタール)中で、37℃
において、空気95%及びCO25%の湿潤雰囲気下で培
養する。炭酸水素ナトリウム(2g/)、抗生物質(ペ
ニシリン300μg/ml、ストレプトマイシン200μg/
ml、タイロシン10μg/ml)、及び10%熱不活性化
(56℃、30分)ウシ胎児血清(FCS)を補給したRoswe
ll Rark Memorial Institute(RPMI)培地−1640(ギブ
コ)中で付着単層として増殖せしめる。
細胞の付着単層を有する組織培養フラスコ1個を選択す
る。コンフルエンスにおいて、血清含有培地を除去し、
そして抗生物質(前記参照)を補給したRPMI-1640培地
50mlにより置換する。この培地にはそのほかの添加物
は含めない。細胞を、37℃において、5%のCO2を補
給した湿潤空気中に保持する。培地を24時間毎に取り
代える。最初細胞は健全でありそして付着したままであ
る。12日後、細胞は培養容器から離脱しそして自由浮
遊を始める。14日後、大多数の細胞が離脱し、そして
生存細胞の小部分のみがなおフラスコに付着し続ける。
離脱細胞を含有する培地を除去する。長時間にわたって
血清を奪われた黒色種細胞のまばらな付着培養物を、同
量のRPMI-1640により稀釈した「条件調節された培地」
から成る新鮮培地50mlにより覆う。「条件調節された
培地」は次のようにして調製する。
コンフルエントな、血清依存性黒色腫細胞Bowse-RPMI 7
272から血清含有培地を除去し、そしてRPMI-1640培地の
みにより置換する。24時間後、この培地を回収し、そし
て2000rpmで5分間遠心分離し、そして0.45μmのミリ
ポアフィルターを通す。こうして得られた溶液を「条件
調節された培地」と称し、そしてただちに同量のRPMI-1
640により稀釈する。
新規なRPMI-1640により稀釈した「条件調節された培地
を、4〜5日の間隔で3箇月にわたり培養物に加える。
この時以後、細胞数が相当に増加し、そして血清不含培
地はもはや「条件調節された培地」を必要としない。そ
して培養物にRPMI-1640培地のみを供給する。
こうして得られた血清非依存性細胞を組織培養フラスコ
(150cm2、コスター)中で培養し、そして生存を保
証するため約106細胞/ml培地の密度で接種しなけれ
ばならない。細胞は典型的には、5×107細胞/50m
l RPMI-1640/150cm2フラスコの密度で接種する。細
胞は、血清不含培地中で非常にゆっくり増殖し、そして
約6日の世代時間を有する(血清依存性セルラインBows
e-RPMI 7272の世代時間約24時間と比較)。コンフル
エンスにおいて、フラスコを激しくたたいて付着細胞を
培地中に離脱せしめることによりパッセージを行う。こ
の機械的方法により離脱した細胞を約106細胞/mlの
濃度でRPMI-1640に懸濁し、そして新たな組織培養フラ
スコに再接種するのに使用する。たたいても離脱しない
細胞には新鮮なRPMI-1640培地を供給する。このように
して、合計5箇月間かけて、血清非依存性セルラインボ
ウエスIIの培養を確立する。
(b)ボウエスI細胞から収集した条件調節された培地の
非存在下でのボウエスIIセルラインの確立 15%のウシ胎児血清及び10%のDMSOを含有する血清
依存性黒色腫セルラインボウエス(Bowse)-RPMI7272(2.5
×106細胞/ml DMEM中)の凍結ストック4mlを解凍
し、そしてこれを、75cm2の組織培養フラスコ中15m
lのあらかじめ加温した血清不含DMEMに加える。この細
胞を、5%のCO2を補給した湿潤空気中で37℃にて一
夜インキュベートする。この期間の後、非付着細胞を含
有する培地全体を除去し、そして、15mlの血清不含培
地で置換する。顕微鏡下で細胞が粒状化するまで(24
〜72時間)インキュベーションを続け、この時点で5
0%の培地を除去し、そして新鮮な血清不含DMEMで置換
する。この操作を2〜3日に1回繰り返し、必要であれ
ば(細胞の顕微鏡的形状、培地のpHの変化)培地の合計
容積を徐々に30mlまで増加する。60〜70%のコン
フルエンスに達したとき(約3週間)、血の表面から細
胞を離脱せしめるために0.02%のEDTAを用いながら同じ
大きさの2個の新たなフラスコに細胞をパッセージす
る。最初のパッセージにおいて、血清不含培地に、EDTA
処理に先立って培養物から取り出した培地を40%補給
する。この時点で血清非依存性セルラインが確立され、
そして細胞は、十分に高い細胞密度、すなわち少なくと
も30%のコンフルエンシーに維持されれば、条件調節
された培地の非存在下で分裂を続けるであろう。
例2ボウエスII細胞の液中培養 組織培養フラスコ中に血清不含培地RPMI-1640中で増殖
したボウエスII細胞を、フラスコを手で激しくたたくこ
とによって離脱せしめ、一緒にして2×105細胞/ml
を含有する0.6の懸濁液を得、そして蒸気殺菌した3
のガラス容器に入れる。細胞懸濁物を機械的攪拌機に
よりゆっくり(40r.p.m.)攪拌する。温度を37±0.
1℃に調節し、そして5%のCO2を含有する空気を0.2
/分の速度で表面通気することにより酸素を供給する。
純粋な空気に戻すことによりpHが6.9より低くならない
ようにする。約1週間の最初の適応期間中、新鮮な血清
不含培地を加えることによりグルコースの涸渇を防止す
る。最終培養容積を1とする。細胞密度が3〜4×1
5細胞/mlに達した時、培養液の定期的取出しを開始
する。2〜4日ごとき3時間攪拌を停止して生存細胞の
ほとんどを沈澱せしめ、そして上方50%のスペント培
地を取り出し、そして新鮮な血清不含培地で置換する。
収得液を2000rpm(〜300G)で5分間遠心分離
して完全細胞及び細胞破片を除去する。この溶液を、ト
リトンX−100(商標)を最終濃度0.1%まで加える
ことによって安定化し、そして酢酸でpH5.5〜6.0とした
後−20℃にて貯蔵する。
例3.組織培養フラスコ中でのボウエスII細胞の培養及び
収得溶液の回収 血清非依存性セルラインボウエスIIを、抗生物質(例1
参照)を補給した50mlのRPMI-1640に、37℃,95
%の空気と5%のCO2とから成る湿潤雰囲気中で、5×
107細胞/150cm2組織培養フラスコ(コスター)の密
度で接種する。細胞が付着したとき、細胞から培地を回
収し、そして抗生物質補充した新鮮なRPMI-1640により
置換する。血清不含収得液の回収を24時間の間隔で、
単層のコンフルエンスがパッセージを必要とするまで反
復する。約5週間後にコンフルエンスに達する。パッセ
ージは例1に記載したのと同様にして行う。収得液を例
2に記載したのと同様にして処理する。
例4.収得溶液中のTPA及びプロ−TPAの含量の測定 TPA及びプロ−TPAを含有する収得液を既知比活性の3H-D
FP(ジイソプロピルフルオロホスフェート)で処理す
る。インキュベーションの後、ラベルされた酵素を回収
し、そして沈澱によって未反応の放射性DFPを除去し、
そしてセリンプロテアーゼに関して文献中に推奨されて
いる方法〔J.A.Cohen等、Methods in Enzymology,Vol.X
I,868頁(1967)〕によりトリフロオロ酢酸を用いて洗浄
する。活性化物質のこの活性部位力価測定により、血清
非依存性ボウエスIIから集めた収得液は、1当り約1
0〜20nモルの合計TPAを含有していることが確定さ
れる。
ボウエスI細胞及びボウエスII細胞による連続する4日
間にわたる合計TPA(TPA及びプロ−TPA)の放出は次の
ようにして測定することができる。
75cm2の組織培養フラスコ(1.3×105細胞/cm2;2
0ml/フラスコ)中に増殖したボウエスI黒色腫細胞か
らの収得液、又は150cm2フラスコ(4×105細胞/
cm2;50ml/フラスコ)中に増殖したボウエスII細胞
からの収得液を、24時間ごとに4日間にわたって回収
する。プラスミノーゲン活性化物質の活性を125I−フ
ィブリン測定(下記)により測定する。TPAの放出は、
ボウエスII細胞の場合4日間にわたって一定であり、他
方、ボウエスI黒色腫細胞の場合、TPA活性は最初の3
日間にわずかに上昇するが4日目には低下する。この時
点までに細胞の多くは表面から離脱し、そして付着を回
復するために10%のFCSを補充したRPMIを加えなけれ
ばならなかった(第1表参照)。125 I−フィブリン測定〔E.L.Wilson及びE.Dowdle,Int.
J.Cancer 22,390〜399(1978)〕において、プラスチック
製組織培養ウェルの内部底表面上の薄層として放射性
125I−フィブリノーゲン/フィブリンを付着せしめる
ことにより固相支持体を得る。測定すべき収得液の試料
をこのウェルに加え、そしてプラスミノーゲンに依存す
る放射能の可溶化を時間の関数として測定しTPA活性を
求める。125I−フィブリン測定によってTPA及びプロ−
TPAの両者の活性が測定されるから、第1表においてTPA
活性と称するのは全酵素の活性を示す。
さらに、血清依存性ボウエス黒色腫細胞及び血清非依存
性ボウエスII細胞のそれぞれの培養液のTPA及びプロ−T
PAの個々の含有量を測定する。
ボウエスI黒色腫細胞を10%のFCSを含有する2mlのR
PMI中にレプリケート35mm皿当り5×105細胞でプレ
ートする。24時間後、培地を血清不含RPMIで置換し、
そして連続3日間にわたって24時間収得液を回収す
る。各24時間の終点においてプレート当りの細胞数を
計測する。
ボウエスII細胞は、2mlのRPMI中に35mmの皿当り3×
106細胞でプレートする。
プラスミノーゲン活性化物質の活性を、基質としてCbz-
Gly-Gly-Arg-AMCを用いる螢光測定により測定する。TPA
の直接アミド分解作用を、螢光源性物質からのアミノメ
チルクマリン(AMC)のアミド分解による放出の結果であ
る455nmにおける螢光の増加を追跡することによって螢
光法的に測定する〔M.Zimmerman等、Proc Natl.Acad.Sc
i.USA 75,750〜753(1978)〕。IFUは、アミド分解測定に
おいて1分間に10pモルの基質を加水分解する酵素の
量を表わす。結果を第2表に示す。
第2表からわかるように、血清非依存性ボウエスII細胞
により分泌されたTPAの約10%が活性酵素形であり約
90%がプロ−酵素(プロ−TPA)の形である。これに
対して、血清依存性ボウエスI黒色腫細胞から集収した
培地は90%のTPAと約10%のプロ−TPAを含有する。
例5.TPA及びプロ−TPAの回収及び精製 (a)DE-3セファロース(商標)カラムの調製 エリスリナ・ラティシマ(Erythrina latissima)から得
られた精製DE-3阻害物質〔F.J.Joubert等、Hoppe-Seyle
r Zeischr.Physiol.Chem.302,531〜538(1981)〕2
6mgを、製造者の指示に従ってシアノゲンブロミド活性
化セファロース4b(商標)(ファルマシア社)5mlに
結合せしめる。このマトリクスを、0.4M HCl 0.1%のト
リトンX−100(商標)及び0.02%のナトリウムアジ
ドを含有する燐酸緩衝塩(PBS)pH7.4により平衡化する。
次にこのマトリクスを5mlのカラムに充填する。
(b)DE-3セファロース4bによるTPA及びプロ−TPAを含
有する収得液のクロマトグラフ的精製 血清非依存性ボウエルII細胞から得られた収得液(例3
参照)2に、0.4MのNaCl及び0.1%のトリトンX−1
00を加え、そして0.45μmの膜(ミリポア)を通して
過する。次に収得液をDE-3セファロースカラム(上記
参照)に、45ml/時の流速で室温において適用し、そ
して流出液を廃棄する。収得液の全量を通した後、カラ
ムを、0.4M Nacl及び0.1%のトリトンX−100を含有
するPBS約50mlにより洗浄する。次に、吸着した蛋白
質を1.6M KSCN,0.4M NaCl及び0.1%のトリトンX−10
0を含有するPBSを用いて溶出し、そして4℃にて2ml
の分画を集める。各分画の蛋白質含量を、280nmにお
けるUV吸収を測定することにより決定する。吸着した蛋
白質がするどいピークとして溶出するのが観察される。
最大UV吸収及び125I−フィブリン測定における最大フ
ィブリン分解活性を有する分画を集めて8mlの溶液を
得、これを−20℃にて貯蔵する。この溶液はカラムに
適用した全活性の約70〜80%を含む。低い活性を含
む分画は別に集める。両溶液の合計回収活性は通常90
〜100%である。
前記の溶液から試料を採取する。トリクロロ酢酸を最終
濃度10%になるように加えることにより蛋白質を沈澱
せしめ、そしてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかける。電気泳動図は、既知分子量を有する同時電気
泳動標識蛋白質を用いるWeber及びOsborneの方法〔J.Bi
ol.Chem.244 4406〜4412(1969)〕に従って測定した場
合、約73,000ダルトンの分子量を有する蛋白質の単一バ
ンドを示す。
一緒にした溶液くTPA及びプロ−TPA含量を、基質として
Cbz-Gly-Gly-Ayg-AMCを用いる螢光測定(例4参照)に
より測定する。プラスミンと共にインキュベートし、プ
ラスミンをトラシロールにより阻害した後に全TPA活性
を測定する。全活性からプラスミン活性化を行わないで
測定した活性を差引くことによりプロ−TPAの量を算定
する。ボウエスII細胞からのプラスミノーゲン活性化物
質を精製することにより、およそ同量ずつのTPA及びプ
ロ−TPAの混合物が得られることが確認される。ボウエ
スII細胞からの未処理収得液においてはTPAが10%、
プロ−TPAが90%の比率であり(例4、第2表参
照)、プロ−TPAは分離の過程で部分的に活性酵素に転
換される。
血清非依存性ボウエス(II)セルラインから得られた収得
液を低濃度のウシ胎児血清(0.01%)で処理することに
よりプロ−TPAがTPAへ転換する。これはおそらく、FCS
中にプラスミンが存在するためであろう。
(C)TPA及びプロ−TPAを含有する収得液の、DE-3セファ
ロース4bによる、蛋白質分解酵素阻害物質の存在下で
のクロマトグラフ的精製 血清非依存性ボウエスII細胞から得られた収得液のクロ
マトグラフィーを例5bに記載したのと同様にして行
う。但し、この方法において、0.1KIU/mlの塩基性膵臓
トリプシン阻害剤を存在せしめる。基質としてCbz-Gly-
Gly-Arg-AMCを用いる螢光測定により、精製溶液中のTPA
及びプロ−TPA含量を測定する。TPAの90%がプロ−酵
素形であり、そして10%が活性形である。従って、精
製過程におけるプロ−TPAからTPAへの転換がBPTIにより
阻害される。
例6.精製したTPA標品中における1鎖プロ−TPAの存在の
証明 血清非依存性セルラインボウエスIIから得られた収得液
を、例5cに記載したのと同様にしてDE-3セファロース
を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製
する。得られた精製溶液中、TPAの約90%がプロ−酵
素形であり、そして約10%が活性酵素形である。この
ことはプラスミン処理の前後におけるアミド分解測定に
より判断される。溶液をT−T(0.1)中に透析する。こ
の溶液の試料を同量のPBS、又は5μg/mlのプラスミン
含有PBSと混合する。20℃にて16時間インキュベー
トした後、SDSを最終濃度0.1まで加え、そして6%のTC
Aにより蛋白質を沈澱せしめる。もとの酵素溶液の試料
200μlからの沈澱をアセトンで洗浄し、そして1%
のSDS及び10%のグリセリンを含有する0.06M Tris-HC
l pH6.8溶液20μlに溶解する。必要であればこの段
階において、これらの試料を、2μlの1MのDTTを添
加しそして37℃にて30分間インキュベートすること
により還元する。次にすべての試料を1分間煮沸し、そ
して各々の20μlを、0.1%のSDSを含有する5〜15
%のポリアクリルアミド平板ゲル中で電気泳動する。電
気泳動した後、クーマシー・ブリリアントブルー(Cooma
ssie brilliant blue)(商標)によりゲルを染色し、そ
して通常通り脱色する。電気泳動トラックには(a)分子
量標識、(b)未処理未還元TPA溶液、(c)未処理還元TPA溶
液、及び(d)フラスミン処理未還元TPA溶液を含める。
トラック(b)は分子量約73,000の唯一の蛋白質バンドを
示す。還元条件下(トラックc)においてもほとんどの
TPAが7300ダルトン領域に移行する。しかしなが
ら、これ以外の弱いバンドが35,000ダルトン領域に観察
される。プラスミン処理及びDTTを用いる還元により73,
000ダルトンの蛋白質が、それぞれ見かけ上35,000ダル
トン及び38,000ダルトンの分子量を有する2つのサブユ
ニットに転換される。これらの実験により、73,000ダル
トンの分子量を有する単鎖プロ−TPAが、プラスミン処
理によりS−S連結された2鎖形(TPA)に転換されるこ
とが証明される。次に、TPAが還元条件下で2つのサブ
ユニットに開裂する。
例7.プロ−TPAの酵素活性の測定 T−T(0.1)中全活性(TPA及びプロ−TPA)約20FU/ml
を含有するTPA標品の試料(500μl)を、5mM DFP
の存在下(a及びb)又は非存在下(c及びd)で、2
0℃にて60分間インキュベートする。H.S.Penefsky
〔J.Biol.Chem.252,2891〜2899(1977)〕の方法に従っ
て、反応混合物の試料100μlをT−T(0.1)で平衡
化したセファテックスG25を充填した1mlのカラムを通
して遠心分離することにより遊離のDFPを除去する。こ
れらの試料に3μlの0.5mg/mlプラスミン(b及び
d)又は3μlのPBS(a及びc)を加える。次にこれ
らの溶液から50μlずつの試料を採取し、10μlの
BPTI(1000KIU/ml)に加えてプラスミン活性を阻害す
る。各試料のアミド分解活性を螢光測定により決定す
る。結果を第3表に示す。
試料は17.48FU/mlの全TPA含量を有し(d)、この内6.25FU
/mlが活性酵素形(c)として存在する。活性酵素はDFPに
よる処理によって検出できないレベルまで阻害される
(a)。DFPにより処理した後プラスミンと共にインキュベ
ートすることにより活性酵素が再生成し、このことはプ
ロ−TPAがDFP処理に対して耐性であり、そして測定しう
る酵素活性を有しないことを示している。
例8.TPAからのプロ−TPAの分離 例5cに記載した方法により得られたTPA(10%)及
びプロ−TPA(90%)から成る溶液を、0.1%のトリト
ンX−100を含有する0.1M Tris・HClによりpH8.0に調
整し、そしてDFP濃度を1mMとする。37℃にて4時間
インキュベートした後、この混合物を5mlのDE-3セファ
ロースカラム(例5a参照)に通す。不可逆的に阻害さ
れたTPA含有する溶出液を廃棄する。カラムを、0.4M Na
Cl及び0.1%のトリトンX−100を含有する6カラム
容量のPBSにより洗浄し、そして次に例5bに記載した
ようにして、1.6M KSCN,0.4M NaCl及び0.1%のトリト
ンX−100を含有するPBSにより溶出する。溶出液は
実質上純粋な形でプロ−TPAを含有し、基質としてCbz-G
ly-Gly-Arg-AMCを用いる螢光測定においてアミド分解活
性は検出されない。プロ−TPAを活性酵素に転換するプ
ラスミンで処理することにより、アミド分解活性及びフ
ィブリン分割活性を再度生成せしめることができる。
例9.不溶化されたフィブリンへのTPA及びプロ−TPAの結
合 異なる比率でTPA及びプロ−TPAを含有する5種類の試料
を、例5cに記載した方法により、又はこの方法により
得た溶液中のプロ−TPAを部分的にTPAに転換することに
より得る。これらの試料の活性TPA及びプロ−TPAの含有
量を、例4に記載したように、プラスミン処理の前後に
おける螢光測定の結果から決定する。次にこれらの試料
をT−T(0.1)中に稀釈して、その0.2mlが2μgのプラ
スミノーゲンの存在下で、リンブロウェルの底に被覆さ
れた125I−フィブリンの約30〜50%を1時間で遊
離せしめるようにする。
次に、これらの試料のアリコート(0.2ml)を、125I−フ
ィブリン(30μg;100,000cpm)を被覆したリンブロ
ウェル4個に加える。0℃にて1時間インキュベートし
た後、4個の内の2個のウェルをT−T(0.1)により3
回洗浄することにより未結合TPA蛋白質を除去する。
2μgのプラスミノーゲン及び80μgのBSAを含有す
るTris・HCl pH8.0溶液0.3mlを加えた後、1時間で可溶
化する125I−フィブリンの量として結合した活性を測
定する。ウェルに加えた全TPA活性は、2μgのプラス
ミノーゲン及び80μgのBSA(0.3mlの同じ緩衝液)を
洗浄してないウェルに加えた後、1時間で可溶化された
125I−フィブリンの量として測定する。
結果を第4表に示す。
第4表は、TPA漂品がプロ−活性化物質形である場合
に、全TPA酵素のより多くの部分が不溶化フィブリンに
結合することを示す。
例10.非経口的投与のための医薬 例5b,5c又は8に記載した方法により得られたTPA
及び/又はプロ−TPA含有溶液を、0.01%のトウイーン
80を含有する0.3モル塩化ナトリウム溶液に対して透
析し、そして−80℃において貯蔵する。投与に先立っ
て、濃度を75μg/mlの全TPA(すなわち、TPA、プロ
−TPA、又はTPA+プロ−TPA)、及び0.3M NaClに調整す
る。この溶液を、0.22μmのメンブランフィルターを通
して過することにより無菌化する。
この方法は、非経口投与、例えば静脈内投与のためのTP
A溶液、プロ−TPA溶液、又はTPA+プロ−TPA溶液を調製
するのに適当である。
例11.血清非依存性セルラインボウエスIIの上昇したレ
ベルでTPAを生産することができる変異体の分離 血清非依存性ボウエスIIセルラインのペトリ皿培養物に
5%のウシ胎児血清を加えることにより、細胞の増殖速
度を上昇せしめ、そしてより多くの細胞がある特定の時
間にs相にあることを保証する。細胞が急速に分裂しつ
つあり、指数増殖期にあり、そしておよそ70%のコン
フルエンスにあるときに、培養物に0.1mMのN−メチル
−N−ニトロ−N′−ニトロソグアニジン(MNNG)を加え
る。この濃度により約70〜80%の細胞が死滅する。
36時間後、残っている生存細胞をトリプシン処理する
ことによりペトリ皿から取り出す。細胞を、1×105
細胞/60mmペトリ皿の密度で再接種する。2週間後、
細胞のコロニーを皿の底において観察する。各コロニー
は変異処理に対して生き残った単一細胞の子孫である。
次にこれらのコロニーを1mlの上層溶液で覆う。この溶
液はは次の組成を有する。
プラスミノーゲン(1mg/ml) 50μl 等張塩溶液中8%カゼイン 300μl 等張塩溶液中2.5%寒天 600μl RPMI-1640l培地 800μl TPAを生産するコロニーの周囲に溶解領域が生じ、最も
大きな溶解領域が最も多くのTPAを生産するコロニーの
周囲に見られる。最も高いレベルでTPAを生産する変異
コロニーを分離し、そしてペトリ皿に拡げる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12N 5/08 C12R 1:01)

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】血清非依存的に増殖し得るヒトセルライン
    又は該セルラインから誘導された血清非依存的に増殖し
    得る変異ヒトセルラインの製造方法であって、次の段階
    すなわち、 (a)血清依存性ヒトセルラインの培養物から血清含有
    培地を除去し、そしてこれを血清不含培地で置換し、 (b)付着細胞又は非付着細胞に血清不含培地を供給
    し、そして、 (c)血清非依存的に増殖し得るセルラインが確立され
    るまで細胞を増殖せしめ、そして所望により得られた血
    清非依存的に増殖し得るセルラインから血清非依存的に
    増殖し得る変異セルラインを製造する、段階を含んで成
    る方法。
  2. 【請求項2】血清不含培地が条件調節された培地であ
    り、そして該条件調節された培地がもはや必要でなくな
    るまで細胞を増殖せしめる特許請求の範囲第1項記載の
    方法。
  3. 【請求項3】条件調節された血清不含培地が仲間の血清
    依存性細胞培養物から収集される特許請求の範囲第2項
    記載の方法。
  4. 【請求項4】細胞を、約30%のコンフルエンシーにおい
    て、条件調節された培地の非存在下において増殖せしめ
    る特許請求の範囲第1項記載の方法。
  5. 【請求項5】非付着細胞を含有する培地を分離し、該培
    地から非付着細胞を分離し、そしてこれを新しい血清不
    含培地と共に付着細胞に加えることにより血清不含培地
    を調製する特許請求の範囲第1項記載の方法。
  6. 【請求項6】血清不含培地の一部分を24〜72時間の間隔
    で新鮮な血清不含培地により置換することにより血清不
    含培地を調製する特許請求の範囲第1項記載の方法。
  7. 【請求項7】血清依存性セルラインがヒト黒色腫セルラ
    インである特許請求の範囲第1項〜第6項のいずれか1
    項に記載の方法。
  8. 【請求項8】血清依存性セルラインが組織プラスミノー
    ゲン活性化物質(TPA)及び/又はプロー組織プラスミノ
    ーゲン活性化物質(プローTPA)を生産するセルライン
    である特許請求の範囲第1項〜第6項のいずれか1項に
    記載の方法。
  9. 【請求項9】血清依存性セルラインがボウエス(Bowes)
    Iセルラインである特許請求の範囲第1項〜第6項のい
    ずれか1項に記載の方法。
  10. 【請求項10】TPA及び/又はプローTPAを生産する血清
    非依存的に増殖し得るセルライン又は該セルラインから
    誘導された変異セルラインを製造するための特許請求の
    範囲第1項記載の方法。
  11. 【請求項11】ボウエスIIセルライン又は該セルライン
    から誘導された血清非依存的に増殖し得る変異セルライ
    ンを製造するための特許請求の範囲第1項記載の方法。
  12. 【請求項12】得られた血清非依存的に増殖し得るセル
    ラインを変異剤で処理し、又は放射線に暴露することに
    より対応する血清非依存的に増殖し得る変異セルライン
    を製造する特許請求の範囲第1項記載の方法。
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